ويتم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الكندية لأبحاث الصحة والمؤسسة الكندية للإبداع ، جامعة كولومبيا البريطانية مركز للبحوث وجامعة الدم قبل الميلاد الشمالية.

1. تحضير كاشف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي إعداد الكواشف لاستخدامها في كافة مراحل التجربة قبل البدء في بروتوكول الجراحية. علما بأن جميع الحلول باستخدام تقنية معقمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تحضير المحلول الملحي أفضل الفسيولوجية (PSS) في عنصرين هما : الأساسية محلول الملح والصوديوم بيكربونات الحل. يعد كل من الحلول في 20X تركيز وتخزين في 4 درجات مئوية. بيكربونات الصوديوم في 20X هو 360.0mM NaHCO 3 (84.01g/mol) والأساسية في محلول الملح هو تركيز 20X 2638.0mM كلوريد الصوديوم (58.44g/mol) ، 94.0mM بوكل (74.56g/mol) ، 40.0mM CaCl 2 • 2H 2 O (147.02g/mol) ، و23.4mM MgSO 4 • 7H 2 O (246.48g/mol). وينبغي إعداد الحلول في DH 2 O والمواد الكيميائية ينبغي أن تضاف في وقت واحد وأثارت الحل واضح حتى قبل إضافة المواد الكيميائية المقبل </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2L من إعداد جهاز الأمن الوقائي عن طريق تمييع كميات متساوية من بيكربونات الصوديوم والملح والحل الأساسي لتمييع تركيز 1X (لمدة 100ML تمييع 2L PSS من كل بيكربونات الصوديوم والملح في حل الأساسية درهم 2 O </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قارورة تحتوي على مكان الحجمي 2L جهاز الأمن الوقائي وجهاز الأمن الوقائي في حمام الماء 37 درجة مئوية. يوازن الحل مع 5 ٪ CO 2 / توازن غاز النيتروجين ل1hr قبل بدء العملية الجراحية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتعد أفضل المواد الكيميائية فعال في الأوعية (مثل فينيليفرين ، أستيل كولين ، نتروبروسيد الصوديوم) بتركيز 1M في dH2O وتخزينها في 100μl aliquots في -20 درجة مئوية. </li></ol> 2. تحضير الحيوانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد وزن الماوس وإدارة الجرعة الأولى من الصوديوم في بنتوباربيتال 90mg/kg عن طريق الحقن داخل الصفاق. في جميع أنحاء الإجراء هو مراقبة باستمرار الماوس للطائرة عن طريق التخدير قرصة أخمص قدميها ، ودراسة متأنية من معدل التنفس. وينبغي أن تدار من الصوديوم الحقن إضافية حسب الحاجة في بنتوباربيتال 20mg/kg للحفاظ على الطائرة التخدير. الحفاظ على الطائرة الجراحية للتخدير وفقا للوائح الفيدرالية والمؤسسية على النحو المبين في بروتوكول الرعاية الحيوانية التي وافقت عليها لجنة رعاية الحيوان والاستخدام (لاعب) من جامعة ق الشمالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الشعر من منطقة البطن والخاصرة / الورك بواسطة ماكينة حلاقة. إزالة الشعر المتبقي فضفاضة بمسحة الكحول والتربيت المنطقة مع الشريط. هذا يكفي لأن هذا الإجراء هو محطة تجريبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الماوس على متن الجراحية واضحة في موقف ضعيف وإرفاق الماوس إلى المجلس عن طريق تسجيل كل قاطع الطريق إلى المجلس. يتم الاحتفاظ درجة حرارة الجسم عن طريق مصباح الحرارة الخارجية ورصدها عبر الحرارة المستقيم لضمان أن لا يحدث انخفاض حرارة الجسم نتيجة للمخدر. </li></ol> 3. الإجراءات الجراحية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أثناء إجراء العمليات الجراحية لضمان كامل يتم الاحتفاظ دائما تتعرض الأنسجة superfused معايرتها مع حل PSS تحسنت. فمن المهم أيضا أن أبدا اجراء اتصالات مع الأوعية الدموية في المصالح مع الأدوات الجراحية أو تجرح السفن عن طريق وضع لإجبار الكثير منهم عن طريق التلاعب في الأنسجة الدهنية والأنسجة الضامة من حولهم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الماوس ضمن نطاق تشريح. جعل شق خط الوسط على طول السطح البطني من تجويف البطن وسحب الجلد نحو العمود الفقري الماوس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حالما يتم سحب الجلد بحيث LN مرئيا بسهولة ، دبوس الجلد على قاعدة التمثال من Sylgard شفافة 184. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طبقة رقيقة من النسيج الضام تتراكب محيط LN </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مسح تتراكب الأنسجة الدهنية وتحيط العقدة الليمفاوية حتى ما يتعرض له سرير الاوعية الدموية الدقيقة. الجزء الرئيسي الشرياني يضع المتاخمة للLN وoverlayed عادة من الوريد. الجراحة كامل يستغرق حوالي 30 دقيقة. </li></ol> 4. التصوير والتحليل سفينة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة يتعرض الجزء السفينة الفائدة في ظل نطاق تشريح ، وتأمين إعداد intravital على المجهر. علما أن الحيوان لا يزال على متن الجراحية واضحة في حين ان على intravital المجهر طوال فترة التجربة. المحافظة على درجة حرارة الجسم عن طريق مصباح الحرارة وقياس الحرارة عن طريق المستقيم كما هو موضح في القسم الجراحي. كما يتم رصد الطائرة التخدير في كافة مراحل التجربة كما هو موضح في القسم 2.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد superfusion وخطوط الامتصاص. Superfusion من PSS يحدث من قبل إطعام الجاذبية من خزان ، في خزان المياه الساخنة سترة (سترة هو تعميم الماء ويسخن قبل تعميم بالحمام المائي) يجري perfused النيتروجين بنسبة 5 ٪ CO 2 متوازنة ، وأسفل خط بالتنقيط بمعدل 10ML / دقيقة. وينبغي أن تستخدم خط الشفط على مواصلة سحب PSS superfused بعيدا عن الإعداد. علما أنه قبل هذه التجربة هي تنظيفها خطوط شفط مياه وسترة وتخزينها بعد كل تجربة. هذا يضمن العقم قبل التجربة المقبلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فحص درجة حرارة PSS superfusing. ضبط درجة حرارةتعميم حمام ماء و / أو معدل superfusion PSS لتحقيق درجة حرارة 37 درجة مئوية ~ عبر التحضير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمح الأوعية الدموية لكي تتوازن مع PSS على الأقل 60 دقيقة ، وقياس قطره سفينة باستخدام الفرجار الفيديو. عادة ، ينبغي تحديد قطرها السفينة في نقاط متعددة (على سبيل المثال ، في 40 و 50 ، و 60 دقيقة) لضمان السفينة قد استقرت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقييم الحالة الصحية للسفينة باستخدام ناهض العضلات الملساء محددة (مثل فينيليفرين ، PE) ، وناهض بطانة معينة (مثلا : الأستيل كولين ، ACH). وينبغي تعديل تركيز ناهض اعتمادا على ناهض ، ولكن لمنظمة العمل ضد الجوع PE ويجب أن يتم تقييم هذه السفينة على كل تركيز بإضافة التراكمي (10 - 5M ل9M - 10) لsuperfusate. يجب فصل كل تطبيق من قبل ناهض مرحلة غسل (عادة 30 دقيقة) باستخدام جهاز الأمن الوقائي حتى يعود إلى سفينة القطر يستريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن إجراء التقييم التالي للصحة السفينة ، والمخدرات فعال في الأوعية اللاحقة ، ووضع العلامات الفلورسنت ، وخلية تتبع التجارب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد نهاية التجربة يتم إعطاء الحيوان جرعة زائدة من الصوديوم بنتوباربيتال. ثم يتم رصد هذا الحيوان لضمان عدم وجود استجابة لقرصة أخمص قدميها ، وعدم وجود حركة التنفس أو خفقان القلب. في مثل هذا الوقت ويتبع ذلك عن طريق خلع عنق الرحم. </li></ol> 5. ممثل النتائج : بعد فترة إعداد موازنة ينبغي أن تسفر عن صورة واضحة تسمح لتحديد شرين على حد سواء والتي تزود الوريد العقدة الليمفاوية الأربية. يجب أن يكون هناك خلايا الدهنية المحيطة الحد الأدنى للسماح للسفن جدران الوريد شرين والتي يتعين مراعاتها بوضوح للالفرجار الفيديو لتكون لها الغلبة على حساب قطر السفينة. نقطة لا يتجزأ من الإعداد الناجح هو شرين ديها امدادات الدم الغني تتحرك من خلال تجويف وأن هناك درجة كبيرة من نغمة الأوعية الدموية (أي شرين لديه القدرة على vasoconstrict vasodilate لضمان سلاسة والعضلات ومنبهات محددة البطانية على التوالي) . <img src="/files/ftp_upload/2551/2551fig1.jpg" alt="الشكل 1"/> الشكل 1. Intravital صورة مجهرية من العقدة الليمفاوية الأربية شرين تغذية (السهم الأحمر) التغذية المتوازنة العقدة الليمفاوية مع محلول ملحي الفسيولوجية ويعمل جنبا الى جنب مع الوريد الرئيسي (السهم الأخضر). <img src="/files/ftp_upload/2551/2551fig2.jpg" alt="الشكل 2"/> الشكل 2. الاستجابة فعال في الأوعية عادي إلى فينيليفرين superfused (PE) بإضافة التراكمية إلى المالحة من تركيزات الفسيولوجية 10 -9 م الى 10 م -5 وجود قوي يوحي تضيق الأوعية العادية وظيفة العضلات الملساء الموجودة في شرين. <img src="/files/ftp_upload/2551/2551fig3.jpg" alt="الشكل 3"/> الشكل 3. استجابة فعال في الأوعية عادي إلى أستيل superfused (ACH) بإضافة التراكمية إلى المالحة من تركيزات الفسيولوجية 10 -9 م الى 10 م -5 وجود قوي يوحي توسع الأوعية العادية الحالية وظيفة بطانة الأوعية الدموية في شرين.

