The authors are deeply indebted to all the members of the scientific community working on pH and ion transport, who have originated and improved the measurements described here. They particularly thank Dr. Jacques Pouyss&#233;gur who originated the H+-killing selection technique used here. They acknowledge the University of Nice-Sophia Antipolis, the CNRS, the ANR (JCJC SVSE1 NHEint) and the ICST Labex for support.

1. H + 죽이는 선택 <ol><li> 세포주 <ol><li> 안정적 NHE 결핍 세포를 형질 감염 (예, CCL39 유래 PS120 세포주 16) 섬유 모세포 세포주에서 효율적인 형질 전환 수율 및 선택을 생산할 예정 포유 동물 발현 벡터 및 형질 전환 방법의 조합을 사용. 참고 : 여러 해 동안 인산 칼슘 침전 (19)가 좋은 형질 전환 수율로 사용되었다. 여기에는 리포 펙 타민 같은 상용 시약에 의해 최근 대체되었습니다, 형질은 제조업체의 지침에 따라 수행된다. </li></ol></li><li> 솔루션 <ol><li> 아래 설명 세 멸균 솔루션을 준비합니다. 여과 (0.22 μm의) 이러한 솔루션을 소독. <ol><li> 50 mM의 CL NH 4, 70 mM의 염화 콜린, 5 mM의 KCl을, 1 ㎜의 MgCl 2, 2 mM의 CaCl2를 5 밀리미터 GL 구성된 NH 4 + 로딩 용액을 준비 (PH 7.4)ucose 및 pH가 7.4에서 15 mM의 MOPS. </li><li> 120 mM의 염화 콜린 5 mM의 KCl을, 1 ㎜의 MgCl 2, 2 mM의 CaCl2를, 5 mM의 포도당하여 pH 7.0에서 15 mM의 HEPES 이루어지는 세정액 (PH 7.0)을 준비한다. </li><li> pH가 7.4에서 120 mM의 염화나트륨, 5 mM의 KCl을, 1 ㎜의 MgCl 2, 2 mM의 CaCl2를, 5 mM의 글루코오스, 15 mM의 HEPES 구성된 복구 솔루션 (PH 7.4)을 준비한다. </li></ol></li></ol></li><li> CO 2가 훼손 될 수 해당 버퍼링 될 것이다 5 %로서, - 선택을 시작하기 전에 ( &quot;무료&quot;인큐베이터 CO 2 라) 외부 탱크로부터 추가 CO 2, 37 ℃에서 사용될 수있다 세포 배양기를 얻기 산성화. 약 2 × 108 세포 (전형적으로 약 20 합류 100mm 플레이트)에 관심 업 NHE 발현 세포주를 증폭. </li><li> H는 절차를 죽이는 + : <ol><li> (3)에 로딩 용액에 1 시간 동안 관심 NHE 세포를 발현 세포를 부화CO 2 - 무료 인큐베이터에서 7 ° C. </li><li> 로딩 솔루션을 대기음 후 상기-세정액에 두 번 씻어 내야합니다. 산성화를 생성하는 가파른 NH 4 + 구배의 생성을 저해 할 잔여 세포 외 NH 4 (CL)을 제거하기 위해 효율적으로이 단계를 수행합니다. </li><li> 흡인 린스 매질을 제거하고 프리 CO 2 인큐베이터에서 37 ° C로 다시 복구 솔루션에서 한 시간 동안 세포를 배양한다. </li><li> 일반 배양 배지 (7.5 % FCS 전형적 DMEM)와 복구 매체를 장착하고 (5 % CO 2 및 95 %의 공기가 공급되는 습한 공기 조건에서 37 ° C)를 표준 배양 조건에서 세포를 성장한다. </li></ol></li><li> 안정적인 클론이 등장 할 때까지 일주일에 두 번 선택의이주기를 반복합니다. 참고 : 세포 배양 및 선택 조건에 관한 특별한주의하십시오. 작품의 달은 오 더 경향이 오염에 의해 파괴 될 수있다문화와 반복 세포 조작의 긴 기간 후 ccur. <ol><li> 여기서, 클론을 증폭하고 상기와 같은 개별적 2-3 절에서 설명한 이들의 특성, 또는 특성화 전에 세포 집단을 생성하기 위해 이들을 함께 풀로 여부를 선택한다. </li></ol></li><li> 카운터 선택 부모의 산에 민감한 표현형 (그림 1B)에 복귀 한 수 사람들을하여 산성화 방지 세포를 유지하기 위해 가끔 선택 (약 2 주에 1 회)를 적용합니다. </li></ol> 2. 세포 내 pH 측정 2.1) 형광의 pH 이미징 <ol><li> 490 nm에서 흥분 할 때의 pH 민감하고 제조 업체의 프로토콜 다음 445 nm의 isosbestic 점을, 소유 비율 계량 pH 민감성 형광 염료 BCECF / AM을 사용합니다. <ol><li> 또한, 제조 업체의 프로토콜 다음 다른 pH 민감성 프로브를 사용합니다. </li></ol></li><li> 영상 설정 콘을 사용하여고감도 비디오 카메라에 결합 도립 현미경 sisting. 450 nm의 여기에 적합한 석영 중립 밀도 필터와 결합 490 nm의 협 대역 간섭 필터 세트를 착용. <ol><li> 가능하면 비도 모두 λ1 및 / 또는 λ2를 들면, 어느 포화 또는 너무 낮게 설정된 기저 형광 값을 피하기 1에 가까워 지도록, λ1과 λ2 위해 설치 필적 형광 값 필터 및 조명 조건의 적절한 세트를 사용. 이 세포 내 pH가 변화하고 있지만 비율이 검출되지 수 있습니다으로 다음 중요한 유물을 얻을 수 있습니다. 참고 :이 시스템에 적절한 발광 파장 (BCECF 535 ㎚)에서 빠른 관류, 시간 경과에 두 개의 상기 파장에서 여기 및 인수를 사용하도록 설정해야합니다. 소프트웨어는 자동 데이터 수집 및 저장을 가능하게하여 시스템을 장비. </li></ol></li></ol> NHE 앞으로 활동 2.2) 측정 (압출 성형세포질에서 양성자) <ol><li> NH 4 + 로딩 용액에 1 시간 배양 세포 산성화 CO 2의 부재 (단계 1.4 참조). </li><li> 마지막 5 분 동안 용액에 BCECF-AM (5 μM 최종 농도)를 첨가하고 세포 외 프로브를 제거 NH 4 + 로딩 용액을 헹군다. </li><li> 현미경 세포를 마운트하고 안정적​​인 바탕을 기록하는 여러 이미지를 가져 가라. 세정액 (위 참조) 관류. 