The authors are deeply indebted to all the members of the scientific community working on pH and ion transport, who have originated and improved the measurements described here. They particularly thank Dr. Jacques Pouyss&#233;gur who originated the H+-killing selection technique used here. They acknowledge the University of Nice-Sophia Antipolis, the CNRS, the ANR (JCJC SVSE1 NHEint) and the ICST Labex for support.

1. H + قتل اختيار <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خطوط الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثابت بالنقل خلايا NHE التي تعاني من نقص (على سبيل المثال، PS120 خط الخلية المستمدة CCL39 16) باستخدام أي مزيج من متجه التعبير الثدييات وطريقة ترنسفكأيشن من شأنها أن تنتج عائدات ترنسفكأيشن كفاءة والتحديد في خط الخلية الليفية. ملاحظة: لسنوات عديدة كانت تستخدم فوسفات الكالسيوم هطول الأمطار 19 مع عائدات ترنسفكأيشن جيدة. تم استبدال هذا أكثر مؤخرا من قبل الكواشف التجارية مثل Lipofectamine2000، وtransfections الذي يقوم باتباع تعليمات الشركة المصنعة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حلول <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد ثلاثة حلول عقيمة وصفها على النحو التالي. تعقيم هذه الحلول عن طريق الترشيح (0.22 ميكرون). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد NH 4 + الحل تحميل (7.4 درجة الحموضة) تتألف من 50 ملي NH 4 CL، 70 ملي كلوريد الكولين، 5 ملي بوكل، 1 ملم MgCl 2، 2 مم CaCl 2، 5 ملي GLucose و 15 ملي اجتماعات الأطراف في درجة الحموضة 7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل شطف (درجة الحموضة 7.0) تتألف من 120 ملي كلوريد الكولين، 5 ملي بوكل، 1 ملم MgCl 2، 2 مم CaCl 2، الجلوكوز 5 ملي و 15 ملي HEPES في درجة الحموضة 7.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل الاسترداد (7.4 درجة الحموضة) تتألف من 120 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملي بوكل، 1 ملم MgCl 2، 2 مم CaCl 2، 5 ملي الجلوكوز و 15 ملي HEPES في درجة الحموضة 7.4. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل البدء في الاختيار، والحصول على حاضنة الثقافة الخلية التي يمكن استخدامها عند 37 درجة مئوية مع عدم وجود CO إضافي 2 من خزان الوقود الخارجي (وهو ما يسمى CO 2 - حاضنة &quot;الحرة&quot;)، و5٪ CO 2 سيؤدي إلى التخزين المؤقت التي قد تنال من التحميض. تضخيم خط الخلية تعبر عن NHE من الفائدة تصل إلى حوالي 2 × 10 8 خلايا (عادة حوالي 20 متكدسة 100 لوحات ملم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> H + قتل الإجراء: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا معربا عن NHE داخل الخلايا من الفائدة لمدة 1 ساعة في الحل تحميل، في 37 ° C في الحاضنة خالية من CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح الحل التحميل وثم شطف لهم مرتين في الحل وصفها-شطف أعلاه. تنفيذ هذه الخطوة بشكل فعال للقضاء على المتبقي خارج الخلية NH 4 الكلورين التي من شأنها أن تنال من إنشاء حاد NH 4 + التدرج من شأنها أن تولد والتحميض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> القضاء على المديين المتوسط ​​شطف بواسطة الطموح واحتضان الخلايا لمدة ساعة واحدة في حل الانتعاش مرة أخرى عند 37 درجة مئوية في حاضنة المجانية CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال المتوسطة الانتعاش مع مستنبت منتظمة (عادة DMEM مع 7.5٪ FCS) وتنمو الخلايا في ظروف الثقافة القياسية (37 درجة مئوية في جو مرطب من CO 2 و 95٪ الجوية 5٪). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر هذه الدورة من اختيار مرتين في الأسبوع حتى تظهر الحيوانات المستنسخة مستقرة. ملاحظة: خذ رعاية خاصة فيما يتعلق زراعة الخلايا وشروط الاختيار. أشهر من العمل يمكن أن تكون مدمرة من قبل أي تلوث التي هي أكثر عرضة للسccur بعد فترة طويلة من الثقافة والتلاعب خلية المتكررة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هنا، اختر ما إذا لتضخيم الحيوانات المستنسخة وتميز منهم على حدة كما هو موضح في أقسام 2-3، أو تجمع لهم معا لتوليد سكان الخلوي قبل التوصيف. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق الاختيار بين الحين والآخر (حوالي مرة كل أسبوعين) للاحتفاظ خلايا مقاومة للحموضة من قبل تلك التي ربما تكون قد عادت إلى حساسة للحمض النمط الظاهري الوالدين (الشكل 1B)، اختيار المضاد. </li></ol> 2. بين الخلايا درجة الحموضة القياسات 2.1) التصوير الإسفار درجة الحموضة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ratiometric الحساسة درجة الحموضة الفلورسنت صبغ BCECF / AM، وهو الرقم الهيدروجيني الحساسة عندما متحمس في 490 نانومتر، وتمتلك 445 نقطة isosbestic نانومتر، بعد بروتوكولات المصنعة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدلا من ذلك، استخدام غيرها من تحقيقات حساسة للدرجة الحموضة، وبعد بروتوكولات الشركة المصنعة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام التصوير المنصوص يخدعsisting من مجهر مقلوب بالإضافة إلى كاميرا فيديو عالية الحساسية. تجهيز هذه المجموعة مع 450 نانومتر و 490 نانومتر الضيقة المرشحات تدخل الفرقة يقترن الكوارتز المناسبة مرشحات الكثافة محايدة لالإثارة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان ذلك ممكنا، استخدم مجموعة مناسبة من المرشحات وشروط الإضاءة لإعداد قيم مضان مماثلة لλ1 وλ2 بحيث تقترب نسبة 1. أيضا تجنب القيم مضان القاعدية التي تم تعيينها إما تشبع أو منخفضة جدا، سواء بالنسبة للλ1 و / أو λ2. وهذا قد تسفر عن القطع الأثرية الهامة كما ثم نسبة قد يكن كشفها على الرغم من أن درجة الحموضة داخل الخلايا يتغير. ملاحظة: هذا النظام يجب تمكين نضح السريع، والإثارة في الوقت الفاصل بين اثنين من موجات المذكورة أعلاه والاستحواذ في الطول الموجي الانبعاثات السليم (535 نانومتر لBCECF). تجهيز نظام مع برنامج تمكين الحصول على البيانات التلقائي والتخزين. </li></ol></li></ol> 2.2) قياس NHE إلى الأمام آخر (بثقالبروتونات من العصارة الخلوية) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحمض الخلايا عن طريق حضانة 1 ساعة في حل NH 4 + التحميل (راجع الخطوة 1.4) في غياب CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة BCECF-AM (5 ميكرومتر تركيز النهائي) إلى حل لآخر خمس دقائق ومن ثم شطفه مع NH 4 + الحل تحميل للقضاء على التحقيق خارج الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تركيب الخلايا على المجهر وأخذ عدة صور لتسجيل خط الأساس مستقرة. يروي الحل شطف (انظر أعلاه). وهذا يؤدي إلى انخفاض في مضان المقابلة لالتحميض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد استقرار درجة الحموضة، ويروي أي من الحلول الواردة أدناه لقياس معدلات الاسترداد درجة الحموضة بوساطة لي + / H +، نا + / H + K + أو / H + الصرف. يحتوي كل حل كاتيون اقتران المحتملين لفحصها لH + الصرف. إذا تم نقل واحد من هؤلاء، وهذا سوف يؤدي إلى زيادة مضان في 495 نانومتر التي سوف الموافقأندو إلى زيادة في درجة الحموضة داخل الخلايا: 120 ملي LiCl، 5 ملي بوكل، 1 ملم MgCl 2، 2 مم CaCl 2، 5 ملي الجلوكوز و 15 ملي HEPES في درجة الحموضة 7.4 120 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملي بوكل، 1 ملم MgCl 2، 2 مم CaCl 2، 5 ملي الجلوكوز و 15 ملي HEPES في درجة الحموضة 7.4 125 ملي بوكل، 1 ملم MgCl 2، 2 مم CaCl 2، 5 ملي الجلوكوز و 15 ملي HEPES في درجة الحموضة 7.4 </li></ol> 2.3) قياس NHE آخر عكسي ملاحظة: إن المبدأ هنا هو عكس الغشاء التدرجات الأيونية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل القياس، تحميل الخلايا مع الموجبة داخل الخلايا من الفائدة (انظر أدناه). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لهم لمدة 5 دقائق مع BCECF / AM (راجع الخطوة 2.2.2)؛ شطف لهم، جبل لهم على المجهر الفيديو. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يروي الحل التحميل وتأخذ عدة صور لتسجيل خط الأساس مستقرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد استقرار خط الأساس، صورة الاختلافات درجة الحموضة عند و perfused الخلايا مع وسيلة الحمضية خارج الخلية التي تحتوي على 120 مM كلوريد الكولين، 5 ملي بوكل، 1 ملم MgCl 2، 2 مم CaCl 2، 5 الجلوكوز ملي و 15 ملي زارة التربية والعلم في درجة الحموضة 6.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لLiCl التحميل واحتضان خلايا لمدة 2 ساعة في محلول مكون من 120 ملي LiCl، 5 ملي بوكل، 1 ملم MgCl 2، 2 مم CaCl 2، 5 ملي الجلوكوز و 15 ملي HEPES في درجة الحموضة 7.4. الليثيوم داخل الخلايا يقاس الامتصاص الذري الطيفي غلة قيمتها نحو 60 ملي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لنا + التحميل واحتضان خلايا لمدة ساعتين في محلول مكون من 120 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملي بوكل، 1 ملم MgCl 2، 2 مم CaCl 2، 5 ملي الجلوكوز و 15 ملي HEPES في درجة الحموضة 7.4 بحضور 1 ملم ابائين لمنع نا / K أتباز. في هذه الظروف، بين الخلايا تركيز نا + هو في حدود 40 مم. ملاحظة: K + تحميل ليس من الضروري كما K + عصاري خلوي التركيز هو في حدود 140 مم وموجهة ظاهريا-K + التدرج هو بالتالي من السهل تحقيق. </li></ol> 2.4) العلاج ومعايرة البيانات: ملاحظة: هذه الخطوة ينطبق على كل من القياسات إلى الأمام وعكس. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في نهاية كل تجربة، يروي خلايا بمحلول مكون من 140 ملي بوكل، 20 ملي HEPES و 5 ميكرومتر nigericin تعديلها لقيم درجة الحموضة ما بين 6.5 و 7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع البيانات والقياسات مضان من الصور (مستويات الرمادي تمثل مستويات كثافة) والتصدير تحت تنسيق النص وعلاج كما هو موضح أدناه باستخدام برنامج جدول بيانات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب القيم الرقم الهيدروجيني بين الخلايا لكل خلية فردية أو المنطقة ذات الاهتمام باستخدام المعادلة التالية: الرقم الهيدروجيني = + الباكاف الحمضية (سجل (R-RMIN) / (ماكس R -R)) × F دقيقة (λ2) / F ماكس (λ2) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام دقيقة F (λ2) / F أماه العاشر (λ2) نسبة إذا كان هناك تحقيق تبييض أو تسرب، مما أدى إلى انخفاض في مضان 450 نانومتر في جميع أنحاء التجارب. هذا هو ولكن نادرا جدا ما لوحظ في الظروف المستخدمة في ديستجارب cribed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كما موجودة في نهاية كل قياس درجة الحموضة بيانات المعايرة، والتحقق ما إذا كانت القيم المحسوبة المناظرة تختلف عن قيم الرقم الهيدروجيني المستخدمة في المعايرة. إذا كان هذا هو الحال، ثم ضبط جميع القيم الرقم الهيدروجيني تجريبيا لمعايرة باستخدام الإجراء التالي: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب حاصل التالية (Q، والفرق بين القيم المقاسة / الفرق بين القيم المعايرة). مضاعفة بيانات كله Q. جعل التعديل النهائي من قبل الجمع أو الطرح بحيث القيم المحسوبة سوف تساوي القيم المعايرة المقابلة. </li></ol></li></ol> 3. قياسات معدلات الأولية للNHE7 التي كتبها سريع لي + امتصاص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا البذور على لوحات متعددة جيدا (6 إلى 24 عاما أيضا) وتحمض لهم باستخدام إما NH 4 تقنية + تحميل المذكورة أعلاه أو بالتناوب nigericin / البقري ألبومين المصل (BSA) تحمض وصفها في 20. </li><lI&gt; لوحات شطف مرتين بسرعة باستخدام محلول شطف المبين أعلاه ثم احتضان الخلايا في امتصاص الحلول التي تحتوي على 1-10 ملم الليثيوم (أقل قليلا من القيم كم) وتركيزات المطلوب من الكاتيونات و / أو مثبطات التي تهم المبلغ المطلوب من الزمن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على فترات امتصاص قصيرة ومتسقة (عادة دقيقة واحدة أو أقل) لضمان حسن سير هذا النقل في ظروف معدلات الأولية. وتأكد أيضا من أن جميع الحلول المستخدمة لامتصاص هي متساوي التوتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في نهاية الوقت امتصاص، والقضاء على بعناية المتوسطة امتصاص وغسل الخلايا أربع مرات مع المالحة الفوسفات الجليد الباردة مخزنة (PBS). تنفيذ هذه يغسل بأسرع وقت ممكن (أقل من 10 ثانية لأربعة منهم هو المثالي) لمنع هروب رأس المال الليثيوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ليز الخلايا في 25٪ حمض النيتريك. تطبيق 250 ميكرولتر لكل بئر من 25٪ حمض النيتريك والسماح لها الجلوس لمدة 1 ساعة على الأقل، ثم إلغاء كل بئر مع نهاية غيض ماصة ونقل تعليق جيدا كله في ميل جديدأنبوب crocentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل المحللة في 1.5 مل أنابيب microcentrifuge، الطرد المركزي لهم لمدة 5 دقائق على 15،000 x ج (درجة حرارة الغرفة) لإزالة الحطام الخلوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس محتوى الليثيوم من supernatants بواسطة الامتصاص الذري الطيفي 21. ملاحظة: توفر شركات مختلفة الطيف الامتصاص الذري، والتي يجب أن تكون مجهزة ليثيوم مصباح الكاثود جوفاء. اتبع تعليمات الشركة المصنعة لأن هذه الآلات هي دقيقة جدا ولكن أيضا حساسة جدا. </li></ol>

