מחקר במעבדה CJN נתמך על ידי מענקים הפועלים מNSERC, הקנדי למלחמה בסרטן אגודת מכון המחקר (CCSRI), והשד הקנדי קרן למלחמה בסרטן (BC-יוקון סניף).

הערה: העבודה הכללית של הליך זה מתואר באיור 2. 1. קביעת מינון צמיחה-מעכבת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה של תרבות לילה שמרים הערה: תקשורת שמרים-תמצית-peptone דקסטרוז הצמיחה (YEPD) שימוש בפרוטוקול זה היא מתכון סטנדרטי 13. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Streak את BY4741 (his3 מאטה Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) תאים על צלחת אגר YEPD דגירה במשך 48 שעות ב 30 מעלות צלזיוס או עד מושבות גלויות טופס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תרבויות לילה בלחסן 5 מיליליטר של נוזל תקשורת YEPD בכלי תרבות סטרילי עם מושבה אחת. דגירה הלילה בשעה 30 ° C עם סיבוב רציף או רועד. התרבות בדרך כלל תגיע לרוויה בבוקר (~ 2 × 10 8 תאים / מיליליטר). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת מדיה אגר מוצקה המכילים מינונים שונים כימיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן כמה מניות שלהכימי להיבדק ב100x ריכוז סופי רצוי בממס מתאים. הערה: ריכוזים אפקטיביים יהיו תלויים בחומר הכימי, ויש לקבוע באופן אמפירי. אי לכך, מומלץ תחילה לבחון מגוון רחב ריכוז סופי, כלומר, ממיקרומטר הנמוך לגבוה מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל ריכוז של חומר כימי להיבדק, aliquot 3 מיליליטר של אגר YEPD המותך לכמה צינור תרבות סטרילי. מקום באמבט המים C ° 55 כדי לשמור לחיזוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל ריכוז של חומר כימי להיבדק להוסיף 30 μl של מתחם 100x לתקשורת מותכת, מערבולת 2-3 שניות כדי לערבב, ופיפטה 1 מיליליטר לכל זוג של בארות כפולות בצלחת 12 גם. הקפד לכלול רכב רק שליטה. לאפשר צלחות להגדיר לילה בטמפרטורת חדר. לבטל את כל אמצעי תקשורת נוספת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי התפשטות ציפוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 10 מיליליטר של נוזל תקשורת YEPD עם 2 μl של תרבית שמרים רוויה, גדל הלילה כמו בשלב 1.1.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת 25 μl של תרבית שמרים מדוללת היטב, להתפשט באופן שווה באמצעות חרוזים זכוכית סטרילית או מוט, ולאפשר את הצלחת לייבוש תחת אש. דגירה צלחת ב 30 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את הצמיחה של שמרים (גם מספר והגודל כולל של מושבות) על הצלחות. בחר ריכוז תת-קטלני של מתחם שלא לעכב את הצמיחה על ידי יותר מ 10% -15% כדי לבצע את המסך. </li></ol></li></ol> 2. מסך כימי גנטי שיטתי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחזוקה של מחיקת מוטנטי-מערך (DMA) והכנה של צלחת המקור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתיאור מפורט על בניית מערכי מוטציה מחיקה ממניות גליצרול עיין et al Baryshnikova. 14. ברגע שמוטציות מחיקה כבר ערוכות בצפיפות של 384 מושבות בכל צלחת, DMA יכול להיות מאוחסן במשך כמה חודשים על 4 מעלות צלזיוס. לשכפל על אגר YEPD המכיל 200 מיקרוגרם / מיליליטר של G418 כנדרש כדי למנוע ממושבות גדלו לתוך כלאחר. יש להימנע משוכפלים סידוריים מרובה על מנת למנוע אובדן של זנים גדלו איטיים ולצמצם את המראה של מוטציות מדכאת: הערה. זה רלוונטי במיוחד אם שמירת האוספים כhaploids. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע את כל שלבי העתק-הציפוי באמצעות חיידקים עֲרִיכָה מערכת רובוטית. לחלופין, לתפעל ערוך מושבות באמצעות כלים pinning ידניים. הערה: אוסף שמרי המחיקה זמין כhaploids וdiploids ממספר מקורות מסחריים ונשלח בדרך כלל כמניות גליצרול ב96-גם צלחות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיבוי מערך המוטציה המחיקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 250 מיליליטר של תקשורת אגר YEPD המכילה 200 מיקרוגרם / מיליליטר של G418. הריכוז היעיל של G418 עשוי להשתנות וכל מגרש יש לבדוק באופן אמפירי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חמש צלחות אגר YEPD על ידי שפיכת 50 מיליליטר של אגר YEPD המכיל 200 מיקרוגרם / מיליליטר של G418 לכל צלחת. האם יום אחד זה לפני עיבוי המערך ולאפשר הצלחות להתקרר בטמפ &#39;החדרerature לילה על אף משטח שטוח. הערה: ארבע צלחות תידרש לאיסוף בצפיפות 1,536 מתח, הצלחת החמישית היא שפך כתוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את 16 צלחות פטרי המכילות את אוסף מחיקת המוטציה בצפיפות של 384 מושבות בכל צלחת ולאפשר להגיע לטמפרטורת חדר (~ 1 שעה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגב כל עיבוי שנוצר על המכסה של כל צלחת באמצעות משימה עדינה לנגב. אם לא יעשה זאת עלולה לגרום לטיפי מים שהופקדו על המערך וזיהום צולב של מוטנטים ערוכים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות רובוט מערך תולה חיידקים, להתעבות DMA מצפיפות של 384 מושבות בכל צלחת (16 צלחות פטרי) ל1,536 מושבות בכל צלחת (4 צלחות פטרי). לבצע את זה כדי שמושבת -1 מפינים 1 הצלחת לחתור עמודה 1 1 של מערך תמצית, המושבה -1 בצלחת 2 לחתור 1 טור 2, המושבה -1 בצלחת 3 לחתור 2 ועמודה 1, ו המושבה -1 בצלחת 4 לחתור 2עמודה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה המערך המאוחד על 30 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבחון את המערך כדי להבטיח העברה אחידה של מושבות מצלחות מקור. תהיה כמה עמדות ריקות, שהתאגדו בכוונה תחילה את המערך, המשמשים כמדריך כדי להבטיח את DMA כבר מרוכז בצורה נכונה (איור 4 א). הערה: אלה יהיו צלחות המקור לציפוי העתק על גבי מדיה המכילה את תרכובת המבחן. צלחת מקור יחידה יכולה לשמש לpinnings מרובה. גם רובוטים רבים יהיו תכונת קיזוז, אשר תבטיח מספרים דומים של שמרים מועברים בכל פעם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערך מוטציה מחיקת צלחת Replica <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 700 מיליליטר של שליטה (רכב בלבד) ו -700 מיליליטר של תקשורת הניסיונית (המכיל כימית). זה מספיק לביצוע assay בשלושה עותקים (12 צלחות לכל מצב, בתוספת שתי תוספות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 50 מיליליטר של אגר YEPD מכיל כימי מבחן או שליטה לכל צלחת. לאפשר t הצלחותo להתקרר בטמפרטורת חדר למשך לילה על אף משטח שטוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש ברובוט לצלחת העתק, לחסן DMA על שלושה סטים של צלחות המכילות כימיקלים בריכוז בניסוי הנחוש, כמו גם שלושה סטים של צלחות