We would like to thank Dr. David Olivieri for critical review of this manuscript, Dr. Nuno Moreno for the logistic help to build our animal holder and heating pads and Dr. Vijay K. Kuchroo for the kind donation of Foxp3-KIgfp/gfp mice. This work is supported by "Funda&ccedil;&atilde;o para Ci&ecirc;ncia e Tecnologia" (FCT, Portugal), grant # PTDC/EBB-BIO/115514/2009.

1. إعداد الحيوان أجريت الايقاف الخلية BM وزرع الغدة الصعترية في ظروف معقمة : ملاحظات مهمة. أعدت تعليق BM داخل الخلية شفاطات لدينا غرفة والثقافة ، في حين تم إجراء عمليات زرع الغدة الصعترية في غرفة العمليات الجراحية التي تقع داخل منشأة الحيوانية لدينا. وكانت من اجل الحفاظ على هذه الشروط وضمان العقيم ، لم يسمح لنا لتسجيل الفيديو لدينا في هذه الأماكن. ومع ذلك ، تم تعقيمها جميع المواد الجراحية وتنظيفها مسبقا على مقاعد البدلاء مع Virkon الجراحية (صيدلي مختبرات بحوث شركة) والايثانول 70 ٪. وقد وافق جميع الإجراءات المتبعة في رعاية الحيوان واستخدام جنة المؤسسية (IACUC) وكانوا في اتفاق مع الاتحاد لحيوانات المختبر الأوروبي للجمعيات العلوم (FELASA) التوجيهات. رقم معرف غير موافقة AO10/2010. كانت كل التجارب صورة الإجراءات النهائية والموت الرحيم كانت الحيوانات مباشرة بعد نهاية الصورالاستحواذ. إجراءات مفصلة كما يلي : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أشرق (مع irradiator - γ) 8 الاسبوع الفئران عارية قديمة مع 900 راد لتدمير السلائف الذاتية للدم داخل العظم الكوسا (BM). بعد التشعيع ، وعودة الحيوانات إلى أقفاصها حتى تقوم بإعداد الخلايا المانحة BM عن الحقن في الوريد وإعادة BM أخرى. تم تنفيذ هذا النقل BM 1 ساعة بعد التشعيع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل الحيوانات المانحة BM. وTibias femurs من أطرافه الخلفية للحيوان واحد عادة ما تكون كافية لإعادة بناء ما يصل الى المتلقي الحيوانات 3. بعد القتل الرحيم مع CO 2 ، إزالة أطرافه الخلفية ومن ثم إزالة الجلد والعضلات من العظام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع نهاية مغلقة من كل العظام والاحمرار مع برنامج تلفزيوني (أو RPMI) أو سحق كل منهم في بمدافع الهاون ، وذلك باستخدام مدقة ، مع 2 مل من برنامج تلفزيوني (أو RPMI) لإزالة BM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعطيل البنية BM الى تعليق وحيد الخلية التي تكرار USI تطلع قويةنانوغرام ماصة P1000. بدلا من ذلك ، يمكنك أيضا تمرير BM طوال إبرة حقنة 21G عدة مرات. الطرد المركزي (400g ، 5 دقائق ، RT) ، وإعادة تعليق الخلايا في برنامج تلفزيوني ، وحقن في الوريد إلى متلقين عارية - المشع الخاص. في تجاربنا استخدمنا BM - KI من Foxp3 GFP / الفئران GFP فيه جميع الخلايا التائية التنظيمية (Tregs) ستبدي GFP 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبول BM المانحة يحدث في الأيام الأولى بعد نقل ، لأن غير BM - المعاد الحيوانات لا يمكن البقاء على قيد الحياة أكثر من 14 يوما. ومع ذلك ، ينبغي للمرء أن ينتظر لمدة 4 الى 6 أسابيع للسماح للانتعاش الكامل من جميع المقصورات BM. Bactrim (روش) وأضيفت إلى الماء (2 ملغ / مل) خلال الأسبوع الأول بعد التشعيع لتقليل مخاطر العدوى البكتيرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقد وصفت بالفعل زرع الغدة الصعترية الجنينية 2. لفترة وجيزة ، بدء تربية أزواج من الفئران إسوي والتحقق من توصيل (دليل على الجماع) كل يوم. منفصلة موصولة إناث و 2 - CO الموت ببطء لهم في يوم 15 من pregnancy (المراقبة من المكونات هو يوم 1 من الحمل). إزالة الأجنة وthymuses و. ضع thymuses الجنينية في برنامج تلفزيوني الباردة حتى نقلها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتنفيذ عمليات زرع thymuses ، BM - تخدير الفئران عارية مع المتلقي ketamin (120 ميكروغرام / غرام من وزن الفأر) / زيلازين (16 ميكروغرام / غرام من وزن الفأر) والاحتفاظ بها على رأس وسادة التدفئة على 37 درجة مئوية حتى يحصلوا على اللاوعي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فضح جراحيا الكلى لتنفيذ عمليات زرع للthymuses. فرك الجلد لأول مرة مع ChloraPrep (Carefusion شركة) والايثانول 70 ٪. ثم ، وجعل قطع 1 سم على الجلد من الجزء الخلفي الجانبي جسم الحيوان ، مم 2 خوار الضلع مشاركة