ويدعم البحوث في المختبر CJN من المنح التي تعمل من NSERC، المعهد الكندي للسرطان جمعية أبحاث (CCSRI)، والثدي المؤسسة الكندية للسرطان (فرع BC-يوكون).

ويرد سير العمل العام لهذا الإجراء في الشكل 2: ملاحظة. 1. تحديد الجرعة النمو المثبطة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الخميرة الثقافة بين عشية وضحاها ملاحظة: وسائل الإعلام نمو الخميرة استخراج-ببتون-الدكستروز (YEPD) المستخدمة في هذا البروتوكول هو وصفة معيارية 13. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خط خارج BY4741 (ماتا HIS3 Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) الخلايا على لوحة أجار YEPD واحتضان لمدة 48 ساعة على 30 درجة مئوية أو حتى شكل مستعمرات مرئية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الثقافات بين عشية وضحاها، فحقن 5 مل من YEPD وسائل الإعلام السائلة في وعاء الثقافة العقيمة مع مستعمرة واحدة. احتضان بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية مع دوران مستمر أو اهتزاز. سوف ثقافة تصل عادة تشبع من صباح اليوم (~ 2 × 10 8 خلية / مل). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد وسائل الاعلام أجار الصلبة التي تحتوي على جرعات متفاوتة الكيميائية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد عدة أسهمهذه المادة الكيميائية لفحصها في 100X المطلوب التركيز النهائي في مذيب مناسب. ملاحظة: سوف تركيزات فعالة تعتمد على المواد الكيميائية، ويجب أن تحدد تجريبيا. ولذلك فمن المستحسن لاختبار في البداية مجموعة التركيز النهائي واسع، أي من ميكرومتر منخفض لملم عالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل تركيز المواد الكيميائية لفحصها، قسامة 3 مل من المنصهر YEPD أجار إلى عدة العقيمة أنبوب الثقافة. مكان في 55 ° C حمام الماء للحفاظ على من ترسيخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل تركيز المواد الكيميائية لفحصها إضافة 30 ميكرولتر من مجمع 100X إلى وسائل الإعلام المنصهرة، دوامة 2-3 ثانية لخلط، وماصة 1 مل في كل زوج من الآبار مكررة في لوحة 12-جيدا. تأكد من تضمين سيارة تحكم فقط. السماح لوحات لضبط بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. تجاهل أي وسيلة إعلامية إضافية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا انتشار تصفيح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطعيم 10 مل من YEPD وسائل الإعلام السائلة مع 2 ميكرولتر من ثقافة الخميرة المشبعة، ونمت بين عشية وضحاها كما في الخطوة 1.1.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة 25 ميكرولتر من ثقافة الخميرة المخفف لكل بئر، موزعة بالتساوي باستخدام الخرز الزجاجي معقمة أو قضيب، والسماح لوحة لتجف تحت لهب. احتضان لوحة عند 30 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقييم نمو الخميرة (سواء عدد وحجم المستعمرات) على لوحات. تحديد تركيز شبه قاتلة من المركب الذي لا تمنع النمو من خلال أكثر من 10٪ -15٪ لأداء الشاشة. </li></ol></li></ol> 2. المنهجية شاشة الوراثية الكيميائية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صيانة الحذف-متحولة صفيف (DMA) وإعداد لوحة المصدر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحصول على وصف مفصل عن بناء المصفوفات متحولة الحذف من المخزونات الجلسرين يرجى الرجوع إلى Baryshnikova وآخرون. 14. مرة واحدة وقد تم المحتشدة المسوخ الحذف في مناطق ذات كثافة من 384 المستعمرات في لوحة، وDMA يمكن تخزينها لعدة أشهر في 4 درجات مئوية. تكرار على YEPD أجار تحتوي على 200 ميكروغرام / مل من G418 ضروريا لمنع المستعمرات من النمو في كلالبعض. وينبغي تجنب متعددة مكررات التسلسلية لمنع فقدان بطيئة سلالات النمو وتقليل ظهور طفرات القامع: ملاحظة. وهذا هو ذات الصلة ولا سيما إذا الحفاظ على مجموعات كما haploids. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ جميع الخطوات طبق الاصل الطلاء باستخدام الميكروبية arraying النظام الآلي. بدلا من ذلك، والتعامل معها المستعمرات باستخدام أدوات التدبيس اليدوية المحتشدة. ملاحظة: جمع الخميرة الحذف هو متاح في haploids وdiploids من عدة مصادر تجارية وشحن وعادة ما أسهم الجلسرين في لوحات 96-جيدا. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التكثيف مجموعة الحذف متحولة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 250 مل من YEPD وسائل الإعلام أجار تحتوي على 200 ميكروغرام / مل من G418. تركيز الفعال لG418 قد تختلف ولكل الكثير وينبغي اختبار تجريبيا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد خمس لوحات YEPD أجار عن طريق سكب 50 مل من YEPD أجار تحتوي على 200 ميكروغرام / مل من G418 لكل لوحة. القيام بذلك قبل يوم واحد التكثيف مجموعة والسماح لوحات لتبرد في درجة حرارة الغرفةerature بين عشية وضحاها حتى على سطح مستو. ملاحظة: سوف تكون هناك حاجة أربعة لوحات لجمع في كثافة 1،536 سلالة، يسكب لوحة الخامسة كما اضافية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة 16 أطباق بتري تحتوي على مجموعة الحذف متحولة في مناطق ذات كثافة من 384 المستعمرات في لوحة والسماح للقدوم إلى درجة حرارة الغرفة (~ 1 ساعة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مسح أي التكثيف التي شكلت على غطاء كل لوحة باستخدام مهمة حساسة مسح. عدم القيام بذلك قد يؤدي إلى قطرات الماء التي تترسب على مجموعة والتلوث عبر المسوخ المحتشدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الميكروبات مجموعة تعلق الروبوت، تكثيف DMA من كثافة 384 المستعمرات في لوحة (16 أطباق بتري) إلى 1،536 المستعمرات في لوحة (4 أطباق بتري). تنفيذ هذا حتى يتسنى لل1 شارع مستعمرة من لوحة 1 دبابيس إلى الصف 1 العمود 1 للمجموعة الموجزة، 1 شارع مستعمرة من لوحة 2 إلى الصف 1 العمود 2، 1 شارع مستعمرة من لوحة 3 إلى الصف 2 والعمود 1، و مستعمرة 1 شارع لوحة 4 إلى الصف 2العمود 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان مجموعة الموحدة في 30 درجة مئوية خلال الليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دراسة مجموعة لضمان نقل موحد للمستعمرات من لوحات المصدر. سيكون هناك العديد من المناصب فارغة، أدرجت عمدا في مجموعة، والتي تكون بمثابة الدليل لضمان تم مكثف للDMA بشكل صحيح (الشكل 4A). ملاحظة: ستكون هذه لوحات مصدر للتصفيح نسخة على وسائط تحتوي على مركب الاختبار. صفيحة مصدر واحد يمكن أن تستخدم لpinnings متعددة. أيضا العديد من الروبوتات سيكون لها ميزة تعويضية، والتي سوف تضمن أعداد مماثلة من الخميرة ونقله في كل مرة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة طبق الاصل حذف متحولة مجموعة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 700 مل من التحكم (السيارة فقط) و 700 مل من وسائل الاعلام التجريبية (التي تحتوي على مادة كيميائية). وهذا يكفي لأداء الفحص في ثلاث نسخ (12 لوحات في حالة، بالإضافة إلى اثنين اشياء). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب 50 مل من YEPD أجار التي تحتوي على اختبار كيميائي أو السيطرة لكل لوحة. السماح لوحات رس يبرد في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها حتى على سطح مستو. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الروبوت لوحة طبق الاصل، وتحصين DMA على ثلاث مجموعات من اللوحات التي تحتوي على المواد الكيميائية على تركيز العزم تجريبيا، فضلا عن ثلاث مجموعات من اللوحات التي تحتوي على السيطرة على السيارة. احتضان لوحات في درجة حرارة الغرفة لمدة 24-48 ساعة. </li></ol></li></ol> 3. لوحات التصوير وتحليل البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة لوحات من الحاضنة والسماح لهم للقدوم إلى درجة حرارة الغرفة (~ 1 ساعة) قبل التصوير. وهذا يمنع من تشكيل التكثيف في حين التصوير لوحات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحات صورة في 24 و 48 ساعة عن طريق إزالة الغطاء ووضع وجهه لأسفل على الماسح الضوئي سرير مسطح. التقاط الصور بدرجة وضوح لا يقل عن 300 نقطة في البوصة. بدلا من ذلك، استخدم كاميرا رقمية لالتقاط الصور. إذا كان ذلك، تواجه لوحات مكان حتى على خلفية داكنة وإزالة الأغطية إلى الصورة. ملاحظة: سوف تنسيق الملف وتحديد المواقع لوحات تعتمد على برنامج الكمي المستخدمة. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء الكمي ومقارنة أحجام مستعمرة مجموعة باستخدام واحدة من العديد من البرامج مفتوحة المصدر، بما في ذلك Balony 15، SGAtools 16، وScreenMill 17. </li></ol> 4. التحقق من الشاشة ملاحظة: في هذه المرحلة عدة الحذف الخميرة المسوخ سوف يسجل الحساسية لهذه المادة الكيميائية المثيرة للاهتمام. يجب المقبل يمكن التحقق من صحة هذه التفاعلات الكيميائية الوراثية بطريقتين. أولا هوية سلالات حساسة ينبغي تأكيد من قبل PCR. ثانيا، يجب سجل مستقل الحساسية الكيميائية. المبينة أدناه هو بروتوكول موجز لأداء فحوصات للتحقق من صحة اكتشاف سلالة فرط الحساسية، وهي تقنية شائعة في الخميرة علم الأحياء. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خط من المطلوب (الحساسية) المسوخ من مجموعة حذف الخميرة على YEPD أجار تحتوي على 200 ميكروغرام / مل من G418. احتضان عند 30 درجة مئوية حتى شكل مستعمرات. التحقق من النمط الجيني لسلالة من التشخيص PCR مع الاشعال وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطعيم 5 مل من السائل YEPD لكل سلالة واحتضان بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية مع دوران أو اهتزاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس OD 600 وتمييع كل سلالة إلى OD 600 = 1 في DH معقم 2 O. هذه هي الآن الثقافات خميرة طبيعية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستغناء 100 ميكرولتر من تطبيع البرية من نوع الخميرة (BY4741) الثقافة إلى ما A1 من لوحة 96-جيدا. الاستغناء 100 ميكرولتر من ما يصل الى سبعة سلالات إضافية لآبار B1-H1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام pipettor الأقنية للاستغناء 90 ميكرولتر من درهم العقيمة 2 O إلى الآبار A2-H2 من خلال A6-H6. وأخيرا، وإعداد سلسلة من التخفيفات 1:10 من الثقافات الخميرة تطبيع. بدء بواسطة pipetting متسلسل 10 ميكرولتر من العمود 1 إلى العمود 2 مع pipettor الأقنية، والاستمرار عبر لوحة 96-جيدا حتى تتم ست التخفيفات (أي 10 0-10 -5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 2-5 ميكرولتر من الثقافات الخميرة المخفف في شبكة باستخدام الأقنيةpipettor على YEPD وسائل الاعلام الصلبة التي تحتوي على المكافحة الكيميائية والمركبات. احتضان لوحات في درجة حرارة مناسبة لمدة 24-48 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفقد لوحات ومقارنة حساسية مختارة المسوخ لالكيميائية (نسبة إلى BY4741 السيطرة). لوحات صورة في 24 و 48 ساعة كما في الخطوة 3.2. ملاحظة: على الرغم من تحديد عدة سلالات شديدة الحساسية مع أنطولوجيات الجينات ذات الصلة أو وظائف يضفي الثقة للصحة الشاشة، مطلوب التحول من سلالة الحذف الحساسية مع البلازميد يحتوي على نسخة من النوع البري من الجين لإنشاء رسميا أن الجين حذف الفائدة (وليس مخفي الطفرات الموقع الثانية) يسبب حساسية المخدرات. </li></ol>