המכילות שליטה ברכב. דגירה צלחות בטמפרטורת חדר למשך 24-48 שעות. </li></ol></li></ol> 3. צלחות הדמיה וניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר צלחות מהחממה ולאפשר להם להגיע לטמפרטורת חדר (~ שעה 1) לפני ההדמיה. זה ימנע עיבוי מ טביעה בזמן ההדמיה הצלחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות תמונה ב 24 ו 48 שעות על ידי הסרת המכסה והצבה עם פנים כלפי מטה על סורק למיטה שטוח. צלם תמונות ברזולוציה של לפחות 300 dpi. לחלופין, להשתמש במצלמה דיגיטלית כדי ללכוד תמונות. אם כך צלחות מקום, עם הפנים כלפי מעלה על רקע כהה ולהסיר את המכסים לתמונה. הערה: תבנית הקובץ והמיקום של צלחות תהיה תלויה בתכנית הכימות בשימוש. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע כימות והשוואה של גדלי מושבה מערך באמצעות אחד מכמה תוכנות קוד פתוחות, כוללים 15 &quot;שטויות, SGAtools 16, וScreenMill 17. </li></ol> 4. אישור של מסך הערה: בשלב זה מוטציות כמה מחיקות שמרים את הציון רגישה כמו לכימי של עניין. אינטראקציות כימיות-גנטי אלה חייבים להיות מאומתים הבאות בשתי דרכים. ראשית את זהותו של זנים רגישים צריכה להיות מאושרת על ידי PCR. שנית, רגישות כימית חייבת להיות הבקיע באופן עצמאי. המפורטים להלן הוא פרוטוקול קצר לביצוע מבחני איתור כדי לאמת את רגישות יתר לחץ, טכניקה נפוצה בשמרי ביולוגיה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Streak את מוטציות רצויה (רגישות יתר) מאוסף מחיקת השמרים על אגר YEPD המכיל 200 מיקרוגרם / מיליליטר של G418. לדגור על 30 מעלות צלזיוס עד טופס מושבות. ודא גנוטיפ של המתח על ידי PCR עם פריימרים אבחון על פיהפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 5 מיליליטר של נוזל YEPD עבור כל זן ודגירת הלילה בשעה 30 ° C עם רוטציה או רועד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד OD 600 ולדלל כל זן לOD 600 = 1 בסטרילי DH 2 O. אלה נמצאים כעת תרביות שמרים מנורמלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר על שמרים מנורמלים wild-type (BY4741) תרבות 100 μl ולA1 של צלחת 96-היטב. לוותר של עד שבעה זנים נוספים 100 μl לבארות B1-H1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש pipettor רב-ערוצי לוותר 90 μl של סטרילי DH 2 O לבארות A2-H2 דרך A6-H6. לבסוף, להכין סדרה של דילולים 1:10 תרבויות שמרים מנורמלות. התחל על ידי סדרתי pipetting 10 μl של עמודת 1 לעמודה 2 עם pipettor רבי ערוצים, ותמשיך על פני הצלחת 96-היטב עד שישה דילולים נעשים (כלומר, 10 0-10 -5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר 2-5 μl של תרבויות שמרים מדוללים ברשת באמצעות רב-ערוציpipettor על גבי מדיה מוצקה YEPD מכילה שליטה כימית ורכב. דגירה צלחות בטמפרטורה המתאימה ל24-48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק צלחות ולהשוות את הרגישות של מוטציות בחרו לכימי (יחסית לBY4741 שליטה). צלחות תמונה ב 24 ו -48 שעות כמו בשלב 3.2. הערה: בעוד שזיהוי של מספר זנים רגישים עם אונטולוגיות גן קשור או פונקציות מעניק ביטחון לתוקף של המסך, הפיכתו של זן מחיקה רגיש עם פלסמיד המכיל עותק wild-type של הגן נדרש לקבוע רשמית כי גן מחיקה של עניין (ומוטציות אתר השניה לא מוסתרות) גורם לרגישות לסמים. </li></ol>