الصدري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خفض التجويف البريتوني والانسحاب الكلى من هذا التجويف. إجراء قطع صغيرة سطحية في كبسولة الكلى بشفرة المشرط. باستخدام ملقط مع طرف رقيقة جدا جعل الحقيبة تحت كبسولة الكلى من الماوس المتلقي وتضيف ما يصل إلى 4 فصوص الغدة الصعترية في هذه الحقيبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ب وضع الكلى<html> ACK إلى مكانها ، خياطة التجويف البريتوني مع واحد أو اثنين غرز ، ومن ثم إغلاق الماوس الجلد باستخدام طريقة خياطة نفسه. بدلا من ذلك ، يمكن القيام به الغراء الغرز الجراحية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن مسكنة (بوتورفانول في 5 ملغ / كلغ) تحت الجلد مباشرة بعد الانتهاء من عملية جراحية لتفادي ألم الحيوان والحفاظ على الحيوانات في لوحة التسخين حتى يبدأ في التعافي من التخدير. والفئران في قفص فردي لأول 3 أيام بعد الزرع لمنع زملائه من قفص إزالة الغرز. إزالة الغرز بعد أسبوع 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الفئران عارية لا تملك خلايا تي. لذلك ، يمكنك قبول تقييم الكسب غير المشروع الغدة الصعترية من خلال رصد نسبة CD4 + CD8 + أو خلايا T في الدم. مرة واحدة في الأسبوع (2) ، بعد أسابيع من زرع الغدة الصعترية ، تنزف الحيوانات وصمة عار في الدم المضادة للCD4 ومكافحة CD8 الاجسام المضادة (MABS). عندما CD4 : CD8 نسبة ما يقرب من 2:1 ، زرع الغدة الصعترية وظيفية بالكامل (الشكل 1). </li></ol>&quot;&gt; 2. الحصول على الصور Intravital تحضير جميع المواد ستحتاج مقدما ووضعها جانبا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الحيوانات مع ketamin / زيلازين (الجرعات الموصوفة في البند نفسه 1.5) ووضعها على رأس وسادة التدفئة على 37 درجة مئوية. ضخ 100 ميكرولتر من B - ثيوسيانات رودامين ديكستران (20 ملغ / مل في برنامج تلفزيوني) عن طريق الوريد للسماح التصور المستقبلي لتدفق الدم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فضح الكلى المزروعة التي تحتوي على الغدة الصعترية وفقا لبروتوكول سبق وصفها في البند 1.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمنع الكلى من العودة إلى موقعها الأصلي ، على مقربة من الجانبين الوحشي شق الجلد مع غرز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قطعة من القطن غارقة في برنامج تلفزيوني على الجزء العلوي من الجهاز لإبقائها رطبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع وسادة التدفئة على رأس الحيوان حامل المرحلة (الشكل 2A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الحيوان في أعلى لوحة التدفئة في صاحب الحيوان ، يصل الجهاز (الشكل 2B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قرصة الجهاز في كلا الجانبين مع المشبك مترADE رقيقة من رقائق الألومنيوم (الشكل 2C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أغلق صاحب الحيوان ومكان التحقيق سخان الأعلى في أقرب وقت ممكن لنسيج الجسم (الشكل 2D). هذا التحقيق سخان التدابير باستمرار درجة حرارة الجهاز ويرسل هذه المعلومات إلى جهاز التدفئة لضبط التيار الكهربائي ، وابقائها عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة القطن غارقة في برنامج تلفزيوني وإضافة منخفضة ذوبان agarose (2 ٪ في برنامج تلفزيوني) في 30 درجة مئوية في أعلى إعداد الخاص بك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية كاملة مع إعداد المدفأة العليا (2E الشكل). في الفتحة على هذا سخان هناك ساترة عزل agarose من الهدف (الشكل 2F). رصد وحقن تخدير الماوس دفعة نصف الجرعة كل 40 دقيقة. بعد الحصول على الصور ، الموت ببطء الحيوان مع CO 2. </li></ol> ملاحظة : يتم عرض الصور من الألومنيوم احباط ومقطع المدفأة الأعلى في الشكل 3. 3. ثنائي الفوتون التصوير اكتساب استخدمنا تستقيم &quot;المرج أولتيما XY&quot; ثنائي الفوتون المجهر. وقد تم تجهيز نظامنا مع تي : ليزر الياقوت ، وأربع فرق إدارة المشاريع PMT العليا للقناة في وقت واحد استحواذ تصل إلى 4 وغمر المياه الهدف 20X. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على تي : ليزر الياقوت والنظام كله المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة المرايا مزدوج اللون ومجموعات التصفية وفقا لموجات المطلوب. في حالتنا استخدمنا حامل أوليمبوس - BX2 كروما وتحتوي على 565 نانومتر مرآة مزدوج اللون ، واحدة 525/50 تصفية نانومتر (على Foxp3 - GFP إشارة) ، واحد 595/50 تصفية نانومتر (لديكستران رودامين - B - إشارة داخل الأوعية الدموية ). وكان نطاق الطول الموجي الليزر المستخدمة بين 880-900 نانومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى صاحب الحيوان المجهر ، الاتصال وتشغيل السخانات في كل شيء ، إضافة الماء على فتحة سخان أعلى ، وانخفاض بعناية الهدف في الماء ، والتركيز على متن سفينة أو بعض GFP Tregs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> س مع المجهر ، Y ، Z للمراقبة الخارجية ، والمسح بسرعة الأنسجة لتحديد المنطقة<html> المصالح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط على كسب هذه الفرق لتحسين فصل الألوان وتقليل كمية الليزر اللازمة لتحقيق إشارة كافية على الخلفية. محاولة استخدام الحد الأدنى من الليزر لتجنب الصور تلف الأنسجة الخاص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة تقع في المنطقة للمصالح ، وتبدأ الوقت الفاصل بين التصوير. في حالتنا ، و5D نموذجي (س ، ص ، ض ، ر ، ولون) بروتوكول اقتناء يتكون من الحصول على صور متسلسلة من حجم 50 ميكرومتر الأنسجة المتعمق ، مقسمة إلى 4.0 ميكرون ض الخطوات ، x و y بطول 140 ميكرون لكل منهما. يأخذ كل وحدة تخزين التي سيتم شراؤها حوالي 30 ثانية. ولذلك ، فإن 60 الاستحواذ تنفيذ نحو 30 دقيقة من الحصول على الصور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل البيانات إلى الخادم المؤسسية واستخدام ImageJ ، Imaris ، أو برامج Volocity لأداء متعدد الأبعاد وجعلها تتبع الخلية. </li></ol> 4. ممثل النتائج <html> g1.jpg &quot;/&gt; الشكل 1. . التوتة الجنينية قبول وظيفة بعد استرداد BM ، وقد تم زرع thymuses الجنينية للحيوانات المعاد BM ؛ بعد أسبوعين من زرع الغدة الصعترية ، ونزفت هذه الفئران مرة واحدة في الأسبوع لمراقبة نسب فرعية الخلايا التائية التي تلطيخ المضادة للCD4 أو CD8 المضادة ، MABS. اعتبرنا قبلت بنجاح الغدة الصعترية في الحيوانات مع CD4 : CD8 حول نسبة 1.5-2.0:1 (A). للتأكد من فاعليته ، ونحن ضحت بعض الحيوانات وزرع الغدة الصعترية ، مقارنة النسبة المئوية للخلية توتية مجموعات سكانية فرعية مختلفة مع الفئران WT (B). النسب المئوية للالمزدوج السلبية (DN ؛ CD4 -- thymocytes -- CD8) المجموعات السكانية الفرعية (عن طريق تلطيخ مع CD25 المضادة للطائرات ومضادة للMABS CD44) ، انقر نقرا مزدوجا إيجابية (DP ؛ CD4 + CD8 + thymocytes) واحدة إيجابية (SP) CD4 + أو CD8 + thymocytes كانت متشابهة بين هذه الحيوانات. ig2.jpg &quot;/&gt; الشكل 2. التجمع صاحب الحيوان ، وبعد تخدير عميق ، يتم وضع الحيوان على رأس وسادة التدفئة ، التي شنت في وقت سابق على رأس الحيوان حامل المرحلة (أ). الكلى المزروعة التي تحتوي على الغدة الصعترية هي مواجهة (B). والمشبك رقائق الألومنيوم القرصات بدقة الكلى كله (C) لابقائه في مكانه. التين. 1C ادخال يبين بالتفصيل المشبك. يتم وضع الجزء العلوي من صاحب الحيوان في مكان (D). تتم إزالة القطن غارقة في برنامج تلفزيوني من الجزء العلوي من الجهاز ، والاستعاضة عنها ذوبان agarose المنخفضة الدافئة ، ويتم إضافة جهاز التدفئة أعلى (E). أخيرا ، يتم نقل التجمع كله المجهر ، التي يمثلها هنا الهدف (F). <img alt="الشكل 3" src="/files/ftp_upload/3504/3504fig3.jpg" /> الشكل 3. تفاصيل أجزاء حامل ، وهذه الصور تظهر المشبك رقائق الألومنيوم (أ) عقد الكلى (B). نلاحظ أيضا في المنطقة حيث تقع الغدة الصعترية المزروعة. هذا يشير إلى ما يقرب من المنطقةلقطع الكبسولة التوتة وجعل جيب لوضع التوتة الجنينية. تم إصلاح سخان ساترة العلوي (C) مع الغراء إلى الجزء السفلي من السيليكون والخمسين (D). فيلم 1. التصوير Intravital من thymocytes + Foxp3 - GFP داخل الغدة الصعترية حيث تم الإبقاء على مستويات الفسيولوجية للالأوكسجين ودرجة الحرارة (37 درجة مئوية) خلال العملية برمتها. لاحظ تدفق الدم والحركة من Tregs. ويمكن قياس هذه السرعات ومقارنة مع البيانات المنشورة. <a href="/files/ftp_upload/3504/3504movie1.avi">انقر هنا لمشاهدة الفيلم.</a> الفيلم 2. Intravital تصوير Tregs داخل الغدة الصعترية ، حيث تم الحصول على الصور في 30 درجة مئوية. لاحظ عدم وجود حركة وشكل الجولة من الخلايا على الرغم من الحفاظ على تدفق الدم. <a href="/files/ftp_upload/3504/3504movie2.avi">انقر هنا لمشاهدة الفيلم.</a>

