מחקר זה נתמך על ידי INSERM, האוניברסיטה אקס-מרסיי ופרס פיתוח קריירה מHFSPO מתקבל על ידי CL פורסטייה.

הצהרת אתיקה: כל המחקרים בבעלי החיים בוצעו בהתאם להנחיות ופרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים של אקס-מרסיי Université, צרפת. C57Bl / 6 עכברים נקבה ב8-10 שבועות היו מסחריים שהושגו ויטופלו בהתאם לכללים של Décret N ° 8 87-848, 19 אוקטובר 1987, פריז. כל הניסויים באמצעות L. טפילי donovani LD1S נערכו בהתאם לתקנות בטיחות ביולוגית מהחקיקה הצרפתית ואיחוד האירופי. 1. זיהום עכבר עם ל &#39; donovani Promastigote טפילים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מדיום התרבות לתחזוקה במבחנה של ל &#39; טפילי promastigote donovani, LD1S (MHOM / SD / 62 / 1S-CL2D). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בינוני M199. להשלים בינוני M199 עם 10% עוברי עגל בסרום (חום מומת-על 56 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות), 25 מ&quot;מ HEPES pH 6.9, 12 מ&quot;מ NaHCO 3, Glu 1 מ&quot;מtamine, RPMI 16040 שילוב ויטמין, חומצה פולית 10 מ&quot;מ, 100 מ&quot;מ אדנוזין, hemin 7.6 מ&quot;מ, 50 U / פניצילין מיליליטר ו 50 מ&quot;ג / מיליליטר סטרפטומיצין. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות LD1S טפילים ב 10 מיליליטר של מדיום M199 מלא ב 26 מעלות צלזיוס בבקבוק מאוורר 25 סנטימטר 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות צעדי צנטריפוגה ההפרש רצופים, להכין אוכלוסייה של טפילי promastigote שמועשרים בצורות metacyclic. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תרבות טפילה שלב אמצע יומן. לסמוך על hemocytomer. Resuspend 5 x 10 5 מיליליטר / טפילים ב 10 מיליליטר של מדיום M199 מלא. לגדול התרבות טפילה בתנאים אנאירוביים עד שהם מגיעים לשלב מאוחר הנייח (בכ 5-6 ימים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין תרבות LD1S ב1,200 XG במשך 10 דקות ב 26 ° C עד גלולה טפילים שאינם metacyclic, לשחזר את supernatant ולסובב אותו שוב ב 2500 XG ב 26 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. הערה: גלולה סופית זה מועשר בטפילי promastigote metacyclic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב 100 μl של PBS. להסיר aliquot קטן לקיבוע עם glutaraldehyde 25% 1/100 v: v ולספור טפילים באמצעות hemocytometer. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את האוכלוסייה טפילה המועשר-metacyclic בPBS 1 x 10 7/100 μl. להזריק את ההשעיה הטפיל לוריד הזנב של עכבר הרדים (ראה להלן) באמצעות מזרק 1 מיליליטר עם מחט 30 G. לבעלי חיים שליטה, להזריק 100 μl PBS לתוך וריד הזנב. </li></ol> 2. ניתוחים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא את מקום העבודה עם תרסיס חיטוי הורגות וכל מכשירי הניתוח עם אתנול 70% למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון הרדמה, בהתאם למשקלו של בעל החיים, המכיל 125 מ&quot;ג / קילוגרם של קטמין ו12.5 מ&quot;ג / קילוגרם של Xylazine מדולל PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את העכבר וintraperitoneally להזריק המינון המתאים של הרדמה באמצעות מזרק 1 מיליליטר עם מחט 30 G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על העכבר חם ולבדוק שהעכבר הוא anesthe לחלוטיןtized ידי צובט את כרית כף הרגל לפני שתמשיך. להזריק מחדש מחצית מינון של חומר ההרדמה בעכבר בכל 60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח את הבטן של העכבר ולנקות אותו עם Vetedine. לעשות חתך קטן בעור והשרירים מתחת לכלוב בית החזה בצד השמאל של הבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח פיסת הגזה לחה בבטן ממש מתחת לאזור פתח. לחשוף את הכבד ומניח אותו על הגזה. הנח פיסת הגזה לחה מעל הכבד אחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 24 x 60 מ&quot;מ 2-150 coverslip העבה מיקרומטר, למסגרת מתכת, על הכבד להדמיה תחת מיקרוסקופ-הערובה cyanoacrylate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגן על העיניים של העכבר עם גזה רטובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר פגישת ההדמיה, להרדימו בהרדמה על ידי נקע בצוואר הרחם. </li></ol> 3. מיקרוסקופית Intravital הדמיה של האדריכלות הכבד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע את ניסויי מיקרוסקופיה intravital במיקרוסקופ confocal הפוכה מצוידים בhermostatic מבוקר קאמרי, מטרת טבילת גליצרול שמן apochromatic 63X (NA 1.4), ארגון (488 ננומטר) וHeNe (543 ננומטר, 633 ננומטר) לייזרים ודיודה כחולה (405 ננומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר על הבמה של מיקרוסקופ עם coverslip מכסה את פניו הכבד על המטרה. הגדר את הטמפרטורה של החדר עד 29 מעלות צלזיוס. התאם את המיקוד באמצעות autofluorescence הכבד כדי לאפשר להדמיה של sinusoids. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להמחיש את כלי הדם, להכין פתרון של 500 מיקרוגרם BSA-Alexa 647 בדילול המלא של PBS 100 μl, לכל עכבר. להזריק את הפתרון הזה לוריד לוריד הזנב של העכבר הרדים באמצעות מזרק 1 מיליליטר עם מחט 30 G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להמחיש את גרעין תא הכבד, להכין פתרון של Hoechst 33342 בPBS. להזריק את הפתרון הזה בשעה 8 מ&quot;ג / קילוגרם של עכבר intraperitoneally באמצעות מזרק 1 מיליליטר עם מחט G 30. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במצב הרגיל רציף, במטרה טבילת 63X והסורק ב 400 הרץ לתמונה הכבדגרעין תא וכלי הדם בכבד. הפעל דיודה 405 ננומטר הכחולה לעירור Hoechst וליזר 633 ננומטר לעירור BSA-Alexa 647. הפעל את לייזר ננומטר ארגון 488 ולהגדיר להקת רכישה גדולה כדי להמחיש את autofluorescence הכבד. </li></ol> 4. מיקרוסקופית Intravital הדמיה של הכבד למדידת זרימת דם מהיר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תוכנת LAS של המיקרוסקופ (הגרסה הצופה לאס-AF 3.1.0 לבנות 8587). בחר את מצב סורק תהודה בעת פתיחת תוכנת מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על כרטיסיית התצורה כדי להגדיר את החומרה. לחץ על לייזר ובחר את לייזר HeNe 633. לחץ על הגדרות ובחר ברזולוציה ביטים 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על תפריט הרכישה. בחלון הגדרות מסלול הקרן, בחר 63X האובייקטיבי ולהגדיר את כוח הלייזר 633 עד 100%. הפעל את רווח אות ואת הפרמטרים שנקבעו על ידי בחירת Alexa-633 מהתפריט הנפתח PM1-3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכרטיסייה לרכוש, בחר את הרכישה &#39;xyt&#39;מצב. רוחב פורמט נקבע על 1,024 x 1,024. בחר את המהירות ב 8000 הרץ. בחר את חריר של 3 יחידות אווריריות. בחר גורם הזום של 3. אל תבחר במצב דו-כיווני. </li></ol> 5. ניתוח כמותי של RBC מהירות שימוש בתמונות xyt (שיטה 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על סמל &quot;חי&quot; כדי להמחיש את זרימת הדם במצב חי. בחר תחום עניין ובחר כלי דם ספציפיים לניתוח. הגדר את הכלי של עניין למצב אופקי על ידי התאמת &#39;X&#39;, &#39;Y&#39; וקואורדינטות סיבוב שדה סריקה בלוח בקרת USB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את המצב &quot;חי&quot; ברגע שהספינה של עניין מוגדרת. לשנות את רוחב סט הפורמט ל1,024 x 256 במצב רכישת הגדרת חלון, קו ממוצע = 1, ממוצע מסגרת = 1, בחר &quot;ערימות&quot; 150. לחצו על &quot;התחל&quot; כדי לרכוש תמונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח כמותי של RBC מהירות באמצעות התמונות &quot;xyt&quot; לפתוח את תוכנת ImageJ. בחר &#39;הקובץ&#39;כרטיסייה בImageJ, לחץ על &quot;פתח&quot; ואז לבחור את הקובץ של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכו לתפריט &quot;תוסף&quot; בImageJ, בחר לוקוסים וביו-פורמטים לייבא אפשרויות. בחלון זה, בחר את ערימת צפייה פרמטרים כמו &#39;hyperstack&#39;. באפשרות כדי ערימה, בחר באפשרות: &quot;xyzct&quot;. הערה: זה פותח חלון עם כל הסדרה של רכישות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &#39;תוספים&#39; בתפריט ImageJ ובחר באפשרות MTrackJ. לחץ על סמל &#39;הוסף&#39; בחלון הקטן ולחץ על RBC כדי לעקוב אחר. לחץ על אותו RBC בכל מסגרת הבאה ולחץ על סמל &#39;מידה&#39; כדי למדוד את המהירות. הערה: הקובץ שנוצר ניתן לשמור בפורמט .exl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקוב אחר מינימום של חמישה RBCs לאונייה ולנתח מינימום של שלושה כלי בודדים באותו הגודל. </li></ol> 6. ניתוח כמותי של RBC מהירות שימוש בתמונות קו XT (שיטה 2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;חי&quot; כדי להמחיש את F הדםנמוך במצב חי. בחר כלי דם ספציפיים לניתוח. הגדר את הכלי של עניין למצב אופקי. עצור את המצב &quot;חי&quot; ברגע שהספינה של עניין מוגדרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את מצב הסריקה &#39;XT &quot;ולהגדיר את לומן של הכלי הנבחר לאורך קו הסריקה המרכזי. רוחב פורמט סט ב1,024 x 512, מהירות = 8,000Hz, ממוצע הקו = 32, זמן = 512. לחצו על &quot;התחל&quot; ולרכוש את תמונות קו XT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור פסים לניתוח כמותי של RBC מהירות על ידי פתיחת קובץ .lif ופתיחת תמונת קו XT של עניין. בתוכנה לאס-AF, בחר &quot;ניסויים&quot;, לפתוח את .lif ובחר את התמונה. הערה: באופן אוטומטי זה ייפתח רשם גלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את הזמן (t, מתקבל על ציר Y) הנדרש לפס חלקיקים (מראה השתקפות כהה) לנסוע מרחק מסוים (ד, שהושג על ציר X) על רשם גלים זה. בחר באפשרות &quot;לצייר קו&quot; ולמתוח קו אופקי לפס. שים לב למרחק במיקרומטר והזמן בשניות שנוצרו בכרטיסיית התוצאה בחלק התחתון של התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב מהירות כV = מרחק / זמן שימוש בערכים המתקבלים מרשם הגלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת מינימום של חמישה פסי חלקיקים לכל תמונת XT ומינימום של שלושה כלי בודדים באותו הגודל. </li></ol>