<ol>
	<li>Giaever, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+profiling+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome.">Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 418, 387-391 (2002).</li><li>Winzeler, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+the+S.+cerevisiae+genome+by+gene+deletion+and+parallel+analysis.">Functional characterization of the S. cerevisiae genome by gene deletion and parallel analysis.</a> Science. 285, 901-906 (1999).</li><li>Breslow, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+strategy+enabling+high-resolution+functional+analysis+of+the+yeast+genome.">A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome.</a> Nat Methods. 5, 711-718 (2008).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+exploration+of+essential+yeast+gene+function+with+temperature-sensitive+mutants.">Systematic exploration of essential yeast gene function with temperature-sensitive mutants.</a> Nat Biotechnol. 29, 361-367 (2011).</li><li>Costanzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+landscape+of+a+cell.">The genetic landscape of a cell.</a> Science. 327, 425-431 (2010).</li><li>Parsons, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+chemical-genetic+and+genetic+interaction+data+links+bioactive+compounds+to+cellular+target+pathways.">Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways.</a> Nat Biotechnol. 22, 62-69 (2004).</li><li>Parsons, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+mode-of-action+of+bioactive+compounds+by+chemical-genetic+profiling+in+yeast.">Exploring the mode-of-action of bioactive compounds by chemical-genetic profiling in yeast.</a> Cell. 126, 611-625 (2006).</li><li>Hillenmeyer, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemical+genomic+portrait+of+yeast:+uncovering+a+phenotype+for+all+genes.">The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes.</a> Science. 320, 362-365 (2008).</li><li>Hillenmeyer, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+analysis+of+genome-wide+fitness+data+in+yeast+reveals+novel+gene+function+and+drug+action.">Systematic analysis of genome-wide fitness data in yeast reveals novel gene function and drug action.</a> Genome Biol. 11, R30 (2010).</li><li>Smith, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competitive+genomic+screens+of+barcoded+yeast+libraries.">Competitive genomic screens of barcoded yeast libraries.</a> J Vis Exp. (54), (2011).</li><li>Bowie, D., Parvizi, P., Duncan, D., Nelson, C. J., Fyles, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical-genetic+identification+of+the+biochemical+targets+of+polyalkyl+guanidinium+biocides.">Chemical-genetic identification of the biochemical targets of polyalkyl guanidinium biocides.</a> Organic &amp; Biomolecular Chemistry. 11, 4359-4366 (2013).</li><li>Alamgir, M., Erukova, V., Jessulat, M., Azizi, A., Golshani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical-genetic+profile+analysis+of+five+inhibitory+compounds+in+yeast.">Chemical-genetic profile analysis of five inhibitory compounds in yeast.</a> BMC Chem Biol. 10 (6), (2010).</li><li>Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cold Spring Harbor Laboratory. Methods In Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , (2005).</li><li>Baryshnikova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+genetic+array+(SGA)+analysis+in+Saccharomyces+cerevisiae+and+Schizosaccharomyces+pombe.">Synthetic genetic array (SGA) analysis in Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe.</a> Methods Enzymol. 470, 145-179 (2010).</li><li>Young, B. P., Loewen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balony:+a+software+package+for+analysis+of+data+generated+by+synthetic+genetic+array+experiments.">Balony: a software package for analysis of data generated by synthetic genetic array experiments.</a> BMC Bioinformatics. 14, 354 (2013).</li><li>Wagih, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SGAtools:+one-stop+analysis+and+visualization+of+array-based+genetic+interaction+screens.">SGAtools: one-stop analysis and visualization of array-based genetic interaction screens.</a> Nucleic Acids Res. 41, W591-W596 (2013).</li><li>Dittmar, J. C., Reid, R. J., Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScreenMill:+a+freely+available+software+suite+for+growth+measurement,+analysis+and+visualization+of+high-throughput+screen+data.">ScreenMill: a freely available software suite for growth measurement, analysis and visualization of high-throughput screen data.</a> BMC Bioinformatics. 11, 353 (2010).</li><li>Longley, D. B., Harkin, D. P., Johnston, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-fluorouracil:+mechanisms+of+action+and+clinical+strategies.">5-fluorouracil: mechanisms of action and clinical strategies.</a> Nat Rev Cancer. 3, 330-338 (2003).</li><li>Lum, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+modes+of+action+for+therapeutic+compounds+using+a+genome-wide+screen+of+yeast+heterozygotes.">Discovering modes of action for therapeutic compounds using a genome-wide screen of yeast heterozygotes.</a> Cell. 116, 121-137 (2004).</li><li>Toussaint, M., Conconi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+and+sensitive+assay+to+measure+yeast+cell+growth:+a+bench+protocol+for+testing+genotoxic+agents.">High-throughput and sensitive assay to measure yeast cell growth: a bench protocol for testing genotoxic agents.</a> Nat Protoc. 1, 1922-1928 (2006).</li><li>Robinson, M. D., Grigull, J., Mohammad, N., Hughes, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FunSpec:+a+web-based+cluster+interpreter+for+yeast.">FunSpec: a web-based cluster interpreter for yeast.</a> BMC Bioinformatics. 3, 35 (2002).</li><li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources.">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nat Protoc. 4, 44-57 (2009).</li><li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatics+enrichment+tools:+paths+toward+the+comprehensive+functional+analysis+of+large+gene+lists.">Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists.</a> Nucleic Acids Res. 37, 1-13 (2009).</li><li>Hong, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Ontology+annotations+at+SGD:+new+data+sources+and+annotation+methods.">Gene Ontology annotations at SGD: new data sources and annotation methods.</a> Nucleic Acids Res. 36, D577-D581 (2008).</li><li>Fang, F., Hoskins, J., Butler, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-fluorouracil+enhances+exosome-dependent+accumulation+of+polyadenylated+rRNAs.">5-fluorouracil enhances exosome-dependent accumulation of polyadenylated rRNAs.</a> Mol Cell Biol. 24, 10766-10776 (2004).</li><li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame,+single-gene+knockout+mutants:+the+Keio+collection.">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Mol Syst Biol. 2, 0008 (2006).</li><li>Nichols, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+landscape+of+a+bacterial+cell.">Phenotypic landscape of a bacterial cell.</a> Cell. 144, 143-156 (2011).</li><li>Dai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+nucleosome+function:+a+highly+versatile+library+of+synthetic+histone+H3+and+H4+mutants.">Probing nucleosome function: a highly versatile library of synthetic histone H3 and H4 mutants.</a> Cell. 134, 1066-1078 (2008).</li></ol>