<ol>
	<li>Bearden, S. E., Payne, G. W., Chisty, A., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arteriolar+network+architecture+and+vasomotor+function+with+ageing+in+mouse+gluteus+maximus+muscle.">Arteriolar network architecture and vasomotor function with ageing in mouse gluteus maximus muscle.</a> J Physiol. 561, 535-545 (2004).</li><li>Looft-Wilson, R. C., Payne, G. W., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+expression+and+conducted+vasodilation+along+arteriolar+endothelium+in+mouse+skeletal+muscle.">Connexin expression and conducted vasodilation along arteriolar endothelium in mouse skeletal muscle.</a> J Appl Physiol. 97, 1152-1158 (2004).</li><li>Payne, G. W., Madri, J. A., Sessa, W. C., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histamine+inhibits+conducted+vasodilation+through+endothelium-derived+NO+production+in+arterioles+of+mouse+skeletal+muscle.">Histamine inhibits conducted vasodilation through endothelium-derived NO production in arterioles of mouse skeletal muscle.</a> Faseb J. 18, 280-286 (2004).</li><li>Smeda, J. S., Payne, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+autoregulatory+and+myogenic+function+in+the+cerebrovasculature+of+Dahl+salt-sensitive+rats.">Alterations in autoregulatory and myogenic function in the cerebrovasculature of Dahl salt-sensitive rats.</a> Stroke. 34, 1484-1490 (2003).</li><li>de With, M. C., de Vries, A. M., Kroese, A. B., van der Heijden, E. P., Bleys, R. L., Segal, S. S., Kon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+anatomy+of+the+hamster+retractor+muscle+with+regard+to+its+microvascular+transfer.">Vascular anatomy of the hamster retractor muscle with regard to its microvascular transfer.</a> Eur Surg Res. 42, 97-105 (2009).</li><li>Domeier, T. L., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electromechanical+and+pharmacomechanical+signalling+pathways+for+conducted+vasodilatation+along+endothelium+of+hamster+feed+arteries.">Electromechanical and pharmacomechanical signalling pathways for conducted vasodilatation along endothelium of hamster feed arteries.</a> J Physiol. 579, 175-186 (2007).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المجهري Intravital من العقدة الليمفاوية الأربية المعروضة هنا يوفر القدرة على microvasculature صورة العقدة الليمفاوية في الجسم الحي ،. وهكذا ، فإنه وسيلة لتسهيل المراقبة المباشرة في الوقت الحقيقي. التصوير من microvasculature LN هو موقع الفريد الذي يسمح احد لدراسة العلاقة بين الاستجابة المناعية والأوعية الدموية و. باستخدام هذا الإعداد ، يمكن توجيه التركيز بشكل خاص على الاستجابة المناعية ، وتعديلات في الأوعية الدموية ، أو على التفاعل بين البلدين. كما هو الحال مع جميع الأساليب التجريبية ، المجهري intravital القياسية على حد سواء