<ol>
	<li>Vollmar, B., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hepatic+microcirculation:+mechanistic+contributions+and+therapeutic+targets+in+liver+injury+and+repair.">The hepatic microcirculation: mechanistic contributions and therapeutic targets in liver injury and repair.</a> Physiol. Rev. 89, 1269-1339 (2009).</li><li>Srinivasan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+blood+flow+measured+by+optical+methods.">Absolute blood flow measured by optical methods.</a> SPIE Newsroom. , (2011).</li><li>Seifalian, A. M., Stansby, G. P., Hobbs, K. E., Hawkes, D. J., Colchester, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+liver+blood+flow:+a+review.">Measurement of liver blood flow: a review.</a> HPB. Surg. 4, 171-186 (1991).</li><li>Engwerda, C. R., Ato, M., Kaye, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages,+pathology+and+parasite+persistence+in+experimental+visceral+leishmaniasis.">Macrophages, pathology and parasite persistence in experimental visceral leishmaniasis.</a> Trends Parasitol. 20, 524-530 (2004).</li><li>Beattie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+experimental+Leishmania+donovani-induced+hepatic+granulomas+detects+Kupffer+cell-restricted+antigen+presentation+to+antigen-specific+CD8+T+cells.">Dynamic imaging of experimental Leishmania donovani-induced hepatic granulomas detects Kupffer cell-restricted antigen presentation to antigen-specific CD8 T cells.</a> PLoS Pathog. 6, e1000805 (2010).</li><li>Lee, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intravascular+immune+response+to+Borrelia+burgdorferi+involves+Kupffer+cells+and+iNKT+cells.">An intravascular immune response to Borrelia burgdorferi involves Kupffer cells and iNKT cells.</a> Nat. Immunol. 11, 295-302 (2010).</li><li>Geissmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+immune+surveillance+by+CXCR6++NKT+cells+patrolling+liver+sinusoids.">Intravascular immune surveillance by CXCR6+ NKT cells patrolling liver sinusoids.</a> PLoS Biol. 3, e113 (2005).</li><li>Marques, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+liver+biology+in+vivo+using+conventional+confocal+microscopy.">Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy.</a> Nat. protocols. 10, 258-268 (2015).</li><li>Thiberge, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+malaria+parasites+in+the+murine+liver.">In vivo imaging of malaria parasites in the murine liver.</a> Nat. protocols. 2, 1811-1818 (2007).</li><li>Vacchina, P., Morales, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+screening+test+using+Leishmania+promastigotes+stably+expressing+mCherry+protein.">In vitro screening test using Leishmania promastigotes stably expressing mCherry protein.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 58, 1825-1828 (2014).</li><li>Ferrer, M., Martin-Jaular, L., Calvo, M., del Portillo, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+of+the+spleen:+quantitative+analysis+of+parasite+mobility+and+blood.">Intravital microscopy of the spleen: quantitative analysis of parasite mobility and blood.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li><li>Kamoun, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurement+of+RBC+velocity,+flux,+hematocrit+and+shear+rate+in+vascular+networks.">Simultaneous measurement of RBC velocity, flux, hematocrit and shear rate in vascular networks.</a> Nat. Methods. 7, 655-660 (2010).</li><li>MacPhee, P. J., Schmidt, E. E., Groom, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermittence+of+blood+flow+in+liver+sinusoids,+studied+by+high-resolution+in+vivo+microscopy.">Intermittence of blood flow in liver sinusoids, studied by high-resolution in vivo microscopy.</a> Am. J. Phys. 269, G692-G698 (1995).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

