Die Forschung im Labor CJN durch Betriebskostenzuschüsse von NSERC, der Canadian Cancer Society Research Institute (CCSRI) und der Canadian Breast Cancer Foundation (BC-Yukon Branch) unterstützt.

HINWEIS: Der allgemeine Arbeitsablauf dieses Verfahrens ist in Figur 2 skizziert. 1. Bestimmung der wachstumshemmende Dosis <ol><li> Herstellung von Hefe-Nacht-Kultur HINWEIS: Der Hefeextrakt-Pepton-Dextrose Wachstumsmedium (YEPD) im Sinne dieses Protokolls ist ein Standardrezept 13. <ol><li> Streak aus BY4741 (MATa his3 Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) Zellen auf einer YEPD-Agar-Platte und Inkubation für 48 Stunden bei 30 ° C oder bis sichtbare Kolonien zu bilden. </li><li> Übernachtkulturen herzustellen durch Inokulieren von 5 ml YEPD flüssigen Medium in einem sterilen Kulturgefäß mit einer Einzelkolonie. Inkubieren über Nacht bei 30 ° C mit kontinuierlicher Rotation oder Schütteln. Die Kultur wird in der Regel erreichen die Sättigung von der Morgen (~ 2 × 10 8 Zellen / ml). </li></ol></li><li> Solide Agarmedien Zubereitung mit unterschiedlichen chemischen Dosen <ol><li> Bereiten Sie einige Vorräte andie Chemikalie bei 100x gewünschte Endkonzentration in einem geeigneten Lösemittel getestet werden. HINWEIS: Wirksame Konzentrationen werden von der chemischen abhängen und muss empirisch ermittelt werden. Es ist daher ratsam, zunächst zu testen eine breite Endkonzentrationsbereich, dh von niedrigen uM bis hoch mM. </li><li> Für jede Konzentration der zu testenden Chemikalie, Aliquot 3 ml geschmolzenem YEPD-Agar mit einem mehrere sterile Kulturröhrchen. Platz in 55 ° C Wasserbad auf erstarrt halten. </li><li> Für jede Konzentration der zu testenden Chemikalie werden 30 ul der 100-fach Verbindung in geschmolzenem Medium, Wirbel 2-3 sec mischen und Pipette 1 ml in jedes Paar von doppelten Vertiefungen einer Platte mit 12 Vertiefungen. Achten Sie darauf, ein Fahrzeug sind nur Kontrolle. Lassen Platten über Nacht bei Raumtemperatur einstellen. Werfen Sie keine zusätzliche Medien. </li></ol></li><li> Verteilt Plattierzellen <ol><li> Impfen Sie 10 ml YEPD flüssige Medien mit 2 ul einer gesättigten Hefekultur, über Nacht, wie in Schritt 1 aufgewachsen.1.2. </li><li> Platte 25 ul verdünnt Hefekultur pro Well, gleichmäßig mit sterilen Glasperlen oder Stange und damit die Platte unter einer Flamme trocknen. Inkubieren Platte bei 30 ° C für 48 Stunden. </li><li> Bewerten des Wachstums von Hefe (sowohl Anzahl und Größe der Kolonien) auf den Platten. Wählen einer subletalen Konzentration der Verbindung, die nicht das Wachstum hemmt, um mehr als 10% bis 15%, um den Bildschirm durchzuführen. </li></ol></li></ol> 2. Systematische Chemical Genetische Bildschirm <ol><li> Wartung von Lösch-Mutante-Array (DMA) und Vorbereitung der Quelle-Platte <ol><li> Für eine detaillierte Beschreibung über den Aufbau Deletionsmutante Arrays aus Glycerin Aktien finden Sie in Baryshnikova et al. 14 verwiesen. Sobald Deletionsmutanten in einer Dichte von 384 Kolonien pro Platte angeordnet wurde, kann der DMA für einige Monate bei 4 ° C gelagert werden. Replizieren auf YEPD-Agar, enthaltend 200 ug / ml G418 wie nötig, um Kolonien zu wachsen in jede verhindernandere. HINWEIS: Mehrere serielle Replikationen sollte vermieden werden, um den Verlust von langsamem Wachstum zu verhindern und das Auftreten von Suppressormutanten minimieren. Dies ist besonders relevant, wenn