이 산성화에 대응 형광의 드롭을 초래한다. </li><li> pH가 안정화되면, 리 + / H +, 나트륨 + / H의 + 또는 K + / H +로 교환하여 pH 매개 회복율을 측정하기 위해 아래에 주어진 임의의 솔루션을 관류. 각 솔루션은 잠재적 인 커플 링 양이온 H + 교환을 테스트 할 포함되어 있습니다. 그 중 하나가 이동하는 경우, 이는 corresp 것이다 495 nm에서의 형광 증가를 초래한다번째 세포 내 pH를 높이려면 : pH가 7.4에서 120 mM의 LiCl을, 5 mM의 KCl을, 1 ㎜의 MgCl 2, 2 mM의 CaCl2를, 5 mM의 글루코오스, 15 mM의 HEPES pH가 7.4에서 120 mM의 염화나트륨, 5 mM의 KCl을, 1 ㎜의 MgCl 2, 2 mM의 CaCl2를, 5 mM의 글루코오스, 15 mM의 HEPES pH가 7.4에서 125 mM의 KCl을, 1 ㎜의 MgCl 2, 2 mM의 CaCl2를, 5 mM의 글루코오스, 15 mM의 HEPES </li></ol> NHE 역 활동의 2.3) 측정 참고 : 여기 원리는 횡단 이온 그라디언트를 반전하는 것입니다. <ol><li> 측정에 앞서, 관심있는 세포 내 양이온과로드 셀 (아래 참조). </li><li> BCECF / AM (단계 참조 2.2.2)와 5 분 동안 그들을 품어; 그들을 씻어 비디오 현미경을 탑재합니다. </li><li> 로딩 솔루션을 관류하고 안정적​​인 바탕을 기록하는 여러 이미지를 가져 가라. </li><li> 베이스 라인 안정화, 이미지 세포가 세포 외 산성 매체가 120m를 포함 관류하는 pH를 변화 후M의 염화 콜린, 5 mM의 KCl을, 1 ㎜의 MgCl 2, 2 mM의 CaCl2를, 5 mM의 포도당하여 pH 6.5에서 15 mM의 MES에. </li><li> LiCl을 로딩, pH를 7.4에서 120 mM의 LiCl을, 5 mM의 KCl을, 1 ㎜의 MgCl 2, 2 mM의 CaCl2를, 5 mM의 글루코오스, 15 mM의 HEPES 이루어지는 용액에서 2 시간 동안 세포를 배양한다. 원자 흡광 법에 의해 측정 된 세포 내 리튬은 약 60 mm의 값을 산출한다. </li><li> 나트륨 + 로딩, 1 밀리미터의 흡수를의 존재 하에서 pH가 7.4에서 120 mM의 염화나트륨, 5 mM의 KCl을, 1 ㎜의 MgCl 2, 2 mM의 CaCl2를, 5 mM의 글루코오스, 15 mM의 HEPES 이루어진 용액에 2 시간 동안 세포를 배양한다 나 / K ATPase의 차단합니다. 이러한 조건에서, 세포 내 나트륨 + 농도는 40 mM의 범위이다. 주 : 세포질 K + 농도가 140 mM이 범위이고 외향 K + - 지향 구배 달성하는 것이 쉽기 때문에 K + 로딩이 필요하지 않다. </li></ol> 2.4) 데이터 처리 및 교정: 주 :이 단계는 순방향 및 역방향 측정 모두에 적용된다. <ol><li> 각 실험의 끝에, 6.5와 7.4 사이의 pH 값으로 조정 된 140 mM의 KCl을 20 mM의 HEPES 및 5 μM의 nigericin의 용액으로 세포를 관류. </li><li> 텍스트 형식으로 아래의 이미지에서 형광 측정과 같은 데이터 (회색 수준의 강도 수준을 나타냄) 및 수출을 수집하고 같은 스프레드 시트 프로그램을 사용하여 아래에 설명 취급합니다. </li><li> 각각의 개별 셀, 또는 다음의 식을 이용하여 관심 영역에 대한 세포 내 pH 값을 계산한다 : pH가의 pKa + (로그 (R이-Rmin을) / (R 최대 -R가)) × F의 분 (λ2) / F 최대 (λ2) </li><li> F의 분 (λ2) / F 엄마 X (λ2) 실험에 걸쳐 450 nm의 형광의 감소의 결과로, 프로브 표백 또는 누설이있는 경우 비율을 사용합니다. 그러나 이것은 매우 드문 데에 사용 된 조건에서 관찰 없습니다cribed 실험. </li><li> 교정 데이터는 각각 pH 측정의 끝에 존재하는 바와 같이 계산 된 값에 대응하는 캘리브레이션에 사용되는 pH 값에서 다른지를 확인한다. 이 경우라면, 다음과 같은 절차를 사용하여 교정에 모두 실험적으로 결정된 pH 값 조정 : <ol><li> 다음 몫 (Q, 보정 값의 측정 값 / 차이의 차이)를 계산. 계산 된 값이 대응하는 캘리브레이션 값을 같게되도록 Q.함으​​로써 전체 데이터 세트가 부가 또는 감산함으로써 최종 조정을 곱한다. </li></ol></li></ol> 빠른 리 + 통풍 관에 의해 NHE7의 초기 요금 3. 측정 <ol><li> 멀티 웰 플레이트 상에 종자 세포 (6- 웰-24) 또는 20 이상에서 설명한 교대 nigericin / 소 혈청 알부민 (BSA) 산성화 바와 NH 4 + 로딩 기술을 사용하여이를 산성화. </li><l난&gt; 린스 플레이트 배 빠르게 상술 세정액을 이용하고, 원하는 양 (약간 km 값 이하) 1-10 mM의 리튬을 함유하는 흡수 용액의 세포와 양이온의 목적하는 농도 및 / 또는 관심의 억제제를 부화 시간. </li><li> 해당 전송 초기 속도 조건에서 작동하기 위해 짧고 일관된 흡수 기간 (일반적으로 1 분 이하)를 유지한다. 또한 흡수에 사용되는 모든 솔루션이 등장 있는지 확인하십시오. </li><li> 흡수 시간의 끝에서, 신중하게 흡수 매질을 제거하고 얼음 - 냉각 된 인산 완충 생리 식염수 (PBS)으로 세포를 네 번 세척 하였다. (그 중 네 적합 미만 10 초) 리튬 유출을 막기 위해 가능한 한 빨리 이러한 세척을 수행한다. </li><li> 를 Lyse 25 % 질산에 세포. 25 % 질산 웰 당 250 μL를 적용하고 그 후, 피펫 팁의 단부와 각 웰 스크랩 새로운 미시간 전체 웰 현탁액을 전송하고, 적어도 1 시간 방치crocentrifuge 튜브. </li><li> 세포 파편을 제거하기 위해 15,000 XG (실온)에서 5 분간 원심 분리하여이를 1.5 ml의 마이크로 원심 분리 튜브에 이동 분해물. </li><li> 원자 흡수 분광법 (21)에 의해 상층 액의 리튬 함량을 측정. 참고 : 다른 기업들이 리튬 중공 음극 램프를 장착 할 필요가 원자 흡수 분광기를 제공합니다. 이 기계는 매우 정밀한뿐만 아니라 매우 섬세으로 제조업체의 지침을 따르십시오. </li></ol>

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</ol>

The authors have nothing to disclose.