הפיתוח האחרון של מיקרוסקופיה intravital של כבד העכבר פותח אפשרויות חדשות לחקירת תגובה הפיזיולוגית לזיהום in vivo ובזמן אמת 5,9,10. זרימת דם איברים היא פרמטר פיסיולוגי קריטי שבו לעתים קרובות שינה במחלות רבות. עם זאת, מעמדו של פרמטרים המודינמיים כבד בתנאים פיסיולוגיי?...

פרמטרים המודינמיים איברים ספציפיים הם תכונות פיסיולוגיות חשובות של כל איבר של יונקים. הפרעות בזרימת דם יכולות להיות התוצאה של דלקת וסימן לבעיות בתפקוד איבר 1. כך, זרימת דם ארגון, מבנה ותפקוד יופיעו פרמטרים קריטיים כמו לניתוח בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים. הטכניקות שהיו בשימוש נפוץ לניתוח זרימת דם באיבר מסוים מכילות מספר מגבלות, כוללים מגבלת הרזולוציה של הטכניקה עצמה (למשל ההדמיה דופלר זרימת דם), היכולת למדידת זרימת דם מוחלטת בלבד (נפח דם ל יחידה משרתת איבר) (למשל טומוגרפיה אופטי קוהרנטיות) והמדידה של שינויים במהירות ממוצע באוכלוסייה גדולה והטרוגנית של כלי דם 2,3. מערכת הדם של כבד קישורים תת כלי שונה ההטרוגנית בגודל, המבנה והתפקוד שלהם. בטכנולוגיית הדמיה מחקר, מיקרוסקופיה intravital (IVM) זה מיושמת להעריך פרמטרים המודינמיים כבד in vivo, בזמן אמת, ברזולוציה גבוהה ובמקביל לחשוף את המאפיינים של כלי דם הבודדים המרכיבים את האיבר הכבד. הפיתוח האחרון של טכניקת הדמיה זה חזק אופטית מאפשר לחוקר לאסוף נתונים דינמיים בחי בעלי חיים ברזולוציה מרחב ובזמן גבוהה. כך שהוא מאפשר להדמיה הישירה וניטור בזמן אמת של תהליכים ביולוגיים ספציפיים ומהירים in vivo, IVM מספק הזדמנות ייחודית לחוקר לכלי דם בודד תמונה, ולמדוד ולכמת את המהירות של תאי דם אדומים יחידים (RBC) בתוך נבחר במיוחד כלי כבד. במחקר זה, יישמנו את טכניקת IVM בכבד העכבר כדי לחקור את ההשפעה של זיהום על ידי עכבר טפיל שושנת יריחו hepatotropic על פרמטרים המודינמיים כבד. L. donovaniהוא הסוכן האחראי לleishmaniasis הקרביים, מחלה קשה המתאפיינת בתגובות דלקתיות חריפות-על-כרוני ופתולוגיה שנמצאת באיברים רבים, כולל הטחול והכבד. במודל עכבר ניסיוני של leishmaniasis הקרביים, דלקת הכבד היא ואילו זיהום הטחול הוא פרוגרסיבי 4 פתרון עצמי. תוצאות אלה של זיהום שושנת יריחו ביחס לאיברים הבודדים עדיין לא הבינו לגמרי. חקירה של פרמטרים המודינמיים כבד וטחול במצבים פתולוגיים תשפוך אור חדש על יחסי גומלין מארח-טפיל והיווצרות מחלה. מערכת המודל הניסיונית שלנו מבוססת על חשיפה והדמית הכבד של עכבר הרדים שקיבל הזרקה תוך ורידית של צבעי ניאון ספציפיים לתיוג של intravasculature הכבד. הכבד הוא איבר חיובי למיקרוסקופיה פנים-חיונית. לאחר ביצוע incisio קטןn בבטן, הכבד מוחצנת בעדינות והניח על גזה רטובה, ולאחר מכן על coverslip עם המטרה של הפחתת כל חפצי תנועה בשל פעימות לב ונשימה. הכבד ממוקם אז במבט של עדשת מיקרוסקופ. בהשוואה לצומת הטחול והלימפה הדורשת השימוש