ويدعم البحوث في المختبر CJN من المنح التي تعمل من NSERC، المعهد الكندي للسرطان جمعية أبحاث (CCSRI)، والثدي المؤسسة الكندية للسرطان (فرع BC-يوكون).

ويرد سير العمل العام لهذا الإجراء في الشكل 2: ملاحظة. 1. تحديد الجرعة النمو المثبطة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الخميرة الثقافة بين عشية وضحاها ملاحظة: وسائل الإعلام نمو الخميرة استخراج-ببتون-الدكستروز (YEPD) المستخدمة في هذا البروتوكول هو وصفة معيارية 13. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خط خارج BY4741 (ماتا HIS3 Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) الخلايا على لوحة أجار YEPD واحتضان لمدة 48 ساعة على 30 درجة مئوية أو حتى شكل مستعمرات مرئية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الثقافات بين عشية وضحاها، فحقن 5 مل من YEPD وسائل الإعلام السائلة في وعاء الثقافة العقيمة مع مستعمرة واحدة. احتضان بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية مع دوران مستمر أو اهتزاز. سوف ثقافة تصل عادة تشبع من صباح اليوم (~ 2 × 10 8 خلية / مل). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد وسائل الاعلام أجار الصلبة التي تحتوي على جرعات متفاوتة الكيميائية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد عدة أسهمهذه المادة الكيميائية لفحصها في 100X المطلوب التركيز النهائي في مذيب مناسب. ملاحظة: سوف تركيزات فعالة تعتمد على المواد الكيميائية، ويجب أن تحدد تجريبيا. ولذلك فمن المستحسن لاختبار في البداية مجموعة التركيز النهائي واسع، أي من ميكرومتر منخفض لملم عالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل تركيز المواد الكيميائية لفحصها، قسامة 3 مل من المنصهر YEPD أجار إلى عدة العقيمة أنبوب الثقافة. مكان في 55 ° C حمام الماء للحفاظ على من ترسيخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل تركيز المواد الكيميائية لفحصها إضافة 30 ميكرولتر من مجمع 100X إلى وسائل الإعلام المنصهرة، دوامة 2-3 ثانية لخلط، وماصة 1 مل في كل زوج من الآبار مكررة في لوحة 12-جيدا. تأكد من تضمين سيارة تحكم فقط. السماح لوحات لضبط بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. تجاهل أي وسيلة إعلامية إضافية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا انتشار تصفيح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطعيم 10 مل من YEPD وسائل الإعلام السائلة مع 2 ميكرولتر من ثقافة الخميرة المشبعة، ونمت بين عشية وضحاها كما في الخطوة 1.1.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة 25 ميكرولتر من ثقافة الخميرة المخفف لكل بئر، موزعة بالتساوي باستخدام الخرز الزجاجي معقمة أو قضيب، والسماح لوحة لتجف تحت لهب. احتضان لوحة عند 30 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقييم نمو الخميرة (سواء عدد وحجم المستعمرات) على لوحات. تحديد تركيز شبه قاتلة من المركب الذي لا تمنع النمو من خلال أكثر من 10٪ -15٪ لأداء الشاشة. </li></ol></li></ol> 2. المنهجية شاشة الوراثية الكيميائية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صيانة الحذف-متحولة صفيف (DMA) وإعداد لوحة المصدر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحصول على وصف مفصل عن بناء المصفوفات متحولة الحذف من المخزونات الجلسرين يرجى الرجوع إلى Baryshnikova وآخرون. 14. مرة واحدة وقد تم المحتشدة المسوخ الحذف في مناطق ذات كثافة من 384 المستعمرات في لوحة، وDMA يمكن تخزينها لعدة أشهر في 4 درجات مئوية. تكرار على YEPD أجار تحتوي على 200 ميكروغرام / مل من G418 ضروريا لمنع المستعمرات من النمو في كلالبعض. وينبغي تجنب متعددة مكررات التسلسلية لمنع فقدان بطيئة سلالات النمو وتقليل ظهور طفرات القامع: ملاحظة. وهذا هو ذات الصلة ولا سيما إذا الحفاظ على مجموعات كما haploids. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ جميع الخطوات طبق الاصل الطلاء باستخدام الميكروبية arraying النظام الآلي. بدلا من ذلك، والتعامل معها المستعمرات باستخدام أدوات التدبيس اليدوية المحتشدة. ملاحظة: جمع الخميرة الحذف هو متاح في haploids وdiploids من عدة مصادر تجارية وشحن وعادة ما أسهم الجلسرين في لوحات 96-جيدا. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التكثيف مجموعة الحذف متحولة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 250 مل من YEPD وسائل الإعلام أجار تحتوي على 200 ميكروغرام / مل من G418. تركيز الفعال لG418 قد تختلف ولكل الكثير وينبغي اختبار تجريبيا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد خمس لوحات YEPD أجار عن طريق سكب 50 مل من YEPD أجار تحتوي على 200 ميكروغرام / مل من G418 لكل لوحة. القيام بذلك قبل يوم واحد التكثيف مجموعة والسماح لوحات لتبرد في درجة حرارة الغرفةerature بين عشية وضحاها حتى على سطح مستو. ملاحظة: سوف تكون هناك حاجة أربعة لوحات لجمع في كثافة 1،536 سلالة، يسكب لوحة الخامسة كما اضافية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة 16 أطباق بتري تحتوي على مجموعة الحذف متحولة في مناطق ذات كثافة من 384 المستعمرات في لوحة والسماح للقدوم إلى درجة حرارة الغرفة (~ 1 ساعة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مسح أي التكثيف التي شكلت على غطاء كل لوحة باستخدام مهمة حساسة مسح. عدم القيام بذلك قد يؤدي إلى قطرات الماء التي تترسب على مجموعة والتلوث عبر المسوخ المحتشدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الميكروبات مجموعة تعلق الروبوت، تكثيف DMA من كثافة 384 المستعمرات في لوحة (16 أطباق