die Aufrechterhaltung der Sammlungen als Haploiden. </li><li> Führen Sie alle Replikat-Plating Schritte mit einer mikrobiellen Anordnen Robotersystem. Alternativ manipulieren angeordnet Kolonien mit manuellen Pinning-Tools. HINWEIS: Die Hefe Löschen Kollektion ist so Haploiden und Diploide von mehreren kommerziellen Quellen erhältlich und wird in der Regel als Glyzerin in 96-Well-Platten geliefert. </li></ol></li><li> Kondensieren der Deletionsmutante Array <ol><li> Bereiten 250 ml YEPD-Agarmedium, enthaltend 200 ug / ml G418. Die effektive Konzentration von G418 können variieren und jede Menge sollte empirisch überprüft werden. </li><li> Bereiten fünf YEPD Agarplatten durch Gießen von 50 ml YEPD-Agar, enthaltend 200 ug / ml G418 pro Platte. Tun Sie dies einen Tag vor Kondensation des Array und damit die Platten bei Raumtemperatur abkühlenratur über Nacht auf eine ebene Unterlage. HINWEIS: Vier Platten werden für die Sammlung bei 1536-Dehnungs Dichte erforderlich ist, wird die fünfte Platte als extra gegossen. </li><li> Entfernen Sie die 16 Petrischalen, die das mutierte Löschen Sammlung bei einer Dichte von 384 Kolonien pro Platte und lassen Sie sie auf Raumtemperatur (ca. 1 Stunde) zu kommen. </li><li> Wischen Sie Kondensation, die mit eine heikle Aufgabe wischen auf dem Deckel jeder Platte gebildet hat. Bei Nichtbeachtung kann es zu Wassertröpfchen führen, dass auf dem Array und Kreuzkontamination von angeordneten Mutanten hinterlegt. </li><li> Mit einem mikrobiellen Array Pinning Roboter, kondensieren die DMA von einer Dichte von 384 Kolonien pro Platte (16 Petrischalen), um 1536 Kolonien pro Platte (4 Petrischalen). Führen Sie diese, so dass der 1. Kolonie von Platte 1 Stifte 1 Spalte 1 der verkürzten Reihe rudern, um die 1. Kolonie Platte 2 Zeile 1 Spalte 2, der 1. Kolonie Platte 3 zu Zeile 2 und Spalte 1, und der 1. Kolonie Platte 4 zu Zeile 2Spalte 2. </li><li> Inkubieren Sie die Konzern-Array bei 30 ° C über Nacht. </li><li> Untersuchen Sie das Array, um eine einheitliche Übertragung von Kolonien von der Quelle Platten zu gewährleisten. Es werden mehrere leere Positionen, absichtlich in das Array aufgenommen, die als Richtschnur dienen, um sicherzustellen, das DMA korrekt (4A) kondensiert sein. HINWEIS: Diese greift auf die Quellplatten für Replikaplattierung auf Medien, die die Testverbindung sein. Eine Hand Platte kann für mehrere Pinnings verwendet werden. Auch viele Roboter Gegenläufig-Funktion, die eine ähnliche Anzahl von Hefe werden jedes Mal übertragen gewährleisten müssen. </li></ol></li><li> Replica Platte Deletionsmutante Array <ol><li> Bereiten 700 ml der Kontrolle (nur Vehikel) und 700 ml Versuchsmedien (chemische haltigen). Das ist genug, zur Durchführung des Assays in dreifacher Ausfertigung (12 Platten pro Zustand, plus zwei Extrakosten). </li><li> Gießen Sie 50 ml YEPD-Agar, der Prüfsubstanz oder Steuer pro Platte. Lassen Sie die Platten to bei Raumtemperatur über Nacht abkühlen lassen auf eine ebene Unterlage. </li><li> Verwendung des Roboters zu Replikaplatte inokulieren die DMA auf drei Sätze von Platten, die Chemikalien an der experimentell bestimmten Konzentration, sowie drei Sätze von Platten, die die Vehikelkontrolle. Platten bei Raumtemperatur inkubieren 24-48 h. </li></ol></li></ol> 3. Speicherfolien und Datenanalyse <ol><li> Platten Entfernen von Inkubator und lassen Sie sie auf Raumtemperatur (ca. 1 