<ol>
	<li>Marshansky, V., Futai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+V-type+H+-ATPase+in+vesicular+trafficking:+targeting,+regulation+and+function.">The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function.</a> Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 415-426 (2008).</li><li>Jentsch, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloride+and+the+endosomal-lysosomal+pathway:+emerging+roles+of+CLC+chloride+transporters.">Chloride and the endosomal-lysosomal pathway: emerging roles of CLC chloride transporters.</a> J Physiol. 578 (3), 633-640 (2007).</li><li>Kornak, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+a3+subunit+of+the+vacuolar+H(+)-ATPase+cause+infantile+malignant+osteopetrosis.">Mutations in the a3 subunit of the vacuolar H(+)-ATPase cause infantile malignant osteopetrosis.</a> Hum Mol Genet. 9 (13), 2059-2063 (2000).</li><li>Gunther, W., Piwon, N., Jentsch, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ClC-5+chloride+channel+knock-out+mouse+-+an+animal+model+for+Dent's+disease.">The ClC-5 chloride channel knock-out mouse - an animal model for Dent's disease.</a> Pflugers Arch. 445 (4), 456-462 (2003).</li><li>Kasper, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+the+chloride+channel+ClC-7+leads+to+lysosomal+storage+disease+and+neurodegeneration.">Loss of the chloride channel ClC-7 leads to lysosomal storage disease and neurodegeneration.</a> Embo J. 24 (5), 1079-1091 (2005).</li><li>Poet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal+storage+disease+upon+disruption+of+the+neuronal+chloride+transport+protein+ClC-6.">Lysosomal storage disease upon disruption of the neuronal chloride transport protein ClC-6.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (37), 13854-13859 (2006).</li><li>Nakamura, N., Tanaka, S., Teko, Y., Mitsui, K., Kanazawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four+Na+/H++exchanger+isoforms+are+distributed+to+Golgi+and+post-Golgi+compartments+and+are+involved+in+organelle+pH+regulation.">Four Na+/H+ exchanger isoforms are distributed to Golgi and post-Golgi compartments and are involved in organelle pH regulation.</a> J Biol Chem. 280 (2), 1561-1572 (2005).</li><li>Gilfillan, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLC9A6+mutations+cause+X-linked+mental+retardation,+microcephaly,+epilepsy,+and+ataxia,+a+phenotype+mimicking+Angelman+syndrome.">SLC9A6 mutations cause X-linked mental retardation, microcephaly, epilepsy, and ataxia, a phenotype mimicking Angelman syndrome.</a> Am J Hum Genet. 82 (4), 1003-1010 (2008).</li><li>Mignot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+mutation+in+SLC9A6+gene+in+a+patient+with+Christianson+syndrome+and+retinitis+pigmentosum.">Novel mutation in SLC9A6 gene in a patient with Christianson syndrome and retinitis pigmentosum.</a> Brain &amp; Development. 35 (2), 172-176 (2013).</li><li>Morrow, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+autism+loci+and+genes+by+tracing+recent+shared+ancestry.">Identifying autism loci and genes by tracing recent shared ancestry.</a> Science. 321 (5886), 218-223 (2008).</li><li>Lasky-Su, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+association+scan+of+the+time+to+onset+of+attention+deficit+hyperactivity+disorder.">Genome-wide association scan of the time to onset of attention deficit hyperactivity disorder.</a> Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet. 147B (8), 1355-1358 (2008).</li><li>Franke, B., Neale, B. M., Faraone, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+association+studies+in+ADHD.">Genome-wide association studies in ADHD.</a> Hum Genet. 126 (1), 13-50 (2009).</li><li>Meda, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+scale+multivariate+parallel+ICA+method+reveals+novel+imaging-genetic+relationships+for+Alzheimer's+disease+in+the+ADNI+cohort.">A large scale multivariate parallel ICA method reveals novel imaging-genetic relationships for Alzheimer's disease in the ADNI cohort.</a> Neuroimage. 60 (3), 1608-1621 (2012).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microdeletion+in+Xp11.3+accounts+for+co-segregation+of+retinitis+pigmentosa+and+mental+retardation+in+a+large+kindred.">A microdeletion in Xp11.3 accounts for co-segregation of retinitis pigmentosa and mental retardation in a large kindred.</a> Am J Med Genet A. 140 (4), 349-357 (2006).</li><li>Sardet, C., Franchi, A., Pouyss&#233;gur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning,+primary+structure,+and+expression+of+the+human+growth+factor-activatable+Na+/H++antiporter.">Molecular cloning, primary structure, and expression of the human growth factor-activatable Na+/H+ antiporter.</a> Cell. 56 (2), 271-280 (1989).</li><li>Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L'Allemain, G., Paris, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+mutation+abolishing+Na+/H++antiport+activity+in+hamster+fibroblasts+precludes+growth+at+neutral+and+acidic+pH.">A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (15), 4833-4837 (1984).</li><li>Franchi, A., Cragoe, E., Pouyss&#233;gur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+properties+of+fibroblast+mutants+overexpressing+an+altered+Na+/H++antiporter.">Isolation and properties of fibroblast mutants overexpressing an altered Na+/H+ antiporter.</a> J Biol Chem. 261 (31), 14614-14620 (1986).</li><li>Milosavljevic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Intracellular+Na+/H++Exchanger+NHE7+effects+a+Na++coupled,+but+not+K++coupled+proton-loading+mechanism+in+endocytosis.">The Intracellular Na+/H+ Exchanger NHE7 effects a Na+ coupled, but not K+ coupled proton-loading mechanism in endocytosis.</a> Cell Reports. 7 (3), 1-8 (2014).</li><li>Wigler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+mammalian+cells+with+genes+from+procaryotes+and+eucaryotes.">Transformation of mammalian cells with genes from procaryotes and eucaryotes.</a> Cell. 16 (4), 777-785 (1979).</li><li>Lacroix, J., Po&#235;t, M., Maherel, C., Counillon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+for+the+activation+of+the+Na/H+exchanger+NHE-1+by+cytoplasmic+acidification+and+mitogens.">A mechanism for the activation of the Na/H exchanger NHE-1 by cytoplasmic acidification and mitogens.</a> EMBO Reports. 5 (1), 91-96 (2004).</li><li>Milosavljevic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nongenomic+Effects+of+Cisplatin:+Acute+Inhibition+of+Mechanosensitive+Transporters+and+Channels+without+Actin+Remodeling.">Nongenomic Effects of Cisplatin: Acute Inhibition of Mechanosensitive Transporters and Channels without Actin Remodeling.</a> Cancer Res. 70 (19), 7514-7522 (2010).</li><li>Boron, W. F., De Weer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pH+transients+in+squid+giant+axons+caused+by+CO2,+NH3,+and+metabolic+inhibitors.">Intracellular pH transients in squid giant axons caused by CO2, NH3, and metabolic inhibitors.</a> J Gen Physiol. 67 (1), 91-112 (1976).</li><li>Paradiso, A. M., Tsien, R. Y., Machen, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na+-H++exchange+in+gastric+glands+as+measured+with+a+cytoplasmic-trapped,+fluorescent+pH+indicator.">Na+-H+ exchange in gastric glands as measured with a cytoplasmic-trapped, fluorescent pH indicator.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (23), 7436-7440 (1984).</li><li>Paradiso, A. M., Tsien, R. Y., Machen, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+image+processing+of+intracellular+pH+in+gastric+oxyntic+and+chief+cells.">Digital image processing of intracellular pH in gastric oxyntic and chief cells.</a> Nature. 325, 447-450 (1987).</li><li>Quentin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RhBG+and+RhCG,+the+putative+ammonia+transporters,+are+expressed+in+the+same+cells+in+the+distal+nephron.">RhBG and RhCG, the putative ammonia transporters, are expressed in the same cells in the distal nephron.</a> J Am Soc Nephrol. 14 (3), 545-554 (2003).</li><li>Geyer, R. R., Musa-Aziz, R., Enkavi, G., Mahinthichaichan, P., Tajkhorshid, E., Boron, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movement+of+NH3+through+the+human+urea+transporter+B:+a+new+gas+channel.">Movement of NH3 through the human urea transporter B: a new gas channel.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 304 (12), F1447-F1457 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