بتري) إلى 1،536 المستعمرات في لوحة (4 أطباق بتري). تنفيذ هذا حتى يتسنى لل1 شارع مستعمرة من لوحة 1 دبابيس إلى الصف 1 العمود 1 للمجموعة الموجزة، 1 شارع مستعمرة من لوحة 2 إلى الصف 1 العمود 2، 1 شارع مستعمرة من لوحة 3 إلى الصف 2 والعمود 1، و مستعمرة 1 شارع لوحة 4 إلى الصف 2العمود 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان مجموعة الموحدة في 30 درجة مئوية خلال الليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دراسة مجموعة لضمان نقل موحد للمستعمرات من لوحات المصدر. سيكون هناك العديد من المناصب فارغة، أدرجت عمدا في مجموعة، والتي تكون بمثابة الدليل لضمان تم مكثف للDMA بشكل صحيح (الشكل 4A). ملاحظة: ستكون هذه لوحات مصدر للتصفيح نسخة على وسائط تحتوي على مركب الاختبار. صفيحة مصدر واحد يمكن أن تستخدم لpinnings متعددة. أيضا العديد من الروبوتات سيكون لها ميزة تعويضية، والتي سوف تضمن أعداد مماثلة من الخميرة ونقله في كل مرة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة طبق الاصل حذف متحولة مجموعة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 700 مل من التحكم (السيارة فقط) و 700 مل من وسائل الاعلام التجريبية (التي تحتوي على مادة كيميائية). وهذا يكفي لأداء الفحص في ثلاث نسخ (12 لوحات في حالة، بالإضافة إلى اثنين اشياء). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب 50 مل من YEPD أجار التي تحتوي على اختبار كيميائي أو السيطرة لكل لوحة. السماح لوحات رس يبرد في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها حتى على سطح مستو. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الروبوت لوحة طبق الاصل، وتحصين DMA على ثلاث مجموعات من اللوحات التي تحتوي على المواد الكيميائية على تركيز العزم تجريبيا، فضلا عن ثلاث مجموعات من اللوحات التي تحتوي على السيطرة على السيارة. احتضان لوحات في درجة حرارة الغرفة لمدة 24-48 ساعة. </li></ol></li></ol> 3. لوحات التصوير وتحليل البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة لوحات من الحاضنة والسماح لهم للقدوم إلى درجة حرارة الغرفة (~ 1 ساعة) قبل التصوير. وهذا يمنع من تشكيل التكثيف في حين التصوير لوحات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحات صورة في 24 و 48 ساعة عن طريق إزالة الغطاء ووضع وجهه لأسفل على الماسح الضوئي سرير مسطح. التقاط الصور بدرجة وضوح لا يقل عن 300 نقطة في البوصة. بدلا من ذلك، استخدم كاميرا رقمية لالتقاط الصور. إذا كان ذلك، تواجه لوحات مكان حتى على خلفية داكنة وإزالة الأغطية إلى الصورة. ملاحظة: سوف تنسيق الملف وتحديد المواقع لوحات تعتمد على برنامج الكمي المستخدمة. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء الكمي ومقارنة أحجام مستعمرة مجموعة باستخدام واحدة من العديد من البرامج مفتوحة المصدر، بما في ذلك Balony 15، SGAtools 16، وScreenMill 17. </li></ol> 4. التحقق من الشاشة ملاحظة: في هذه المرحلة عدة الحذف الخميرة المسوخ سوف يسجل الحساسية لهذه المادة الكيميائية المثيرة للاهتمام. يجب المقبل يمكن التحقق من صحة هذه التفاعلات الكيميائية الوراثية بطريقتين. أولا هوية سلالات حساسة ينبغي تأكيد من قبل PCR. ثانيا، يجب سجل مستقل الحساسية الكيميائية. المبينة أدناه هو بروتوكول موجز لأداء فحوصات للتحقق من صحة اكتشاف سلالة فرط الحساسية، وهي تقنية شائعة في الخميرة علم الأحياء. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خط من المطلوب (الحساسية) المسوخ من مجموعة حذف الخميرة على YEPD أجار تحتوي على 200 ميكروغرام / مل من G418. احتضان عند 30 درجة مئوية حتى شكل مستعمرات. التحقق من النمط الجيني لسلالة من التشخيص PCR مع الاشعال وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطعيم 5 مل من السائل YEPD لكل سلالة واحتضان بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية مع دوران أو اهتزاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس OD 600 وتمييع كل سلالة إلى OD 600 = 1 في DH معقم 2 O. هذه هي الآن الثقافات خميرة طبيعية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستغناء 100 ميكرولتر من تطبيع البرية من نوع الخميرة (BY4741) الثقافة إلى ما A1 من لوحة 96-جيدا. الاستغناء 100 ميكرولتر من ما يصل الى سبعة سلالات إضافية لآبار B1-H1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام pipettor الأقنية للاستغناء 90 ميكرولتر من درهم العقيمة 2 O إلى الآبار A2-H2 من خلال A6-H6. وأخيرا، وإعداد سلسلة من التخفيفات 1:10 من الثقافات الخميرة تطبيع. بدء بواسطة pipetting متسلسل 10 ميكرولتر من العمود 1 إلى العمود 2 مع pipettor الأقنية، والاستمرار عبر لوحة 96-جيدا حتى تتم ست التخفيفات (أي 10 0-10 -5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 2-5 ميكرولتر من الثقافات الخميرة المخفف في شبكة باستخدام الأقنيةpipettor على YEPD وسائل الاعلام الصلبة التي تحتوي على المكافحة الكيميائية والمركبات. احتضان لوحات في درجة حرارة مناسبة لمدة 24-48 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفقد لوحات ومقارنة حساسية مختارة المسوخ لالكيميائية (نسبة إلى BY4741 السيطرة). لوحات صورة في 24 و 48 ساعة كما في الخطوة 3.2. ملاحظة: على الرغم من تحديد عدة سلالات شديدة الحساسية مع أنطولوجيات الجينات ذات الصلة أو وظائف يضفي الثقة للصحة الشاشة، مطلوب التحول من سلالة الحذف الحساسية مع البلازميد يحتوي على نسخة من النوع البري من الجين لإنشاء رسميا أن الجين حذف الفائدة (وليس مخفي الطفرات الموقع الثانية) يسبب حساسية المخدرات. </li></ol>

