We are grateful to the past and present members of the laboratory, in particular Urszula Liwak, for critical discussion regarding polysome profiling protocols and sharing of data. This work was supported by operating grants from the Canadian institutes of Health Research, Cancer Research Society, and the National Science and Engineering Research Council of Canada to MH. MDF was supported by the Vanier Canada Graduate Scholarship Doctoral Award and the Ontario Graduate Scholarship, and this work forms part of her Ph.D. dissertation.

<ol>
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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling:+new+views+of+translation,+from+single+codons+to+genome+scale.">Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale.</a> Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments.">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Polysomaler Profilierung ist eine leistungsfähige Technik, die zur Quantifizierung der Zustand der Übersetzung der spezifischen Transkripte unter verschiedenen Behandlungsbedingungen ermöglicht. Es ist eine sehr einfache Technik im Prinzip doch mehrere Schritte der Ausführung, von denen einige kritische zur Herstellung guter Polysomen-Profile erfordert. Diese wichtigen Schritte sind: 1) mit RNase-frei Chemikalien und Kunststoffgeschirr, 2) Vorbereitung gute Saccharosegradienten (nach unserer Erfahrung ein 10-50% Saccharosegradienten funktionieren am besten, für die effiziente Lösung von 40 / 60S-Untereinheiten und mRNAs mit gebundenen Ribosomen) und 3 ) unter Verwendung von Zellen, die exponentiell wachsen und nicht mehr als 80% konfluent, um zu erfassen die höchsten Raten der Übersetzung. Dieser letztere Schritt ist zu berücksichtigen, wenn dabei lange Zellbehandlungen, wie beispielsweise Knock-down oder Überexpression genommen werden, so dass die Menge der Zellen an der Platte wird eine Funktion, wie viel sich die Zellen am Endpunkt konfluent sein. In den Ergebnissen presented hier Polysomen-Profil-Analyse war ein wichtiges Werkzeug für die Bewertung Pdcd4 Rolle in der Translationsregulation der IRES-tragenden mRNAs XIAP und Bcl-xL 12. Die Tatsache, dass wir keine Änderung der allgemeinen Polysom ​​Profile auf Pdcd4 knock-down (1B) nicht beachten konnten wir feststellen, dass Pdcd4 nicht globalen zellulären Übersetzung unter den Bedingungen des Experiments beeinträchtigen. Als nächstes verwendet RT-qPCR-Analyse, um die Verteilung des XIAP und Bcl-xL-mRNAs in Zellen, die mit Pdcd4 oder Kontroll siRNAs behandelt bestimmen. qPCR ist ein Verfahren der Wahl für die Analyse von Polysomen-Profile, im Gegensatz zu Standard-RT-PCR oder Northern-Blot, weil es für eine quantitative anstatt semi-quantitative Analyse der mRNA Verteilung und zum Nachweis von feinen Verschiebungen in Translationseffizienz zwischen den Behandlungen. Mit dieser Technik konnten wir zeigen, dass die Verteilung der XIAP und Bcl-xL-mRNAs (ausgedrückt als Prozent des gesamten Ziel-mRNA durch die gradient) signifikant in schwere Polyribosome (mRNAs mit einer großen Anzahl von Ribosomen mit ihnen verbunden sind), nachdem Pdcd4 knock-down (1D, E) verschoben wird, was auf eine Erhöhung der Übersetzung dieser mRNAs. Dies wurde weiter durch eine Erhöhung der XIAP und Bcl-xL-Protein-Spiegel, aber nicht in ihrer stationären RNA-Niveaus (1F, G) bestätigt. Wichtiger ist, die Polysomen Verteilung des nicht-IRES-Variante von XIAP war unverändert zwischen behandelten und unbehandelten Zellen (1C). Alternativ kann die Translationseffizienz als das Verhältnis der mRNA-Gehalt in Polysomen (üblicherweise die Fraktionen 5 bis 10) gegenüber monosomes vorgestellt (üblicherweise die Fraktionen 2 bis 4) 14. Die Verwendung von Steuerelementen im gesamten Protokoll ist bei der Validierung keine Polysom ​​Profilierungsergebnis wichtig, da von Absorptionswerte bei 254 nm beobachtet Spitzen können nicht auf eigene Faust, um die ribosomale RNA (Reinigungsmittel zurückzuführens, beispielsweise Triton X-100 stark absorbieren in diesem Bereich des Spektrums und kann 40 / 60S Spitzen an der Spitze des Gradienten verdecken). Lassen Gradienten ohne Lysat und / oder mit Lysatpuffer müssen ausgeführt werden, um den relativen Beitrag der Puffer zu der Absorption bei 254 nm zu bestimmen. Artefakt Strukturen höherer Ordnung können auch zu Fehlinterpretationen von Polysomen, wo es in der Tat keine (zB &quot;pseudo-Polysomen&quot; 20) führen. Maskierungs Magnesium (während des gesamten Verfahrens zur Stabilisierung von 80S Ribosomen) mit der zweiwertige Kationenchelator EDTA zugegeben, um Lysate und dem Gradienten-Puffer (20 mM für 15 min) wird die Trennung des Ribosoms in seine Komponenten kleinen (40S) führen und große (60S ) Untereinheiten. Wenn somit Absorptionspeaks bei 260 nm aufgezeichnet sind zwar Polysomen, EDTA-Behandlung das Profil, so dass ein einziges Maximum wird in der Nähe der Oberseite des Gradienten, die zu mRNA und die ribosomale Einheiten frei entspricht beachten kollabieren (Daten nicht gezeigt). Übereinstimmendmit EDTA-induzierten Zerfall des Profils, sollten alle der besonderen Ziele durch qPCR analysiert jetzt an der Oberseite des Gradienten gefunden werden. Die Anzahl der Ribosomen mit einer mRNA assoziiert ist nicht immer ein Indikator dafür, wie effizient diese bestimmte mRNA übersetzt wird. Tatsächlich gibt es bestimmte Kontexte, in denen aktive Übersetzung auf Polysomen wird ins Stocken geraten 21,22, die der Leser bewusst sein