Die Forschung im Labor CJN durch Betriebskostenzuschüsse von NSERC, der Canadian Cancer Society Research Institute (CCSRI) und der Canadian Breast Cancer Foundation (BC-Yukon Branch) unterstützt.

HINWEIS: Der allgemeine Arbeitsablauf dieses Verfahrens ist in Figur 2 skizziert. 1. Bestimmung der wachstumshemmende Dosis <ol><li> Herstellung von Hefe-Nacht-Kultur HINWEIS: Der Hefeextrakt-Pepton-Dextrose Wachstumsmedium (YEPD) im Sinne dieses Protokolls ist ein Standardrezept 13. <ol><li> Streak aus BY4741 (MATa his3 Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) Zellen auf einer YEPD-Agar-Platte und Inkubation für 48 Stunden bei 30 ° C oder bis sichtbare Kolonien zu bilden. </li><li> Übernachtkulturen herzustellen durch Inokulieren von 5 ml YEPD flüssigen Medium in einem sterilen Kulturgefäß mit einer Einzelkolonie. Inkubieren über Nacht bei 30 ° C mit kontinuierlicher Rotation oder Schütteln. Die Kultur wird in der Regel erreichen die Sättigung von der Morgen (~ 2 × 10 8 Zellen / ml). </li></ol></li><li> Solide Agarmedien Zubereitung mit unterschiedlichen chemischen Dosen <ol><li> Bereiten Sie einige Vorräte andie Chemikalie bei 100x gewünschte Endkonzentration in einem geeigneten Lösemittel getestet werden. HINWEIS: Wirksame Konzentrationen werden von der chemischen abhängen und muss empirisch ermittelt werden. Es ist daher ratsam, zunächst zu testen eine breite Endkonzentrationsbereich, dh von niedrigen uM bis hoch mM. </li><li> Für jede Konzentration der zu testenden Chemikalie, Aliquot 3 ml geschmolzenem YEPD-Agar mit einem mehrere sterile Kulturröhrchen. Platz in 55 ° C Wasserbad auf erstarrt halten. </li><li> Für jede Konzentration der zu testenden Chemikalie werden 30 ul der 100-fach Verbindung in geschmolzenem Medium, Wirbel 2-3 sec mischen und Pipette 1 ml in jedes Paar von doppelten Vertiefungen einer Platte mit 12 Vertiefungen. Achten Sie darauf, ein Fahrzeug sind nur Kontrolle. Lassen Platten über Nacht bei Raumtemperatur einstellen. Werfen Sie keine zusätzliche Medien. </li></ol></li><li> Verteilt Plattierzellen <ol><li> Impfen Sie 10 ml YEPD flüssige Medien mit 2 ul einer gesättigten Hefekultur, über Nacht, wie in Schritt 1 aufgewachsen.1.2. </li><li> Platte 25 ul verdünnt Hefekultur pro Well, gleichmäßig mit sterilen Glasperlen oder Stange und damit die Platte unter einer Flamme trocknen. Inkubieren Platte bei 30 ° C für 48 Stunden. </li><li> Bewerten des Wachstums von Hefe (sowohl Anzahl und Größe der Kolonien) auf den Platten. Wählen einer subletalen Konzentration der Verbindung, die nicht das Wachstum hemmt, um mehr als 10% bis 15%, um den Bildschirm durchzuführen. </li></ol></li></ol> 2. Systematische Chemical Genetische Bildschirm <ol><li> Wartung von Lösch-Mutante-Array (DMA) und Vorbereitung der Quelle-Platte <ol><li> Für eine detaillierte Beschreibung über den Aufbau Deletionsmutante Arrays aus Glycerin Aktien finden Sie in Baryshnikova et al. 14 verwiesen. Sobald Deletionsmutanten in einer Dichte von 384 Kolonien pro Platte angeordnet wurde, kann der DMA für einige Monate bei 4 ° C gelagert werden. Replizieren auf YEPD-Agar, enthaltend 200 ug / ml G418 wie nötig, um Kolonien zu wachsen in jede verhindernandere. HINWEIS: Mehrere serielle Replikationen sollte vermieden werden, um den Verlust von langsamem Wachstum zu verhindern und das Auftreten von Suppressormutanten minimieren. Dies ist besonders relevant, wenn