<ol>
	<li>Giaever, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+profiling+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome.">Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 418, 387-391 (2002).</li><li>Winzeler, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+the+S.+cerevisiae+genome+by+gene+deletion+and+parallel+analysis.">Functional characterization of the S. cerevisiae genome by gene deletion and parallel analysis.</a> Science. 285, 901-906 (1999).</li><li>Breslow, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+strategy+enabling+high-resolution+functional+analysis+of+the+yeast+genome.">A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome.</a> Nat Methods. 5, 711-718 (2008).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+exploration+of+essential+yeast+gene+function+with+temperature-sensitive+mutants.">Systematic exploration of essential yeast gene function with temperature-sensitive mutants.</a> Nat Biotechnol. 29, 361-367 (2011).</li><li>Costanzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+landscape+of+a+cell.">The genetic landscape of a cell.</a> Science. 327, 425-431 (2010).</li><li>Parsons, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+chemical-genetic+and+genetic+interaction+data+links+bioactive+compounds+to+cellular+target+pathways.">Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways.</a> Nat Biotechnol. 22, 62-69 (2004).</li><li>Parsons, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+mode-of-action+of+bioactive+compounds+by+chemical-genetic+profiling+in+yeast.">Exploring the mode-of-action of bioactive compounds by chemical-genetic profiling in yeast.</a> Cell. 126, 611-625 (2006).</li><li>Hillenmeyer, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemical+genomic+portrait+of+yeast:+uncovering+a+phenotype+for+all+genes.">The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes.</a> Science. 320, 362-365 (2008).</li><li>Hillenmeyer, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+analysis+of+genome-wide+fitness+data+in+yeast+reveals+novel+gene+function+and+drug+action.">Systematic analysis of genome-wide fitness data in yeast reveals novel gene function and drug action.</a> Genome Biol. 11, R30 (2010).</li><li>Smith, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competitive+genomic+screens+of+barcoded+yeast+libraries.">Competitive genomic screens of barcoded yeast libraries.</a> J Vis Exp. (54), (2011).</li><li>Bowie, D., Parvizi, P., Duncan, D., Nelson, C. J., Fyles, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical-genetic+identification+of+the+biochemical+targets+of+polyalkyl+guanidinium+biocides.">Chemical-genetic identification of the biochemical targets of polyalkyl guanidinium biocides.</a> Organic &amp; Biomolecular Chemistry. 11, 4359-4366 (2013).</li><li>Alamgir, M., Erukova, V., Jessulat, M., Azizi, A., Golshani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical-genetic+profile+analysis+of+five+inhibitory+compounds+in+yeast.">Chemical-genetic profile analysis of five inhibitory compounds in yeast.</a> BMC Chem Biol. 10 (6), (2010).</li><li>Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cold Spring Harbor Laboratory. Methods In Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , (2005).</li><li>Baryshnikova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+genetic+array+(SGA)+analysis+in+Saccharomyces+cerevisiae+and+Schizosaccharomyces+pombe.">Synthetic genetic array (SGA) analysis in Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe.</a> Methods Enzymol. 470, 145-179 (2010).</li><li>Young, B. P., Loewen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balony:+a+software+package+for+analysis+of+data+generated+by+synthetic+genetic+array+experiments.">Balony: a software package for analysis of data generated by synthetic genetic array experiments.</a> BMC Bioinformatics. 14, 354 (2013).</li><li>Wagih, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SGAtools:+one-stop+analysis+and+visualization+of+array-based+genetic+interaction+screens.">SGAtools: one-stop analysis and visualization of array-based genetic interaction screens.</a> Nucleic Acids Res. 41, W591-W596 (2013).</li><li>Dittmar, J. C., Reid, R. J., Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScreenMill:+a+freely+available+software+suite+for+growth+measurement,+analysis+and+visualization+of+high-throughput+screen+data.">ScreenMill: a freely available software suite for growth measurement, analysis and visualization of high-throughput screen data.</a> BMC Bioinformatics. 11, 353 (2010).</li><li>Longley, D. B., Harkin, D. P., Johnston, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-fluorouracil:+mechanisms+of+action+and+clinical+strategies.">5-fluorouracil: mechanisms of action and clinical strategies.</a> Nat Rev Cancer. 3, 330-338 (2003).</li><li>Lum, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+modes+of+action+for+therapeutic+compounds+using+a+genome-wide+screen+of+yeast+heterozygotes.">Discovering modes of action for therapeutic compounds using a genome-wide screen of yeast heterozygotes.</a> Cell. 116, 121-137 (2004).</li><li>Toussaint, M., Conconi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+and+sensitive+assay+to+measure+yeast+cell+growth:+a+bench+protocol+for+testing+genotoxic+agents.">High-throughput and sensitive assay to measure yeast cell growth: a bench protocol for testing genotoxic agents.</a> Nat Protoc. 1, 1922-1928 (2006).</li><li>Robinson, M. D., Grigull, J., Mohammad, N., Hughes, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FunSpec:+a+web-based+cluster+interpreter+for+yeast.">FunSpec: a web-based cluster interpreter for yeast.</a> BMC Bioinformatics. 3, 35 (2002).</li><li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources.">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nat Protoc. 4, 44-57 (2009).</li><li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatics+enrichment+tools:+paths+toward+the+comprehensive+functional+analysis+of+large+gene+lists.">Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists.</a> Nucleic Acids Res. 37, 1-13 (2009).</li><li>Hong, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Ontology+annotations+at+SGD:+new+data+sources+and+annotation+methods.">Gene Ontology annotations at SGD: new data sources and annotation methods.</a> Nucleic Acids Res. 36, D577-D581 (2008).</li><li>Fang, F., Hoskins, J., Butler, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-fluorouracil+enhances+exosome-dependent+accumulation+of+polyadenylated+rRNAs.">5-fluorouracil enhances exosome-dependent accumulation of polyadenylated rRNAs.</a> Mol Cell Biol. 24, 10766-10776 (2004).</li><li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame,+single-gene+knockout+mutants:+the+Keio+collection.">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Mol Syst Biol. 2, 0008 (2006).</li><li>Nichols, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+landscape+of+a+bacterial+cell.">Phenotypic landscape of a bacterial cell.</a> Cell. 144, 143-156 (2011).</li><li>Dai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+nucleosome+function:+a+highly+versatile+library+of+synthetic+histone+H3+and+H4+mutants.">Probing nucleosome function: a highly versatile library of synthetic histone H3 and H4 mutants.</a> Cell. 134, 1066-1078 (2008).</li></ol>