이 프로토콜은 부위 특이 적 변이에 의해 자신의 기본 순서를 변경하지 않고 세포막에서 세포 나 + / H + 교환기를 발현하는 세포를 선택하는 방법에 대해 설명합니다. 이러한 교환기 이제 특성화 될 수있다. 이 방법은 세포막에 소포 나 + / H + 교환기를 표현한다 세포주를 선택하는 양성자 세포의 세포 독성에 기초한다. 여기에는 리튬 +, K +, 또는 고사 +로 전송할 수 의심 될 수있는 다른 양이온을 사용하는 것이 원칙적으로 할 수 있습니다. 그러나,이 불확실성의 수준이 향상됩니다. 선택은 임의의 양성 클론을 산출하지 않는 경우, 그 후 테스트가 반송되지 양이온 교환기 또는 세포막에 있지 있는지 여부를 평가하기 어렵다. 이 외 SUBSTR 그대로 이러한 이유로, 선택은 결합 + 양이온으로서 나트륨을 사용하여 수행되어왔다생리적 조건에서 가장 풍부하게 발견 먹었다. 이 NHE7 (18)뿐만 아니라 NHE6 및 NHE9 등의 세포막 (시인 Counillon, 게시되지 않은 결과를) 표현 변종의 선택되었다. 이것은 세포막 발현 수송차 원경 만 세포막 수송차에 사용될 수 방법으로 기능 파라미터의 측정을 가능하게한다. 물론 막 환경에서 그러한 변화가 소포 NHEs의 기능적 특징에 영향을 미칠 수 있다는 것을 배제 할 수 없다. 그러나,이 전략은 적어도 세 가지 이유로 사용할 가치가있다 : (ⅰ) NHE6의 세포 내 발현, 7 및 9는 임의의 상세한 기능 측정을 방해한다, (ⅱ) 막 환경과 단백질 또는 지질 파트너는 주로 규제 미묘한 영향을 보여왔다 커플 링 양이온, 선택, 방향성, 산도의 다른 NHEs의 메커니즘과이 운송이 아닌 그들의 매우 기본적인 기능 (친화도armacological 기능). 그래서 사람들은 기공을 NHEs의 멤브레인 식으로 변경되지 않습니다 가능성이 매우 높다. (ⅲ) 작용 기전과 세포막 소포 발현기구의 약리학 적 프로파일을 알면, 그 포성 pH 측정은 세포막 소포 및 발현 가능한 이들 사이의 불일치를 해결할 수 있도록하는 것이 가능하다. 이 기술의 또 다른 잠재적 인 제한은 여기에 설명 된 전략은 다른 H 발현 + 형질 소포보다기구를 압출하는 셀을 선택하게 될 수도 있기 때문이다 나 같은 세포막 NHE, 또는 예를 들면 H + -ATP 아제 등 + / H + 기 ( ). 이 실험에서 관찰되지 않았지만, 실제로 관심 NHE는 실제로 세포막에서 발현되는 것을 확인하기 위해 침묵에 연결된 고전 세포 표면 표지를 사용하는 것이 중요하고 나트륨 + 또는 리튬 +을 매개 </s의존성 양성자 유출&gt;까지 (예를 Milosavljevic 등. 18 참조). 이러한 수송의 활성을 특성화, 두 프로토콜 각각 세포의 pH 변화 및 ​​이온 플럭스에 기초하여 설명한다. 첫 번째 방법은 pH 민감성 형광 프로브 및 적절한 형광 현미경 영상 시스템의 사용을 필요로한다. 필드에서 여러 그룹에 의해 사용되는이 방법은, 그 후에 24 videomicroscopy하는 형광 여기 및 획득을 연결함으로써 각각의 세포를 측정하기 위해 디지털 획득하여, 제 현탁액 (23)에 신호 형태 셀을 측정하는 fluorimeters를 사용하여, 1980 년대에 개발되었다. 후자의 기술은 지금 인해 카메라, 조명 및 컴퓨터 시스템의 높은 성능, 매우 빠르고 쉽게되어있다. 흥미롭게도, 기업은 보통 형광 프로브 매우 유익한 기술 시트를 함께 제공합니다. 이들의 pH 변화는 중요한 정보를 제공프로톤 유출 결합 외 양이온의 성질을 결정한다. 이러한 관점에서, 암모늄의 예비 배양 기간은주의 깊게 측정을 위해 사용되는 세포에 따라 조정되어야하는 것이 주목하는 것이 중요하다. CCL39 유래 섬유 아세포, 50 mM의 NH 4 CL과 아주 잘 한 시간 로딩을 지원합니다. 이 NHE 전체 활성화를 가능하게하고 측정 (VMAX 조건)에 대한 강한 신호를 생성하는 매우 강한 산성화를 초래한다. 그러나 심근 세포 또는 기본 신장 세포 등 다른 세포는 중요한 암모늄로드를 지원하지 않습니다. 이것은 다른 배양 시간 또는 NH 4 CL 농도 여러 예비 시험을 수행하는 가치가있다. NH 4 CL에 감도 등의 차이에 대한 이유는 명확하지 않다. 이들은 암모늄 운송 시스템 (25, 26)의 표현 가능한 관련 될 수있다. 마찬가지로 로딩 헹굼 용액에 사용되는 무 나트륨 용액을 해칠 수있다예를 들어 심근 세포 등의 세포에 의해. 초기 속도가 덜 정확하게 결정될 것이지만, 그것은 암모늄 로딩 후 복구 솔루션 직접 관류하는 것이 필요하다. 또한, 세포 내 pH 측정도 용이 pH 값 다음의 교정과 같이 표현 될 수있다 BCECF 형광 수준의 저하에 의해 검출 될 것이다 산성화를 만들어 반전 모드와 이들 기의 가역적 특성을 조사하기위한 간단한 방법을 제공한다 . 이러한 실험의 제한은 로그 스케일상에서 동작하고 세포 내 완충 능력에 의해 제한되는 실험 측정 산도의 변화, 운송 등의 활동에 대한 정확한 정량의 부족이다. 후자를 측정하여 pH 변화는 완충력 수율 이온 플럭스에 의해 곱해질 수있다. 그러나,이 프로세스는 pH 측정, 완충 능 측정 및 CALIBRA에 (몇몇 실험 에러를 결합한기) 및 따라서 높은 양적 없습니다. 따라서 트랜스 포터를 발현 세포막 효소 상수를 액세스하는 빠른 이온 플럭스 기술은 훨씬 더 간단하고 정확하다. 세포 내 내용이 세포질 나트륨 NHE-매개 변화를 감지 밀리몰 범위에 있기 때문에 할 수 없습니다. 금후, 년간 같은 흡수 기법 예컨대 나트륨 + 22 등의 방사성 동위 원소의 사용에 기초 하였다. 이 원고 (22) 나 +도 NHEs 의해 사용이 양이온, 세포 세포질 결석 및 원자 흡광 분석 (21)을 사용하여 좋은 정밀도로 측정 할 수 있다는 원리에 기초하여, 리튬에 의해 대체되는 비 방사성 방법을 설명한다. 다른 잠재적 결합 양이온에 대한 적절한 결정 조건 (시간, 리튬 농도) 선형 수착을 측정 (예., 초기 등급 조건 임), 친화 일단 및 / 또는도 3 및도 4에 도시 된 바와 같이 억제제는 정확하게 측정 될 수있다. 마지막 전위 제한 리튬 흡수 방법은 물론에만 관심이 크게 교환기 양이온을 수송하는 경우 기능을 할 수 있다는 것이다. 그 이외의 경우, 실험자는 전술 한 세포 내 pH 측정에 의존 하나를 가질 것이다 또는 방사성 나트륨 흡수를 사용해야한다. 실험의 이러한 세트가 주도 최근에 처음 믿었다 NHE7 세포 나 + / H + 교환기, 엔도 좀 산성화 메커니즘이 나트륨에 결합 된 소포를 alkalinize 것 H + / K + 수송 사실이었다 될 수있는 관찰을 주도 (18). 이것은 지금까지이 역할이 VH + -ATPase를에 전념 할 생각되었다 세포 내 구획에 대한 깊은 의미를 가지고있다. NHE 가족의 각 구성원은 매우 구체적인 운동 서명 O를 표시하기 위해 다음과 같이 나타납니다생리 학적 역할에 날개, 그것은 NHE6과 NHE9의 특성은 자신의 생리 기능을 강조합니다 소설과 예상치 못한 기능을 발표 할 예정이 문서에서 설명하는 방법을 사용하여 가설 유혹한다.

대부분의 세포 내 구획 성숙, 인신 매매, 단백질이나 호르몬과로드 신경 전달 물질의 재활용을위한 핵심 매개 변수입니다 산성 내강의 pH를 표시합니다. 그것은 세포질 포성 내용 사이의 pH 구배 소포 CLC 클로라이드 컨베이어 (2)에 결합 된 액포 H + -ATPase를 (1)에 의해 생성되는 것으로 밝혀졌다. 두 녹아웃 (KO) 마우스 및 인간 환자에서, 이들 컨베이어의 중요성 3-6 유전자 돌연변이로 인한 무거운 표현형에 의해 강조되었다. 나트륨 수소 교환기 SLC9A 가족의 구성원, 또한 나트륨 + / H + 교환기 NHEs 불리는 세포 내 pH 및 세포 볼륨 조절 키 이펙터에서뿐만 아니라 상피 걸쳐 산 - 염기 당량의 vectorial 수송 것으로 나타났다 . 세포막 NHEs 외에도 세 고도로 + / H + 기, NHE 6, 7은 Na 보존9는 트랜스 - 골지 네트워크에서 초기 엔도 좀 (7)로 표현된다. 유전자의 돌연변이는 엔젤 형 또는 크리스찬 증후군 8-9, 가족 기반의 자폐증 (10)와 주의력 결핍 과잉 행동 장애 11-12로 연결되어있다. 이 교환기는 또한 알츠하이머 병의 감수성 (13)과 X-링크 된 정신 지체 연속 유전자와 같은 신경 퇴행성 문제 (14) 증후군에 참여했습니다. 함께 찍은, 이러한 연구는 두뇌 발달 및 / 또는 기능에서 이러한 세포 내 NHEs의 중요성을 강조 표시합니다. 이러한 기의 세포 내 현지화 정확한 자신의 이온 선택성 측정, 전송 방향, 운동 매개 변수 및 규제를 방지 할 수 있습니다. 세포 내 구획에서 발현 모든 컨베이어의 경우와 같이, 자신의 생화학 활동을 평가하기 때문에 완전히 생리적 역할과 mechan을 이해하는 것은 매우 어렵다ISMS는 병적 인 의미를 기본. 높은 세포질 K + 농도에 따라, 가장 일반적으로 받아 들여지는 가설은 K + 결합 된 양성자 유출 컨베이어로 작업하는 것이 었습니다. 이 정상 상태 포성 산도를 유지하기 위해 V--ATPase를 펌핑하여 양성자를 상쇄 할 수있다 등의 양자 누출의 존재가 가정되었다. 이 시각 문서의 목적은 세포막에서 이러한 소포 ​​수송차를 표현하고, (ⅱ) 이러한 수송의 기능을 측정하는 두 개의 독립적 인 방법을 보여 세포주의 유전을 선택할 수 있도록하는 방법을 설명하기 (I)이다. 세 년 전, Pouysségur과 프란은 NHE 가족 (15)의 구성원의 분자 클로닝 및 특성을 활성화 유전 적 접근 방식을 개척했다. 이 스크리닝 방법으로 세포 독성 양성자에 기초 하였다. 첫 번째 단계는 결핍 세포주를 수득 하였다어떤 나 + / H +의 교환이 전달체 가역성을 이용 세포막에서 발현. 섬유 아세포 (CCL39 세포주) 또는 리튬 나트륨 + + 미리로드 한 후 2 시간 동안 세포 외 산성 매질 (PH 6.5)에 넣었다. 이것은 기능적 나 + / H + 교환을 발현하는 세포의 죽음과 antiporter 결핍 세포 (PS120 세포주) (16)의 선택되었다. 중탄산없는 배지에서 배양하면, 이들 세포는 급성 세포 내 산성화에 매우 민감하다. 이러한 세포는 세포 급성 acidifications에 제출하는 경우 결과적으로, 세포막에서 기능적 양성자 유출기구의 발현 양 (도 17 참조)를 선택한다. 이러한 기술은 산성화 세포막에서 WT 세포 NHEs의 강제 발현을 활성화 결함 트래 피킹 세포주를 분리 할 수​​있다. 진핵 세포 나 + / H로교환기 electroneutral 있습니다 +, 그들은 채널을 측정하기 위해 큰 성공과 함께 사용 된 전기 생리 학적 방법에 의해 측정 할 수 없습니다. 이 원고 따라서 세포 내 pH 측정과 리튬의 빠른 흡수 동력학하여 교환기의 활성을 측정하는 방법을 설명한다. 기본 개념은 동일한하는, 그 선택 부 위해 개발 된 많은 프로세스는 또한 작용 성 측정에 사용되는 직접 통지 흥미 롭다. 흥미롭게도,이 논문에 설명 된 접근법을 사용하여 선택된 세포주에 존재 매매 결함은 소낭 칼륨 채널 TWIK1 18과 같이 세포막에 다른 소포의 단백질보다 발현에 이르게 것을 관찰했다. 이것은 소포 막 관통 단백질 일반적인 고정 결함기구의 선택을 향해 지적한다. 그러므로 이러한 선택 절차 및 5 월의 생성 세포세포 내 구획의 막 단백질에 근무하는 과학적인 지역 사회를위한 유망한 도구를 구성한다. 뿐만 아니라 여기에 제시된 측정 기술은 다른 비 electrogenic 운송을 연구 적용 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Standard cell culture equipement</td><td></td><td></td><td>Used for H+ killing selection composed of many devices with different catalog numbers</td></tr><tr><td>Incubator with CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sanyo</td><td>MCO15A</td><td></td></tr><tr><td>Incubator without CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Heraeus instrument</td><td>BB6220</td><td></td></tr><tr><td>Laminar flow hood PSM1200NF</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>52010120</td><td></td></tr><tr><td>DMEM medium</td><td>sigma</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>FBS gold</td><td>GE Healthcare</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin/streptomycin</td><td>PAA</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 10x</td><td>PAA</td><td>L11-003</td><td></td></tr><tr><td>Atomic Absorption spectrometer with Zeeman furnace system</td><td>Thermo Scientific</td><td>ICE 3500 GFZ</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>sigma</td><td>L4408</td><td></td></tr><tr><td>Nitric Acid</td><td>sigma</td><td>438073</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence videomicroscopy set</td><td>Leica</td><td></td><td>Composed of many devices with different catalog numbers</td></tr><tr><td>Inverted automated microscope</td><td>Leica</td><td>DMI6000B</td><td></td></tr><tr><td>microscope stand</td><td>leica</td><td>11888906</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888911</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11505180</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888377</td><td></td></tr><tr><td>incident fluorescence</td><td>leica</td><td>11888901</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11504166</td><td></td></tr><tr><td>motor bracket</td><td>leica</td><td>11888379</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11505234</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521505</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11522106</td><td></td></tr><tr><td>LED transmission light&amp;nbsp;</td><td>leica</td><td>8097321</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>8102034</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521580</td><td></td></tr><tr><td>motorized plate</td><td>leica</td><td>11522068</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11531172</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521734</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521719</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888423</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888424</td><td></td></tr><tr><td>camera output</td><td>leica</td><td>11888373</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11507807</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888393</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888259</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888258</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11541510</td><td></td></tr><tr><td>images acquisition/analysis software</td><td>leica</td><td>11888375</td><td></td></tr><tr><td>optics</td><td>leica</td><td>11506507</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11506243</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11506203</td><td></td></tr><tr><td>fluorescence Xenon lamp</td><td>leica</td><td>DMI6000</td><td></td></tr><tr><td>camera</td><td>hamamatsu</td><td>8100601</td><td></td></tr><tr><td>metafluor/Mmfluor software</td><td></td><td>11640905</td><td></td></tr><tr><td>pH sensitive probe, BCECF-AM</td><td>life technologies</td><td>B1170</td><td></td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Sigma</td><td>N7143</td><td></td></tr></tbody></table>

functional characterization of na+/h+ exchangers of intracellular compartments using proton-killing selection to express them at the plasma membrane

엔도 솜 산성화는 시냅스 소포의 단백질 분해 및 재활용, 둔감 수용체 및 신경 전달 물질의 로딩 등의 처리, 다양한 중요하다. 이 산성화는 CLC 염화 컨베이어에 결합 된 양성자 -ATPase를,에 의해 매개되는 기술되어있다. electroneutral 양성자 수송을 고도로 보존, ​​나 + / H + 교환기 (NHE) 6, 7, 9는 이러한 구획에서 표현된다. 유전자의 돌연변이는 인간의인지 적, 신경 퇴행성 질환과 연결되어있다. 자신의 세포 내 현지화 상세한 기능 특성을 방지 것처럼 역설적으로 자신의 역할은 애매 남아있다. 이 논문은이 문제를 해결하는 방법을 나타내고있다. 이것은 세포막에서 세포를 유지하여 NHEs 급성 세포질 산성화 생존 가능한 돌연변이 세포주의 선택으로 구성. 그러므로 이온 선택성 및 활성을 측정하기 위해 두 개의 상보적인 프로토콜을 도시(ⅰ) 하나의 비디오 형광 현미경을 사용하여 세포 내 pH 측정에 기초하고, (ⅱ) 하나의 리튬의 빠른 흡수 동력학에 기초한 이러한 교환기. 이러한 프로토콜은 다른 비 electrogenic 수송차를 측정하도록 외삽 될 수있다. 또한, 여기에 제시된 선택 절차는 세포 표현형으로 고정 불량 셀을 생성한다. 따라서, 이러한 세포는 세포막에서 다른 소포 막 단백질을 발현한다. 여기에 묘사 된 실험 전략은 따라서 다음 소낭 + / H + 선택에 사용 교환기 나트륨과 함께 ​​세포막에서 발현된다 다른 세포 내 단백질을 연구하기 위해 잠재적으로 강력한 도구를 구성 할 수있다.