<ol>
	<li>Bettelli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+developmental+pathways+for+the+generation+of+pathogenic+effector+TH17+and+regulatory+T+cells.">Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells.</a> Nature. 441, 235-238 (2006).</li><li>Ramsdell, F., Z&#250;&#241;iga-Pfl&#252;cker, J. C., Takahama, Y., Coligan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+systems+for+the+study+of+T+cell+development:+fetal+thymus+organ+culture+and+OP9-DL1+cell+coculture.">In vitro systems for the study of T cell development: fetal thymus organ culture and OP9-DL1 cell coculture.</a> Current protocols in immunology. , (2006).</li><li>Tadokoro, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T+cells+inhibit+stable+contacts+between+CD4++T+cells+and+dendritic+cells+in+vivo.">Regulatory T cells inhibit stable contacts between CD4+ T cells and dendritic cells in vivo.</a> J. Exp. Med. 203, 505-511 (2006).</li><li>Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+priming+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes+occurs+in+three+distinct+phases.">T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases.</a> Nature. 427, 154-159 (2004).</li><li>Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+single+cell+dynamics+of+CD4++T+cell+activation+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes.">Imaging the single cell dynamics of CD4+ T cell activation by dendritic cells in lymph nodes.</a> J. Exp. Med. 200, 847-856 (2004).</li><li>Shakhar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+T+cell-dendritic+cell+interactions+precede+the+development+of+both+tolerance+and+immunity+in+vivo.">Stable T cell-dendritic cell interactions precede the development of both tolerance and immunity in vivo.</a> Nat. Immunol. 6, 707-714 (2005).</li><li>Hugues, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+T+cell+dynamics+in+lymph+nodes+during+the+induction+of+tolerance+and+immunity.">Distinct T cell dynamics in lymph nodes during the induction of tolerance and immunity.</a> 5, 1235-1242 (2004).</li><li>Tang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+regulatory+T+cell+control+of+autoimmune+responses+in+nonobese+diabetic+mice.">Visualizing regulatory T cell control of autoimmune responses in nonobese diabetic mice.</a> Nat. Immunol. 7, 83-92 (2006).</li><li>Le Borgne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+negative+selection+on+thymocyte+migration+in+the+medulla.">The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla.</a> Nature immunology. 10, 823-830 (2009).</li><li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy.">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvascular research. 5, 384-394 (1973).</li><li>Wang, B., Zinselmeyer, B. H., McDole, J. R., Gieselman, P. A., Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+Imaging+of+Leukocyte+Homing+and+Migration+in+vivo.">Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo.</a> J. Vis. Exp. (46), e2062-e2062 (2010).</li><li>Barretto, R. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+imaging+of+disease+progression+in+deep+brain+areas+using+fluorescence+microendoscopy.">Time-lapse imaging of disease progression in deep brain areas using fluorescence microendoscopy.</a> Nature medicine. 17, 223-228 (2011).</li></ol>