The authors declare they have no competing financial interests.

المبين هنا هو نهج لتوليد ملامح التفاعل الكيميائي الوراثية. وطريقة بسيطة: من خلال مقارنة أحجام مستعمرة من كل سلالة في مجموعات الحذف الجين شاملة في وجود وعدم وجود مادة كيميائية، ويتم تحديد جميع الجينات اللازمة لتحمل إهانة الكيميائية. ويمكن بعد ذلك استخدام تحليل تخصيب الشرح من القائمة الناتجة من سلالات حساسة لتوفير نظرة ثاقبة وضع المواد الكيميائية للعمل. في حين تم تحسين هذا البروتوكول لفي مهدها الخميرة، فإنه يمكن أيضا أن تتكيف للاستخدام مع غيرها من المجموعات المحتشدة حذف الميكروبية، مثل E. جمع القولونية كيو، والتي تم استخدامها بنجاح للتحقيق في مئات من الاضطرابات الخلوي 26،27. وراسخة التنميط والكيميائية الوراثية في الخميرة والكائنات الحية الأخرى. وقد اعتمدت معظم هذه الدراسات على المقايسات المنافسة التي تجمع تحديد طفرات الحذف من خلال تحليل ميكروأري أو الإنتاجية العالية sequencing من الباركود جينية فريدة. وقد أثبت هذا النهج الناجح في انتاج لمحات من المواد الكيميائية وراثية قوية المكتبات الكيميائية الكبيرة. منهجية الموصوفة هنا يوفر بديلا مفيدا للتحليل الكيميائي الوراثية لعدد أقل من المركبات الاختبار. يوفر الفحص قراءات البسيطة التي هي أقل تكلفة باهظة من التسلسل الإنتاجية العالية أو تحليل ميكروأري ولا تعاني من التحيز التسلسل. في حين أن البروتوكول على النحو المبين يتطلب أداة الروبوتية للتلاعب مستعمرة، مثل هذه النظم أصبحت أكثر بأسعار معقولة، وبالتناوب بروتوكول يمكن تعديلها للاستخدام مع أدوات التدبيس اليدوية، والأمثلة التي أدرجت في قائمة المواد. من المهم أن يكون على بينة من القيود المفروضة على هذا النهج والتنميط الجيني الكيميائية بشكل عام. أولا، يجب أن يكون المجمع تأثير على جدوى في مهدها الخميرة، أو كائن محدد يجري استخدامها. بينما العديد من العمليات البيولوجية الأساسيةوظائف وحفظها جيدا بين حقيقيات النوى، قد تختلف كائن التفاعلات الكيميائية المحددة الوراثية على نطاق واسع، وكذلك امتصاص المواد الكيميائية في الخلايا. كما تجدر الإشارة إلى أن عدة سلالات الحذف وقد وجد أن تكون حساسة للعلاجات الدوائية متعددة 8. وتشمل هذه الجينات المسؤولة عن هروب رأس المال المخدرات، وظيفة فجوي، وسلامة الغشاء. من المهم أن تأخذ في الاعتبار المقاومة للعقاقير المتعددة عند اتخاذ الاستنتاجات فيما يتعلق مباشرة وغير مباشرة وسائط للعمل. تم تنفيذ الشاشة الموضحة هنا باستخدام مجموعة الحذف فرداني، نهج مشترك لتحليل الكيميائي الوراثية في الخميرة. هناك الآن مجموعات متعددة من المسوخ الخميرة المتاحة لمزيد من المساعدات في تحديد وضع مركب كيميائي للعمل. هذا لا يشمل فقط متماثل الكامل ومتخالف مجموعات الحذف مضاعفا، ولكن أيضا مشروطة المسوخ الجينات الأساسية حساسة للحرارة، وDecreASED وفرة من مرنا التشويش (الخام) الخميرة مكتبة متحولة، وهيستون H3 H4 الاصطناعية وجمع متحولة، والتي يمكن استخدامها لتحقيق جينية العلاجات الجزيئية أساس 3،4،28، نظرا لعمق لا تصدق من الأدوات المتاحة، وسهولة هذه المنهجية، والبنية التحتية المطلوبة محدودة، ويوفر هذا النهج شكل يسهل الوصول إليها للوصول إلى المعلومات وظيفية غنية فيما يتعلق بآلية مركب كيميائي.

وقد مكنت الأدوات والموارد المتاحة في الكائن الحي نموذج خميرة الخباز الوراثية واسعة النطاق علم الجينوم وظيفية الدراسات التي توفر مجتمعة نظرة جديدة في كيفية عمل الجينات كشبكات للوفاء بمتطلبات النظم البيولوجية. وكان حجر الزاوية في هذه الأدوات إنشاء تعاونية من مجموعة كاملة من الجينات الحذف غير الضرورية من جميع الأطر القراءة المفتوحة في الخميرة 1،2. ومن الملاحظات اللافتة التي فقط ~ 20٪ من جينات الخميرة ويلزم للبقاء عندما نمت كما haploids تحت ظروف المختبر القياسية. هذا يسلط الضوء على قدرة خلية لالعازلة ضد الاضطرابات الجينومية من خلال الاستفادة من المسارات البيولوجية البديلة. المسوخ الوراثية التي هي قابلة للتطبيق بشكل فردي، ولكن قاتلة في الجمع، وإشارة مسارات بيولوجية موازية متصلة أو متقاربة وتشكيل شبكات التفاعل الجينية التي تصف الوظيفة البيولوجية. مع تطور الشركة المصرية للاتصالات الشرطيةالأليلات mperature الحساسة وhypomorphic من الجينات الأساسية التكنولوجيا لم تقتصر على دراسة الجينات غير الضرورية 3،4. وقد تم تطبيق هذا المفهوم على نطاق الجينوم انتاج منحازة خريطة التفاعل الجيني توضح كيف تتجمع الجينات المسؤولة عن العمليات الخلوية المتشابهة معا 5. الاضطرابات الكيميائية للشبكات الوراثية الجينات الحذف تقليد (الشكل 1) 6. الاستعلام عن المركبات النمو المثبطة ضد مجموعة عالية الكثافة من سلالات الحذف لفرط الحساسية يحدد لمحة التفاعل الكيميائي الوراثية، أي قائمة من الجينات المطلوبة لتحمل الإجهاد الكيميائية. مثل التفاعلات الوراثية، وقد أظهرت شاشات واسعة النطاق من المكتبات الكيميائية التي المركبات مع وضع مماثل من كتلة العمل معا 7. ولذلك، من خلال إنشاء الملف الشخصى التفاعل الكيميائي الوراثية من مركب يمكن الاستدلال على طريقة عمل عن طريق مقارنتها مع لارجنرال الكتريك نطاق التفاعل الجيني الوراثي والكيميائي الاصطناعية مجموعات البيانات 8،9. وقد أجريت شاشات الكيميائية الوراثية على نطاق واسع، حيث يتم استجواب العشرات من المركبات، من خلال فحوصات المنافسة الباركود. في هذا النهج، ويزرع جمع المجمعة من سلالات الحذف بشكل جماعي لعدة أجيال في حجم صغير وسائل الإعلام التي تحتوي على مادة كيميائية. لأن كل متحولة الحذف المرافئ الباركود وراثية فريدة من نوعها، يتم تعقب الجدوى / نمو المسوخ الفردية داخل بركة من سلالات الحذف من قبل ميكروأري أو عالية الإنتاجية تسلسل 10. استنتاج اللياقة البدنية من خلال رصد حجم مستعمرة من المسوخ العريض جسديا نمت على أجار الصلبة التي تحتوي على مركب النشطة بيولوجيا هو أيضا وسيلة فعالة لتحديد التفاعلات الكيميائية الوراثية 11،12. ويوفر هذا النهج بديلا فعالا من حيث التكلفة لفحص القائم على المنافسة ومناسب تماما لمعايرة مكتبات صغيرة من المواد الكيميائية.المبين هنا هو منهجية بسيطة لإنتاج قائمة من التفاعلات الكيميائية الوراثية في S. الخباز أن لا تعتمد على التلاعب الجزيئية علم الأحياء أو البنية التحتية. ويتطلب سوى جمع الخميرة الحذف، جهاز التدبيس الروبوتية أو اليدوي، ومتاحة بحرية برنامج تحليل الصور.