Stunde) vor der Bilderzeugung kommen. Dadurch wird die Bildung von Kondenswasser während Abbildung der Platten zu verhindern. </li><li> Bildplatten 24 und 48 Stunden nach Entfernen des Deckels und Platzierung der Vorderseite nach unten auf einem Flachbettscanner. Machen Sie Bilder mit einer Auflösung von mindestens 300 dpi. Alternativ können Sie eine Digitalkamera zur Erfassung von Bildern. Wenn dabei konfrontiert Ort Platten auf einem dunklen Hintergrund, und entfernen Sie den Deckel zu Bild. HINWEIS: Das Dateiformat und Positionierung der Platten wird auf der Quantifizierung Programm abhängen. </li&gt; <li> Führen Quantifizierung und den Vergleich der Array Koloniegrößen mit einem der vielen Open-Source-Programme, einschließlich Balony 15. SGAtools 16 und ScreenMill 17. </li></ol> 4. Validierung von Screen HINWEIS: In dieser Phase wird mehrere Hefe-Mutanten Deletionen als überempfindlich auf die Chemikalie punkten. Diese chemisch-genetischer Interaktionen muss nächste auf zwei Arten überprüft werden. Zunächst wird die Identität der empfindliche Stämme sollten durch PCR bestätigt werden. Zweitens müssen die Chemikalien-Sensitivität unabhängig gewertet. Folgenden Abschnitten wird eine kurze Protokoll zur Durchführung von Tests, um Spotting Dehnungsempfindlichkeit, eine Technik, die in Hefe Biologie gemeinsam zu überprüfen. <ol><li> Streak out gewünschte (allergisch) Mutanten aus der Deletion Sammlung Hefe auf YEPD-Agar, enthaltend 200 ug / ml G418. Inkubiere bei 30 ° C bis Kolonien bilden. Stellen Sie sicher, das Erbgut des Stammes durch diagnostische PCR mit Primern nachProtokoll des Herstellers. </li><li> Impfen Sie 5 ml der YEPD Flüssigkeit für jeden Stamm beimpft und über Nacht bei 30 ° C mit einer Rotation oder Schütteln. </li><li> Messen OD 600 und verdünnt jede Belastung in sterile dH 2 O OD 600 = 1 Diese werden nun die normierten Hefekulturen. </li><li> Dispense 100 ul der normalisierten Wildtyp-Hefe (BY4741) Kultur und A1 einer 96-Well-Platte. Dispense 100 ul von bis zu sieben zusätzliche Belastungen in die Vertiefungen B1-H1. </li><li> Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette auf 90 ul sterilem dH 2 O in die Vertiefungen A2-H2 bis A6-H6 verzichten. Schließlich bereiten eine Reihe von 1:10 Verdünnungen normalisierte Hefekulturen. Starten Sie durch serielles Pipettieren von 10 ul der Spalte 1 Spalte 2 mit einer Mehrkanalpipette, und weiter über die Platte mit 96 Vertiefungen bis sechs Verdünnungen hergestellt werden (dh 10 0 bis 10 -5). </li><li> Übertragen Sie 2-5 ul der verdünnten Hefekulturen in einem Raster mit einer MehrkanalPipette auf YEPD festen Medien, die chemischen und Fahrzeugsteuerung. Platten bei der geeigneten Temperatur für 24-48 Std. </li><li> Untersuchen Platten und vergleichen Sie die Empfindlichkeit des ausgewählten Mutanten gegen chemische (bezogen auf BY4741-Steuerung). Bildplatten bei 24 und 48 h, wie in Schritt 3.2. HINWEIS: Während der Identifizierung mehrerer überempfindlich Stämme mit verwandten Gen Ontologien oder Funktionen verleiht Vertrauen auf die Gültigkeit des Bildschirms, Umwandlung eines überempfindlichen Deletionsstamm mit einem Plasmid, das eine Wildtyp-Kopie des Gens wird benötigt, um förmlich festgestellt werden, dass ein Gen, Löschen von Interesse (und nicht versteckt zweiten Standort Mutationen) verursacht Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten. </li></ol>