die Aufrechterhaltung der Sammlungen als Haploiden. </li><li> Führen Sie alle Replikat-Plating Schritte mit einer mikrobiellen Anordnen Robotersystem. Alternativ manipulieren angeordnet Kolonien mit manuellen Pinning-Tools. HINWEIS: Die Hefe Löschen Kollektion ist so Haploiden und Diploide von mehreren kommerziellen Quellen erhältlich und wird in der Regel als Glyzerin in 96-Well-Platten geliefert. </li></ol></li><li> Kondensieren der Deletionsmutante Array <ol><li> Bereiten 250 ml YEPD-Agarmedium, enthaltend 200 ug / ml G418. Die effektive Konzentration von G418 können variieren und jede Menge sollte empirisch überprüft werden. </li><li> Bereiten fünf YEPD Agarplatten durch Gießen von 50 ml YEPD-Agar, enthaltend 200 ug / ml G418 pro Platte. Tun Sie dies einen Tag vor Kondensation des Array und damit die Platten bei Raumtemperatur abkühlenratur über Nacht auf eine ebene Unterlage. HINWEIS: Vier Platten werden für die Sammlung bei 1536-Dehnungs Dichte erforderlich ist, wird die fünfte Platte als extra gegossen. </li><li> Entfernen Sie die 16 Petrischalen, die das mutierte Löschen Sammlung bei einer Dichte von 384 Kolonien pro Platte und lassen Sie sie auf Raumtemperatur (ca. 1 Stunde) zu kommen. </li><li> Wischen Sie Kondensation, die mit eine heikle Aufgabe wischen auf dem Deckel jeder Platte gebildet hat. Bei Nichtbeachtung kann es zu Wassertröpfchen führen, dass auf dem Array und Kreuzkontamination von angeordneten Mutanten hinterlegt. </li><li> Mit einem mikrobiellen Array Pinning Roboter, kondensieren die DMA von einer Dichte von 384 Kolonien pro Platte (16 Petrischalen), um 1536 Kolonien pro Platte (4 Petrischalen). Führen Sie diese, so dass der 1. Kolonie von Platte 1 Stifte 1 Spalte 1 der verkürzten Reihe rudern, um die 1. Kolonie Platte 2 Zeile 1 Spalte 2, der 1. Kolonie Platte 3 zu Zeile 2 und Spalte 1, und der 1. Kolonie Platte 4 zu Zeile 2Spalte 2. </li><li> Inkubieren Sie die Konzern-Array bei 30 ° C über Nacht. </li><li> Untersuchen Sie das Array, um eine einheitliche Übertragung von Kolonien von der Quelle Platten zu gewährleisten. Es werden mehrere leere Positionen, absichtlich in das Array aufgenommen, die als Richtschnur dienen, um sicherzustellen, das DMA korrekt (4A) kondensiert sein. HINWEIS: Diese greift auf die Quellplatten für Replikaplattierung auf Medien, die die Testverbindung sein. Eine Hand Platte kann für mehrere Pinnings verwendet werden. Auch viele Roboter Gegenläufig-Funktion, die eine ähnliche Anzahl von Hefe werden jedes Mal übertragen gewährleisten müssen. </li></ol></li><li> Replica Platte Deletionsmutante Array <ol><li> Bereiten 700 ml der Kontrolle (nur Vehikel) und 700 ml Versuchsmedien (chemische haltigen). Das ist genug, zur Durchführung des Assays in dreifacher Ausfertigung (12 Platten pro Zustand, plus zwei Extrakosten). </li><li> Gießen Sie 50 ml YEPD-Agar, der Prüfsubstanz oder Steuer pro Platte. Lassen Sie die Platten to bei Raumtemperatur über Nacht abkühlen lassen auf eine ebene Unterlage. </li><li> Verwendung des Roboters zu Replikaplatte inokulieren die DMA auf drei Sätze von Platten, die Chemikalien an der experimentell bestimmten Konzentration, sowie drei Sätze von Platten, die die Vehikelkontrolle. Platten bei Raumtemperatur inkubieren 24-48 h. </li></ol></li></ol> 3. Speicherfolien und Datenanalyse <ol><li> Platten Entfernen von Inkubator und lassen Sie sie auf Raumtemperatur (ca. 1 