The authors declare they have no competing financial interests.

מתואר כאן הוא גישה ליצירת פרופילי אינטראקציה כימית-גנטית. השיטה היא פשוטה: על ידי השוואת גדלי מושבה של כל זן באוספי מחיקת גן מקיפים בנוכחות והיעדרות של חומר כימי, כל הגנים הדרושים כדי לסבול עלבון כימי מזוהים. ניתוח העשרת ביאור של הרשימה של זנים רגישים וכתוצאה מכך לאחר...

הכלים ומשאבים זמינים באורגניזם המודל Saccharomyces cerevisiae הגנטיים אפשרו מחקרי גנומיקה התפקודית בקנה מידה גדולה שביחד מספקים תובנה חדשה איך גנים לתפקד כרשתות כדי למלא את הדרישות של מערכות ביולוגיות. אבן הפינה של כלים אלה הייתה היצירה המשותפת של סט שלם של מחיקות גן שאינו חיוניות של כל מסגרות הקריאה הפתוחה בשמרי 1,2. תצפית מדהימה הייתה שרק ~ 20% מגנים של שמרים נדרשים לכדאיות כאשר גדלו כhaploids בתנאי מעבדה סטנדרטיים. זה מדגיש את יכולתו של תא לחיץ נגד הפרעות הגנומי באמצעות הניצול של מסלולים ביולוגיים חלופיים. מוטציות גנטיות כי הן מבחינה אישית, אך קטלניות בשילוב, לאותת מסלולים ביולוגיים מקבילים מחוברים או מתכנסים ויוצרות רשתות אינטראקציה גנטיות המתארות פונקציה ביולוגית. עם התפתחותה של te המותנהאללים mperature רגישים וhypomorphic של גנים חיוניים הטכנולוגיה לא מוגבל למחקר של גנים שאינם חיוניים 3,4. מושג זה יושם בקנה מידה הגנומי לייצר מפת אינטראקציה גנטית משוחדת הממחישה את הגנים מעורבים בתהליכים תאיים דומים להתקבץ יחדיו 5. הפרעות כימיות של רשתות גנטיות מחיקות גן לחקות (איור 1) 6. שאילתות תרכובות צמיחה מעכבת כנגד מערך צפיפות גבוהה של זני מחיקה לרגישות יתר מזהה פרופיל אינטראקציה כימית-גנטי, כלומר רשימה של גנים שנדרשו לסבול מתח כימי. כמו אינטראקציות גנטיות, מסכי בקנה מידה גדולה של ספריות כימיות הראו כי תרכובות עם מצב דומה של אשכול פעולה יחד 7. לכן, על ידי הקמת פרופיל האינטראקציה הכימית-גנטית של מתחם המצב של פעולה ניתן ללמוד על ידי השוואתו עם larאינטראקציה גנטית וכימית סינתטית ge בקנה המידה גנטית מערכי נתונים 8,9. מסכי כימיים-גנטית בקנה מידה גדול, שבו עשרות רבות של תרכובות נחקרו, בוצעו על ידי מבחני תחרות ברקוד. בגישה זו, האוסף המשולב של זני מחיקה הוא גדל בהמוניהם לכמה דורות בנפח קטן של מדיה המכילה חומר כימי. מאז כל מוטציה מחיקת נמלים ברקוד גנטי ייחודי, את הכדאיות / הצמיחה של מוטציות בודדות בתוך הבריכה של זני מחיקה היא מעקב על ידי microarray או תפוקה גבוהה רצף 10. הסיק כושר על ידי ניטור גודל מושבה של מוטציות ערוכות מבחינה פיזית גדלו על אגר מוצק המכיל תרכובת ביו-אקטיבית הוא גם שיטה יעילה לזיהוי אינטראקציות כימיות-גנטי 11,12. גישה זו מספקת חלופה חסכונית להקרנה מבוססת תחרות והוא גם מתאים למנסה לאמוד ספריות קטנות של כימיקלים.מתואר כאן היא מתודולוגיה פשוטה להפקת רשימה של אינטראקציות כימיות-גנטי בS. cerevisiae שאינו מסתמך על מניפולציות מולקולריות ביולוגיה או תשתיות. זה דורש רק אוסף שמרי מחיקה, מנגנון נעיצה רובוטית או ידני, ותוכנת ניתוח תמונה זמינה באופן חופשי.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="987">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Name of Material/ Equipment&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Company&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Catalog Number&#160;</td>
			<td style="width:457px;">Comments/Description&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:213px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:161px;">BioBasic</td>
			<td>G0961</td>
			<td style="width:457px;">For YEPD liquid/solid media add to 1% final concentration (w/v)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:213px;">Tyrptone Powder</td>
			<td style="width:161px;">BD Biosciences</td>
			<td>211820</td>