<ol>
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The authors declare they have no competing financial interests.

Hier skizziert ist ein Ansatz zur Erzeugung von chemisch-genetischer Interaktionsprofile. Das Verfahren ist einfach: durch Vergleich Koloniegrößen von jedem Stamm in umfassenden Gendeletion Sammlungen in Gegenwart und in Abwesenheit einer chemischen, alle Gene benötigt wird, um eine chemische Insult tolerieren identifiziert. Annotation Bereicherung Analyse des resultierenden Liste sensibler Stämme können dann verwendet werden, um einen Einblick in eine Chemikalien Wirkungs bieten. Während dieses Protokolls für B?...

Die genetischen Tools und Ressourcen im Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae haben großen funktionellen Genomik Studien, die gemeinsam ein neues Licht auf, wie Gene funktionieren, wie Netzwerke, um die Anforderungen von biologischen Systemen erfüllen zu können. Der Grundstein dieser Tools war die gemeinsame Erstellung eines vollständigen Satzes von nicht wesentlichen Gendeletionen aller offenen Leserahmen in Hefe 1,2. Eine auffallende Beobachtung war, dass nur ~ 20% der Hefe-Gene sind für die Lebensfähigkeit erforderlich, wenn als Haploiden unter Standardlaborbedingungen gezüchtet. Dies unterstreicht die Fähigkeit einer Zelle, durch die Nutzung alternativer biologischen Bahnen gegen genomische Perturbationen puffern. Genetische Mutanten, die individuell lebensfähig sind, aber tödlich in Verbindung, Signal angeschlossenen oder konvergent parallel biologische Pfade und bilden genetische Interaktionsnetzwerke, die biologische Funktion zu beschreiben. Mit der Entwicklung der bedingten temperature empfindlichen und hypomorphen Allele von essentiellen Genen die Technik nicht auf die Untersuchung von nicht-essentiellen Genen 3,4 beschränkt. Dieses Konzept wurde in einer genomischen Maßstab angewendet produziert eine unvoreingenommene genetische Interaktion Karte darstellen, wie Gene in ähnlichen zellulären Prozessen beteiligt Cluster zusammen 5. Chemische Störungen der genetischen Netzwerke Mimik Gendeletionen (Abbildung 1) 6. Abfragen von wachstumshemmenden Verbindungen gegen eine hochdichte Anordnung von Deletionsstämme Überempfindlichkeit identifiziert eine chemisch-genetischen Interaktionsprofil, also eine Liste von Genen, die erforderlich ist, um die chemische Beanspruchung verträgt. Wie genetische Interaktionen, Großbildschirme von chemischen Bibliotheken haben gezeigt, dass mit einem ähnlichen Wirkmechanismus Cluster zusammen 7 Verbindungen. Daher wird durch die Gründung der chemisch-genetische Wechselwirkungsprofil von einer Verbindung der Wirkmechanismus kann durch einen Vergleich mit lar entnehmen,ge-Skala synthetischen genetischen und chemischen genetische Interaktion Datensätze von 8,9. Groß chemisch-genetischen Screens, wo Dutzende von Verbindungen werden verhört wurden von Barcode Konkurrenztests durchgeführt. Bei diesem Ansatz wird die gepoolte Sammlung von Deletionsmutanten ist en masse über mehrere Generationen in einem kleinen Volumen an Medium, das eine chemische gezüchtet. Da jeder Deletionsmutante beherbergt eine einzigartige genetische Barcode wird die Lebensfähigkeit / Wachstum einzelner Mutanten innerhalb des Pools von Deletionsstämme von Microarray-oder Hochdurchsatz-Sequenzierung 10 verfolgt. Ableitung Fitness durch Überwachung Koloniegröße von physikalisch Array-Mutanten auf festem Agar, der eine bioaktive Verbindung gewachsen ist auch eine wirksame Methode, um chemisch-genetischer Interaktionen 11,12 identifizieren. Dieser Ansatz bietet eine kostengünstige Alternative für den Wettbewerb basierten Screening und zur Bestimmung von kleinen Bibliotheken von Chemikalien geeignet.Hier skizziert ist eine einfache Methode zur Erzeugung einer Liste von chemisch-genetischer Interaktionen in S. cerevisiae, die nicht auf der Molekularbiologie Manipulationen oder Infrastruktur angewiesen ist. Es erfordert nur eine Hefe Löschen Sammlung, einen Roboter oder manuell Pinning Gerät und frei verfügbaren Bildanalyse-Software.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="987">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Name of Material/ Equipment&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Company&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Catalog Number&#160;</td>
			<td style="width:457px;">Comments/Description&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:213px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:161px;">BioBasic</td>
			<td>G0961</td>
			<td style="width:457px;">For YEPD liquid/solid media add to 1% final concentration (w/v)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:213px;">Tyrptone Powder</td>
			<td style="width:161px;">BD Biosciences</td>
			<td>211820</td>
			<td style="width:457px;">For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:213px;">Dextrose</td>
			<td style="width:161px;">Anachemia</td>
			<td style="width:156px;">31096-380</td>
			<td style="width:457px;">For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v) - Do not autoclave. Prepare 20% stock solution, filter sterilize, and add to media after autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Agar A</td>
			<td style="width:161px;">Bio Basic</td>
			<td>FB0010</td>
			<td style="width:457px;">For YEPD solid media add to 2% final concentration (w/v)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:213px;">G418</td>
			<td style="width:161px;">A.G. Scientific Inc.</td>
			<td style="width:156px;">G-1033</td>
			<td style="width:457px;">Prepare 1000x stock at 200mg/ml in dH2O and filter sterilize.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">12 well plate</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">5ml culture tubes</td>
			<td>Evergreen Scientific</td>
			<td>222-2376-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">10cm Petri Dish</td>
			<td style="width:161px;">VWR</td>
			<td>25384-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ROTOR HDA</td>
			<td>Singer Instruments&#160;</td>
			<td>ROT-001</td>
			<td>high-throughput microbial array pinning robot</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PLUSPLATE&#169; Petri Dish</td>
			<td>Singer Instruments&#160;</td>
			<td>PLU-001</td>
			<td>Box of 200 dishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">384 Short-Pin RePad</td>
			<td>Singer Instruments&#160;</td>
			<td>RP-MP-384</td>
			<td>Box of 1000 pads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1536 Short-Pin RePad</td>
			<td>Singer Instruments&#160;</td>
			<td>RP-MP-1536</td>
			<td>Box of 1000 pads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alternative Pinning Tools:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fully Automated Robtic Systems</td>
			<td>S&#38;P robotics</td>
			<td>http://www.sprobotics.com</td>
			<td>Several automated colony handling robitic and imagining systems available.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manual Pinning Tools</td>
			<td>V&#38;P Scientific</td>
			<td>http://www.vp-scientific.com</td>
			<td>Handheld replication tools and accessories.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid identification of chemical genetic interactions in saccharomyces cerevisiae