مزايا وقيود. ويمكن بسهولة IVM القياسية ، مثل إعداد وصفها هنا ، يمكن تعديلها ، وثبت في السابق من قبل المؤلفين للسماح المجهري epifluorescent عبر إدخال التتبع الأصباغ الفلورية أو السكان الخلية المسمى. على الرغم من أن معيار IVM لا يعطي إمكانية التصوير ثلاثة الابعاد والتعقب مثل ستعطى من قبل اثنين من الفوتون المجهري أو تصوير الأوعية ، ويتحقق ما زالت تتبع خلية في بعدين السماح الخلية الى خلية والخلية إلى أن الأوعية الدموية التفاعل ولاحظ وكميا ، وبالتعاون مع الإدارة في الجسم الحي ، وتلطيخ لاحقة مع الأضداد الفلورسنت يمكن استخدامها لتقديم بيانات عن البروتين / علامة التعبير في الوقت الحقيقي. خصوصا ، وتقنيات التصوير تتطلب بيئة بديلة للصور الثابتة ؛ لقط من منطقة العمليات الجراحية أو إضافة ساترة على إعداد شقة مطلوب بشكل متكرر. هذه الحدود ، إذا لم يحل ، والقدرة على يروي بنشاط وسطاء أو غيرها من الأوعية الدموية أكثر من إعداد لتقييم سلامة الأوعية الدموية وعلم وظائف الأعضاء أو غيرها في استخدام تقنيات أخرى مثل التجارب التي أجريت في إطار توسع الأوعية إعداد IVM. وعلاوة على ذلك ، ومعيار IVM لا تتطلب إعداد مسطح تماما والتي لا تتأثر الحركة ، مثل تلك التي تم إنشاؤها بواسطة التنفس من الحيوان. وهذا يسمح لاستخدامها IVM قياسية في مناطق أكثر الجراحية مع زيادة تكرارية. ويتجلى ذلك من خلال إعداد العقدة الليمفاوية الأربية الموصوفة هنا. نظرا لحجم وشكل العقدة الليمفاوية ، لا يمكن أن يتم إعداد شقة دون إصابة الأنسجة وموقع العقدة يثير الاقتراح كبيرة بسبب تنفس الحيوانات. ومثل هذه القضايا يكون من الصعب التغلب عليها عن طريق أساليب أخرى ، ولكن يتم التعامل بسهولة مع استخدام إعداد IVM القياسية وصفها. باختصار ، يمكن الجمع بين إعداد المفصلة أعلاه مع أي عدد آخر من الكيمياء الحيوية ، والأوعية الدموية ، و / أو التقنيات المناعية مثل نقل أو مجموعات فرعية من تنشيط الخلايا المسمى ، تحريض نقص الأكسجين ، والإفراط في التعبير عن نفاد الوسطاء الأوعية الدموية. ومع ذلك ، تطبيقات إضافية تعتمد على الحالة الصحية للإعداد الأولي. لذا ، فمن الضروري دائما لاختبار صحة الأوعية الدموية التي يجري تصويرها وتقييمها. النقاط الرئيسية لتحقيق الصحة وإعداد ضمان perfused باستمرار مع إعداد PSS معايرتها في درجة حرارة الجسم والتقليل من الاتصال والتوتر وضعت على منطقة العمليات الجراحية أثناء الجراحة.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف </th><th> شركة </th></tr><tr><td> بيكربونات الصوديوم </td><td> سيغما الدريتش </td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم </td><td> سيغما الدريتش </td></tr><tr><td> كلوريد البوتاسيوم </td><td> سيغما الدريتش </td></tr><tr><td> كلوريد الكالسيوم ثنائي الهيدرات </td><td> سيغما الدريتش </td></tr><tr><td> نتروبروسيد الصوديوم </td><td> سيغما الدريتش </td></tr><tr><td> فينيليفرين </td><td> سيغما الدريتش </td></tr><tr><td> أستيل </td><td> سيغما الدريتش </td></tr><tr><td> كلوريد المغنيسيوم heptahydrate </td><td> سيغما الدريتش </td></tr><tr><td> Pentobarbitol الصوديوم </td><td></td></tr></tbody></table>

intravital microscopy of the inguinal lymph node

الغدد الليمفاوية (LN) ، وتقع في جميع أنحاء الجسم ، هي جزء لا يتجزأ من الجهاز المناعي. انهم بمثابة موقع لتحريض الاستجابة المناعية التكيفية ، وبالتالي ، وتطوير الخلايا المستجيب. على هذا النحو ، LNS هي المفتاح لمحاربة الجراثيم الغازية والحفاظ على الصحة. وأملت اختيار LN للدراسة والوصول النموذج المطلوب ، ويقع كذلك في العقدة الليمفاوية الأربية ، وتدعم دراسات بسهولة من النماذج ذات الصلة بيولوجيا من الجلد والالتهابات المخاطية التناسلية. وLN الأربية ، شأنها شأن جميع LNS ، لديه شبكة واسعة الاوعية الدموية الدقيقة إمداده بالدم. بشكل عام ، وهذا يشمل شبكة الاوعية الدموية الدقيقة شرين الوجبة الرئيسية للLN أن فروع في وقت لاحق والأعلاف الوريدات البطانية عالية (HEVs). HEVs متخصصة لتسهيل الاتجار الخلايا المناعية في LN خلال التوازن على حد سواء والعدوى. كيف HEVs تنظيم الاتجار في LN تحت كل هذه الظروف هو مجال التنقيب المكثفة. تغذية LN شرين ، لها تأثير مباشر على المنبع وHEVs هو الإمداد الرئيسي للمواد الغذائية والدم الغني الخلية في LN. وعلاوة على ذلك ، فإن التغييرات في تورط شرين الأعلاف في تسهيل تحريض الاستجابة المناعية التكيفية. وmicrovasculature LN له أهمية واضحة في الحفاظ على تدفق الدم إلى LN الأمثل وتنظيم تدفق الخلايا المناعية في LN ، والتي هي عناصر حاسمة في وظيفة LN السليم والاستجابة المناعية لاحقا. القدرة على دراسة microvasculature LN في الجسم الحي هو المفتاح لتوضيح كيف يمكن لنظام المناعة وmicrovasculature تتفاعل وتؤثر على بعضها البعض داخل LN. هنا ، نقدم طريقة لتصوير في الجسم الحي من العقدة الليمفاوية الأربية. ونحن نركز على التصوير من microvasculature من LN ، مع إيلاء اهتمام خاص للطرق التي تضمن دراسة السفن صحية ، والقدرة على الحفاظ على التصوير من السفن قادرة على البقاء على مدى عدة ساعات ، والكمي لحجم السفينة. وتعرض أيضا أساليب لنضح من microvasculature بالأدوية فعال في الأوعية وكذلك القدرة على تتبع وقياس حركة المرور الخلوية. Intravital المجهري للLN الأربية يسمح بتقييم وظائف الاوعية الدموية الدقيقة مباشرة في الوقت الحقيقي واجهة من واجهة مباشرة بين الخلايا المناعية ، LN ، ودوران الأوعية الدقيقة لل. هذه التقنية القدرة على أن تكون جنبا إلى جنب مع العديد من التقنيات المناعية والخلايا نيون وضع العلامات وكذلك التلاعب بها كما لدراسة الأوعية الدموية من LNS الأخرى.

Watch this Scientific Journal Video about Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node at JoVE.com

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

ويرد تقنية لأداء المجهري intravital من العقدة الليمفاوية الأربية (LN). هذه التقنية تسمح في الوقت الحقيقي ،<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; دراسة العقدة الليمفاوية microvasculature والهيكل على حد سواء خلال التوازن والعدوى. ويمكن تكييف هذه التقنية لدراسات الاتجار الخلية وغيرها من المواقع العقدة الليمفاوية.

Intravital الميكروسكوب من العقدة الليمفاوية الأربي

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

intravital-microscopy-of-the-inguinal-lymph-node

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

19.9K Views.  University of Northern British Columbia. ويرد تقنية لأداء المجهري intravital من العقدة الليمفاوية الأربية (LN). هذه التقنية تسمح في الوقت الحقيقي ، في الجسم الحي دراسة العقدة الليمفاوية microvasculature والهيكل على حد سواء خلال التوازن والعدوى. ويمكن تكييف هذه التقنية لدراسات الاتجار الخلية وغيرها من الموا?...

Video: Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration of T cells into lymph nodes is a complex process which involves both cellular and chemical factors including chemokines. Recently, the use of two-photon microscopy has permitted to track T cells in intact lymph nodes and to derive some quantitative information on their behavior and their interactions with other cells. While there are obvious advantages to an in vivo system, this approach requires a complex and expensive instrumentation and provides limited access to the tissue. To analyze the behavior of T cells within murine lymph nodes, we have developed a slice assay 
1, originally set up by neurobiologists and transposed recently to murine thymus 2. In this technique, fluorescently labeled T cells are plated on top of an acutely prepared lymph node slice. In this video-article, the localization and migration of T cells into the tissue are analyzed in real-time with a widefield and a confocal microscope. The technique which complements in vivo two-photon microscopy offers an effective approach to image T cells in their natural environment and to elucidate mechanisms underlying T cell migration.

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

This protocol describes a method to image fluorescent T cells introduced into lymph node slices. The technique permits real-time analyses of T cell migration with traditional widefield fluorescence or confocal microscopes.

التصوير خارج الحي من خلايا تي في الفئران شرائح العقدة الليمفاوية مع Widefield ومجاهر متحد البؤر

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration ...

Murine Superficial Lymph Node Surgery

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often followed over time. Similarly, the study of lymphocyte homeostasis requires time course experiments. Performing these studies within the same mouse is ideal to reduce the experimental variability as well as the number of mice used. Blood withdrawal allows performance of time course experiments, but it only gives information about circulating lymphocytes and provides a limited number of cells1-4. Since lymphocytes circulating through the body and residing in the lymph nodes have different properties, it is important to examine both locations. The sequential removal of lymph nodes by surgery provides a unique opportunity to follow an immune response or immune cell expansion in the same mouse over time. Furthermore, this technique yields between 1-2x106 cells per lymph node which is sufficient to perform phenotypic characterization and/or functional assays. Sequential lymph node surgery or lymphadenectomy has been successfully used by us and others5-11. Here, we describe how the brachial and inguinal lymph nodes can be removed by making a small incision in the skin of an anesthetised mouse. Since the surgery is superficial and done rapidly, the mouse recovers very quickly, heals well and does not experience excessive pain. Every second day, it is possible to harvest one or two lymph nodes allowing for time course experiments. This technique is thus suitable to study the characteristics of lymph node-residing lymphocytes over time. This approach is suitable to various experimental designs and we believe that many laboratories would benefit from performing sequential lymph node surgeries.

To follow the progression of an immune response over time within the same mouse, lymph nodes can be sequentially removed by surgery. Here, we describe how this technique can be performed.

الفئران عقدة اللمفاوية السطحية جراحة

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

Intravital تصوير الغدة الصعترية باستخدام الماوس 2 فوتون الميكروسكوب

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

Intravital الميكروسكوب في الطحال : التحليل الكمي للتنقل الطفيلي وتدفق الدم

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign antigens from peripheral tissues to prime the adaptive immune response. Juxtaposed between innate and adaptive immune responses, the LN is an ideal site to study immune cell interactions1,2. Lymphocytes (T cells, B cells and NK cells), dendritic cells (DCs), and macrophages comprise the bulk of bone marrow-derived cellular elements of the LN. These cells are strategically positioned in the LN to allow efficient surveillance of self antigens and potential foreign antigens3-5. The process by which lymphocytes successfully encounter cognate antigens is a subject of intense investigation in recent years, and involves an integration of molecular contacts including antigen receptors, adhesion molecules, chemokines, and stromal structures such as the fibro-reticular network2,6-12. 
Prior to the development of high-resolution real-time fluorescent in vivo imaging, investigators relied on static imaging, which only offers answers regarding morphology, position, and architecture. While these questions are fundamental in our understanding of immune cell behavior, the limitations intrinsic with this technique does not permit analysis to decipher lymphocyte trafficking and environmental clues that affect dynamic cell behavior. Recently, the development of intravital two-photon laser scanning microscopy (2P-LSM) has allowed investigators to view the dynamic movements and interactions of individual cells within live LNs in situ12-16. In particular, we and others have applied this technique to image cellular behavior and interactions within the popliteal LN, where its compact, dense nature offers the advantage of multiplex data acquisition over a large tissue area with diverse tissue sub-structures11,17-18. It is important to note that this technique offers added benefits over explanted tissue imaging techniques, which require disruption of blood, lymph flow, and ultimately the cellular dynamics of the system. Additionally, explanted tissues have a very limited window of time in which the tissue remains viable for imaging after explant. With proper hydration and monitoring of the animal's environmental conditions, the imaging time can be significantly extended with this intravital technique. Here, we present a detailed method of preparing mouse popliteal LN for the purpose of performing intravital imaging.

Recent advances in 2-photon microscopy have enabled real-time in situ imaging of live tissues in animal models, thereby enhancing our ability to investigate cellular behavior in both physiologic and pathologic conditions. Here, we outline the preparations required to perform intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.

Intravital التصوير من العقدة اللمفية الفأر المأبضية

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the mechanisms governing its formation. Lymph nodes are always encapsulated in adipose tissue and we recently demonstrated the importance of this relation for the formation of lymph node stroma. Adipocyte precursor cells migrate into the lymph node during its development and upon engagement of the Lymphotoxin-b receptor switch off adipogenesis and differentiate into lymphoid stromal cells (B&#233;n&#233;zech&#160;et al.14). Based on the lymphoid stroma potential of adipose tissue, we present a method using a lymph node/fat pad chimera that allows the lineage tracing of lymph node stromal cell precursors. We show how to isolate newborn lymph nodes and EYFP+ embryonic adipose tissue and make a LN/ EYFP+ fat pad chimera. After transfer under the kidney capsule of a host mouse, the lymph node incorporates local adipose tissue precursor cells and finishes its formation. Progeny analysis of EYFP+ fat pad cells in the resulting lymph nodes can be performed by flow-cytometric analysis of enzymatically digested lymph nodes or by immunofluorescence analysis of lymph nodes cryosections. By using fat pads from different knockout mouse models, this method will provide an efficient way of analyzing the origin of the different lymph node stromal cell populations.