sollten. Bestimmen, ob oder nicht Transkripte werden aktiv mit der Translationsmaschinerie in Eingriff kann durch eine geführt werden) Behandeln der Probe mit Puromycin, die im Gegensatz EDTA, bewirkt &#39;run-off &quot;von Ribosomen, die aktiv in einem mRNA translozieren sind, oder b) Behandeln der Probe mit Homoharringtonin die Translokation nur der ersten Ribosom am Startcodon hemmt, was wiederum zu &quot;Run-off&quot; aller nachgelagerten Translokationseinheit Ribosomen. Die Verwendung von Steuer Transkripten qPCR-Analyse ist ebenfalls kritisch. Das Selection von Transkripten, die nicht durch unterschiedliche Behandlungsbedingungen wie einige Housekeeping-Gene (GAPDH, Actin, Tubulin, Nucleolin), ribosomale mRNAs (18S, Rpl13a) oder in diesem Fall der Nicht-IRES Variante des XIAP IRES betroffen sind, ist in wichtigen Überprüfung, ob die Behandlung die Wirkung auf Übersetzung ist spezifisch oder generalisiert. Diese Steuer Transkripten verwendet werden, um die Verteilung der mRNAs analysiert, wie es hier gemacht normalisieren (XIAP und Bcl-xL-mRNAs wurden auf GAPDH-mRNA normalisiert und als Prozentsatz der Gesamt-mRNA-Gehalt durch die Summe der mRNA-Gehalt in jeder Fraktion vertreten ) oder alternativ können Ziel- und Steuerungs mRNAs als Absolutwerte angegeben und gesondert auszuweisen. qPCR-Analyse der Eingangs Lysaten (in der Regel 10% des Gesamtvolumens) ist ein weiterer Schritt, der für die Verteilung von spezifischen mRNAs steuern wird. Idealerweise sollte der mRNA-Gehalt einer spezifischen Transkripts in der Eingangs Lysat vergleichbar mit der Summe der mRNA-Gehalt in den Fraktionen 10 analysiert werden. Schließlich, Ein optionaler Schritt, um für die Phenol steuern: Chloroform Extraktionsschritt besteht darin, jeden Polysom ​​Fraktion mit einem in vitro transkribiert Reporter mRNA Spike (wie CAT, Chloramphenicolacetyltransferase), die anschließend von qPCR quantifiziert werden wird und kann sogar verwendet werden, um die Normalisierung Daten 14. Wie bei jeder Technik stellt die Polysomen Profilierung einige Einschränkungen. Die Tatsache, dass in der Regel ein Minimum von 10 Fraktionen (subtilere Veränderungen der Translationseffizienz erfordern 20 oder mehr) benötigen, um schöne Polysom ​​Distributionen gesammelt macht dieser Schritt Begrenzung, in dem Sinne, dass nur maximal 4 Proben kann zu einem Zeitpunkt analysiert, um in der Lage, bequem hand RNA-Extraktion und qPCR-Analyse von 40 Proben und 4 Input-Kontrollen auf einmal sein. Die Stichprobengröße kann leicht bis mit, wie viele Transkripte analysiert werden und wie viele qPCR repliziert zu tun, und das kann teuer werden. Eine weitere Einschränkung eines qPCR-basierte polysomaler Profilierung einnalysis ist, dass sie nur auf einen Kandidaten-basierten Ansatz (wobei die Transkripte zu analysierende im Voraus bekannt sind) und kann nicht für genomweiten Analyse von Übersetzungs angewendet werden erfolgen. Doch zu Beginn des 21. Jahrhunderts begannen die Ermittler ihre polysomaler RNA an genomischer Ebene mit Hilfe von DNA-Microarrays zu verhören 15 und in jüngerer Zeit mit der nächsten Generation Sequenzierung 16,17. In diesem leistungsfähigen Ansatz wird polysomaler Profilierung durchgeführt, wie in diesem Protokoll beschrieben ist, außer, dass anstatt der Durchführung qPCR Analyse der einzelnen Fraktionen, monosomes Fraktionen (in der Regel Bruch 2-4) und Polysomen Fraktionen (meist Fraktionen) werden vereinigt und Variationen in der globalen Übersetzung analysiert durch DNA-Microarray oder des gesamten Genoms RNA Sequenzierung. Daher bei diesem Ansatz ist es möglich zu beurteilen, alle mRNAs, deren Verteilung verschiebt sich von Polysomen zu monosomes (Abnahme der Übersetzung) oder umgekehrt (Erhöhung der Übersetzung) auf ausdrückliches treatment. Validierung und Quantifizierung spezifischer mRNA Polysomen Verteilung kann dann durch qPCR erfolgen. Eine noch leistungsfähigere Nutzung der polysomaler Profilierung Prinzip ist Ribosom Profilierung. Weitere Hochdurch Erweiterung dieser Technik wurde kürzlich berichtet, dass zur gleichzeitigen Überwachung von Hunderten von Polysomen Fraktionen 23 ermöglicht. Dies stellt einen klaren Vorteil beim Antasten Translationseffizienzen von Mutantensammlungen oder in einer groß angelegten RNAi-Screens. Ribosom Profiling ist eine Technik, die ausnutzt Next Generation Sequencing, um RNA-Fragmente von Ribosomen (Ribosomen Fußabdrücke) geschützt in der Proteinsynthese 24,25 engagiert abzubilden. Bei dieser Technik kann Ribosomentranslokation mit Cycloheximid (reversibel) oder Emetin (irreversible), gefolgt von Zell-Lyse und RNase-Verdau, um eine Population von Ribosomen Fußabdrücke ergeben gehemmt werden. Ribosomen sind angereichert, die Gesamt-RNA isoliert und verunreinigen ribosomale und mitochondriale ribosomale RNA wird entfernt.RNA Fußabdrücke von ca. 26-28 Nukleotiden werden isoliert, revers transkribiert, in eine cDNA-Bibliothek umgewandelt und sequenziert 26. Im Gegensatz zu Standard Polysom ​​Profiling, dieser Ansatz nicht nur identifiziert spezifische mRNAs, die translational reguliert werden, sondern auch liefert mRNA-spezifische Informationen bei Codon Auflösung wie die genaue Besetzung und Dichte der Ribosomen entlang einer spezifischen Transkript. Dies ist besonders interessant für mRNAs mit bestimmten Arten der Übersetzung wie IRES-beherbergen mRNAs, wie es mehr Informationen darüber, wo auf dem Transkript Ribosom-Rekrutierung auftritt geben könnte.