Stunde) vor der Bilderzeugung kommen. Dadurch wird die Bildung von Kondenswasser während Abbildung der Platten zu verhindern. </li><li> Bildplatten 24 und 48 Stunden nach Entfernen des Deckels und Platzierung der Vorderseite nach unten auf einem Flachbettscanner. Machen Sie Bilder mit einer Auflösung von mindestens 300 dpi. Alternativ können Sie eine Digitalkamera zur Erfassung von Bildern. Wenn dabei konfrontiert Ort Platten auf einem dunklen Hintergrund, und entfernen Sie den Deckel zu Bild. HINWEIS: Das Dateiformat und Positionierung der Platten wird auf der Quantifizierung Programm abhängen. </li&gt; <li> Führen Quantifizierung und den Vergleich der Array Koloniegrößen mit einem der vielen Open-Source-Programme, einschließlich Balony 15. SGAtools 16 und ScreenMill 17. </li></ol> 4. Validierung von Screen HINWEIS: In dieser Phase wird mehrere Hefe-Mutanten Deletionen als überempfindlich auf die Chemikalie punkten. Diese chemisch-genetischer Interaktionen muss nächste auf zwei Arten überprüft werden. Zunächst wird die Identität der empfindliche Stämme sollten durch PCR bestätigt werden. Zweitens müssen die Chemikalien-Sensitivität unabhängig gewertet. Folgenden Abschnitten wird eine kurze Protokoll zur Durchführung von Tests, um Spotting Dehnungsempfindlichkeit, eine Technik, die in Hefe Biologie gemeinsam zu überprüfen. <ol><li> Streak out gewünschte (allergisch) Mutanten aus der Deletion Sammlung Hefe auf YEPD-Agar, enthaltend 200 ug / ml G418. Inkubiere bei 30 ° C bis Kolonien bilden. Stellen Sie sicher, das Erbgut des Stammes durch diagnostische PCR mit Primern nachProtokoll des Herstellers. </li><li> Impfen Sie 5 ml der YEPD Flüssigkeit für jeden Stamm beimpft und über Nacht bei 30 ° C mit einer Rotation oder Schütteln. </li><li> Messen OD 600 und verdünnt jede Belastung in sterile dH 2 O OD 600 = 1 Diese werden nun die normierten Hefekulturen. </li><li> Dispense 100 ul der normalisierten Wildtyp-Hefe (BY4741) Kultur und A1 einer 96-Well-Platte. Dispense 100 ul von bis zu sieben zusätzliche Belastungen in die Vertiefungen B1-H1. </li><li> Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette auf 90 ul sterilem dH 2 O in die Vertiefungen A2-H2 bis A6-H6 verzichten. Schließlich bereiten eine Reihe von 1:10 Verdünnungen normalisierte Hefekulturen. Starten Sie durch serielles Pipettieren von 10 ul der Spalte 1 Spalte 2 mit einer Mehrkanalpipette, und weiter über die Platte mit 96 Vertiefungen bis sechs Verdünnungen hergestellt werden (dh 10 0 bis 10 -5). </li><li> Übertragen Sie 2-5 ul der verdünnten Hefekulturen in einem Raster mit einer MehrkanalPipette auf YEPD festen Medien, die chemischen und Fahrzeugsteuerung. Platten bei der geeigneten Temperatur für 24-48 Std. </li><li> Untersuchen Platten und vergleichen Sie die Empfindlichkeit des ausgewählten Mutanten gegen chemische (bezogen auf BY4741-Steuerung). Bildplatten bei 24 und 48 h, wie in Schritt 3.2. HINWEIS: Während der Identifizierung mehrerer überempfindlich Stämme mit verwandten Gen Ontologien oder Funktionen verleiht Vertrauen auf die Gültigkeit des Bildschirms, Umwandlung eines überempfindlichen Deletionsstamm mit einem Plasmid, das eine Wildtyp-Kopie des Gens wird benötigt, um förmlich festgestellt werden, dass ein Gen, Löschen von Interesse (und nicht versteckt zweiten Standort Mutationen) verursacht Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten. </li></ol>