선택 : 도 1a에 도시 된 바와 같이 H + 죽이는 선택은, 암모늄 약 염기의 확산에 기초한다. 약염기의 pH 및 세포 내에서 산의 확산 효과는 월터 붕소 및 공동 (22)에 의해 개척되었다. 우아한 아이디어는 긍정적 인 유전자 선택을위한 치명적인 산성화가 다음 자크 Pouysségur (17)에 의해 개발 된 생산하는이 현상을 사용할 수 있습니다. 이러한 프로토콜에서 세포 내 pH는 약 5.5 헹굼 단계 이후로 떨어진다. 세포막에서 기능적 NHE를 발현하지 않는 세포는 중성 pH 값을 복구하고 편평한 형상 및 세포질 과립 (도 1B)으로 산성화 전형적인 양태를 표시 할 수 없습니다. 선택을 반복주기는 약 10-7의 주파수에서 충분히 안정적이 산성화 (도 1C)을 등장 생존 세포 (약 2의 H +는 절차 / 주 사망).이것은 개별적 특징 혹은 원한다면 세포 집단을 얻을 수 풀링 개별 세포 클론의 형성을 초래할 것이다. 이러한 세포 표면 바이오 틸 또는 RNA 사일런 같은 표준 실험은 세포막에서 발현 된 단백질이 실제로 NHE7 같은 세포 NHE 같은 것을 제어 (예컨대 Milosavljevic 등. 18 참조) 수행 할 수있다. 뿐만 아니라, RT-PCR 및 후속 시퀀싱 선택된 세포주에서 발현 세포 NHEs의 시퀀스에서 최종 돌연변이를 확인하기 위해 수행되어야한다. 기능 특성 : 형광 Videomicroscopy : 세포막에서 발현 세포 NHEs의 활성 및 선택성 이온은 다양한 조건에 의해 유도 NHEs 이들 세포의 pH 변화를 측정함으로써 특성화 될 수있다. 이를 위해 videomicroscopy 세트는 조명 장착이미지 D 취득 설정은 BCECF / AM 등 비율 적 프로브를도 2a에 도식화한다.도 2B 및 2C는 NH 4 + 산성화 로딩.도 2D 다음 직접 490 및 450 nm에서의 여기 (excitation)에 대해 얻어진 형광 값의 전형적인 변화를 보여 2.4에 기재된 데이터 처리) 다음 이들 형광 값에 의한 산도 곡선을 나타낸다. 리튬 통풍 : 함께 수소 나트륨과 리튬은 주기율표 제 칼럼의 일부를 포함하고 나 + / H + 교환기 효율적인 결합 양이온 것으로 밝혀졌다. 또한 상세 사항 NA + / H + 교환기 기능 파라미터를 측정하기 위해, 리튬 흡수 설치 빠른 동역학이 정보를 활용하는 것이 가능하다. 이 양이온으로 CYT에 따라 자사의 축적 세포의 세포질에서 결석osolic 산성화 정량적 세포막 NHE의 동작을 반영한다. 또한, 리튬의 피코 몰 나노 몰 농도는 원자 흡수 분광법을 사용하여 좋은 정밀도로 측정 할 수있다. 세포막 발현 소포 교환기의 선택과 결합 될 때 따라서,이 방법은 매우 강력하다. 3 프로토콜의 섹션 3에 기재된 측정 Protocol)를 도시한다. 전술 한 바와 같이 바람직하게는 다중 웰 플레이트 (6 ~ 24)에 시드 균체 산성화된다. 운동은 리튬 함유 배지에서 세포 배양으로 시작하고, 관심있는 다른 양이온 또는 (도 3a)의 억제제. 흡수를 중지하려면 세포는 얼음처럼 차가운 PBS에서 네 빠른 헹굼에 제출됩니다. 유의 리튬 유출 (그림 3B)를 발생하지 않도록 보장하면서 빠르게 작동하면 어떤 세포 외 리튬을 제거합니다. 각 웰에서의 리튬 농도는 인리튬 축적 시간 코스 (도 3d)의 경사 측정으로 얻어지는 직접 정상 상태에서의 기의 활성을 수득하는, 원자 흡수 분광법 (도 3c), 리튬을 흡수의 초기 속도를 사용하여 측정. 효소 반응 속도에 관해서는, 초기 비율의 투여 량 - 반응 억제에 대한 Ki 값의 기판 (도 4A) 미국 km 값들을 유도하는데 이용 될 수있다. 트랜스 포터의 흥미로운 기능은 다른 커플 링 양이온 수송을 위해 경쟁하는 것입니다. 이것은 리튬 흡수 (도 4B)과의 경쟁에 의해 나트륨 위해 km의 측정 가능성을 산출한다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52453/52453fig1.jpg" /> 그림 1 : 세포의 선택은 + / H + &lt;나 세포 내 발현/ 그들의 세포막에서 강한&gt; 교환기. (A) 전략은 세 단계에 대해 H는 세포막에서 돌연변이 비 작용 성 및 비 태그 NHE 세포를 발현하는 세포의 선택을 죽이는 +. 산 부하에 제출 PS120 부모의 세포 (B) 위상차 현미경 이미지. 스케일 바 : 하중 산 다음 세포막 소포 교환기에서의 발현을 위해 선택된 세포 PS120, 25 ㎛의 (C) 위상차 현미경 이미지. 스케일 바 : 25 μm의 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52453/52453fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52453/52453fig2.jpg" /> 그림 2 : 세포 내 pH 측정 pH를 videomicroscopy 측정 (A) 원리.. (B) E490 nm에서 여기 다음 BCECF 산도 프로브의 방출 형광 (595 나노 미터)의 소용돌이. L : 산로드, 리; 복구, Cal6.5 :, 다시 씻어 교정을 6.5의 세포 내 pH에서, Cal7.0는 : BCECF 산도 프로브의 방출 형광 (595 나노 미터)의 7.0 (C) 진화의 세포 내 pH에서 교정은 여기를 다음 450 nm의. L : 산로드, 리; 복구, Cal6.5 :, 다시 씻어 교정을 6.5의 세포 내 pH에서, Cal7.0 : BCECF 산도의 450분의 490 nm의 형광 비율에서 계산 된 세포 내 pH가 7.0 (D)의 세포 내 pH에서 교정 진화 프로브와 교정 점에서. L : 산로드, 리; 복구, Cal6.5 :, 다시 씻어 교정을 6.5의 세포 내 pH에서, Cal7.0은 : 7.0의 세포 내 pH에서 교정 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52453/52453fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 도 3 :. NHE 활동 리 + 흡수의 초기 속도 측정 (A - C) 소포 NHE7 교환기 리튬 흡수의 측정 된 시간 코스의 측정 기술 (D) 실시 예들의 다른 중요한 단계를 묘사 한 방식은 플라즈마 발현 막. 초기 속도 측정을 보장 실험 조건 내에서 운동의 선형성을합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52453/52453fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52453/52453fig4.jpg" /> 그림 4 : NHE7의 일반적인 용량 - 반응 곡선 (18 원래의 데이터).리튬 흡수의 초기 속도는 1 분 동력학을 측정 하였다. (A), 리튬 세포 용량 - 반응 곡선. 1mM의 세포 외 리튬 흡수에 세포 외 나트륨의 서로 다른 농도의 (B) 경쟁. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52453/52453fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers.

나의 기능적 특성<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; 선택을 양자가 살해 사용하여 세포 내 구획의 교환기는 플라즈마 막에서 그들을 표현하는

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and ...

functional-characterization-na-h-exchangers-intracellular

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

9.2K 조회수.  Université Nice-Sophia Antipolis, Laboratoire de Physiomédecine Moléculaire, CNRS UMR7370, and Laboratories of Excellence Ion Channel Science and Therapeutics. The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers. 

비디오: Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also known as Band 3), the most abundant membrane protein in the red blood cells. The SLC4 family is homologous with borate transporters, which have been characterized in plants and fungi. It remains a significant technical challenge to express and purify membrane transport proteins to homogeneity in quantities suitable for&#160;structural or functional studies. Here we describe detailed procedures for the overexpression of borate transporters in Saccharomyces cerevisiae, isolation of yeast membranes, solubilization of protein by detergent, and purification of borate transporter homologs from S. cerevisiae, Arabidopsis thaliana, and Oryza sativa. We also detail a glutaraldehyde cross-linking experiment to assay multimerization of homomeric transporters. Our generalized procedures can be applied to all three proteins and have been optimized for efficacy. Many of the strategies developed here can be utilized for the study of other challenging membrane proteins.

Here we present a protocol to express, solubilize, and purify several eukaryotic borate transporters with homology to the SLC4 transporter family using yeast. We also describe a chemical cross-linking assay to assess the purified homomeric proteins for multimeric assembly. These protocols can be adapted for other challenging membrane proteins.

표현, 가용 화, 그리고 진 핵 Borate 전송기의 정화

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

연구

생화학

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine exchangers in plants have not been identified. Here, we outline a method to characterize polyamine antiporters using membrane vesicles generated from the lysis of Escherichia coli cells heterologously expressing a plant antiporter. First, we heterologously expressed AtBAT1 in an E. coli strain deficient in polyamine and arginine exchange transporters. Vesicles were produced using a French press, purified by ultracentrifugation and utilized in a membrane filtration assay of labeled substrates to demonstrate the substrate specificity of the transporter. These assays demonstrated that AtBAT1 is a proton-mediated transporter of arginine, &#947;-aminobutyric acid (GABA), putrescine and spermidine. The mutant strain that was developed for the assay of AtBAT1 may be useful for the functional analysis of other families of plant and animal polyamine exchangers. We also hypothesize that this approach can be used to characterize many other types of antiporters, as long as these proteins can be expressed in the bacterial cell membrane. E. coli is a good system for the characterization of novel transporters, since there are multiple methods that can be employed to mutagenize native transporters.

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

We describe a method for the characterization of proton-driven membrane transporters in membrane vesicle preparations produced by heterologous expression in E. coli and lysis of cells using a French press.

대장균의 이종 식에 의한 멤브레인 수송기의 특성화 및 멤브레인 소포 생산

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. This method combines expression of proteins tagged with the fluorescent non-canonical amino acid ANAP, and FRET between ANAP and fluorescent (trinitrophenyl) nucleotide derivatives. We present examples of nucleotide binding to ANAP-tagged KATP ion channels measured in unroofed plasma membranes and excised, inside-out membrane patches under voltage clamp. The latter allows for simultaneous measurements of ligand binding and channel current, a direct readout of protein function. Data treatment and analysis are discussed extensively, along with potential pitfalls and artefacts. This method provides rich mechanistic insights into the ligand-dependent gating of KATP channels and can readily be adapted to the study of other nucleotide-regulated proteins or any receptor for which a suitable fluorescent ligand can be identified.

This protocol presents a method for measuring adenine nucleotide binding to receptors in real time in a cellular environment. Binding is measured as F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) between trinitrophenyl nucleotide derivatives and protein labeled with a non-canonical, fluorescent amino acid.

온전한 기능성 막 단백질에 대한 뉴클레오티드 결합을 실시간으로 측정

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane (SSM)-Based Electrophysiology

Single domain antibodies (nanobodies) have been extensively used in mechanistic and structural studies of proteins and they pose an enormous potential as tools for developing clinical therapies, many of which depend on the inhibition of membrane proteins such as transporters. However, most of the methods used to determine the inhibition of transport activity are difficult to perform in high-throughput routines and depend on labeled substrates availability thereby complicating the screening of large nanobody libraries. Solid-supported membrane (SSM) electrophysiology is a high-throughput method, used for characterizing electrogenic transporters and measuring their transport kinetics and inhibition. Here we show the implementation of SSM-based electrophysiology to select inhibitory and non-inhibitory nanobodies targeting an electrogenic secondary transporter and to calculate nanobodies inhibitory constants. This technique may be especially useful for selecting inhibitory nanobodies targeting transporters for which labeled substrates are not available.

Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane SSM-Based Electrophysiology

Nanobodies are important tools in structural biology and pose a great potential for the development of therapies. However, the selection of nanobodies with inhibitory properties can be challenging. Here we demonstrate the use of solid-supported-membrane (SSM)-based electrophysiology for the classification of inhibitory and non-inhibitory nanobodies targeting electrogenic membrane transporters.

고체 지원 멤브레인(SSM) 기반 전기생리학에 의한 수송기 표적 억제 나노체 선택

Single domain antibodies (nanobodies) have been extensively used in mechanistic and structural studies of proteins and they pose an enormous potential as ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

이온 채널의 돌연변이 유발과 기능 분석 Heterologously 포유 동물 세포에 표현

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

생물학

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase is more difficult to investigate. Many transport assays utilize radioisotopes to achieve a sufficient signal-to-noise ratio, however, the necessary security measures impose severe restrictions regarding human exposure or assay design. Furthermore, ion transport across cell membranes is critically influenced by the membrane potential, which is not straightforwardly controlled in cell culture or in proteoliposome preparations. Here, we make use of the outstanding sensitivity of atomic absorption spectrophotometry (AAS) towards trace amounts of chemical elements to measure Rb+ or Li+ transport by Na+,K+- or gastric H+,K+-ATPase in single cells. Using Xenopus oocytes as expression system, we determine the amount of Rb+ (Li+) transported into the cells by measuring samples of single-oocyte homogenates in an AAS device equipped with a transversely heated graphite atomizer (THGA) furnace, which is loaded from an autosampler. Since the background of unspecific Rb+ uptake into control oocytes or during application of ATPase-specific inhibitors is very small, it is possible to implement complex kinetic assay schemes involving a large number of experimental conditions simultaneously, or to compare the transport capacity and kinetics of site-specifically mutated transporters with high precision. Furthermore, since cation uptake is determined on single cells, the flux experiments can be carried out in combination with two-electrode voltage-clamping (TEVC) to achieve accurate control of the membrane potential and current. This allowed e.g. to quantitatively determine the 3Na+/2K+ transport stoichiometry of the Na+,K+-ATPase and enabled for the first time to investigate the voltage dependence of cation transport by the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase. In principle, the assay is not limited to K+-transporting membrane proteins, but it may work equally well to address the activity of heavy or transition metal transporters, or uptake of chemical elements by endocytotic processes.

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

We describe a method to quantify the activity of K+-countertransporting P-type ATPases by heterologous expression of the enzymes in Xenopus oocytes and measuring Rb+ or Li+ uptake into individual cells by atomic absorption spectrophotometry. The method is a sensitive and safe alternative to radioisotope flux experiments facilitating complex kinetic studies.

오세영, K와 H, K-ATPase에 의해 양이온 교통 측정<em&gt; Xenopus</em원자 흡수 분광 광도법에 의한&gt; Oocytes : 방사성 동위 원소의 Assays에 대한 대안

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating ...