<ol>
	<li>Giaever, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+profiling+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome.">Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 418, 387-391 (2002).</li><li>Winzeler, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+the+S.+cerevisiae+genome+by+gene+deletion+and+parallel+analysis.">Functional characterization of the S. cerevisiae genome by gene deletion and parallel analysis.</a> Science. 285, 901-906 (1999).</li><li>Breslow, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+strategy+enabling+high-resolution+functional+analysis+of+the+yeast+genome.">A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome.</a> Nat Methods. 5, 711-718 (2008).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+exploration+of+essential+yeast+gene+function+with+temperature-sensitive+mutants.">Systematic exploration of essential yeast gene function with temperature-sensitive mutants.</a> Nat Biotechnol. 29, 361-367 (2011).</li><li>Costanzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+landscape+of+a+cell.">The genetic landscape of a cell.</a> Science. 327, 425-431 (2010).</li><li>Parsons, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+chemical-genetic+and+genetic+interaction+data+links+bioactive+compounds+to+cellular+target+pathways.">Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways.</a> Nat Biotechnol. 22, 62-69 (2004).</li><li>Parsons, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+mode-of-action+of+bioactive+compounds+by+chemical-genetic+profiling+in+yeast.">Exploring the mode-of-action of bioactive compounds by chemical-genetic profiling in yeast.</a> Cell. 126, 611-625 (2006).</li><li>Hillenmeyer, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemical+genomic+portrait+of+yeast:+uncovering+a+phenotype+for+all+genes.">The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes.</a> Science. 320, 362-365 (2008).</li><li>Hillenmeyer, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+analysis+of+genome-wide+fitness+data+in+yeast+reveals+novel+gene+function+and+drug+action.">Systematic analysis of genome-wide fitness data in yeast reveals novel gene function and drug action.</a> Genome Biol. 11, R30 (2010).</li><li>Smith, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competitive+genomic+screens+of+barcoded+yeast+libraries.">Competitive genomic screens of barcoded yeast libraries.</a> J Vis Exp. (54), (2011).</li><li>Bowie, D., Parvizi, P., Duncan, D., Nelson, C. J., Fyles, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical-genetic+identification+of+the+biochemical+targets+of+polyalkyl+guanidinium+biocides.">Chemical-genetic identification of the biochemical targets of polyalkyl guanidinium biocides.</a> Organic &amp; Biomolecular Chemistry. 11, 4359-4366 (2013).</li><li>Alamgir, M., Erukova, V., Jessulat, M., Azizi, A., Golshani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical-genetic+profile+analysis+of+five+inhibitory+compounds+in+yeast.">Chemical-genetic profile analysis of five inhibitory compounds in yeast.</a> BMC Chem Biol. 10 (6), (2010).</li><li>Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cold Spring Harbor Laboratory. Methods In Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , (2005).</li><li>Baryshnikova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+genetic+array+(SGA)+analysis+in+Saccharomyces+cerevisiae+and+Schizosaccharomyces+pombe.">Synthetic genetic array (SGA) analysis in Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe.</a> Methods Enzymol. 470, 145-179 (2010).</li><li>Young, B. P., Loewen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balony:+a+software+package+for+analysis+of+data+generated+by+synthetic+genetic+array+experiments.">Balony: a software package for analysis of data generated by synthetic genetic array experiments.</a> BMC Bioinformatics. 14, 354 (2013).</li><li>Wagih, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SGAtools:+one-stop+analysis+and+visualization+of+array-based+genetic+interaction+screens.">SGAtools: one-stop analysis and visualization of array-based genetic interaction screens.</a> Nucleic Acids Res. 41, W591-W596 (2013).</li><li>Dittmar, J. C., Reid, R. J., Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScreenMill:+a+freely+available+software+suite+for+growth+measurement,+analysis+and+visualization+of+high-throughput+screen+data.">ScreenMill: a freely available software suite for growth measurement, analysis and visualization of high-throughput screen data.</a> BMC Bioinformatics. 11, 353 (2010).</li><li>Longley, D. B., Harkin, D. P., Johnston, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-fluorouracil:+mechanisms+of+action+and+clinical+strategies.">5-fluorouracil: mechanisms of action and clinical strategies.</a> Nat Rev Cancer. 3, 330-338 (2003).</li><li>Lum, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+modes+of+action+for+therapeutic+compounds+using+a+genome-wide+screen+of+yeast+heterozygotes.">Discovering modes of action for therapeutic compounds using a genome-wide screen of yeast heterozygotes.</a> Cell. 116, 121-137 (2004).</li><li>Toussaint, M., Conconi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+and+sensitive+assay+to+measure+yeast+cell+growth:+a+bench+protocol+for+testing+genotoxic+agents.">High-throughput and sensitive assay to measure yeast cell growth: a bench protocol for testing genotoxic agents.</a> Nat Protoc. 1, 1922-1928 (2006).</li><li>Robinson, M. D., Grigull, J., Mohammad, N., Hughes, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FunSpec:+a+web-based+cluster+interpreter+for+yeast.">FunSpec: a web-based cluster interpreter for yeast.</a> BMC Bioinformatics. 3, 35 (2002).</li><li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources.">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nat Protoc. 4, 44-57 (2009).</li><li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatics+enrichment+tools:+paths+toward+the+comprehensive+functional+analysis+of+large+gene+lists.">Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists.</a> Nucleic Acids Res. 37, 1-13 (2009).</li><li>Hong, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Ontology+annotations+at+SGD:+new+data+sources+and+annotation+methods.">Gene Ontology annotations at SGD: new data sources and annotation methods.</a> Nucleic Acids Res. 36, D577-D581 (2008).</li><li>Fang, F., Hoskins, J., Butler, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-fluorouracil+enhances+exosome-dependent+accumulation+of+polyadenylated+rRNAs.">5-fluorouracil enhances exosome-dependent accumulation of polyadenylated rRNAs.</a> Mol Cell Biol. 24, 10766-10776 (2004).</li><li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame,+single-gene+knockout+mutants:+the+Keio+collection.">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Mol Syst Biol. 2, 0008 (2006).</li><li>Nichols, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+landscape+of+a+bacterial+cell.">Phenotypic landscape of a bacterial cell.</a> Cell. 144, 143-156 (2011).</li><li>Dai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+nucleosome+function:+a+highly+versatile+library+of+synthetic+histone+H3+and+H4+mutants.">Probing nucleosome function: a highly versatile library of synthetic histone H3 and H4 mutants.</a> Cell. 134, 1066-1078 (2008).</li></ol>