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The authors declare they have no competing financial interests.

Hier skizziert ist ein Ansatz zur Erzeugung von chemisch-genetischer Interaktionsprofile. Das Verfahren ist einfach: durch Vergleich Koloniegrößen von jedem Stamm in umfassenden Gendeletion Sammlungen in Gegenwart und in Abwesenheit einer chemischen, alle Gene benötigt wird, um eine chemische Insult tolerieren identifiziert. Annotation Bereicherung Analyse des resultierenden Liste sensibler Stämme können dann verwendet werden, um einen Einblick in eine Chemikalien Wirkungs bieten. Während dieses Protokolls für B?...

Die genetischen Tools und Ressourcen im Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae haben großen funktionellen Genomik Studien, die gemeinsam ein neues Licht auf, wie Gene funktionieren, wie Netzwerke, um die Anforderungen von biologischen Systemen erfüllen zu können. Der Grundstein dieser Tools war die gemeinsame Erstellung eines vollständigen Satzes von nicht wesentlichen Gendeletionen aller offenen Leserahmen in Hefe 1,2. Eine auffallende Beobachtung war, dass nur ~ 20% der Hefe-Gene sind für die Lebensfähigkeit erforderlich, wenn als Haploiden unter Standardlaborbedingungen gezüchtet. Dies unterstreicht die Fähigkeit einer Zelle, durch die Nutzung alternativer biologischen Bahnen gegen genomische Perturbationen puffern. Genetische Mutanten, die individuell lebensfähig sind, aber tödlich in Verbindung, Signal angeschlossenen oder konvergent parallel biologische Pfade und bilden genetische Interaktionsnetzwerke, die biologische Funktion zu beschreiben. Mit der Entwicklung der bedingten temperature empfindlichen und hypomorphen Allele von essentiellen Genen die Technik nicht auf die Untersuchung von nicht-essentiellen Genen 3,4 beschränkt. Dieses Konzept wurde in einer genomischen Maßstab angewendet produziert eine unvoreingenommene genetische Interaktion Karte darstellen, wie Gene in ähnlichen zellulären Prozessen beteiligt Cluster zusammen 5. Chemische Störungen der genetischen Netzwerke Mimik Gendeletionen (Abbildung 1) 6. Abfragen von wachstumshemmenden Verbindungen gegen eine hochdichte Anordnung von Deletionsstämme Überempfindlichkeit identifiziert eine chemisch-genetischen Interaktionsprofil, also eine Liste von Genen, die erforderlich ist, um die chemische Beanspruchung verträgt. Wie genetische Interaktionen, Großbildschirme von chemischen Bibliotheken haben gezeigt, dass mit einem ähnlichen Wirkmechanismus Cluster zusammen 7 Verbindungen. Daher wird durch die Gründung der chemisch-genetische Wechselwirkungsprofil von einer Verbindung der Wirkmechanismus kann durch einen Vergleich mit lar entnehmen,ge-Skala synthetischen genetischen und chemischen genetische Interaktion Datensätze von 8,9. Groß chemisch-genetischen Screens, wo Dutzende von Verbindungen werden verhört wurden von Barcode Konkurrenztests durchgeführt. Bei diesem Ansatz wird die gepoolte Sammlung von Deletionsmutanten ist en masse über mehrere Generationen in einem kleinen Volumen an Medium, das eine chemische gezüchtet. Da jeder Deletionsmutante beherbergt eine einzigartige genetische Barcode wird die Lebensfähigkeit / Wachstum einzelner Mutanten innerhalb des Pools von Deletionsstämme von Microarray-oder Hochdurchsatz-Sequenzierung 10 verfolgt. Ableitung Fitness durch Überwachung Koloniegröße von physikalisch Array-Mutanten auf festem Agar, der eine bioaktive Verbindung gewachsen ist auch eine wirksame Methode, um chemisch-genetischer Interaktionen 11,12 identifizieren. Dieser Ansatz bietet eine kostengünstige Alternative für den Wettbewerb basierten Screening und zur Bestimmung von kleinen Bibliotheken von Chemikalien geeignet.Hier skizziert ist eine einfache Methode zur Erzeugung einer Liste von chemisch-genetischer Interaktionen in S. cerevisiae, die nicht auf der Molekularbiologie Manipulationen oder Infrastruktur angewiesen ist. Es erfordert nur eine Hefe Löschen Sammlung, einen Roboter oder manuell Pinning Gerät und frei verfügbaren Bildanalyse-Software.