			<td style="width:457px;">For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:213px;">Dextrose</td>
			<td style="width:161px;">Anachemia</td>
			<td style="width:156px;">31096-380</td>
			<td style="width:457px;">For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v) - Do not autoclave. Prepare 20% stock solution, filter sterilize, and add to media after autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Agar A</td>
			<td style="width:161px;">Bio Basic</td>
			<td>FB0010</td>
			<td style="width:457px;">For YEPD solid media add to 2% final concentration (w/v)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:213px;">G418</td>
			<td style="width:161px;">A.G. Scientific Inc.</td>
			<td style="width:156px;">G-1033</td>
			<td style="width:457px;">Prepare 1000x stock at 200mg/ml in dH2O and filter sterilize.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">12 well plate</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">5ml culture tubes</td>
			<td>Evergreen Scientific</td>
			<td>222-2376-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">10cm Petri Dish</td>
			<td style="width:161px;">VWR</td>
			<td>25384-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ROTOR HDA</td>
			<td>Singer Instruments&#160;</td>
			<td>ROT-001</td>
			<td>high-throughput microbial array pinning robot</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PLUSPLATE&#169; Petri Dish</td>
			<td>Singer Instruments&#160;</td>
			<td>PLU-001</td>
			<td>Box of 200 dishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">384 Short-Pin RePad</td>
			<td>Singer Instruments&#160;</td>
			<td>RP-MP-384</td>
			<td>Box of 1000 pads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1536 Short-Pin RePad</td>
			<td>Singer Instruments&#160;</td>
			<td>RP-MP-1536</td>
			<td>Box of 1000 pads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alternative Pinning Tools:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fully Automated Robtic Systems</td>
			<td>S&#38;P robotics</td>
			<td>http://www.sprobotics.com</td>
			<td>Several automated colony handling robitic and imagining systems available.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manual Pinning Tools</td>
			<td>V&#38;P Scientific</td>
			<td>http://www.vp-scientific.com</td>
			<td>Handheld replication tools and accessories.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid identification of chemical genetic interactions in saccharomyces cerevisiae

קביעת מצב פעולה של כימיקלים ביו-אקטיביים היא עניין למגוון רחב של אקדמיות, תרופות, ומדענים תעשייתיים. Saccharomyces cerevisiae, או שמרי ניצנים, הוא מודל לeukaryote שאוסף של ~ 6000 מוטציות מחיקת גן וגן חיוני hypomorphic מלא מוטציות זמינות מסחרי. אוספים אלה של מוטציות יכולים לשמש כדי לזהות באופן שיטתי אינטראקציות כימיות-גן, גנים כלומר צורך לסבול כימי. מידע זה, בתורו, דיווחים על המצב הסביר של פעולה של המתחם. כאן אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי המהיר של אינטראקציות כימיות-גנטית בשמרי ניצנים. אנו מדגימים את השיטה באמצעות הסוכן כימותרפיות 5-fluorouracil (5-FU), שבה יש מנגנון מוגדר היטב של פעולה. התוצאות שלנו מראות כי הנווד הגרעיני RNA אנזימי exosome ותיקון DNA נחוצים לשגשוג בנוכחות 5-FU, שעולה בקנה אחד עם מ &#39;קודםicroarray גישות המבוססות על קידוד בר כימיות גנטיות והידע ש5-FU משפיע לרעה על חילוף חומרים הן RNA ו- DNA. פרוטוקולי האימות המבוקשות למסכי תפוקה גבוהה אלה גם מתוארים.