We have nothing to disclose.

In this paper we demonstrated the procedures for two-photon imaging of thymocytes inside a living animal. We also described some parameters that one should carefully control, such as the continuation of blood flow and the maintenance of organ temperature during the imaging procedures. Nonetheless, despite careful efforts to keep the organ stable, motion artifacts such as "organ drifting" can occur. Posterior image correction can be performed by the development of algorithms specifically designed for this purpose. Further image analysis could also be the source of new protocols development which seeks to minimize errors.
The thymus is the organ where all T cells are produced and, therefore, it is the organ where immunologists interested in understanding the generation of &#x03B3;&delta;, CD4, or CD8 T cells will focus their attention. Most studies concerning T cells are based upon differences in the numbers and/or stability of these cells after different in vitro/in vivo manipulations. However, only after the in vivo visualization we could observe the interaction between cells of the immune system involved in maintaining homeostasis3-7. Therefore, the in vivo observation of thymocytes is probably one of the most important missing information to better understand T cell biology. Intravital TPM provides a detailed picture of T cell movements and interactions and we demonstrate here how it can be used for detailed thymocyte studies. However, every technique has its limitations. While intravital imaging acquisition is the most accurate system for reflecting cells behavior inside the body, it is also true that explanted image acquisition of organs is less laborious and has been used to collect important information about the immune system8,9. Moreover, one cannot deny intravital imaging methods require surgery to expose tissues and blood vessels in anesthetized animals, which per se could cause an alteration in the whole organ physiology10. Nevertheless, there are non-invasively methods that abolish the artifacts caused by the surgical procedure11 and new methods are being developed that better prepare in advance the animals to be used12. Therefore, new surgical procedures and tolls will minimize or bypass actual limitations of intravital imaging acquisition and become more and more accessible to the scientific community.
We have demonstrated that the method we have described is feasible and it reports all in vivo systemic manipulations, such drug administration, that we have used. Thus, we suggest the use of this method together with ex vivo techniques already available in order to complement and strengthen further studies concerning thymocytes development.

<table border="1">
<thead>
<tr>
<td>Name of the reagent</td>
<td>Company</td>
<td>Catalogue number</td>
<td>Comments</td>
</tr>
</thead>
<tbody>
<tr>
<td>Rhodamine B ishothiocyanate-Dextran</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>R9379</td>
<td>prepare stock at 20 mg/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Two-photon microscope</td>
<td>Prairie Technologies Inc.</td>
<td>Prairie Ultima X-Y</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Ti:Sapphire laser</td>
<td>Coherent, Inc.</td>
<td>Chameleon Ultra Family</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>20x/1.00 NA immersion objective</td>
<td>Olympus Inc.</td>
<td>XLUMPLFLN 20XW</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Holder (Filters/Dichroic)</td>
<td>Chroma Technology Corp.</td>
<td>91018 BX2 (U-MF2)</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>525 nm/50 filter</td>
<td>Chroma Technology Corp.</td>
<td>ET525/50m</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>595 nm/50 filter</td>
<td>Chroma Technology Corp.</td>
<td>ET595/50m</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>565 nm dichroic</td>
<td>Chroma Technology Corp.</td>
<td>565dcxr</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Imaris software</td>
<td>Bitplane AG Inc.</td>
<td>Imaris</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Volocity</td>
<td>PerkinElmer Inc.</td>
<td>Volocity</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>ImageJ</td>
<td>NIH, USA</td>
<td>ImageJ</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
</tbody>
</table>

intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon microscopy

ثنائي الفوتون المجهري (TPM) على الحصول على الصور في مناطق عميقة داخل الأنسجة والأعضاء. في تركيبة مع تطوير أدوات جديدة المجسم والعمليات الجراحية ، TPM تصبح تقنية قوية لتحديد &quot;منافذ&quot; داخل الأجهزة الخلوية وثيقة &quot;السلوك&quot; في الحيوانات الحية. بينما intravital التصوير يوفر المعلومات التي تمثل أفضل السلوك الحقيقي الخلوية داخل الجهاز ، فإنه أكثر وشاقة وتتطلب من الناحية الفنية من حيث المعدات المطلوبة / الإجراءات البديلة السابقين من التصوير اكتساب الجسم الحي. وبالتالي ، فإننا تصف عملية جراحية ورواية &quot;المجسم&quot; حامل الجهاز الذي يتيح لنا متابعة تحركات Foxp3 + الخلايا داخل الغدة الصعترية. Foxp3 هو المنظم الرئيسي لتوليد الخلايا التائية التنظيمية (Tregs). وعلاوة على ذلك ، يمكن تصنيف هذه الخلايا وفقا لأصلهم : أي. وتسمى الغدة الصعترية ، متباينة Tregs &quot;طبيعيا Tregs&quot; (nTregs) ، كما سpposed محيطيا لتحويلها Tregs (pTregs). على الرغم من أنه تم الإبلاغ عن كمية كبيرة من البحوث في الأدب المتعلق النمط الظاهري وعلم وظائف الأعضاء من هذه الخلايا T ، ولا يعرف سوى القليل جدا عن التفاعلات في الجسم الحي مع الخلايا الأخرى. قد يكون هذا النقص بسبب غياب التقنيات التي من شأنها أن تسمح مثل هذه الملاحظات. البروتوكول وصفها في هذه الورقة يقدم علاجا لهذه الحالة. لدينا بروتوكول يتكون من استخدام الفئران عارية التي تفتقر إلى التوتة الذاتية منذ لديهم طفرة المنضبطة في تسلسل الحمض النووي الذي يهدد تمايز بعض الخلايا الظهارية ، بما في ذلك الخلايا الظهارية التوتة. وكانت الفئران عارية غاما المشع وتشكيل العظام مع الكوسا (BM) من الفئران GFP / GFP Foxp3 - KI. بعد شفائهم BM (6 أسابيع) ، تلقى كل حيوان التوتة الجنينية زرع الكلى داخل الكبسولة. بعد قبول الغدة الصعترية (6 أسابيع) ، تم تخدير الحيوانات ، والتي تحتوي على الكلىتعرض الغدة الصعترية المزروعة ، حامل ثابت في جهازنا ، وأبقى في ظل الظروف الفسيولوجية في الجسم الحي للتصوير بواسطة TPM. لقد تم استخدام هذا النهج لدراسة تأثير المخدرات في توليد الخلايا التائية التنظيمية.

Watch this Scientific Journal Video about Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy at JoVE.com

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

Intravital تصوير الغدة الصعترية باستخدام الماوس 2 فوتون الميكروسكوب

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

intravital-imaging-of-the-mouse-thymus-using-2-photon-microscopy

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.8K Views.  Instituto Gulbenkian de Ciência. We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of “niches” within the thymus where T cell development occurs.

Video: Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune response and therefore, the development of effector cells. As such, LNs are key to fighting invading pathogens and maintaining health. The choice of LN to study is dictated by accessibility and the desired model; the inguinal lymph node is well situated and easily supports studies of biologically relevant models of skin and genital mucosal infection.
The inguinal LN, like all LNs, has an extensive microvascular network supplying it with blood. In general, this microvascular network includes the main feed arteriole of the LN that subsequently branches and feeds high endothelial venules (HEVs). HEVs are specialized for facilitating the trafficking of immune cells into the LN during both homeostasis and infection. How HEVs regulate trafficking into the LN under both of these circumstances is an area of intense exploration. The LN feed arteriole, has direct upstream influence on the HEVs and is the main supply of nutrients and cell rich blood into the LN. Furthermore, changes in the feed arteriole are implicated in facilitating induction of adaptive immune response. The LN microvasculature has obvious importance in maintaining an optimal blood supply to the LN and regulating immune cell influx into the LN, which are crucial elements in proper LN function and subsequently immune response. 
The ability to study the LN microvasculature in vivo is key to elucidating how the immune system and the microvasculature interact and influence one another within the LN. Here, we present a method for in vivo imaging of the inguinal lymph node. We focus on imaging of the microvasculature of the LN, paying particular attention to methods that ensure the study of healthy vessels, the ability to maintain imaging of viable vessels over a number of hours, and quantification of vessel magnitude. Methods for perfusion of the microvasculature with vasoactive drugs as well as the potential to trace and quantify cellular traffic are also presented. 
Intravital microscopy of the inguinal LN allows direct evaluation of microvascular functionality and real-time interface of the direct interface between immune cells, the LN, and the microcirculation. This technique potential to be combined with many immunological techniques and fluorescent cell labelling as well as manipulated to study vasculature of other LNs.

A technique for performing intravital microscopy of the inguinal lymph node (LN) is outlined. Such technique allows for real-time, in vivo study of the lymph node microvasculature and structure both during homeostasis and infection. This technique can be adapted to cell trafficking studies and to other lymph node sites.