<table><tbody><tr><td>Yeast Extract</td><td>BioBasic</td><td>G0961</td><td>For YEPD liquid/solid media add to 1% final concentration (w/v)</td></tr><tr><td>Tyrptone Powder</td><td>BD Biosciences</td><td>211820</td><td>For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v)</td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Anachemia</td><td>31096-380</td><td>For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v) &amp;#8212; do not autoclave. Prepare 20% stock solution, filter sterilize, and add to media after autoclaving.</td></tr><tr><td>Agar A</td><td>Bio Basic</td><td>FB0010</td><td>For YEPD solid media add to 2% final concentration (w/v)</td></tr><tr><td>G418</td><td>A.G. Scientific Inc.</td><td>G-1033</td><td>Prepare 1,000x stock at 200&amp;nbsp;mg/ml in dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O and filter sterilize.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>12-well plate</td><td>Greiner Bio One</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>5 ml culture tubes</td><td>Evergreen Scientific</td><td>222-2376-080</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Petri Dish</td><td>VWR</td><td>25384-302</td><td></td></tr><tr><td>ROTOR HDA</td><td>Singer Instruments&amp;nbsp;</td><td>ROT-001</td><td>high-throughput microbial array pinning robot</td></tr><tr><td>PLUSPLATE&amp;copy; Petri Dish</td><td>Singer Instruments&amp;nbsp;</td><td>PLU-001</td><td>Box of 200 dishes</td></tr><tr><td>384 Short-Pin RePad</td><td>Singer Instruments&amp;nbsp;</td><td>RP-MP-384</td><td>Box of 1,000 pads</td></tr><tr><td>1536 Short-Pin RePad</td><td>Singer Instruments&amp;nbsp;</td><td>RP-MP-1536</td><td>Box of 1,000 pads</td></tr><tr><td colspan="4">Alternative Pinning Tools:</td></tr><tr><td>Fully Automated Robtic Systems</td><td>S&amp;amp;P robotics</td><td>http://www.sprobotics.com</td><td>Several automated colony handling robitic and imagining systems available.</td></tr><tr><td>Manual Pinning Tools</td><td>V&amp;amp;P Scientific</td><td>http://www.vp-scientific.com</td><td>Handheld replication tools and accessories.&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

rapid identification of chemical genetic interactions in saccharomyces cerevisiae

Die Ermittlung der Wirkungsweise von bioaktiven Chemikalien ist von Interesse für ein breites Spektrum von akademischen, pharmazeutischen und industriellen Wissenschaftlern. Saccharomyces cerevisiae oder Bäckerhefe, ist ein Modell, Eukaryoten, für die eine vollständige Sammlung von ~ 6000 Gen-Deletionsmutanten und hypomorphen essentielles Gen Mutanten sind im Handel erhältlich. Diese Sammlung von Mutanten verwendet werden, um systematisch erkennen chemisch-Gen-Interaktionen, dh Gene notwendig, eine chemische tolerieren. Diese Information wiederum berichtet über die wahrscheinliche Wirkungsweise der Verbindung. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die schnelle Identifizierung von chemischen genetischen Wechselwirkungen in Bäckerhefe. Wir zeigen, das Verfahren unter Verwendung des Chemotherapeutikum 5-Fluorouracil (5-FU), die eine wohldefinierte Wirkmechanismus besitzt. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Kern TRAMP RNA-Exosom und DNA-Reparaturenzyme sind für die Proliferation in Gegenwart von 5-FU, die im Einklang mit früheren m ist erforderlichicroarray basierten Barcode-Chemie genetische Ansätze und das Wissen, dass 5-FU beeinträchtigt sowohl RNA als auch DNA-Stoffwechsel. Die erforderlichen Validierungsprotokolle dieser Hochdurchsatz werden ebenfalls beschrieben.