כאימות של גישה זו הופענו מסך נציג כימי גנטי אינטראקציה של 5-fluorouracil הסוכן כימותרפיות (5-FU) בעקבות הפרוטוקול שתואר לעיל. 5-FU ידוע לשבש synthase thymidylate כמו גם DNA ו- RNA חילוף חומרים 18. האינטראקציות הגנטיות הכימית של 5-FU היטב למדו ונחקרו על ידי טכניקות microarray השמרים ברקוד באמצע...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

מהיר זיהוי של אינטראקציות גנטיות כימיות ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

rapid-identification-chemical-genetic-interactions-saccharomyces

Research

JoVE Journal

Biology

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

10.3K Views.  University of Victoria. Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

Video: Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

Dissection של Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

זיהוי של קומפלקסים חלבונים עם proteomics כמותיים cerevisiae ס

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Phosphoproteomics כמותיים חומצת שומן מגורה Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

ביטוי וטיהור של חלבון פיברוזיס פיברוזיס הטרנסממברני הרגולטור מוליכות ב Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

ניתוח גנטי מהיר של איתות אפיתל-mesenchymal במהלך התחדשות שיער

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

הדמיה וניתוח של מולקולות ה-mRNA באמצעות הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה ב<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

מבחני יחד לrefolding החלבון בניטור<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the correct amount of protein is synthesized for the cell&#8217;s specific growth conditions. One approach for measuring mRNA decay rates is inhibiting transcription and subsequently monitoring the disappearance of the already present mRNA. The rate of mRNA decay can then be quantified, and an accurate half-life can be determined utilizing several techniques. In S. cerevisiae, protocols that measure mRNA half-lives have been developed and include inhibiting transcription of mRNA using strains that harbor a temperature sensitive allele of RNA polymerase II, rpb1-1. Other techniques for measuring mRNA half-lives include inhibiting transcription with transcriptional inhibitors such as thiolutin or 1,10-phenanthroline, or alternatively, by utilizing mRNAs that are under the control of a regulatable promoter such as the galactose inducible promoter and the TET-off system. Here, we describe measurement of S. cerevisiae mRNA decay rates using the temperature sensitive allele of RNA polymerase II. This technique can be used to measure mRNA decay rates of individual mRNAs or genome-wide.

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

The steady state level of specific mRNAs is determined by the rate of synthesis and decay of the mRNA. Genome-wide mRNA degradation rates or the decay rates of specific mRNAs can be measured by determining mRNA half-lives. This protocol focuses on measurement of mRNA decay rates in Saccharomyces cerevisiae.

מדידת שיעורי ריקבון mRNA ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; שימוש ב<em&gt; Rpb1-1</em&gt; זנים

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

קביעה מבוססת צמיחה ואישור ביוכימית של דרישות גנטיות לפירוק חלבונים ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that involves the construction, cloning and expression of mutant libraries, coupled to high frequency homologous DNA recombination in vivo. Here, we present a protocol to create and screen mutant libraries in yeast based on the example of a fungal aryl-alcohol oxidase (AAO) to enhance its total activity. Two protein segments were subjected to focused-directed evolution by random mutagenesis and in vivo DNA recombination. Overhangs of ~50 bp flanking each segment allowed the correct reassembly of the AAO-fusion gene in a linearized vector giving rise to a full autonomously replicating plasmid. Mutant libraries enriched with functional AAO variants were screened in S. cerevisiae supernatants with a sensitive high-throughput assay based on the Fenton reaction. The general process of library construction in S. cerevisiae described here can be readily applied to evolve many other eukaryotic genes, avoiding extra PCR reactions, in vitro DNA recombination and ligation steps.

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

בימוי שיטת אבולוציה<em&gt; שמר האפייה</em&gt;: יצירת ספריית Mutant והקרנה

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...