Die Ermittlung der Wirkungsweise von bioaktiven Chemikalien ist von Interesse für ein breites Spektrum von akademischen, pharmazeutischen und industriellen Wissenschaftlern. Saccharomyces cerevisiae oder Bäckerhefe, ist ein Modell, Eukaryoten, für die eine vollständige Sammlung von ~ 6000 Gen-Deletionsmutanten und hypomorphen essentielles Gen Mutanten sind im Handel erhältlich. Diese Sammlung von Mutanten verwendet werden, um systematisch erkennen chemisch-Gen-Interaktionen, dh Gene notwendig, eine chemische tolerieren. Diese Information wiederum berichtet über die wahrscheinliche Wirkungsweise der Verbindung. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die schnelle Identifizierung von chemischen genetischen Wechselwirkungen in Bäckerhefe. Wir zeigen, das Verfahren unter Verwendung des Chemotherapeutikum 5-Fluorouracil (5-FU), die eine wohldefinierte Wirkmechanismus besitzt. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Kern TRAMP RNA-Exosom und DNA-Reparaturenzyme sind für die Proliferation in Gegenwart von 5-FU, die im Einklang mit früheren m ist erforderlichicroarray basierten Barcode-Chemie genetische Ansätze und das Wissen, dass 5-FU beeinträchtigt sowohl RNA als auch DNA-Stoffwechsel. Die erforderlichen Validierungsprotokolle dieser Hochdurchsatz werden ebenfalls beschrieben.