يصف هذا البروتوكول وكيفية اختيار الخلايا معربا داخل الخلايا نا + / H + المبادلات في غشاء البلازما دون تغيير تسلسل الأساسي من خلال الطفرات موقع الموجه. ويمكن الآن أن تتسم هذه المبادلات. ويستند هذا الأسلوب على سمية الخلوي...

عرض معظم مقصورات درجة الحموضة داخل الخلايا اللمعية الحمضية، وهي معلمة رئيسية للنضوج، والاتجار، وإعادة التدوير من البروتينات أو الهرمونات والناقلات العصبية تحميل. وقد تبين أن يتم إنشاء التدرج درجة الحموضة بين العصارة الخلوية والحويصلي المحتوى من قبل فجوي H + ATPases 1، بالإضافة إلى حويصلي النقل كلوريد CLC 2. سواء في طرق المغادرة (KO) الفئران والمرضى من البشر، وقد تم تسليط الضوء على أهمية هذه الناقلين من الظواهر الثقيلة التي تسببها طفرات في جيناتها 3-6. ووصف أعضاء المبادلات الصوديوم والهيدروجين SLC9A الأسرة، وكذلك NHEs لنا + / H + المبادلات، وقد ثبت أن تكون المؤثرات الرئيسية في درجة الحموضة داخل الخلايا وتنظيم حجم الخلية، وكذلك في نقل اتجاهي من مكافئات الحمضي القاعدي عبر الظهارة . إلى جانب NHEs غشاء البلازما، وثلاثة حفظا للغاية نا + / H + المبادلات، NHE 6 و 7ويتم التعبير عن 9 في شبكة عابرة للجولجي والإندوسومات في وقت مبكر (7). وقد تم ربط الطفرات في الجينات مع Angelman تشبه أو كرستيانسون المتلازمات 8-9 والتوحد القائم على الأسرة 10 ونقص الانتباه فرط النشاط اضطراب 11-12. كما شاركت هذه المبادلات في المشاكل العصبية مثل مرض الزهايمر القابلية 13 و X-ربط التخلف العقلي الجينات متجاورة متلازمات 14. أخذت معا، وتبرز هذه الدراسات على أهمية هذه NHEs داخل الخلايا في نمو الدماغ و / أو وظيفة. توطين الخلايا من هذه المبادلات يمنع قياسات دقيقة من الانتقائية أيون، والاتجاه النقل والمعلمات الحركية، والتنظيم. كما هو الحال بالنسبة لجميع الناقلين أعرب في المقصورات داخل الخلايا، فإنه من الصعب للغاية لتقييم أنشطتها الحيوية، وبالتالي التوصل إلى فهم كامل أدوارهم الفسيولوجية وميكانالمذهبين الكامنة آثارها المرضية. وبناء على عصاري خلوي تركيز K + عالية، وكانت الفرضية الأكثر شيوعا قبلت أن كانوا يعملون كما K + جانب بروتون النقل هروب رأس المال. وكان وجود مثل تسرب بروتون تم الافتراض، لأنها قد موازنة بروتون ضخ من قبل V-ATPases من أجل الحفاظ على حالة الاستقرار حويصلي درجة الحموضة. والهدف من هذه المادة هو البصرية (ط) ليبرهن على وجود طريقة التي تسمح للاختيار الوراثية من خطوط الخلايا التي تعبر عن هذه الناقلين حويصلي في غشاء البلازما الخاصة بهم، و (ثانيا) لإظهار نهجين مستقلة لقياس وظائف هذه الناقلين. قبل ثلاثة عقود، Pouysségur وفرانكي كان لها السبق في نهج الجيني التي مكنت الاستنساخ الجزيئي وتوصيف أعضاء الأسرة NHE 15. وقد استند هذا على سمية البروتونات داخل الخلايا كوسيلة من وسائل الفحص. وكانت الخطوة الأولى للحصول على خطوط الخلايا ناقصةفي أي نا + / H + الصرف التي أعرب عنها في غشاء البلازما، وذلك باستخدام عكس هذا الناقل. تم مسبقة الخلايا الليفية (CCL39 خط خلية) مع نا + أو لي + ثم توضع في وسيلة خارج الخلية الحمضية (الرقم الهيدروجيني 6.5) لمدة 2 ساعة. وأدى ذلك إلى موت خلايا تعبر عن وظيفي نا + / H + الصرف واختيار خلايا antiporter ناقص (PS120 خط الخلية) 16. عندما يزرع في خالية من بيكربونات المتوسطة، وهذه الخلايا هي حساسة جدا لتحمض داخل الخلايا الحاد. ونتيجة لذلك، وسيتم اختيار التعبير عن أي آلية بروتون هروب رأس المال وظيفية في غشاء البلازما إيجابيا (انظر 17) إذا قدمت مثل هذه الخلايا إلى داخل الخلايا acidifications الحادة. تقنيات تحمض مثل هذه يمكن استخدامها لعزل خطوط الخلايا مع الاتجار العيوب تمكين التعبير القسري للNHEs داخل الخلايا WT على غشاء البلازما. كما حقيقية النواة نا + / H+ المبادلات هي electroneutral، فهي ليست قابلة للقياس من قبل النهج الكهربية التي استخدمت مع النجاح الكبير لقياس القنوات. لذا يوضح هذا المخطوط كيفية قياس نشاط هذا مبادل من قياسات درجة الحموضة داخل الخلايا وحركية السريع لامتصاص الليثيوم. كما المفاهيم الأساسية هي نفسها، ومن المثير للاهتمام أن نلاحظ أن العديد من العمليات التي وضعت لاختيار القسم تستخدم أيضا بشكل مباشر عن القياسات الوظيفية. ومن المثير للاهتمام، لاحظنا أن العيب الاتجار الحالي في خطوط الخلية المحددة باستخدام النهج الوارد وصفها في هذه المخطوطة يؤدي إلى التعبير أكبر من البروتينات حويصلي أخرى في غشاء البلازما مثل قناة البوتاسيوم حويصلي TWIK1 18. وهذا يشير إلى نحو اختيار آلية عيب الاحتفاظ العامة للبروتينات الغشاء حويصلي. وبالتالي هذا الإجراء الاختيار وخلايا أنه يولد مايوتشكل أداة واعدة بالنسبة للمجتمع العلمي تعمل على بروتينات الغشاء من المقصورات داخل الخلايا. وكذلك تقنيات قياس المقدمة هنا قد تكون قابلة للتطبيق لدراسة أخرى الناقلين غير كهربي.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="621">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:119px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Standard cell culture equipement</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Used for H+ killing selection composed of many devices with different catalog numbers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Incubator with CO2</td>
			<td style="width:119px;">Sanyo</td>
			<td style="width:119px;">MCO15A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Incubator without CO2</td>
			<td style="width:119px;">Heraeus instrument</td>
			<td style="width:119px;">BB6220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Laminar flow hood PSM1200NF</td>
			<td style="width:119px;">Fisher&#160;</td>
			<td style="width:119px;">52010120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM medium</td>