Regulation der Proteinsynthese (Translation) ist ein Schlüssel zellulären Prozess, der eng mit zellulären Überleben verknüpft ist. Da Übersetzung verbraucht mehr als 50% der Energie Zelle, ist es nicht verwunderlich, dass Übersetzung ist streng reguliert, und dass Störungen in der Übersetzung nicht gut vertragen. Umgekehrt sind viele aberrante zelluläre Prozesse erfordern, dass Translationsmaschinerie und Übersetzungs Ausgang (dh Proteom) müssen geändert werden. Dies ist häufig in verschiedenen Stressantwort und Krankheitszuständen der Fall, und ist wahrscheinlich am besten in der Krebsbeispielhaft dargestellt. Ein wesentlicher Vorteil der Translationskontrolle ist die Fähigkeit von Zellen, sich schnell neu zu programmieren, die das Protein Ausgabe in Reaktion auf verschiedene externe und interne Trigger, wodurch eine Feinabstimmung Mechanismus, neigt das Gleichgewicht zwischen Zellüberleben und Tod 1. Zwei Aspekte der Translationskontrolle sind besonders interessant; Verständnis der Natur des Regelungs mechanism (s) und Kontrollelemente, die für bestimmte Übersetzung zu ermöglichen, und die Identifizierung von spezifischen mRNAs und deren Proteinprodukte, die in der zellulären Reaktion auf den Trigger, insbesondere selektive Translation in erster Linie ausgelöst teilzunehmen. Polysomen-Profilierung ist eine Technik, die effektive Untersuchung beider Prozesse ermöglicht. Das übergeordnete Ziel des Polysom ​​Profiling-Technik ist, um zu studieren und zu quantifizieren Übersetzung Zustand spezifischer mRNAs unter verschiedenen zellulären Bedingungen. Das Prinzip der Technik ist es, die mRNA-Translation durch &#39;&#39; Einfrieren &#39;&#39; aktiv übersetzen Ribosomen auf verschiedenen Transkripte und trennen Sie die resultierende Polyribosomen durch Ultrazentrifugation auf einem Saccharose-Gradienten, so dass eine Unterscheidung zwischen hoch übersetzte Transkripte (von mehreren Ribosomen gebunden) erfassen und schlecht übersetzt Einsen (mit einem oder zwei Ribosomen gebunden). In diesem speziellen Protokoll, das Antibiotikum Cycloheximid, die das bindet60S ribosomalen Untereinheit und blockiert die Freisetzung von deacetyliertes tRNA aus dem Ribosom E Park 2, wird verwendet, um Ribosomentranslokation hemmen und Stall Ribosomen an der Übersetzung mRNAs. Aber auch andere Blockierungsmittel, wie Emetin, die auch Blöcke Translationselongation 3, können verwendet werden. Im Gegensatz zu dem Western Blotting und 35 S-Methionin-Markierungstechniken, die die endgültige Ausgabe des Übersetzungsprozesses zu messen, Polysomen-Profilierung hat den Vorteil der Messung Ribosomen Verbindung mit aktiv-translatierte mRNAs, wodurch für eine genauere Untersuchung der Übersetzungsmechanismen unter verschiedenen Bedingungen. Daher kann die Technik leicht an spezifisch untersuchen verschiedene Modi der Übersetzung 4-6 werden die Übersetzungsregelung 7-9, Stressbedingungen beeinflussen die Proteinsynthese 1,10,11 oder die Auswirkungen von mRNA-Strukturen wie IRES oder stromaufwärts beteiligten Proteine ​​Faktoren offene Leserahmen auf die Protein synthESIS 12-14. Heutzutage sind Polysom ​​Profilierung Anwendungen noch breiteres mit dem Einsatz von DNA-Microarrays 15 oder Next-Generation-Sequencing 16,17 zu analysieren Polysomen-assoziierte mRNAs.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="772">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:135px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Gradient Master 108 automated gradient maker</td>
			<td style="width:135px;">BIOCOMP</td>
			<td style="width:119px;">107-201M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Auto Densi-Flow two-chamber gradient maker</td>
			<td style="width:135px;">LABCONCO</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4517000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">Beckman Ultracentrifuge&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">Model # L-100-XP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Density gradient fractionator</td>
			<td style="width:135px;">TELEDYNE ISCO</td>
			<td style="width:119px;">69-3873-246</td>
			<td>Composed of: tube piercing system,&#160; peristaltic pump, UA-6 Detector with 254 and 280nm filters and Foxy R1 Fraction Collector</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">WinDaq data acquisition software</td>
			<td style="width:135px;">DATAQ INSTRUMENTS</td>
			<td style="width:119px;">WINDAQ/LITE</td>
			<td>http://www.dataq.com/products/software/acquisition.htm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">Pollyallomer ultracentrifuge tubes (for SW41, 14x89 mm)</td>
			<td style="width:135px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (dolphin nose)</td>
			<td style="width:135px;">DiaMed</td>
			<td style="width:119px;">PRE1900-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (flat bottom)</td>
			<td style="width:135px;">SafeSeal</td>
			<td style="width:119px;">12000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Sucrose (nucleases-free)</td>
			<td style="width:135px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">573113</td>
			<td>MW = 342.3 g/mol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Cycloheximide</td>
			<td style="width:135px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">C7698</td>
			<td>MW = 281.4 g/mol. Resuspend in DMSO and keep at -80C for long term sotrage. Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation. Wear mask when weighing.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Sodium chloride (nucleases-free)</td>
			<td style="width:135px;">OmniPur</td>
			<td style="width:119px;">7710</td>
			<td>MW = 58.44 g/mol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">MgCl2.6H2O (nucleases-free)</td>
			<td style="width:135px;">OmniPur</td>
			<td style="width:119px;">5980</td>
			<td>MW = 203.3 g/mol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Tris Base (nucleases-free)</td>
			<td style="width:135px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:119px;">4109-01</td>
			<td>MW = 121.14 g/mol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:135px;">OmniPur</td>
			<td align="right" style="width:119px;">9400</td>
			<td>Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td style="width:135px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">N2515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">RNaseZap Rnase inactivation solution</td>
			<td style="width:135px;">Ambion, Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL)</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen, Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td>
			<td style="width:135px;">Ambion, Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM9722</td>
			<td>Caution: TOXIC ! Can cause repiratory tracts irritation as well as skin irritation and corrosion</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of selective mrna translation in mammalian cells by polysome profiling