The authors declare they have no competing financial interests.

المبين هنا هو نهج لتوليد ملامح التفاعل الكيميائي الوراثية. وطريقة بسيطة: من خلال مقارنة أحجام مستعمرة من كل سلالة في مجموعات الحذف الجين شاملة في وجود وعدم وجود مادة كيميائية، ويتم تحديد جميع الجينات اللازمة لتحمل إهانة الكيميائية. ويمكن بعد ذلك استخدام تحليل تخصيب ...

وقد مكنت الأدوات والموارد المتاحة في الكائن الحي نموذج خميرة الخباز الوراثية واسعة النطاق علم الجينوم وظيفية الدراسات التي توفر مجتمعة نظرة جديدة في كيفية عمل الجينات كشبكات للوفاء بمتطلبات النظم البيولوجية. وكان حجر الزاوية في هذه الأدوات إنشاء تعاونية من مجموعة كاملة من الجينات الحذف غير الضرورية من جميع الأطر القراءة المفتوحة في الخميرة 1،2. ومن الملاحظات اللافتة التي فقط ~ 20٪ من جينات الخميرة ويلزم للبقاء عندما نمت كما haploids تحت ظروف المختبر القياسية. هذا يسلط الضوء على قدرة خلية لالعازلة ضد الاضطرابات الجينومية من خلال الاستفادة من المسارات البيولوجية البديلة. المسوخ الوراثية التي هي قابلة للتطبيق بشكل فردي، ولكن قاتلة في الجمع، وإشارة مسارات بيولوجية موازية متصلة أو متقاربة وتشكيل شبكات التفاعل الجينية التي تصف الوظيفة البيولوجية. مع تطور الشركة المصرية للاتصالات الشرطيةالأليلات mperature الحساسة وhypomorphic من الجينات الأساسية التكنولوجيا لم تقتصر على دراسة الجينات غير الضرورية 3،4. وقد تم تطبيق هذا المفهوم على نطاق الجينوم انتاج منحازة خريطة التفاعل الجيني توضح كيف تتجمع الجينات المسؤولة عن العمليات الخلوية المتشابهة معا 5. الاضطرابات الكيميائية للشبكات الوراثية الجينات الحذف تقليد (الشكل 1) 6. الاستعلام عن المركبات النمو المثبطة ضد مجموعة عالية الكثافة من سلالات الحذف لفرط الحساسية يحدد لمحة التفاعل الكيميائي الوراثية، أي قائمة من الجينات المطلوبة لتحمل الإجهاد الكيميائية. مثل التفاعلات الوراثية، وقد أظهرت شاشات واسعة النطاق من المكتبات الكيميائية التي المركبات مع وضع مماثل من كتلة العمل معا 7. ولذلك، من خلال إنشاء الملف الشخصى التفاعل الكيميائي الوراثية من مركب يمكن الاستدلال على طريقة عمل عن طريق مقارنتها مع لارجنرال الكتريك نطاق التفاعل الجيني الوراثي والكيميائي الاصطناعية مجموعات البيانات 8،9. وقد أجريت شاشات الكيميائية الوراثية على نطاق واسع، حيث يتم استجواب العشرات من المركبات، من خلال فحوصات المنافسة الباركود. في هذا النهج، ويزرع جمع المجمعة من سلالات الحذف بشكل جماعي لعدة أجيال في حجم صغير وسائل الإعلام التي تحتوي على مادة كيميائية. لأن كل متحولة الحذف المرافئ الباركود وراثية فريدة من نوعها، يتم تعقب الجدوى / نمو المسوخ الفردية داخل بركة من سلالات الحذف من قبل ميكروأري أو عالية الإنتاجية تسلسل 10. استنتاج اللياقة البدنية من خلال رصد حجم مستعمرة من المسوخ العريض جسديا نمت على أجار الصلبة التي تحتوي على مركب النشطة بيولوجيا هو أيضا وسيلة فعالة لتحديد التفاعلات الكيميائية الوراثية 11،12. ويوفر هذا النهج بديلا فعالا من حيث التكلفة لفحص القائم على المنافسة ومناسب تماما لمعايرة مكتبات صغيرة من المواد الكيميائية.المبين هنا هو منهجية بسيطة لإنتاج قائمة من التفاعلات الكيميائية الوراثية في S. الخباز أن لا تعتمد على التلاعب الجزيئية علم الأحياء أو البنية التحتية. ويتطلب سوى جمع الخميرة الحذف، جهاز التدبيس الروبوتية أو اليدوي، ومتاحة بحرية برنامج تحليل الصور.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="987">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Name of Material/ Equipment&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Company&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Catalog Number&#160;</td>