<table><tbody><tr><td>Yeast Extract</td><td>BioBasic</td><td>G0961</td><td>For YEPD liquid/solid media add to 1% final concentration (w/v)</td></tr><tr><td>Tyrptone Powder</td><td>BD Biosciences</td><td>211820</td><td>For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v)</td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Anachemia</td><td>31096-380</td><td>For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v) &amp;#8212; do not autoclave. Prepare 20% stock solution, filter sterilize, and add to media after autoclaving.</td></tr><tr><td>Agar A</td><td>Bio Basic</td><td>FB0010</td><td>For YEPD solid media add to 2% final concentration (w/v)</td></tr><tr><td>G418</td><td>A.G. Scientific Inc.</td><td>G-1033</td><td>Prepare 1,000x stock at 200&amp;nbsp;mg/ml in dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O and filter sterilize.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>12-well plate</td><td>Greiner Bio One</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>5 ml culture tubes</td><td>Evergreen Scientific</td><td>222-2376-080</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Petri Dish</td><td>VWR</td><td>25384-302</td><td></td></tr><tr><td>ROTOR HDA</td><td>Singer Instruments&amp;nbsp;</td><td>ROT-001</td><td>high-throughput microbial array pinning robot</td></tr><tr><td>PLUSPLATE&amp;copy; Petri Dish</td><td>Singer Instruments&amp;nbsp;</td><td>PLU-001</td><td>Box of 200 dishes</td></tr><tr><td>384 Short-Pin RePad</td><td>Singer Instruments&amp;nbsp;</td><td>RP-MP-384</td><td>Box of 1,000 pads</td></tr><tr><td>1536 Short-Pin RePad</td><td>Singer Instruments&amp;nbsp;</td><td>RP-MP-1536</td><td>Box of 1,000 pads</td></tr><tr><td colspan="4">Alternative Pinning Tools:</td></tr><tr><td>Fully Automated Robtic Systems</td><td>S&amp;amp;P robotics</td><td>http://www.sprobotics.com</td><td>Several automated colony handling robitic and imagining systems available.</td></tr><tr><td>Manual Pinning Tools</td><td>V&amp;amp;P Scientific</td><td>http://www.vp-scientific.com</td><td>Handheld replication tools and accessories.&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

rapid identification of chemical genetic interactions in saccharomyces cerevisiae

تحديد طريقة عمل المواد الكيميائية الحيوية النشطة هي التي تهم مجموعة واسعة من الأكاديمية، والمستحضرات الدوائية، والعلماء الصناعي. خميرة الخباز، أو في مهدها الخميرة، هو حقيقي النواة نموذج الذي مجموعة كاملة من ~ 6،000 المسوخ حذف الجينات وhypomorphic الجين ضروري تتوفر تجاريا المسوخ. هذه المجموعات من المسوخ يمكن استخدامها للكشف عن منهجية التفاعلات الكيميائية الجينات، أي الجينات اللازمة لتحمل مادة كيميائية. هذه المعلومات، بدوره، تقارير عن الوضع المحتمل لعمل المجمع. نحن هنا وصف بروتوكول لتحديد سرعة التفاعلات الكيميائية الوراثية في مهدها الخميرة. ونحن لشرح طريقة استخدام وكيل العلاج الكيميائي 5-فلورويوراسيل (5-FU)، والتي لديها آلية واضحة المعالم للعمل. نتائجنا تظهر أن TRAMP النووي RNA وهناك حاجة exosome وإصلاح الحمض النووي الانزيمات لانتشار في وجود 5-FU، وهو ما يتسق مع م السابقicroarray النهج الترميز شريط الكيميائية الوراثية على أساس ومعرفة أن 5-FU يؤثر سلبا على كل من RNA والحمض النووي الأيض. كما وصف بروتوكولات المصادقة المطلوب من هذه الشاشات عالية الإنتاجية.

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

تحديد سرعة التفاعلات الكيميائية الوراثية في<em&gt; خميرة الخباز</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

rapid-identification-chemical-genetic-interactions-saccharomyces

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

10.3K Views.  University of Victoria. Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

Video: Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident processes. Formaldehyde crosslinking followed by chromatin immunoprecipitation and high-throughput sequencing (X-ChIP-seq) has been used to gain many valuable insights into genome biology. However, X-ChIP-seq has notable limitations linked to crosslinking and sonication. Native ChIP avoids these drawbacks by omitting crosslinking, but often results in poor recovery of chromatin-bound proteins. In addition, all ChIP-based methods are subject to antibody quality considerations. Enzymatic methods for mapping protein-DNA interactions, which involve fusion of a protein of interest to a DNA-modifying enzyme, have also been used to map protein-DNA interactions. We recently combined one such method, chromatin endogenous cleavage (ChEC), with high-throughput sequencing as ChEC-seq. ChEC-seq relies on fusion of a chromatin-associated protein of interest to micrococcal nuclease (MNase) to generate targeted DNA cleavage in the presence of calcium in living cells. ChEC-seq is not based on immunoprecipitation and so circumvents potential concerns with crosslinking, sonication, chromatin solubilization, and antibody quality while providing high resolution mapping with minimal background signal. We envision that ChEC-seq will be a powerful counterpart to ChIP, providing an independent means by which to both validate ChIP-seq findings and discover new insights into genomic regulation.

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

We describe chromatin endogenous cleavage coupled with high-throughput sequencing (ChEC-seq), a chromatin immunoprecipitation (ChIP)-orthogonal method for mapping protein binding sites genome-wide with micrococcal nuclease (MNase) fusion proteins.

رسم الخرائط على نطاق الجينوم من التفاعلات البروتين الحمض النووي مع تشيك-سيق في<em&gt; ساكاروميسز سيريفيسياي</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

Genetics

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely related biochemical pathways. Previous methods such as the Synthetic Genetic Array (SGA) analysis, and random mutagenesis techniques using ultraviolet (UV) or chemicals like ethyl methanesulfonate (EMS) or N-ethyl-N- nitrosourea (ENU), have been widely used but are often costly and laborious. Also, these mutagen-based screening methods are frequently associated with severe side effects on the organism, inducing multiple mutations that add to the complexity of isolating the suppressors. Here, we present a simple and effective protocol to identify suppressor mutations in mutants which confer a growth defect in Schizosaccharomyces pombe. The fitness of cells with a growth deficiency in standard rich liquid media or synthetic liquid media can be monitored for recovery using an automated 96-well plate reader over an extended period. Once a cell acquires a suppressor mutation in the culture, its descendants outcompete those of the parental cells. The recovered cells that have a competitive growth advantage over the parental cells can then be isolated and backcrossed with the parental cells. The suppressor mutations are then identified using whole-genome sequencing. Using this approach, we have successfully isolated multiple suppressors that alleviate the severe growth defects caused by loss of Elf1, an AAA+ family ATPase that is important in nuclear mRNA transport and maintenance of genomic stability. There are currently over 400 genes in S. pombe with mutants conferring a growth defect. As many of these genes are uncharacterized, we propose that our method will hasten the identification of novel functional interactions with this user-friendly, high-throughput approach.

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

We present a simple suppressor screen protocol in fission yeast. This method is efficient, mutagen-free, and&#160; selective&#160; for&#160; mutations that&#160; often&#160; occur at&#160; &#160;a&#160; single&#160; genomic&#160; locus.&#160; The protocol is suitable for isolating suppressors that alleviate growth defects in liquid culture that are caused by a mutation or a drug.

شاشة القامع عميق--التسلسل-ساعد، عفوية في "انشطار الخميرة" شيزوساكتشاروميسيس بومبي

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the strength of linkage and association mapping methods, which trace the relationship between DNA sequence variants and phenotype across recombinant progeny from matings between individuals of a species. These approaches, although powerful, are not well suited to trait differences between reproductively isolated species. Here we describe a new method for genome-wide dissection of natural trait variation that can be readily applied to incompatible species. Our strategy, RH-seq, is a genome-wide implementation of the reciprocal hemizygote test. We harnessed it to identify the genes responsible for the striking high temperature growth of the yeast Saccharomyces cerevisiae relative to its sister species S. paradoxus. RH-seq utilizes transposon mutagenesis to create a pool of reciprocal hemizygotes, which are then tracked through a high-temperature competition via high-throughput sequencing. Our RH-seq workflow as laid out here provides a rigorous, unbiased way to dissect ancient, complex traits in the budding yeast clade, with the caveat that resource-intensive deep sequencing is needed to ensure genomic coverage for genetic mapping. As sequencing costs drop, this approach holds great promise for future use across eukaryotes.

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Reciprocal hemizygosity via sequencing (RH-seq) is a powerful new method to map the genetic basis of a trait difference between species. Pools of hemizygotes are generated by transposon mutagenesis and their fitness is tracked through competitive growth using high-throughout sequencing. Analysis of the resulting data pinpoints genes underlying the trait.

رسم الخرائط الوراثية للاختلافات التسامح الحراري بين أنواع الخميرة Saccharomyces عن طريق تحليل الهيميزيغوستي على نطاق الجينوم المتبادل

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

تحديد بروتين المجمعات مع كمية البروتينات في البيرة س.

