هذا البروتوكول هو مناسبة لدراسة الفوعة الليشماني، لأنه يوفر نظرة نظامية للمضيف الفقارية للعدوى الجلدية. الميزة الرئيسية لاعتماد هذا البروتوكول هو أنه يسمح للباحثين لتقييم الاستجابة الالتهابية المضيفة وتكرار الطفيليات في وقت واحد. يمكن استخدام هذه الطريقة لتميز العديد من الأهداف والعلاجات المتعلقة بالوعاء ، والتي يمكن أن تجلب رؤى جديدة في التحكم بالليشمانيات الجلدية.
ويمكن أيضا أن تطبق على سلالات الفئران الأخرى وأنواع الليشمانيات التي تسبب داء الليشمانيات الجلدية. هذه الاحتياج لها بعض الخطوات الحاسمة، مثل طلب موظفين مدربين الذين يشعرون بالراحة في العمل مع الفئران ولديهم خبرة في إجراء الحقن دون الزرع لتجنب التعرض العرضي للمواد المعدية. و سيكون من خلال هذا الإجراء الدكتور ريكاردو زامبيري، وهو فني من مختبري.
ابدأ بزراعة شكل L.amazonensis في قارورة زراعة الخلايا التي تبلغ مساحتها 25 سنتيمترًا مربعًا ، والتي تحتوي على 10 ملليلترات من الموالية للوسط ، لمدة ثلاثة أيام عند 25 درجة مئوية. بعد الحضانة، ماصة خمسة ملليلتر من ثقافة مرحلة نمو اللوغاريتم في قارورة جديدة. إضافة خمسة ملليلترات من ama المتوسطة إلى القارورة، واحتضانها في 34 درجة مئوية لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام.
تقسيم الثقافة عن طريق تمييعها بنسبة واحد إلى ثلاثة مع ama-medium الطازجة في قارورة جديدة. ثم احتضانه لمدة ثلاثة إلى خمسة أيام أخرى. نقل aliquot من تعليق amastigotes أكسين المخفف في برنامج تلفزيوني إلى غرفة Neubauer والعد الطفيليات غير flagellated.
ثم، تمييع التعليق في برنامج تلفزيوني وفقا لجرعة inoculum المطلوب وعدد من inoculums المقصود. تحميل حقنة الدرملولين مع إبرة قياس 27 مع تعليق الطفيليات المعدة. تأكد من تخدير الماوس بالكامل مع قرصة إصبع القدم وتطعيم 50 ميكرولترات من التعليق في الأنسجة subplantar على القدم اليسرى الخلفية.
تسجيل تطور الآفة مرة واحدة في الأسبوع ، عن طريق قياس سمك لوحات القدم المصابة وغير المصابة باستخدام الفرجار ، وحساب الفرق في سمك بين اثنين من footpads لتقييم تطور الآفة. إضافة ملليلتر واحد من الموالية المتوسطة في أنبوب طاحونة الأنسجة الزجاجية لكل آفة ووزنها الأنبوب. رش 70٪ الإيثانول على مهبط القدمين لتطهير ومزكات قدم الحيوان في كعب لاستخراج مهبط القدم المصاب.
تأكد من أن المقص والملقط يتم تعقيمها عن طريق إبقائها غارقة في 70٪ الإيثانول. ضع لوحة القدم في طبق بيتري معقمة وتشريحه مع ملقط ومشرط. جمع جميع الأنسجة الرخوة والتخلص من العظام.
نقل الأنسجة التي تم جمعها إلى أنبوب طاحونة الأنسجة الزجاجية وتزن الأنبوب مرة أخرى لتحديد وزن الآفة. التجانس الأنسجة 10 مرات مع طاحونة لاضطراب الأنسجة كاملة، والسماح للخليط لتسوية. جمع 20 ميكرولترات من المُتطَع وتحميله في العمود الأول والممر الأول من لوحة البئر 96، المعدة وفقاً لاتجاهات المخطوطة.
كرر هذه الخطوة للممرات الثلاثة التالية للحصول على نتائج رباعية لكل. التجانس كل بئر 10 مرات باستخدام ماصة متعددة القنوات، ونقل 20 ميكرولترات من العينة المخففة من الأول إلى العمود الثاني. استمر في التخفيف التسلسلي حتى يتم الوصول إلى العمود الأخير، وتجاهل الـ 20 ميكرولترات النهائية للعينة المخففة.
ختم لوحة مع فيلم، واحتضانه في 25 درجة مئوية لمدة سبعة أيام في غرفة رطبة. بعد الحضانة ، قم بتحليل اللوحة تحت مجهر مقلوب لتحديد آخر بئر تحتوي على الطفيليات لكل حارة. توجد طفيليات الليشمانيات البروتوزوانية في شكلين من أشكال النمو خلال دورة حياتها في اللافقاريات والمصابيح الفقارية: التشكلات واللياتون.
يمكن أن تحاكي ظروف Axenic بيئات مضيفة مختلفة في المختبر ، والحفاظ على مورفولوجيا الطفيليات وقابليتها للحياة. ظروف أكسينيك لmastigotes تحاكي البيئة الحمضية وزيادة درجة الحرارة من المضيفين الفقاريات. سوف يفرق الوزيمات إلى amastigotes في ظل هذه الظروف.
عندما يتم نقلها إلى درجة حِسّ محايدة ومحتضنة عند درجة حرارة 25 درجة مئوية، تتحول amastigotes الفأس مرة أخرى إلى شكل. ولوحظ الفرق الفوعة من النوع البرية وليشمانيا الحديد المنظم 1 سلالات بالضربة القاضية على الحفش الماوس المصابة. ينظم LIR1 مستويات الحديد داخل الخلايا في الليشمانيا، ويتوسط في تصدير الحديد ويمنع تراكمه داخل الخلايا إلى مستويات سامة.
كشف فحص العدوى الذي يتضمن الفرق في تطور التورم وآفة أن LIR1 ضروري لL.amazonensis في الفوعة الجسم الحي. تم تحديد الحمل الطفيلي من خلال إجراء اختبار التخفيف الحد من الآفات المصابة. تحتوي آفات الفئران المصابة بالضربة القاضية LIR1 على 10 إلى ستة طفيليات أقل من تلك التي من النوع البري ليشمانيا الفئران المصابة ، مما يكشف عن أن غياب LIR1 يمنع تكرار الخلايا من amastigotes.
واحدة من أهم الأشياء التي يجب تذكرها عند تنفيذ هذا الإجراء هو استخدام ثقافات الليشمانيات التي تم تمريرها في المختبر أقل من عشر مرات لتجنب فقدان فوعة الطفيلي. بالإضافة إلى هذا الإجراء، يمكنك استخدام مقايسات العدوى في المختبر. ومع ذلك ، هذه طريقة محدودة ، لأنها لا توفر نظرة عامة فسيولوجية نظامية للتفاعل بين الطفيليات المضيفة.
هذا في طريقة vivo هو أفضل نهج لتقييم الاستجابات النظامية لداء الليشمانيات الجلدي، مثل القياس الكمي المؤشرات الحيوية المصل في الأنسجة المضيفة المستردة لمزيد من الدراسات المناعية.