			<td style="width:457px;">Comments/Description&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:213px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:161px;">BioBasic</td>
			<td>G0961</td>
			<td style="width:457px;">For YEPD liquid/solid media add to 1% final concentration (w/v)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:213px;">Tyrptone Powder</td>
			<td style="width:161px;">BD Biosciences</td>
			<td>211820</td>
			<td style="width:457px;">For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:213px;">Dextrose</td>
			<td style="width:161px;">Anachemia</td>
			<td style="width:156px;">31096-380</td>
			<td style="width:457px;">For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v) - Do not autoclave. Prepare 20% stock solution, filter sterilize, and add to media after autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Agar A</td>
			<td style="width:161px;">Bio Basic</td>
			<td>FB0010</td>
			<td style="width:457px;">For YEPD solid media add to 2% final concentration (w/v)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:213px;">G418</td>
			<td style="width:161px;">A.G. Scientific Inc.</td>
			<td style="width:156px;">G-1033</td>
			<td style="width:457px;">Prepare 1000x stock at 200mg/ml in dH2O and filter sterilize.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">12 well plate</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">5ml culture tubes</td>
			<td>Evergreen Scientific</td>
			<td>222-2376-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">10cm Petri Dish</td>
			<td style="width:161px;">VWR</td>
			<td>25384-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ROTOR HDA</td>
			<td>Singer Instruments&#160;</td>
			<td>ROT-001</td>
			<td>high-throughput microbial array pinning robot</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PLUSPLATE&#169; Petri Dish</td>
			<td>Singer Instruments&#160;</td>
			<td>PLU-001</td>
			<td>Box of 200 dishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">384 Short-Pin RePad</td>
			<td>Singer Instruments&#160;</td>
			<td>RP-MP-384</td>
			<td>Box of 1000 pads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1536 Short-Pin RePad</td>
			<td>Singer Instruments&#160;</td>
			<td>RP-MP-1536</td>
			<td>Box of 1000 pads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alternative Pinning Tools:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fully Automated Robtic Systems</td>
			<td>S&#38;P robotics</td>
			<td>http://www.sprobotics.com</td>
			<td>Several automated colony handling robitic and imagining systems available.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manual Pinning Tools</td>
			<td>V&#38;P Scientific</td>
			<td>http://www.vp-scientific.com</td>
			<td>Handheld replication tools and accessories.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid identification of chemical genetic interactions in saccharomyces cerevisiae

تحديد طريقة عمل المواد الكيميائية الحيوية النشطة هي التي تهم مجموعة واسعة من الأكاديمية، والمستحضرات الدوائية، والعلماء الصناعي. خميرة الخباز، أو في مهدها الخميرة، هو حقيقي النواة نموذج الذي مجموعة كاملة من ~ 6،000 المسوخ حذف الجينات وhypomorphic الجين ضروري تتوفر تجاريا المسوخ. هذه المجموعات من المسوخ يمكن استخدامها للكشف عن منهجية التفاعلات الكيميائية الجينات، أي الجينات اللازمة لتحمل مادة كيميائية. هذه المعلومات، بدوره، تقارير عن الوضع المحتمل لعمل المجمع. نحن هنا وصف بروتوكول لتحديد سرعة التفاعلات الكيميائية الوراثية في مهدها الخميرة. ونحن لشرح طريقة استخدام وكيل العلاج الكيميائي 5-فلورويوراسيل (5-FU)، والتي لديها آلية واضحة المعالم للعمل. نتائجنا تظهر أن TRAMP النووي RNA وهناك حاجة exosome وإصلاح الحمض النووي الانزيمات لانتشار في وجود 5-FU، وهو ما يتسق مع م السابقicroarray النهج الترميز شريط الكيميائية الوراثية على أساس ومعرفة أن 5-FU يؤثر سلبا على كل من RNA والحمض النووي الأيض. كما وصف بروتوكولات المصادقة المطلوب من هذه الشاشات عالية الإنتاجية.

كما التحقق من صحة هذا النهج أجرينا شاشة التفاعل تمثيلية الكيميائية الوراثية من وكيل العلاج الكيميائي 5-فلورويوراسيل (5-FU) بعد بروتوكول المبينة أعلاه. ومن المعروف 5-FU لتعطيل ثيميديلات سينسيز وكذلك DNA و RNA الأيض 18. التفاعلات الكيميائية الوراثية من 5-FU هي مدروسة وتم ا...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

تحديد سرعة التفاعلات الكيميائية الوراثية في<em&gt; خميرة الخباز</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

rapid-identification-chemical-genetic-interactions-saccharomyces

Research

JoVE Journal

Biology

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

10.2K Views.  University of Victoria. Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

Video: Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

تشريح السكيراء الجعوية زقاق

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

تحديد بروتين المجمعات مع كمية البروتينات في البيرة س.

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

حفز Phosphoproteomics الكمية في الأحماض الدهنية السكيراء الجعوية</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

تحليل لميكروأري السكيراء الجعوية</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

تحليل سريع لالوراثية طلائي-الوسيطة اشارة خلال تجديد الشعر

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

التصور والتحليل من جزيئات الرنا المرسال عن طريق الإسفار<em&gt; في الموضع</em&gt; التهجين في<em&gt; خميرة الخباز</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

فحوصات بالإضافة لرصد طوي ثانية بروتين في<em&gt; خميرة الخباز</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

تنقية التليف الكيسي عبر الغشاء المواصلة منظم البروتين المعبر عنه في<em&gt; خميرة الخباز</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to identify and quantify the cofactors in their detectable redox state.
The technique is complementary to direct electrochemistry (voltammetry) approaches, as it does not offer information on electron transfer rates, but does establish the identity and redox state of the cofactors in the protein under study. The technique is widely applicable to any protein containing an electron paramagnetic resonance (EPR) detectable cofactor.
A typical titration requires 2 ml protein with a cofactor concentration in the range of 1-100 &#181;M. The protein is titrated with a chemical reductant (sodium dithionite) or oxidant (potassium ferricyanide) in order to poise the sample at a certain potential. A platinum wire and a Ag/AgCl reference electrode are connected to a voltmeter to measure the potential of the protein solution. A set of 13 different redox mediators is used to equilibrate between the redox cofactors of the protein and the electrodes. Samples are drawn at different potentials and the Electron Paramagnetic Resonance spectra, characteristic for the different redox cofactors in the protein, are measured. The plot of the signal intensity versus the sample potential is analyzed using the Nernst equation in order to determine the midpoint potential of the cofactor.

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

The goal of this protocol is to use electron paramagnetic resonance (EPR) monitored redox titrations to identify different cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1. Redox titrations offer a very robust way to obtain midpoint potentials of different redox active cofactors in enzymes and proteins.

EPR رصدت الأكسدة والاختزال المعايرة من العوامل المساعدة لل<em&gt; خميرة الخباز</em&gt; Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the correct amount of protein is synthesized for the cell&#8217;s specific growth conditions. One approach for measuring mRNA decay rates is inhibiting transcription and subsequently monitoring the disappearance of the already present mRNA. The rate of mRNA decay can then be quantified, and an accurate half-life can be determined utilizing several techniques. In S. cerevisiae, protocols that measure mRNA half-lives have been developed and include inhibiting transcription of mRNA using strains that harbor a temperature sensitive allele of RNA polymerase II, rpb1-1. Other techniques for measuring mRNA half-lives include inhibiting transcription with transcriptional inhibitors such as thiolutin or 1,10-phenanthroline, or alternatively, by utilizing mRNAs that are under the control of a regulatable promoter such as the galactose inducible promoter and the TET-off system. Here, we describe measurement of S. cerevisiae mRNA decay rates using the temperature sensitive allele of RNA polymerase II. This technique can be used to measure mRNA decay rates of individual mRNAs or genome-wide.

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

The steady state level of specific mRNAs is determined by the rate of synthesis and decay of the mRNA. Genome-wide mRNA degradation rates or the decay rates of specific mRNAs can be measured by determining mRNA half-lives. This protocol focuses on measurement of mRNA decay rates in Saccharomyces cerevisiae.

قياس مرنا تسوس الأسعار<em&gt; خميرة الخباز</em&gt; استخدام<em&gt; rpb1-1</em&gt; سلالات

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...