			<td style="width:119px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">D5796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FBS gold</td>
			<td style="width:119px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">A15-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicilin/streptomycin</td>
			<td style="width:119px;">PAA</td>
			<td>P11-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin 10X</td>
			<td style="width:119px;">PAA</td>
			<td style="width:119px;">L11-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Atomic Absorption spectrometer with Zeeman furnace system</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ICE 3500 GFZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LiCl</td>
			<td style="width:119px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">L4408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nitric Acid</td>
			<td style="width:119px;">sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">438073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fluorescence videomicroscopy set</td>
			<td style="width:119px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Composed of many devices with different catalog numbers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Inverted automated microscope</td>
			<td style="width:119px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">DMI6000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">microscope stand</td>
			<td style="width:119px;">leica</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11888906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11888911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11505180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11888377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">incident fluorescence</td>
			<td style="width:119px;">leica</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11888901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11504166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">motor bracket</td>
			<td style="width:119px;">leica</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11888379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11505234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11521505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11522106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LED transmission light&#160;</td>
			<td style="width:119px;">leica</td>
			<td align="right" style="width:119px;">8097321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">8102034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11521580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">motorized plate</td>
			<td style="width:119px;">leica</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11522068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11531172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11521734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11521719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11888423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11888424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">camera output</td>
			<td style="width:119px;">leica</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11888373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11507807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11888393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11888259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11888258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11541510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">images acquisition/analysis software</td>
			<td style="width:119px;">leica</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11888375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">optics</td>
			<td style="width:119px;">leica</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11506507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11506243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11506203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">fluorescence Xenon lamp</td>
			<td style="width:119px;">leica</td>
			<td style="width:119px;">DMI6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">camera</td>
			<td style="width:119px;">hamamatsu</td>
			<td align="right" style="width:119px;">8100601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">metafluor/Mmfluor software</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11640905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pH sensitive probe, BCECF-AM</td>
			<td style="width:119px;">life technologies</td>
			<td style="width:119px;">B1170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nigericin</td>
			<td style="width:119px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N7143</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional characterization of na+/h+ exchangers of intracellular compartments using proton-killing selection to express them at the plasma membrane