בשני מיקרוסקופיה פוטון ללימודי IVM, היתרון של הכבד הוא בארכיטקטורת 3D הומוגנית / האנטומיה שלה, המאפשרת לשימוש במיקרוסקופ confocal קונבנציונלי, עם עומק חדירה מקסימאלי של כ 50 מיקרומטר, הדמיה מיקרוסקופיה intravital 5-8. מחקר זה מתאר שתי שיטות הדמיה עצמאיות למדידת כמותית של מהירות וזרימת דם במהירות RBC בכלי דם בודדים. בשיטה הראשונה, זרימת דם בכבד נרכשה באמצעות מצב דו-ממדי XY לאורך זמן. נתונים xyt התוצאה מנותחים באמצעות תוסף MtrackJ בתוכנת ImageJ החופשית, המאפשר למעקב של individרע&quot;מ RBCs לאורך זמן. בשיטה השנייה, כלי דם בודדים שנבחרו ואת זרימת הדם המתאים מנותחת באמצעות מצב רכישה מהירה סריקת קו של מיקרוסקופ לייזר סריקת confocal. הכלי של העניין נסרק בתדירות גבוהה לאורך הציר המרכזי שלה באמצעות קו צירי. זרימת דם המהירות אז לכמת מבוססת על ההבדל בניגוד בין אריתרוציטים כהים ללא תווית והפלזמה שכותרתו fluorescently. עוצמות הקרינה של תאי דם אדומים ופלזמה שנרכשו לאורך קו הסריקה הם זממו נגד זמן כדי להשיג פסים, הזוויות שלו הן פרופורציונליות למהירויות של RBC בודד. מטרתו של מאמר זה היא לספק שיטה פשוטה לשחזור להדמיה ומדידת מהירות זרימת דם בתוך כלי דם בודדים של הכבד ולהפוך לזמינים את הכלים הבסיסיים לביצוע המוצלח של ניתוח עכבר, IVM וניתוחים כמותיים של המהירות RBCs הבודד. Tגישתו תאפשר לחוקרים כדי לקבל תובנות חדשות דם מהירות בתנאים פתולוגיים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-Alexa 647</td>
			<td>lifetechnologies</td>
			<td>A34785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran-FITC 500 mol wt</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>46947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>PanPharma</td>
			<td>20434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>KP07KEU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetedine</td>
			<td>Pharma Animal</td>
			<td>6869029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate liquid</td>
			<td>Cyanolit</td>
			<td>5833300005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip frame: Membrane slide for microdissection part N&#176;: 5013</td>
			<td>Molecular machines</td>
			<td>50103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip DiaPath 24x60 ep: 1.6 mm</td>
			<td>DiaPath</td>
			<td>61061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>TCS-SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS-AF viewer&#160;</td>
			<td>Leica software</td>
			<td>Version 3.1.0 buid 8587</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intravital microscopy imaging of the liver following leishmania infection: an assessment of hepatic hemodynamics

מיקרוסקופיה intravital (IVM) היא טכניקת הדמיה אופטית רבת עוצמה שאפשרה את ההדמיה, הניטור והכימות של אירועים ביולוגיים שונים בזמן אמת ובבעלי חיים. טכנולוגיה זו התקדמה מאוד ההבנה של תהליכים פיסיולוגיים ותופעות בתיווך הפתוגן באיברים ספציפיים שלנו. במחקר זה, IVM מוחל על כבד העכבר ופרוטוקולים נועדו תמונת in vivo מערכת הדם של הכבד ולמדוד תא דם אדום מהירות (RBC) בכלי כבד בודדים. כדי להמחיש את תת כלי שונה המאפיינים את האיבר הכבד ולבצע מדידות זרימת דם מהירות, C57Bl / 6 עכברים מוזרקים לוריד עם מגיב פלזמה ניאון שתוויות כלי הדם הקשורים בכבד. IVM מאפשר in vivo, בזמן אמת, מדידה של RBC מהירות בכלי ספציפי של עניין. הקמת מתודולוגיה זו תאפשר ללחקור פרמטרים המודינמיים כבד בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים. סופו של דבר, מתודולוגיה מבוססת הדמיה זה תהיה חשובה ללימוד ההשפעה של ל &#39; זיהום donovani על פרמטרים המודינמיים בכבד. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מודלים זיהומיות אחרים ואיברי עכבר ועשויה להתארך עוד יותר לפרה-קלינית לבדיקה של ההשפעה של תרופה על ידי דלקת כימות השפעתו על זרימת דם.

הארגון האדריכלי הספציפי של sinusoids בכבד יכול להיות דמיינו מבוסס על רכוש autofluorescent של איבר זה (איור 1, לוח ב &#39;וג&#39;, ירוק), זריקת intraperitoneal של Hoechst לתיוג של גרעיני hepatocyte (איור 1, כחול) וההזרקה תוך ורידית של BSA ניאון להכתמה של מערכת דם בכבד (איור 1 ג, אד?...

Watch this Scientific Journal Video about Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics at JoVE.com

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.

מיקרוסקופית Intravital הדמיה של הכבד הבא<em&gt; שושנת יריחו</em&gt; זיהום: הערכה של פרמטרים המודינמיים בדיה

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

intravital-microscopy-imaging-liver-following-leishmania-infection-an

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

11.4K Views.  University of Aix-Marseille. This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.

Video: Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most common forms of disease are visceral leishmaniasis (VL) and cutaneous leishmaniasis (CL). Mouse models of leishmaniasis are widely used, but quantification of parasite burdens during murine disease requires mice to be euthanized at various times after infection. Parasite loads are then measured either by microscopy, limiting dilution assay, or qPCR amplification of parasite DNA. The in vivo imaging system (IVIS) has an integrated software package that allows the detection of a bioluminescent signal associated with cells in living organisms. Both to minimize animal usage and to follow infection longitudinally in individuals, in vivo models for imaging Leishmania spp. causing VL or CL were established. Parasites were engineered to express luciferase, and these were introduced into mice either intradermally or intravenously. Quantitative measurements of the luciferase driving bioluminescence of the transgenic Leishmania parasites within the mouse were made using IVIS. Individual mice can be imaged multiple times during longitudinal studies, allowing us to assess the inter-animal variation in the initial experimental parasite inocula, and to assess the multiplication of parasites in mouse tissues. Parasites are detected with high sensitivity in cutaneous locations. Although it is very likely that the signal (photons/second/parasite) is lower in deeper visceral organs than the skin, but quantitative comparisons of signals in superficial versus deep sites have not been done. It is possible that parasite numbers between body sites cannot be directly compared, although parasite loads in the same tissues can be compared between mice. Examples of one visceralizing species (L. infantum chagasi) and one species causing cutaneous leishmaniasis (L. mexicana) are shown. The IVIS procedure can be used for monitoring and analyzing small animal models of a wide variety of Leishmania species causing the different forms of human leishmaniasis.

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

An in vivo imaging system is used to generate quantitative measurements of murine infection with the Trypanosomatid protozoan Leishmania. This is a non-invasive and non-lethal method for detecting parasites expressing luciferase within many tissues throughout the course of chronic Leishmania spp. infection.

בתחום ההדמיה vivo של טפילים טראנסגנטי שושנת יריחו שורה חיים

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune response and therefore, the development of effector cells. As such, LNs are key to fighting invading pathogens and maintaining health. The choice of LN to study is dictated by accessibility and the desired model; the inguinal lymph node is well situated and easily supports studies of biologically relevant models of skin and genital mucosal infection.
The inguinal LN, like all LNs, has an extensive microvascular network supplying it with blood. In general, this microvascular network includes the main feed arteriole of the LN that subsequently branches and feeds high endothelial venules (HEVs). HEVs are specialized for facilitating the trafficking of immune cells into the LN during both homeostasis and infection. How HEVs regulate trafficking into the LN under both of these circumstances is an area of intense exploration. The LN feed arteriole, has direct upstream influence on the HEVs and is the main supply of nutrients and cell rich blood into the LN. Furthermore, changes in the feed arteriole are implicated in facilitating induction of adaptive immune response. The LN microvasculature has obvious importance in maintaining an optimal blood supply to the LN and regulating immune cell influx into the LN, which are crucial elements in proper LN function and subsequently immune response. 
The ability to study the LN microvasculature in vivo is key to elucidating how the immune system and the microvasculature interact and influence one another within the LN. Here, we present a method for in vivo imaging of the inguinal lymph node. We focus on imaging of the microvasculature of the LN, paying particular attention to methods that ensure the study of healthy vessels, the ability to maintain imaging of viable vessels over a number of hours, and quantification of vessel magnitude. Methods for perfusion of the microvasculature with vasoactive drugs as well as the potential to trace and quantify cellular traffic are also presented. 
Intravital microscopy of the inguinal LN allows direct evaluation of microvascular functionality and real-time interface of the direct interface between immune cells, the LN, and the microcirculation. This technique potential to be combined with many immunological techniques and fluorescent cell labelling as well as manipulated to study vasculature of other LNs.

A technique for performing intravital microscopy of the inguinal lymph node (LN) is outlined. Such technique allows for real-time, in vivo study of the lymph node microvasculature and structure both during homeostasis and infection. This technique can be adapted to cell trafficking studies and to other lymph node sites.

מיקרוסקופית Intravital של הצומת לימפה מפשעתי

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

הדמיה Intravital של קורנית עכבר באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופית

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

מיקרוסקופית Intravital של הטחול: ניתוח כמותי של ניידות טפיל ואת זרימת הדם

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign antigens from peripheral tissues to prime the adaptive immune response. Juxtaposed between innate and adaptive immune responses, the LN is an ideal site to study immune cell interactions1,2. Lymphocytes (T cells, B cells and NK cells), dendritic cells (DCs), and macrophages comprise the bulk of bone marrow-derived cellular elements of the LN. These cells are strategically positioned in the LN to allow efficient surveillance of self antigens and potential foreign antigens3-5. The process by which lymphocytes successfully encounter cognate antigens is a subject of intense investigation in recent years, and involves an integration of molecular contacts including antigen receptors, adhesion molecules, chemokines, and stromal structures such as the fibro-reticular network2,6-12. 
Prior to the development of high-resolution real-time fluorescent in vivo imaging, investigators relied on static imaging, which only offers answers regarding morphology, position, and architecture. While these questions are fundamental in our understanding of immune cell behavior, the limitations intrinsic with this technique does not permit analysis to decipher lymphocyte trafficking and environmental clues that affect dynamic cell behavior. Recently, the development of intravital two-photon laser scanning microscopy (2P-LSM) has allowed investigators to view the dynamic movements and interactions of individual cells within live LNs in situ12-16. In particular, we and others have applied this technique to image cellular behavior and interactions within the popliteal LN, where its compact, dense nature offers the advantage of multiplex data acquisition over a large tissue area with diverse tissue sub-structures11,17-18. It is important to note that this technique offers added benefits over explanted tissue imaging techniques, which require disruption of blood, lymph flow, and ultimately the cellular dynamics of the system. Additionally, explanted tissues have a very limited window of time in which the tissue remains viable for imaging after explant. With proper hydration and monitoring of the animal's environmental conditions, the imaging time can be significantly extended with this intravital technique. Here, we present a detailed method of preparing mouse popliteal LN for the purpose of performing intravital imaging.

Recent advances in 2-photon microscopy have enabled real-time in situ imaging of live tissues in animal models, thereby enhancing our ability to investigate cellular behavior in both physiologic and pathologic conditions. Here, we outline the preparations required to perform intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.