Als Validierung dieses Ansatzes Wir führten eine repräsentative chemische genetische Wechselwirkung Bildschirm des Chemotherapeutikum 5-Fluorouracil (5-FU) gemäß dem oben beschriebenen Protokoll. 5-FU ist bekannt, die Thymidylat-Synthase sowie die DNA und RNA-Metabolismus 18 stören. Die chemischen genetischen Wechselwirkungen von 5-FU sind gut untersucht und wurden von Hefe Barcode-Mikroarray-Techniken unter Verwendung von sowohl heterozygote und homozygote Deletion Sammlungen 8,19 untersucht....

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Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

Schnelle Identifikation von chemischen Genetische Interaktionen in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

rapid-identification-chemical-genetic-interactions-saccharomyces

Research

JoVE Journal

Biology

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

10.3K Aufrufe.  University of Victoria. Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

Serie: Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident processes. Formaldehyde crosslinking followed by chromatin immunoprecipitation and high-throughput sequencing (X-ChIP-seq) has been used to gain many valuable insights into genome biology. However, X-ChIP-seq has notable limitations linked to crosslinking and sonication. Native ChIP avoids these drawbacks by omitting crosslinking, but often results in poor recovery of chromatin-bound proteins. In addition, all ChIP-based methods are subject to antibody quality considerations. Enzymatic methods for mapping protein-DNA interactions, which involve fusion of a protein of interest to a DNA-modifying enzyme, have also been used to map protein-DNA interactions. We recently combined one such method, chromatin endogenous cleavage (ChEC), with high-throughput sequencing as ChEC-seq. ChEC-seq relies on fusion of a chromatin-associated protein of interest to micrococcal nuclease (MNase) to generate targeted DNA cleavage in the presence of calcium in living cells. ChEC-seq is not based on immunoprecipitation and so circumvents potential concerns with crosslinking, sonication, chromatin solubilization, and antibody quality while providing high resolution mapping with minimal background signal. We envision that ChEC-seq will be a powerful counterpart to ChIP, providing an independent means by which to both validate ChIP-seq findings and discover new insights into genomic regulation.

Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae

We describe chromatin endogenous cleavage coupled with high-throughput sequencing (ChEC-seq), a chromatin immunoprecipitation (ChIP)-orthogonal method for mapping protein binding sites genome-wide with micrococcal nuclease (MNase) fusion proteins.

Genom-weite Abbildung von Protein-DNA-Wechselwirkungen mit ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Genome-wide mapping of protein-DNA interactions is critical for understanding gene regulation, chromatin remodeling, and other chromatin-resident ...

Forschung

Genetik

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely related biochemical pathways. Previous methods such as the Synthetic Genetic Array (SGA) analysis, and random mutagenesis techniques using ultraviolet (UV) or chemicals like ethyl methanesulfonate (EMS) or N-ethyl-N- nitrosourea (ENU), have been widely used but are often costly and laborious. Also, these mutagen-based screening methods are frequently associated with severe side effects on the organism, inducing multiple mutations that add to the complexity of isolating the suppressors. Here, we present a simple and effective protocol to identify suppressor mutations in mutants which confer a growth defect in Schizosaccharomyces pombe. The fitness of cells with a growth deficiency in standard rich liquid media or synthetic liquid media can be monitored for recovery using an automated 96-well plate reader over an extended period. Once a cell acquires a suppressor mutation in the culture, its descendants outcompete those of the parental cells. The recovered cells that have a competitive growth advantage over the parental cells can then be isolated and backcrossed with the parental cells. The suppressor mutations are then identified using whole-genome sequencing. Using this approach, we have successfully isolated multiple suppressors that alleviate the severe growth defects caused by loss of Elf1, an AAA+ family ATPase that is important in nuclear mRNA transport and maintenance of genomic stability. There are currently over 400 genes in S. pombe with mutants conferring a growth defect. As many of these genes are uncharacterized, we propose that our method will hasten the identification of novel functional interactions with this user-friendly, high-throughput approach.

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

We present a simple suppressor screen protocol in fission yeast. This method is efficient, mutagen-free, and&#160; selective&#160; for&#160; mutations that&#160; often&#160; occur at&#160; &#160;a&#160; single&#160; genomic&#160; locus.&#160; The protocol is suitable for isolating suppressors that alleviate growth defects in liquid culture that are caused by a mutation or a drug.

Ein Deep-Sequenzierung-gestützte, spontane Suppressor-Bildschirm in der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the strength of linkage and association mapping methods, which trace the relationship between DNA sequence variants and phenotype across recombinant progeny from matings between individuals of a species. These approaches, although powerful, are not well suited to trait differences between reproductively isolated species. Here we describe a new method for genome-wide dissection of natural trait variation that can be readily applied to incompatible species. Our strategy, RH-seq, is a genome-wide implementation of the reciprocal hemizygote test. We harnessed it to identify the genes responsible for the striking high temperature growth of the yeast Saccharomyces cerevisiae relative to its sister species S. paradoxus. RH-seq utilizes transposon mutagenesis to create a pool of reciprocal hemizygotes, which are then tracked through a high-temperature competition via high-throughput sequencing. Our RH-seq workflow as laid out here provides a rigorous, unbiased way to dissect ancient, complex traits in the budding yeast clade, with the caveat that resource-intensive deep sequencing is needed to ensure genomic coverage for genetic mapping. As sequencing costs drop, this approach holds great promise for future use across eukaryotes.

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Reciprocal hemizygosity via sequencing (RH-seq) is a powerful new method to map the genetic basis of a trait difference between species. Pools of hemizygotes are generated by transposon mutagenesis and their fitness is tracked through competitive growth using high-throughout sequencing. Analysis of the resulting data pinpoints genes underlying the trait.

Genetische Kartierung von Thermotoleranzunterschieden zwischen Spezies von Saccharomyces Hefe über Genom-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

Identifizierung von Protein-Komplexen mit der quantitativen Proteomik in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Biologie

Detection of Homologous Recombination Intermediates via Proximity Ligation and Quantitative PCR in Saccharomyces cerevisiae

DNA damage, including DNA double-stranded breaks and inter-strand cross-links, incurred during the S and G2 phases of the cell cycle can be repaired by homologous recombination (HR). In addition, HR represents an important mechanism of replication fork rescue following stalling or collapse. The regulation of the many reversible and irreversible steps of this complex pathway promotes its fidelity. The physical analysis of the recombination intermediates formed during HR enables the characterization of these controls by various nucleoprotein factors and their interactors. Though there are well-established methods to assay specific events and intermediates in the recombination pathway, the detection of D-loop formation and extension, two critical steps in this pathway, has proved challenging until recently. Here, efficient methods for detecting key events in the HR pathway, namely DNA double-stranded break formation, D-loop formation, D-loop extension, and the formation of products via break-induced replication (BIR) in Saccharomyces cerevisiae are described. These assays detect their relevant recombination intermediates and products with high sensitivity and are independent of cellular viability. The detection of D-loops, D-loop extension, and the BIR product is based on proximity ligation. Together, these assays allow for the study of the kinetics of HR at the population level to finely address the functions of HR proteins and regulators at significant steps in the pathway.