تحمض Endosomal أمر بالغ الأهمية لمجموعة واسعة من العمليات، مثل إعادة التدوير البروتين وتدهور، مستقبلات الحساسية، وناقل عصبي تحميل في الحويصلات المشبكية. يتم وصف هذا تحمض أن بوساطة ATPases بروتون، بالإضافة إلى النقل كلوريد CLC. غاية الحفاظ-البروتونات النقل electroneutral، وأعرب نا + / H + المبادلات (NHE) 6 و 7 و 9 أيضا في هذه المقصورات. وقد تم ربط الطفرات في الجينات مع الأمراض المعرفية والعصبية البشرية. ومن المفارقات، تظل أدوارهم بعيد المنال، وتوطين لهم داخل الخلايا منعت توصيف وظيفي مفصل. وتظهر هذه المخطوطة طريقة لحل هذه المشكلة. هذا يتكون من مجموعة من خطوط الخلايا الطافرة، قادرة على قيد الحياة تحمض عصاري خلوي الحاد من خلال الاحتفاظ NHEs داخل الخلايا في الغشاء البلازمي. ثم يصور اثنين من البروتوكولات المكملة لقياس الانتقائية أيون والنشاطهذه المبادلات: (ط) واحدة على أساس قياسات درجة الحموضة داخل الخلايا باستخدام المجهر مضان الفيديو، و (ثانيا) واحدة على أساس حركية سريعة الامتصاص الليثيوم. هذه البروتوكولات يمكن استقراء لقياس غيرها من شركات النقل غير كهربي. وعلاوة على ذلك، فإن الإجراء اختيار المعروضة هنا يولد خلايا مع الاحتفاظ النمط الظاهري خلل داخل الخلايا. لذلك هذه الخلايا سوف التعبير عن الأخرى أيضا بروتينات الغشاء الحويصلي على غشاء البلازما. ولذلك فإن استراتيجية التجريبية يصور هنا تشكل أداة قوية محتملة لدراسة البروتينات داخل الخلايا الأخرى التي سيتم ثم أعرب عنها في غشاء البلازما جنبا إلى جنب مع حويصلي نا + / H + المبادلات المستخدمة في اختيار.