Generation of lymph node/fat pad chimeras for the study of lymph node stromal cell origin is described. The method involves the isolation of lymph nodes from newborn mice and embryonic fat pads, the generation of chimeric lymph node-fat pads, and their transfer under the kidney capsule of a host mouse.

جيل من العقدة الليمفاوية الدسم سادة الوهم لدراسة العقدة الليمفاوية اللحمية خلية المنشأ

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

حل غاية intravital المجهري مخطط في الإضاءة مراكز جرمينال

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host. 
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

عزل خلايا الفئران العقدة الليمفاوية اللحمية

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various biological events in real time and in live animals. This technology has greatly advanced our understanding of physiological processes and pathogen-mediated phenomena in specific organs.
In this study, IVM is applied to the mouse liver and protocols are designed to image in vivo the circulatory system of the liver and measure red blood cell (RBC) velocity in individual hepatic vessels. To visualize the different vessel subtypes that characterize the hepatic organ and perform blood flow speed measurements, C57Bl/6 mice are intravenously injected with a fluorescent plasma reagent that labels the liver-associated vasculature. IVM enables in vivo, real time, measurement of RBC velocity in a specific vessel of interest. Establishing this methodology will make it possible to investigate liver hemodynamics under physiological and pathological conditions. Ultimately, this imaging-based methodology will be important for studying the influence of L. donovani infection&#160;on hepatic hemodynamics.
This method can be applied to other infectious models and mouse organs and might be further extended to pre-clinical testing of a drug&#8217;s effect on inflammation by quantifying its effect on blood flow.

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.

حيوي داخلي المجهري التصوير الكبد التالية<em&gt; الليشمانيا</em&gt; العدوى: تقييم كبدي ديناميكا الدم

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and E. coli, and are useful for the study of pathogenesis and/or spread of the bacteria in natural hosts. With the key function of lymph nodes in the host immune response, lymph node tissues serve as a potential source of RNA for downstream transcriptomic analyses, in order to assess the temporal changes in gene expression in cells over the course of an infection. This article presents an overview of the process of lymph node collection, tissue sampling, and downstream RNA processing in livestock, using cattle (Bos taurus) as a model, with additional examples provided from the American bison (Bison bison). The protocol includes information about the location, identification, and removal of lymph nodes from multiple key sites in the body. Additionally, a biopsy sampling methodology is presented that allows for a consistency of sampling across multiple animals. Several considerations for sample preservation are discussed, including the generation of RNA suitable for downstream methodologies like RNA-sequencing and RT-PCR. Due to the long delays inherent in large animal vs. mouse time course studies, representative results from bison and bovine lymph node tissues are presented to describe the time course of the degradation in this tissue type, in the context of a review of previous methodological work on RNA degradation in other tissues. Overall, this protocol will be useful to both veterinary researchers beginning transcriptome projects on large animal samples and to molecular biologists interested in learning techniques for in vivo tissue sampling and in vitro processing.

This protocol provides an overview of procedures for the isolation of RNA for the transcriptomic profiling of lymph node tissues from large animals, including steps in the identification and excision of lymph nodes from livestock and wildlife, sampling approaches to provide consistency across multiple animals, and considerations plus representative results for the post-collection preservation and processing for RNA analysis.

جمع وتجهيز العقد الليمفاوية من الحيوانات الكبيرة لتحليل الحمض النووي الريبي: التحضير للدراسات ترانسكريبتوميك العقدة الليمفاوية للأنواع الحيوانية الكبيرة

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...