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined lipid composition. We are studying the lipid-dependent gating effects in a prototype voltage-gated potassium (Kv) channel, and have worked out detailed procedures to reconstitute the channels into different membrane systems. Our reconstitution procedures take consideration of both detergent-induced fusion of vesicles and the fusion of protein/detergent micelles with the lipid/detergent mixed micelles as well as the importance of reaching an equilibrium distribution of lipids among the protein/detergent/lipid and the detergent/lipid mixed micelles. Our data suggested that the insertion of the channels in the lipid vesicles is relatively random in orientations, and the reconstitution efficiency is so high that no detectable protein aggregates were seen in fractionation experiments. We have utilized the reconstituted channels to determine the conformational states of the channels in different lipids, record electrical activities of a small number of channels incorporated in planar lipid bilayers, screen for conformation-specific ligands from a phage-displayed peptide library, and support the growth of 2D crystals of the channels in membranes. The reconstitution procedures described here may be adapted for studying other membrane proteins in lipid bilayers, especially for the investigation of the lipid effects on the eukaryotic voltage-gated ion channels.

Procedures for complete reconstitution of a prototype voltage-gated potassium channel into lipid membranes are described. The reconstituted channels are suitable for biochemical assays, electrical recordings, ligand screening and electron crystallographic studies. These methods may have general applications to the structural and functional studies of other membrane proteins.

구조 및 기능 연구를위한 지질 막에 Kv 값 채널의 재구성

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as from eukaryotes. This increase has been largely driven by the successful push to obtain structural information on membrane proteins. However, the ability to functionally interrogate these proteins has not advanced at the same rate and is often limited to qualitative assays of limited quantitative value, thereby limiting the mechanistic insights that they can provide. An assay to quantitatively investigate the transport activity of reconstituted Cl- channels or transporters is described. The assay is based on the measure of the efflux rate of Cl- from proteoliposomes following the addition of the K+ ionophore valinomycin to shunt the membrane potential. An ion sensitive electrode is used to follow the time-course of ion efflux from proteoliposomes reconstituted with the desired protein. The method is highly suited for mechanistic studies, as it allows for the quantitative determination of key properties of the reconstituted protein, such as its unitary transport rate, the fraction of active protein and the molecular mass of the functional unit. The assay can also be utilized to determine the effect of small molecule compounds that directly inhibit/activate the reconstituted protein, as well as to test the modulatory effects of the membrane composition or lipid-modifying reagents. Where possible, direct comparison between results obtained using this method were found to be in good agreement with those obtained using electrophysiological approaches. The technique is illustrated using CLC-ec1, a CLC-type H+/Cl- exchanger, as a model system. The efflux assay can be utilized to study any Cl- conducting channel/transporter and, with minimal changes, can be adapted to study any ion-transporting protein.

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

Proteoliposomes are used to study purified channels and transporters reconstituted in a well-defined biochemical environment. An experimental procedure to measure efflux mediated by these proteins is illustrated. The steps to prepare proteoliposomes, perform the recordings, and analyze data to quantitatively determine the functional properties of the reconstituted protein are described.

Proteoliposome 기반 유출 분석은 CL의 단일 분자의 속성을 확인하는<sup&gt; -</sup&gt; 채널 및 전송기

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as ...

Membrane Transport Processes Analyzed by a Highly Parallel Nanopore Chip System at Single Protein Resolution

Membrane protein transport on the single protein level still evades detailed analysis, if the substrate translocated is non-electrogenic. Considerable efforts have been made in this field, but techniques enabling automated high-throughput transport analysis in combination with solvent-free lipid bilayer techniques required for the analysis of membrane transporters are rare. This class of transporters however is crucial in cell homeostasis and therefore a key target in drug development and methodologies to gain new insights desperately needed.
The here presented manuscript describes the establishment and handling of a novel biochip for the analysis of membrane protein mediated transport processes at single transporter resolution. The biochip is composed of microcavities enclosed by nanopores that is highly parallel in its design and can be produced in industrial grade and quantity. Protein-harboring liposomes can directly be applied to the chip surface forming self-assembled pore-spanning lipid bilayers using SSM-techniques (solid supported lipid membranes). Pore-spanning parts of the membrane are freestanding, providing the interface for substrate translocation into or out of the cavity space, which can be followed by multi-spectral fluorescent readout in real-time. The establishment of standard operating procedures (SOPs) allows the straightforward establishment of protein-harboring lipid bilayers on the chip surface of virtually every membrane protein that can be reconstituted functionally. The sole prerequisite is the establishment of a fluorescent read-out system for non-electrogenic transport substrates.
High-content screening applications are accomplishable by the use of automated inverted fluorescent microscopes recording multiple chips in parallel. Large data sets can be analyzed using the freely available custom-designed analysis software. Three-color multi spectral fluorescent read-out furthermore allows for unbiased data discrimination into different event classes, eliminating false positive results.
The chip technology is currently based on SiO2 surfaces, but further functionalization using gold-coated chip surfaces is also possible.

The presented protocol describes the analysis of membrane protein mediated transport on the single transporter level using pore-spanning solvent-free lipid bilayers. This is achieved by the creation of bulk produced nanopore array chips, combined with highly parallel data acquisition and analysis, enabling the future establishment of membrane protein effector screenings.

멤브레인 운송은 단일 단백질 해상도에서 고도의 병렬 나노 기공 칩 시스템에 의해 분석 처리합니다

Membrane protein transport on the single protein level still evades detailed analysis, if the substrate translocated is non-electrogenic. Considerable ...

Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. These transport mechanisms are mediated by the activities of specialized transporter proteins. Specifically,pH dynamics are finely controlled by plasma membrane proton (H+) extrusion systems, such as the Na+/H+ exchanger (NHE) protein family. Despite extensive efforts to study the mechanisms underlying NHE regulation, our current understanding of the biophysical and molecular properties of the NHE family is inadequate because of the limited availability of methods to effectively measure NHE activity. In this manuscript, we used H+-selective electrodes during whole-cell patch clamping recording to measure NHE-induced H+ flux. We proposed this approach to overcome some limitations of typically used methods to measure NHE activity, such as radioactive uptake and fluorescent membrane permeants. Measurement of NHE activity using the described method enables high sensitivity and time resolution and more efficient control of intracellular H+ concentrations. H+-selective electrodes are based on the fact that transporter activity creates an ion gradient in close proximity to the cell membrane. An H+-selective electrode moving up to and away from the cell membrane in a repetitive, oscillatory fashion records a voltage difference that is dependent on H+ flux. While H+-selective electrodes are used to detect H+ flux moving out of the cell, the patch clamp method in the whole-cell configuration is used to control the intracellular ion composition. Moreover, application of the giant patch clamp technique allows modification of the intracellular composition of not only ions but also lipids. The transporter activity of NHE isoform 3 (NHE3) was measured using this technical approach to study the molecular basis of NHE3 regulation by phosphoinositides.

This manuscript describes the applications of proton-selective electrodes and patch clamping methods to measure the activity of proton transport systems. These methods overcome some limitations of techniques commonly used to study proton transport activity, such as moderate sensitivity, time resolution and insufficient intracellular milieu control.

전기 중립 전송기의 활동을 연구 전기 생리학 측정의 응용

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. ...

나의 기능적 특성

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