Detection of Homologous Recombination Intermediates via Proximity Ligation and Quantitative PCR in Saccharomyces cerevisiae

The D-loop capture (DLC) and D-loop extension (DLE) assays utilize the principle of proximity ligation together with quantitative PCR to quantify D-loop formation, D-loop extension, and product formation at the site of an inducible double-stranded break in Saccharomyces cerevisiae.

Nachweis homologer Rekombinationszwischenprodukte mittels Proximityligation und quantitativer PCR in Saccharomyces cerevisiae

DNA damage, including DNA double-stranded breaks and inter-strand cross-links, incurred during the S and G2 phases of the cell cycle can be repaired by ...

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, and release of the complex components. Glycerol gradient centrifugation has been used for the separation of protein or RNP (RiboNucleoProtein) complexes for functional and structural studies. Here, we describe the utilization of Grafix (Gradient Fixation), which was first developed to purify and stabilize macromolecular complexes for single particle cryo-electron microscopy, to identify interactions between splicing factors that bind transiently to the spliceosome complex. This method is based on the centrifugation of samples into an increasing concentration of a fixation reagent to stabilize complexes. After centrifugation of yeast total extracts loaded on glycerol gradients, recovered fractions are analyzed by dot blot for the identification of the spliceosome sub-complexes and determination of the presence of individual splicing factors.

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Here, we describe the utilization of Grafix (Gradient Fixation), a glycerol gradient centrifugation in the presence of a crosslinker, to identify interactions between splicing factors that bind transiently to the spliceosome complex.

Verwendung von Grafix zum Nachweis transienter Interaktoren von Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, ...

Biochemie

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray-Analyse für Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Competitive Genomic Screens von Barcoded Hefe Bibliotheken

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

Growth-basierte Bestimmung und biochemische Bestätigung der genetischen Voraussetzungen für Proteinabbau in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Genetic Screen for Identification of Multicopy Suppressors in Schizosaccharomyces pombe

Identification of genetic interactions is a powerful tool to decipher the functions of gene(s) by providing insights into their functional relationships with other genes and organization into biological pathways and processes. Although the majority of the genetic screens were initially developed in Saccharomyces cerevisiae, a complementary platform for carrying out these genetic screens has been provided by Schizosaccharomyces pombe. One of the common approaches used to identify genetic interactions is by overexpression of clones from a genome-wide, high-copy-number plasmid library in a loss-of-function mutant, followed by selection of clones that suppress the mutant phenotype.
This paper describes a protocol for carrying out this &#39;multicopy suppression&#39;-based genetic screen in S. pombe. This screen has helped identify multicopy suppressor(s) of the genotoxic stress-sensitive phenotype associated with the absence of the Ell1 transcription elongation factor in S. pombe. The screen was initiated by transformation of the query ell1 null mutant strain with a high-copy-number S. pombe cDNA plasmid library and selecting the suppressors on EMM2 plates containing 4-nitroquinoline 1-oxide (4-NQO), a genotoxic stress-inducing compound. Subsequently, plasmid was isolated from two shortlisted suppressor colonies and digested by restriction enzymes to release the insert DNA. Plasmids releasing an insert DNA fragment were retransformed into the ell1 deletion strain to confirm the ability of these suppressor plasmid clones to restore growth of the ell1 deletion mutant in the presence of 4-NQO and other genotoxic compounds. Those plasmids showing a rescue of the deletion phenotype were sequenced to identify the gene(s) responsible for suppression of the ell1 deletion-associated genotoxic stress-sensitive phenotype.

Genetic Screen for Identification of Multicopy Suppressors in Schizosaccharomyces pombe

This work describes a protocol for a multicopy suppressor genetic screen in Schizosaccharomyces pombe. This screen uses a genome-wide plasmid library to identify suppressor clone(s) of a loss-of-function phenotype associated with a query mutant strain. Novel genetic suppressors of the ell1 null mutant were identified using this screen.

Genetischer Screen zur Identifizierung von Multicopy-Suppressoren in Schizosaccharomyces pombe

Identification of genetic interactions is a powerful tool to decipher the functions of gene(s) by providing insights into their functional relationships ...

Schnelle Identifikation von chemischen Genetische Interaktionen in

Zusammenfassung

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