Intravital الميكروسكوب من العقدة الليمفاوية الأربي

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an effective gas exchange must be maintained, while at the same time avoiding infection by the multiple pathogens that are inhaled 
during normal breathing. To achieve this, a superb set of defense strategies combining humoral and cellular immune mechanisms exists. One of the most 
effective measures for acute defense of the lung is the recruitment of neutrophils, which either phagocytose the inhaled pathogens or kill them by 
releasing cytotoxic chemicals. A recent addition to the arsenal of neutrophils is their explosive release of extracellular DNA-NETs by which bacteria 
or fungi can be caught or inactivated even after the NET releasing cells have died. We present here a method that allows one to directly observe neutrophils, 
migrating within a recently infected lung, phagocytosing fungal pathogens as well as visualize the extensive NETs that they have produced throughout the 
infected tissue. The method describes the preparation of thick viable lung slices 7 hours after intratracheal infection of mice with conidia of the mold 
Aspergillus fumigatus and their examination by multicolor time-lapse 2-photon microscopy. This approach allows one to directly investigate antifungal 
defense in native lung tissue and thus opens a new avenue for the detailed investigation of pulmonary immunity.

We show, how to use 2-photon microscopy for the observation of the dynamics of neutrophil granulocytes in infected lungs while they phagocytose pathogens or produce neutrophil extracellular traps (NETs).

المراقبة المباشرة للالبلعمة وNET تشكيل تلو العدلات في الرئتين المصابة باستخدام الميكروسكوب 2 - الفوتون

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

Intravital الميكروسكوب في الطحال : التحليل الكمي للتنقل الطفيلي وتدفق الدم

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign antigens from peripheral tissues to prime the adaptive immune response. Juxtaposed between innate and adaptive immune responses, the LN is an ideal site to study immune cell interactions1,2. Lymphocytes (T cells, B cells and NK cells), dendritic cells (DCs), and macrophages comprise the bulk of bone marrow-derived cellular elements of the LN. These cells are strategically positioned in the LN to allow efficient surveillance of self antigens and potential foreign antigens3-5. The process by which lymphocytes successfully encounter cognate antigens is a subject of intense investigation in recent years, and involves an integration of molecular contacts including antigen receptors, adhesion molecules, chemokines, and stromal structures such as the fibro-reticular network2,6-12. 
Prior to the development of high-resolution real-time fluorescent in vivo imaging, investigators relied on static imaging, which only offers answers regarding morphology, position, and architecture. While these questions are fundamental in our understanding of immune cell behavior, the limitations intrinsic with this technique does not permit analysis to decipher lymphocyte trafficking and environmental clues that affect dynamic cell behavior. Recently, the development of intravital two-photon laser scanning microscopy (2P-LSM) has allowed investigators to view the dynamic movements and interactions of individual cells within live LNs in situ12-16. In particular, we and others have applied this technique to image cellular behavior and interactions within the popliteal LN, where its compact, dense nature offers the advantage of multiplex data acquisition over a large tissue area with diverse tissue sub-structures11,17-18. It is important to note that this technique offers added benefits over explanted tissue imaging techniques, which require disruption of blood, lymph flow, and ultimately the cellular dynamics of the system. Additionally, explanted tissues have a very limited window of time in which the tissue remains viable for imaging after explant. With proper hydration and monitoring of the animal's environmental conditions, the imaging time can be significantly extended with this intravital technique. Here, we present a detailed method of preparing mouse popliteal LN for the purpose of performing intravital imaging.

Recent advances in 2-photon microscopy have enabled real-time in situ imaging of live tissues in animal models, thereby enhancing our ability to investigate cellular behavior in both physiologic and pathologic conditions. Here, we outline the preparations required to perform intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.

Intravital التصوير من العقدة اللمفية الفأر المأبضية

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

حل غاية intravital المجهري مخطط في الإضاءة مراكز جرمينال

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various biological events in real time and in live animals. This technology has greatly advanced our understanding of physiological processes and pathogen-mediated phenomena in specific organs.
In this study, IVM is applied to the mouse liver and protocols are designed to image in vivo the circulatory system of the liver and measure red blood cell (RBC) velocity in individual hepatic vessels. To visualize the different vessel subtypes that characterize the hepatic organ and perform blood flow speed measurements, C57Bl/6 mice are intravenously injected with a fluorescent plasma reagent that labels the liver-associated vasculature. IVM enables in vivo, real time, measurement of RBC velocity in a specific vessel of interest. Establishing this methodology will make it possible to investigate liver hemodynamics under physiological and pathological conditions. Ultimately, this imaging-based methodology will be important for studying the influence of L. donovani infection&#160;on hepatic hemodynamics.
This method can be applied to other infectious models and mouse organs and might be further extended to pre-clinical testing of a drug&#8217;s effect on inflammation by quantifying its effect on blood flow.

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.