Regulation der Proteinsynthese stellt einen wichtigen Kontrollpunkt in der zellulären Antwort auf Stress. Insbesondere wurden diskreten RNA Regulationselemente gezeigt, die selektive Translation bestimmter mRNAs, die für Proteine ​​codieren typischerweise für eine bestimmte Stressantwort erforderlich zu ermöglichen. Identifizierung dieser mRNAs als auch die Charakterisierung von regulatorischen Mechanismen für die selektive Translation verantwortlich ist, an der Spitze der molekularen Biologie seit einiger Zeit. Polysom ​​Profilierung ist ein Eckpfeiler Verfahren in diesen Studien. Das Ziel Polysom ​​Profilierung ist es, mRNA-Translation durch Immobilisierung aktiv übersetzen Ribosomen auf verschiedenen Transkripte erfassen und trennen Sie die resultierende Polyribosomen durch Ultrazentrifugation auf einem Saccharose-Gradienten, so dass eine Unterscheidung zwischen hoch übersetzte Transkripte und schlecht übersetzt Einsen. Diese können dann durch traditionelle biochemische und molekularbiologische Methoden charakterisiert werden. Wichtig ist, dass die Kombination von polysome Profilierung mit hohem Durchsatz genomische Ansätze erlaubt eine groß angelegte Analyse der Translationsregulation.