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Detection of Homologous Recombination Intermediates via Proximity Ligation and Quantitative PCR in Saccharomyces cerevisiae

DNA damage, including DNA double-stranded breaks and inter-strand cross-links, incurred during the S and G2 phases of the cell cycle can be repaired by homologous recombination (HR). In addition, HR represents an important mechanism of replication fork rescue following stalling or collapse. The regulation of the many reversible and irreversible steps of this complex pathway promotes its fidelity. The physical analysis of the recombination intermediates formed during HR enables the characterization of these controls by various nucleoprotein factors and their interactors. Though there are well-established methods to assay specific events and intermediates in the recombination pathway, the detection of D-loop formation and extension, two critical steps in this pathway, has proved challenging until recently. Here, efficient methods for detecting key events in the HR pathway, namely DNA double-stranded break formation, D-loop formation, D-loop extension, and the formation of products via break-induced replication (BIR) in Saccharomyces cerevisiae are described. These assays detect their relevant recombination intermediates and products with high sensitivity and are independent of cellular viability. The detection of D-loops, D-loop extension, and the BIR product is based on proximity ligation. Together, these assays allow for the study of the kinetics of HR at the population level to finely address the functions of HR proteins and regulators at significant steps in the pathway.

Detection of Homologous Recombination Intermediates via Proximity Ligation and Quantitative PCR in Saccharomyces cerevisiae

The D-loop capture (DLC) and D-loop extension (DLE) assays utilize the principle of proximity ligation together with quantitative PCR to quantify D-loop formation, D-loop extension, and product formation at the site of an inducible double-stranded break in Saccharomyces cerevisiae.

الكشف عن وسيطة إعادة التركيب المتماثلة عن طريق ربط القرب و PCR الكمي في Saccharomyces cerevisiae

DNA damage, including DNA double-stranded breaks and inter-strand cross-links, incurred during the S and G2 phases of the cell cycle can be repaired by ...

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, and release of the complex components. Glycerol gradient centrifugation has been used for the separation of protein or RNP (RiboNucleoProtein) complexes for functional and structural studies. Here, we describe the utilization of Grafix (Gradient Fixation), which was first developed to purify and stabilize macromolecular complexes for single particle cryo-electron microscopy, to identify interactions between splicing factors that bind transiently to the spliceosome complex. This method is based on the centrifugation of samples into an increasing concentration of a fixation reagent to stabilize complexes. After centrifugation of yeast total extracts loaded on glycerol gradients, recovered fractions are analyzed by dot blot for the identification of the spliceosome sub-complexes and determination of the presence of individual splicing factors.

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Here, we describe the utilization of Grafix (Gradient Fixation), a glycerol gradient centrifugation in the presence of a crosslinker, to identify interactions between splicing factors that bind transiently to the spliceosome complex.

استخدام Grafix للكشف عن المتفاعلات العابرة من Saccharomyces cerevisiae التشبيكليسومات الفرعية

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, ...

Biochemistry

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

تحليل لميكروأري السكيراء الجعوية</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

الجينوم شاشات التنافسية للمكتبات الخميرة Barcoded

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

تحديد القائم على النمو وتأكيد البيوكيميائية من متطلبات الوراثية للتدهور البروتين في<em&gt; خميرة الخباز</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Genetic Screen for Identification of Multicopy Suppressors in Schizosaccharomyces pombe

Identification of genetic interactions is a powerful tool to decipher the functions of gene(s) by providing insights into their functional relationships with other genes and organization into biological pathways and processes. Although the majority of the genetic screens were initially developed in Saccharomyces cerevisiae, a complementary platform for carrying out these genetic screens has been provided by Schizosaccharomyces pombe. One of the common approaches used to identify genetic interactions is by overexpression of clones from a genome-wide, high-copy-number plasmid library in a loss-of-function mutant, followed by selection of clones that suppress the mutant phenotype.
This paper describes a protocol for carrying out this &#39;multicopy suppression&#39;-based genetic screen in S. pombe. This screen has helped identify multicopy suppressor(s) of the genotoxic stress-sensitive phenotype associated with the absence of the Ell1 transcription elongation factor in S. pombe. The screen was initiated by transformation of the query ell1 null mutant strain with a high-copy-number S. pombe cDNA plasmid library and selecting the suppressors on EMM2 plates containing 4-nitroquinoline 1-oxide (4-NQO), a genotoxic stress-inducing compound. Subsequently, plasmid was isolated from two shortlisted suppressor colonies and digested by restriction enzymes to release the insert DNA. Plasmids releasing an insert DNA fragment were retransformed into the ell1 deletion strain to confirm the ability of these suppressor plasmid clones to restore growth of the ell1 deletion mutant in the presence of 4-NQO and other genotoxic compounds. Those plasmids showing a rescue of the deletion phenotype were sequenced to identify the gene(s) responsible for suppression of the ell1 deletion-associated genotoxic stress-sensitive phenotype.

Genetic Screen for Identification of Multicopy Suppressors in Schizosaccharomyces pombe

This work describes a protocol for a multicopy suppressor genetic screen in Schizosaccharomyces pombe. This screen uses a genome-wide plasmid library to identify suppressor clone(s) of a loss-of-function phenotype associated with a query mutant strain. Novel genetic suppressors of the ell1 null mutant were identified using this screen.

الفحص الجيني لتحديد مثبطات النسخ المتعددة في Schizosaccharomyces pombe

Identification of genetic interactions is a powerful tool to decipher the functions of gene(s) by providing insights into their functional relationships ...

تحديد سرعة التفاعلات الكيميائية الوراثية في

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

رسم الخرائط على نطاق الجينوم من التفاعلات البروتين الحمض النووي مع تشيك-سيق في