حيوي داخلي المجهري التصوير الكبد التالية<em&gt; الليشمانيا</em&gt; العدوى: تقييم كبدي ديناميكا الدم

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, neutrophils, T cell subsets, B cells, natural killer (NK) and NKT cells. Intravital microscopy of the liver for monitoring immune cell migration is particularly challenging due to the high requirements regarding sample preparation and fixation, optical resolution and long-term animal survival. Yet, the dynamics of inflammatory processes as well as cellular interaction studies could provide critical information to better understand the initiation, progression and regression of inflammatory liver disease. Therefore, a highly sensitive and reliable method was established to study migration and cell-cell-interactions of different immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hr) by intravital two-photon laser scanning microscopy (TPLSM) in combination with intensive care monitoring.
The method provided includes a gentle preparation and stable fixation of the liver with minimal perturbation of the organ; long term intravital imaging using multicolor multiphoton microscopy with virtually no photobleaching or phototoxic effects over a time period of up to 6 hr, allowing tracking of specific leukocyte subsets; and stable imaging conditions due to extensive monitoring of mouse vital parameters and stabilization of circulation, temperature and gas exchange.
To investigate lymphocyte migration upon liver inflammation CXCR6.gfp knock-in mice were subjected to intravital liver imaging under baseline conditions and after acute and chronic liver damage induced by intraperitoneal injection(s) of carbon tetrachloride (CCl4).
CXCR6 is a chemokine receptor expressed on lymphocytes, mainly on Natural Killer T (NKT)-, Natural Killer (NK)- and subsets of T lymphocytes such as CD4 T cells but also mucosal associated invariant (MAIT) T cells1. Following the migratory pattern and positioning of CXCR6.gfp+ immune cells allowed a detailed insight into their altered behavior upon liver injury and therefore their potential involvement in disease progression.

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

المدى الطويل حيوي داخلي Multiphoton المجهر التصوير من الخلايا المناعية في السليمة والمريضة الكبد عن طريق الفئران CXCR6.Gfp مراسل

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target cells. Inside the host cell the effector proteins manipulate cellular functions to the benefit of the bacteria. To better understand the control of type III secretion during host cell interaction, sensitive and accurate assays to measure translocation are required. We here describe the application of an assay based on the fusion of a Yersinia enterocolitica effector protein fragment (Yersinia outer protein; YopE) with TEM-1 beta-lactamase for quantitative analysis of translocation. The assay relies on cleavage of a cell permeant FRET dye (CCF4/AM) by translocated beta-lactamase fusion. After cleavage of the cephalosporin core of CCF4 by the beta-lactamase, FRET from coumarin to fluorescein is disrupted and excitation of the coumarin moiety leads to blue fluorescence emission. Different applications of this method have been described in the literature highlighting its versatility. The method allows for analysis of translocation in vitro and also in in vivo, e.g., in a mouse model. Detection of the fluorescence signals can be performed using plate readers, FACS analysis or fluorescence microscopy. In the setup described here, in vitro translocation of effector fusions into HeLa cells by different Yersinia mutants is monitored by laser scanning microscopy. Recording intracellular conversion of the FRET reporter by the beta-lactamase effector fusion in real-time provides robust quantitative results. We here show exemplary data, demonstrating increased translocation by a Y. enterocolitica YopE mutant compared to the wild type strain.

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

تحليل<em&gt; يرسينيا القولون</em&gt; المستجيب إزفاء في الخلايا المضيفة عن طريق بيتا لاكتاماز المستجيب الإنشطار

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

التصوير العدلات وحيدات في مساريقي الأوردة التي كتبها حيوي داخلي المجهري على الفئران مخدرة في الوقت الحقيقي

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that enhances the phagocytic functionality of neutrophils. Although extensive studies have unveiled the existence and importance of neutrophil priming during infection and injury, means of visualizing this process in vivo have been unavailable. The protocol provided enables monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals by combining three methodologies: 1) DsRed reporter signal &#8212; used as a measure of priming 2) in vivo neutrophil labeling &#8212; achieved by injection of fluorescence-conjugated anti-lymphocyte antigen 6G (Ly6G) monoclonal antibody (mAb) and 3) intravital confocal imaging. Several critical steps are involved in this protocol: oxazolone-induced mouse ear skin inflammation, appropriate sedation of animals, repeated injections of anti-Ly6G mAb, and prevention of focus drift during imaging. Although a few limitations have been observed, such as the limit of continuous imaging time (~ 8 hr) in one mouse and the leakage of fluorescein isothiocyanate-dextran from blood vessels in the inflammatory state, this protocol provides a fundamental framework for intravital imaging of primed neutrophil behavior and function, which can easily be expanded to examination of other immune cells in mouse inflammation models.

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&amp;#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.

التصوير حيوي داخلي من العدلات الاشعال عن طريق IL-1β يحركها المروج عن dsRed الفئران مراسل

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that ...