Als Validierung dieses Ansatzes Wir führten eine repräsentative chemische genetische Wechselwirkung Bildschirm des Chemotherapeutikum 5-Fluorouracil (5-FU) gemäß dem oben beschriebenen Protokoll. 5-FU ist bekannt, die Thymidylat-Synthase sowie die DNA und RNA-Metabolismus 18 stören. Die chemischen genetischen Wechselwirkungen von 5-FU sind gut untersucht und wurden von Hefe Barcode-Mikroarray-Techniken unter Verwendung von sowohl heterozygote und homozygote Deletion Sammlungen 8,19 untersucht....

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Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

Schnelle Identifikation von chemischen Genetische Interaktionen in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

rapid-identification-chemical-genetic-interactions-saccharomyces

Research

JoVE Journal

Biology

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

10.3K Aufrufe.  University of Victoria. Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

Serie: Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

Präparation Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Forschung

Biologie

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

Identifizierung von Protein-Komplexen mit der quantitativen Proteomik in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray-Analyse für Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Schnelle Genetische Analyse von epithelial-mesenchymale Signaling Während Haarregeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualisierung und Analyse von mRNA Moleküle mittels Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

Gekoppelt Assays zur Überwachung Proteinrückfaltung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

Die Reinigung des Cystic Fibrosis Transmembran Regulator-Protein in Ausgedrückt<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to identify and quantify the cofactors in their detectable redox state.
The technique is complementary to direct electrochemistry (voltammetry) approaches, as it does not offer information on electron transfer rates, but does establish the identity and redox state of the cofactors in the protein under study. The technique is widely applicable to any protein containing an electron paramagnetic resonance (EPR) detectable cofactor.
A typical titration requires 2 ml protein with a cofactor concentration in the range of 1-100 &#181;M. The protein is titrated with a chemical reductant (sodium dithionite) or oxidant (potassium ferricyanide) in order to poise the sample at a certain potential. A platinum wire and a Ag/AgCl reference electrode are connected to a voltmeter to measure the potential of the protein solution. A set of 13 different redox mediators is used to equilibrate between the redox cofactors of the protein and the electrodes. Samples are drawn at different potentials and the Electron Paramagnetic Resonance spectra, characteristic for the different redox cofactors in the protein, are measured. The plot of the signal intensity versus the sample potential is analyzed using the Nernst equation in order to determine the midpoint potential of the cofactor.

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

The goal of this protocol is to use electron paramagnetic resonance (EPR) monitored redox titrations to identify different cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1. Redox titrations offer a very robust way to obtain midpoint potentials of different redox active cofactors in enzymes and proteins.

EPR Wachte Redox-Titration der Cofaktoren von<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the correct amount of protein is synthesized for the cell&#8217;s specific growth conditions. One approach for measuring mRNA decay rates is inhibiting transcription and subsequently monitoring the disappearance of the already present mRNA. The rate of mRNA decay can then be quantified, and an accurate half-life can be determined utilizing several techniques. In S. cerevisiae, protocols that measure mRNA half-lives have been developed and include inhibiting transcription of mRNA using strains that harbor a temperature sensitive allele of RNA polymerase II, rpb1-1. Other techniques for measuring mRNA half-lives include inhibiting transcription with transcriptional inhibitors such as thiolutin or 1,10-phenanthroline, or alternatively, by utilizing mRNAs that are under the control of a regulatable promoter such as the galactose inducible promoter and the TET-off system. Here, we describe measurement of S. cerevisiae mRNA decay rates using the temperature sensitive allele of RNA polymerase II. This technique can be used to measure mRNA decay rates of individual mRNAs or genome-wide.

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

The steady state level of specific mRNAs is determined by the rate of synthesis and decay of the mRNA. Genome-wide mRNA degradation rates or the decay rates of specific mRNAs can be measured by determining mRNA half-lives. This protocol focuses on measurement of mRNA decay rates in Saccharomyces cerevisiae.

Die Messung der mRNA-Abbau Preise in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Verwenden<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Die Stämme

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...