الاختيار: ويستند اختيار H + قتل على نشر قاعدة ضعيفة الأمونيوم، كما هو مبين في الشكل 1A. وقد رائدة تأثير قواعد ضعيفة والأحماض نشر على درجة الحموضة داخل الخلايا والتر البورون والمتعاونين 22. فكرة أنيقة لاستخدام هذ...

Watch this Scientific Journal Video about Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane at JoVE.c

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers.

توصيف وظيفي نا<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; المبادلات بين الخلايا من المقصورات عن طريق بروتون-مما أسفر عن مقتل اختيار للتعبير عنها في غشاء البلازما

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and ...

functional-characterization-na-h-exchangers-intracellular

Research

JoVE Journal

Biology

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

9.2K Views.  Université Nice-Sophia Antipolis, Laboratoire de Physiomédecine Moléculaire, CNRS UMR7370, and Laboratories of Excellence Ion Channel Science and Therapeutics. The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers. 

Video: Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, increasing evidence suggests that astrocytes may also actively participate in brain function through functional interactions with neurons.  However, many fundamental aspects of astrocyte biology remain controversial, unclear and/or experimentally unexplored. One important issue is the dynamics of intracellular calcium transients in astrocytes. This is relevant because calcium is well established as an important second messenger and because it has been proposed that astrocyte calcium elevations can trigger the release of transmitters from astrocytes. However, there has not been any detailed or satisfying description of near plasma membrane calcium signaling in astrocytes. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful tool to analyze physiologically relevant signaling events within about 100 nm of the plasma membrane of live cells. Here, we use TIRF microscopy and describe how to monitor near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics almost simultaneously. The further refinement and systematic application of this approach has the potential to inform about the precise details of astrocyte calcium signaling. A detailed understanding of astrocyte calcium dynamics may provide a basis to understand if, how, when and why astrocytes and neurons undergo calcium-dependent functional interactions.

We describe how to measure near membrane and global intracellular calcium dynamics in cultured astrocytes using total internal reflection and epifluorescence microscopy.

قياس الأدنى غشاء البلازما والعالمية حيوية الكالسيوم بين الخلايا في الخلايا النجمية

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

بلورة البروتينات الغشائية لتحديد الهيكل باستخدام Mesophases Lipidic

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

قياس الكمي GLUT4 إزفاء إلى غشاء البلازما التي التدفق الخلوي

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Identifying the Effects of BRCA1 Mutations on Homologous Recombination using Cells that Express Endogenous Wild-type BRCA1

The functional analysis of missense mutations can be complicated by the presence in the cell of the endogenous protein. Structure-function analyses of the BRCA1 have been complicated by the lack of a robust assay for the full length BRCA1 protein and the difficulties inherent in working with cell lines that express hypomorphic BRCA1 protein1,2,3,4,5. We developed a system whereby the endogenous BRCA1 protein in a cell was acutely depleted by RNAi targeting the 3'-UTR of the BRCA1 mRNA and replaced by co-transfecting a plasmid expressing a BRCA1 variant. One advantage of this procedure is that the acute silencing of BRCA1 and simultaneous replacement allow the cells to grow without secondary mutations or adaptations that might arise over time to compensate for the loss of BRCA1 function. This depletion and add-back procedure was done in a HeLa-derived cell line that was readily assayed for homologous recombination activity. The homologous recombination assay is based on a previously published method whereby a recombination substrate is integrated into the genome (Figure 1)6,7,8,9. This recombination substrate has the rare-cutting I-SceI restriction enzyme site inside an inactive GFP allele, and downstream is a second inactive GFP allele. Transfection of the plasmid that expresses I-SceI results in a double-stranded break, which may be repaired by homologous recombination, and if homologous recombination does repair the break it creates an active GFP allele that is readily scored by flow cytometry for GFP protein expression. Depletion of endogenous BRCA1 resulted in an 8-10-fold reduction in homologous recombination activity, and add-back of wild-type plasmid fully restored homologous recombination function. When specific point mutants of full length BRCA1 were expressed from co-transfected plasmids, the effect of the specific missense mutant could be scored. As an example, the expression of the BRCA1(M18T) protein, a variant of unknown clinical significance10, was expressed in these cells, it failed to restore BRCA1-dependent homologous recombination. By contrast, expression of another variant, also of unknown significance, BRCA1(I21V) fully restored BRCA1-dependent homologous recombination function. This strategy of testing the function of BRCA1 missense mutations has been applied to another biological system assaying for centrosome function (Kais et al, unpublished observations). Overall, this approach is suitable for the analysis of missense mutants in any gene that must be analyzed recessively.

We provide a method for testing BRCA1 variants in a tissue culture based assay for homologous recombination repair of DNA damage by depleting endogenous BRCA1 protein from a cell using RNAi and replacing it with a BRCA1 point mutant that contains a coding change.