Intravital הדמיה של בלוטות לימפה popliteal עכבר

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

מיקרוסקופית Intravital הפסים תאורה נפתר מאוד של מרכזי ז&#39;רמינל

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

תזרים הידבקות Assay ללמוד יקוציט גיוס לבדית אדם סינוסי תנאי האנדותל של מתח שאר

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, neutrophils, T cell subsets, B cells, natural killer (NK) and NKT cells. Intravital microscopy of the liver for monitoring immune cell migration is particularly challenging due to the high requirements regarding sample preparation and fixation, optical resolution and long-term animal survival. Yet, the dynamics of inflammatory processes as well as cellular interaction studies could provide critical information to better understand the initiation, progression and regression of inflammatory liver disease. Therefore, a highly sensitive and reliable method was established to study migration and cell-cell-interactions of different immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hr) by intravital two-photon laser scanning microscopy (TPLSM) in combination with intensive care monitoring.
The method provided includes a gentle preparation and stable fixation of the liver with minimal perturbation of the organ; long term intravital imaging using multicolor multiphoton microscopy with virtually no photobleaching or phototoxic effects over a time period of up to 6 hr, allowing tracking of specific leukocyte subsets; and stable imaging conditions due to extensive monitoring of mouse vital parameters and stabilization of circulation, temperature and gas exchange.
To investigate lymphocyte migration upon liver inflammation CXCR6.gfp knock-in mice were subjected to intravital liver imaging under baseline conditions and after acute and chronic liver damage induced by intraperitoneal injection(s) of carbon tetrachloride (CCl4).
CXCR6 is a chemokine receptor expressed on lymphocytes, mainly on Natural Killer T (NKT)-, Natural Killer (NK)- and subsets of T lymphocytes such as CD4 T cells but also mucosal associated invariant (MAIT) T cells1. Following the migratory pattern and positioning of CXCR6.gfp+ immune cells allowed a detailed insight into their altered behavior upon liver injury and therefore their potential involvement in disease progression.

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

לטווח ארוך Intravital multiphoton מיקרוסקופית הדמיה של תאים חיסוני בבריאים וחולה כבד באמצעות עכברים CXCR6.Gfp Reporter

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are extremely high, no direct treatment or organ-related mechanism has been examined in detail in real time. The liver is the key organ that manages toxins and infections in the human body. Herein, we aimed to perform intravital imaging of mouse liver after induction of endotoxemia in order to track the motility of immune cells, such as neutrophils and liver capsular macrophages (LCMs). Accordingly, we designed a novel surgical method for exposure of the liver with minimally invasive surgery. Mice were intraperitoneally injected with lipopolysaccharide (LPS), a common endotoxin. Using our novel surgical approach for exposure and intravital imaging of the mouse liver, we found that neutrophil recruitment in LPS-treated LysM-green fluorescent protein (GFP) mouse liver was increased compared with that in phosphate-buffered saline-treated liver. After LPS treatment, the number of neutrophils increased significantly with time. Additionally, using CX3Cr1-GFP mice, we successfully visualized liver resident macrophages called LCMs. Therefore, to investigate the efficacy of new reagents to control immune mobility in vivo, determining the motility and morphology of neutrophils and LCMs in the liver may allow us to identify therapeutic effect in organ failure and tissue damage caused by leukocytes activation in sepsis.

We established a novel surgical protocol for two-photon imaging of live mice liver with minimal invasion. With this technique, we identified the detailed structure of the liver during lipopolysaccharide-induced endotoxemia. We anticipate that this method may be utilized to determine the effectiveness of various reagents treatment to hepatic leukocyte migration.

שני הפוטונים הדמיה Intravital של לויקוציטים במהלך התגובה החיסונית בכבד עכבר שטופלו ליפופוליסכריד

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. Two-photon intravital microscopy (2P-IVM) allows the observation of cell interactions in deep tissue in living animals, while minimizing the photobleaching generated during image acquisition. To date, different models for 2P-IVM of lymphoid and non-lymphoid organs have been described. However, imaging of respiratory organs remains a challenge due to the movement associated with the breathing cycle of the animal.
Here, we describe a protocol to visualize in vivo immune cell interactions in the trachea of mice infected with influenza virus using 2P-IVM. To this purpose, we developed a custom imaging platform, which included the surgical exposure and intubation of the trachea, followed by the acquisition of dynamic images of neutrophils and dendritic cells (DC) in the mucosal epithelium. Additionally, we detailed the steps needed to perform influenza intranasal infection and flow cytometric analysis of immune cells in the trachea. Finally, we analyzed neutrophil and DC motility as well as their interactions during the course of a movie. This protocol allows for the generation of stable and bright 4D images necessary for the assessment of cell-cell interactions in the trachea.

In this study, we present a protocol to perform two-photon intravital imaging and cell interaction analysis in the murine tracheal mucosa after infection with influenza virus. This protocol will be relevant for researchers studying immune cell dynamics during respiratory infections.

אינטראקציה תא הדמיה ב רירית והכו אותי במהלך זיהום בנגיף שפעת באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטונים Intravital

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...