Wir haben kürzlich eine neue Rolle für das Tumorsuppressor Pdcd4 als selektiver Inhibitor der Übersetzung IRES-tragenden mRNAs Apoptoseinhibitoren XIAP und Bcl-xL 12. Polysom ​​Profilierung war eine Schlüsseltechnik, um die spezifische Beteiligung von Pdcd4 in IRES-vermittelte Übersetzung zu demonstrieren. HEK293-Zellen wurden transient transfiziert endogenen Pdcd4 (1A) führen und dann einer Profilanalyse Polysomen. Wir haben beobachtet, dass die Reduzierung des Niveaus Pdcd4 nicht globalen zellularen Übersetzung beeinträchtigt, wie durch das Fehlen von Änderungen der Polysomen-Profil im Vergleich siCTRL und siPDCD4 behandelten Zellen (1B) beurteilt. Ebenso Polysomen Verteilung nicht-IRES Variante XIAP 19 unverändert zwischen behandelten und unbehandelten Zellen (1C). Dagegen Polysomen Verteilung der beiden IRES-tragenden mRNAs, XIAP und Bcl-xL, signifikant verändert. In der Abwesenheit von PDCD4 die Verteilung dieser beiden mRNAs in schweren ribopolysomes (1D, E) verschoben. Da dies nicht durch Veränderungen in der Steady-State-Niveaus von XIAP und Bcl-xL mRNA (1F) diesen Ergebnissen begleitet weisen eine verbesserte Übersetzung von XIAP und Bcl-xL in Zellen mit vermindertem Pdcd4 Ebenen, die durch Western Blot (Abbildung bestätigt wurde 1G). <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52295/52295fig1highres.jpg" /> Fig. 1: Polysomen Profilierung identifiziert Pdcd4 als selektiver Inhibitor von XIAP und Bcl-xL-Übersetzung (A) HEK293-Zellen wurden mit Pdcd4 siRNA oder Kontrolle (CTRL) behandelt, nicht-Targeting siRNA, lysiert und mit Anti-Pdcd4 Western-Blot-Analyse unterzogen, und Anti-Nucleolin Antikörper, um das Ausmaß des Pdcd4 knock-down zu überprüfen. (B) Pdcd4 wurde verkleinert, wie in (A) klopfte undZelllysate wurden einer Profilierung Polysom. Repräsentative Polysom ​​Profil wird im oberen Bereich angezeigt; Verteilung des XIAP IRES nicht (C) wird Bcl-xL (D) und XIAP IRES (E) mRNAs relativ zu der GAPDH als Prozentsatz der Gesamt-mRNA (% mRNA) in jeder Fraktion gezeigt. (F) stetig -state mRNA-Spiegel wurden mittels RT-qPCR in Pdcd4 siRNA oder Kontrolle (CTRL) siRNA behandelten Zellen gemessen. (G) Die Lysate aus (A) wurden auch Western-Blot-Analyse mit anti-XIAP, anti-Bcl-xL und ausgesetzt Anti-Nucleolin Antikörper. (NB. Die dargelegten Daten in Abbildung 1 wurden ursprünglich in 12 veröffentlicht) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52295/52295fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions.

Bewertung der Selective mRNA Translation in Säugerzellen durch Polysomen Profilieren

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...

assessment-selective-mrna-translation-mammalian-cells-polysome

Research

JoVE Journal

Biology

28.0K Aufrufe.  University of Ottawa. The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions. 

Serie: Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Analyse des Zellzyklus Position in Säugerzellen

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Forschung

Biologie

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells. Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus (EBV) and Kaposi's Sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), which cause multiple human malignancies 1-3. These two genomes are replicated in a licensed manner, each using a single viral protein and cellular replication machinery, and are passed to daughter cells during cell division despite their lacking traditional centromeres 4-8.
Much work has been done to characterize the replications of these plasmid genomes using methods such as Southern blotting and fluorescence in situ hybridization (FISH). These methods are limited, though. Quantitative PCR and Southern blots provide information about the average number of plasmids per cell in a population of cells. FISH is a single-cell assay that reveals both the average number and the distribution of plasmids per cell in the population of cells but is static, allowing no information about the parent or progeny of the examined cell.
Here, we describe a method for visualizing plasmids in live cells. This method is based on the binding of a fluorescently tagged lactose repressor protein to multiple sites in the plasmid of interest 9. The DNA of interest is engineered to include approximately 250 tandem repeats of the lactose operator (LacO) sequence. LacO is specifically bound by the lactose repressor protein (LacI), which can be fused to a fluorescent protein. The fusion protein can either be expressed from the engineered plasmid or introduced by a retroviral vector. In this way, the DNA molecules are fluorescently tagged and therefore become visible via fluorescence microscopy. The fusion protein is blocked from binding the plasmid DNA by culturing cells in the presence of IPTG until the plasmids are ready to be viewed.
This system allows the plasmids to be monitored in living cells through several generations, revealing properties of their synthesis and partitioning to daughter cells. Ideal cells are adherent, easily transfected, and have large nuclei. This technique has been used to determine that 84% of EBV-derived plasmids are synthesized each generation and 88% of the newly synthesized plasmids partition faithfully to daughter cells in HeLa cells. Pairs of these EBV plasmids were seen to be tethered to or associated with sister chromatids after their synthesis in S-phase until they were seen to separate as the sister chromatids separated in Anaphase10. The method is currently being used to study replication of KSHV genomes in HeLa cells and SLK cells. HeLa cells are immortalized human epithelial cells, and SLK cells are immortalized human endothelial cells. Though SLK cells were originally derived from a KSHV lesion, neither the HeLa nor SLK cell line naturally harbors KSHV genomes11. In addition to studying viral replication, this visualization technique can be used to investigate the effects of the addition, removal, or mutation of various DNA sequence elements on synthesis, localization, and partitioning of other recombinant plasmid DNAs.

A method of observing individual DNA molecules in live cells is described. The technique is based on the binding of a fluorescently tagged lac repressor protein to binding sites engineered into the DNA of interest. This method can be adapted to follow many recombinant DNAs in live cells over time.

Überwachung Plasmid-Replikation in lebenden Säugerzellen über mehrere Generationen durch Fluoreszenz-Mikroskopie

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

Visualisierung von endoplasmatischen Retikulum lokalisierte mRNAs in Säugerzellen

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. Alterations of this program can lead to the growth of damaged cells, a hallmark of cancer development, or to premature cell death such as seen in neurodegenerative diseases. Much of what is known concerning the molecular basis for translational control has been obtained from polysome analysis using a density gradient fractionation system. This technique relies on ultracentrifugation of cytoplasmic extracts on a linear sucrose gradient. Once the spin is completed, the system allows fractionation and quantification of centrifuged zones corresponding to different translating ribosomes populations, thus resulting in a polysome profile. Changes in the polysome profile are indicative of changes or defects in translation initiation that occur in response to various types of stress. This technique also allows to assess the role of specific proteins on translation initiation, and to measure translational activity of specific mRNAs. Here we describe our protocol to perform polysome profiles in order to assess translation initiation of eukaryotic cells and tissues under either normal or stress growth conditions.

Here, we describe a method to analyze changes in the initiation of mRNA translation of eukaryotic cells in response to stress conditions. This method is based on the velocity separation on sucrose gradients of translating ribosomes from non-translating ribosomes.

Analyse der Translation Initiation Während Stress-Bedingungen durch Polysomprofile Profiling

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

Profiling Individuelle humanen embryonalen Stammzellen durch quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. Accordingly, dysregulation of mRNA translation is considered to play a major role in a variety of pathological states including cancer. Ribosomes also host chaperones, which facilitate folding of nascent polypeptides, thereby modulating function and stability of newly synthesized polypeptides. In addition, emerging data indicate that ribosomes serve as a platform for a repertoire of signaling molecules, which are implicated in a variety of post-translational modifications of newly synthesized polypeptides as they emerge from the ribosome, and/or components of translational machinery. Herein, a well-established method of ribosome fractionation using sucrose density gradient centrifugation is described. In conjunction with the in-house developed &#8220;anota&#8221; algorithm this method allows direct determination of differential translation of individual mRNAs on a genome-wide scale. Moreover, this versatile protocol can be used for a variety of biochemical studies aiming to dissect the function of ribosome-associated protein complexes, including those that play a central role in folding and degradation of newly synthesized polypeptides.

Ribosomes play a central role in protein synthesis. Polyribosome (polysome) fractionation by sucrose density gradient centrifugation allows direct determination of translation efficiencies of individual mRNAs on a genome-wide scale. In addition, this method can be used for biochemical analysis of ribosome- and polysome-associated factors such as chaperones and signaling molecules.

Polysomprofile Fraktionierung und Analyse von Säuger Translatomes auf einer Genom-weite Skala

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Die Messung der Hämsynthese Levels in Säugerzellen

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Imaging Lokale Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signale in kultivierten Säugetierzellen

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

An Easy Method for Plant Polysome Profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the analysis of translational regulation. The method described here is an easy and economical way for fractionating polysomes from various plant tissues. A sucrose gradient is made without the need for a gradient maker by sequentially freezing each layer. Cytosolic extracts are then prepared in a buffer containing cycloheximide and chloramphenicol to immobilize the cytosolic and chloroplastic ribosomes to mRNA and are loaded onto the sucrose gradient. After centrifugation, six fractions are directly collected from the bottom to the top of the gradient, without piercing the ultracentrifugation tube. During collection, the absorbance at 260 nm is read continuously to generate a polysome profile that gives a snapshot of global translational activity. Fractions are then pooled to prepare three different mRNA populations: the polysomes, mRNAs bound to several ribosomes; the monosomes, mRNAs bound to one ribosome; and mRNAs that are not bound to ribosomes. mRNAs are then extracted. This protocol has been validated for different plants and tissues including Arabidopsis thaliana seedlings and adult plants, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum, and Oryza sativa leaves.

This protocol describes an easy method to extract and fractionate transcripts from plant tissues on the basis of the number of bound ribosomes. It allows a global estimate of translation activity and the determination of the translational status of specific mRNAs.

Eine einfache Methode für Pflanzen Polysomen Profilieren

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...