تحديد آثار الطفرات BRCA1 على التوحد باستخدام خلايا متماثلة التي تعبر عن الذاتية وحشية من نوع BRCA1

The functional analysis of missense mutations can be complicated by the presence in the cell of the endogenous protein. Structure-function analyses of the ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

استخدام روبوت لارتفاع الإنتاجية البلورة من بروتينات الغشاء في Mesophases شحمي

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

الحصاد والبرد تبريد بلورات من بروتينات الغشاء يزرع في Mesophases شحمي لتحديد هيكل للعلم البلورات ضخم الجزيئات

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

حيوي داخلي المجهري للهياكل التصوير التحت خلوية في الفئران لايف تعرب عن البروتينات الفلورية

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

The Cell-based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. The cell based L-glutathione protection assays can be used to study endocytosis and recycling of protein receptors, channels, transporters, and adhesion molecules localized at the cell surface. The endocytic assay requires labeling of cell surface proteins with a cell membrane impermeable biotin containing a disulfide bond and the N-hydroxysuccinimide (NHS) ester at 4 &#186;C -&#160;a temperature at which membrane trafficking does not occur. Endocytosis of biotinylated plasma membrane proteins is induced by incubation at 37 &#186;C. Next, the temperature is decreased again to 4 &#186;C to stop endocytic trafficking and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins that have remained at the plasma membrane is reduced with L-glutathione. At this point, only proteins that were endocytosed remain protected from L-glutathione and thus remain biotinylated. After cell lysis, biotinylated proteins are isolated with streptavidin agarose, eluted from agarose, and the biotinylated protein of interest is detected by western blotting. During the recycling assay, after biotinylation cells are incubated at 37 &#176;C to load endocytic vesicles with biotinylated proteins and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins remaining at the plasma membrane is reduced with L-glutathione at 4 &#186;C as in the endocytic assay. Next, cells are incubated again at 37 &#176;C to allow biotinylated proteins from endocytic vesicles to recycle to the plasma membrane. Cells are then incubated at 4 &#186;C, and the disulfide bond in biotin attached to proteins that recycled to the plasma membranes is reduced with L-glutathione. The biotinylated proteins protected from L-glutathione are those that did not recycle to the plasma membrane.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. Methods described in this article are designed to study endocytosis and recycling of plasma membrane proteins.

في دراسة لالإلتقام وإعادة غشاء البلازما من البروتينات القائم على خلية L-الجلوتاثيون حماية فحوصات

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during the fusion of vesicle and plasma membranes. These rapid and localized changes are achieved by dynamic interactions between lipids and specialized proteins that control membrane curvature. The absence of such interactions would not only have devastating consequences for vesicle fusion, but a host of other cellular functions that involve control of membrane shape. In recent years, the identity of a number of proteins with membrane-shaping properties has been determined. What remains missing is a roadmap of when, where, and how they act as fusion and content release progress.
Our understanding of the molecular events that enable membrane remodeling has historically been limited by a lack of analytical methods that are sensitive to membrane curvature or have the temporal resolution to track rapid changes. PTIRFM satisfies both of these criteria. We discuss how pTIRFM is implemented to visualize and interpret rapid, submicron changes in the orientation of chromaffin cell membranes during dense core vesicle (DCV) fusion. The chromaffin cells we use are isolated from bovine adrenal glands. The membrane is stained with a lipophilic carbocyanine dye,1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate, or&#160;diD. DiD intercalates in the membrane plane with a &#34;fixed&#34; orientation and is therefore sensitive to the polarization of the evanescent field. The diD-stained cell membrane is sequentially excited with orthogonal polarizations of a 561&#160;nm laser (p-pol, s-pol). A 488&#160;nm laser is used to visualize vesicle constituents and time the moment of fusion. Exocytosis is triggered by locally perfusing cells with a depolarizing KCl solution. Analysis is performed offline using custom-written software to understand how diD emission intensity changes relate to fusion pore dilation.

Polarization-based Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) enables real-time detection of cell membrane dynamics. This article describes the implementation of pTIRFM for the study of membrane remodeling during regulated exocytosis. The technique is generalizable to other processes in cell biology that directly or indirectly involve changes in membrane shape.

التصوير البلازما غشاء التشويهات مع pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure plasma (LPP) discharges contain a broad spectrum of active species, which lead to rapid microbial inactivation. To study the efficiency and mechanisms of sterilization by LPP, we use spores of the test organism Bacillus subtilis because of their extraordinary resistance against conventional sterilization procedures. We describe the production of B. subtilis spore monolayers, the sterilization process by low pressure plasma in a double inductively coupled plasma reactor, the characterization of spore morphology using scanning electron microscopy (SEM), and the analysis of germination and outgrowth of spores by live cell microscopy. A major target of plasma species is genomic material (DNA) and repair of plasma-induced DNA lesions upon spore revival is crucial for survival of the organism. Here, we study the germination capacity of spores and the role of DNA repair during spore germination and outgrowth after treatment with LPP by tracking fluorescently-labelled DNA repair proteins (RecA) with time-resolved confocal fluorescence microscopy. Treated and untreated spore monolayers are activated for germination and visualized with an inverted confocal live cell microscope over time to follow the reaction of individual spores. Our observations reveal that the fraction of germinating and outgrowing spores is dependent on the duration of LPP-treatment reaching a minimum after 120 s. RecA-YFP (yellow fluorescence protein) fluorescence was detected only in few spores and developed in all outgrowing cells with a slight elevation in LPP-treated spores. Moreover, some of the vegetative bacteria derived from LPP-treated spores showed an increase in cytoplasm and tended to lyse. The described methods for analysis of individual spores could be exemplary for the study of other aspects of spore germination and outgrowth.

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

This protocol illustrates the important consecutive steps required to assess the relevance of monitoring vitality parameter and DNA repair processes in reviving Bacillus subtilis spores after treatment with low pressure plasma by tracking fluorescence-labelled DNA repair proteins via time-resolved confocal microscopy and scanning electron microscopy.

التحقيق "تضر الآثار من منخفضة الضغط البلازما التعقيم" على البقاء لجراثيم Bacillus نجحت "باستخدام خلية يعيش مجهرية"

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure ...