The authors are deeply indebted to all the members of the scientific community working on pH and ion transport, who have originated and improved the measurements described here. They particularly thank Dr. Jacques Pouyss&#233;gur who originated the H+-killing selection technique used here. They acknowledge the University of Nice-Sophia Antipolis, the CNRS, the ANR (JCJC SVSE1 NHEint) and the ICST Labex for support.

1. H + Töten Auswahl <ol><li> Zelllinien <ol><li> Stabil zu transfizieren NHE-defiziente Zellen (zB die CCL39-abgeleitete PS120 Zellinie 16) mit einer beliebigen Kombination von Säugetier-Expressionsvektor und Transfektion Verfahren, die eine effiziente Transfektion Ausbeuten und Selektion in einer Fibroblastenzelllinie zu produzieren. HINWEIS: Viele Jahre wurde Calciumphosphatpräzipitation 19 mit guten Ausbeuten Transfektion verwendet. Dies wurde in jüngerer Zeit durch kommerzielle Reagenzien wie Lipofectamine2000 ersetzt, wobei die Transfektionen nach Herstellerangaben durchgeführt. </li></ol></li><li> Lösungen <ol><li> Bereiten drei nachstehend beschriebenen sterilen Lösungen. Sterilisieren Sie diese Lösungen durch Filtration (0,22 um). <ol><li> Vorbereiten einer NH 4 + Loading-Lösung (pH 7,4) von 50 mM NH 4 Cl, 70 mM Cholinchlorid, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 5 mM gl umfasstucose und 15 mM MOPS pH 7,4. </li><li> Bereiten einer Spüllösung (pH 7,0), der 120 mM Cholinchlorid, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 5 mM Glucose und 15 mM HEPES bei pH 7,0 enthielt. </li><li> Vorbereiten einer Gewinnungslösung (pH 7,4), der 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 5 mM Glucose und 15 mM HEPES bei pH 7,4 enthielt. </li></ol></li></ol></li><li> Vor Beginn der Auswahl, erhalten eine Zellkulturbrutschrank, die bei 37 ° C ohne zusätzliche CO 2 aus externem Behälter (genannt CO 2 - &quot;frei&quot; Inkubator) verwendet werden kann, wie 5% CO 2 wird in Puffer Ergebnis, dass die beeinträchtigen können Versauerung. Erhöhen der Zelllinie, die NHE von Interesse bis zu etwa 2 x 10 8 Zellen (in der Regel etwa 20 konfluenten 100 mm-Platten). </li><li> H + Töten Verfahren: <ol><li> Die Zellen, die den intrazellulären NHE interessiere Inkubation für 1 Stunde in der Auftragslösung bei 37 ° C im CO 2 -freie Inkubator. </li><li> Saugen Sie das Lade Lösung und dann zweimal spülen Sie sie in der oben beschriebenen-Spüllösung. Führen Sie diesen Schritt effizient, um die restliche extrazellulären NH 4 Cl, die die Schaffung eines steilen NH 4 + Gradienten, die die Versauerung generieren beeinträchtigen beseitigen. </li><li> Beseitigen Sie die Spülmedium durch Aspiration und inkubieren Sie die Zellen für eine Stunde im Recovery-Lösung wieder auf 37 ° C im CO 2 Inkubator frei. </li><li> Ersetzen des Wiederherstellungsmedium mit regelmäßigen Kulturmedium (typischerweise DMEM mit 7,5% FCS) und wachsen die Zellen in Standardkulturbedingungen (37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2 und 95% Luft). </li></ol></li><li> Wiederholen Sie diesen Zyklus der Auswahl zweimal in der Woche, bis stabile Klone entstehen. HINWEIS: Seien Sie besonders vorsichtig über die Zellkultur und Selektionsbedingungen. Monate Arbeit kann von jedem Kontamination, die anfälliger für o ist ruiniertCCur nach einer langen Periode der Kultur und wiederholte Zellmanipulationen. <ol><li> Hier auswählen, ob die Klone zu verstärken und zu charakterisieren, sie individuell, wie weiter in Abschnitte 2-3 beschrieben, oder sie gemeinsam zusammen, um eine Zellpopulation vor der Charakterisierung zu erzeugen. </li></ol></li><li> Anwenden gelegentlichen Auswahl (etwa einmal alle zwei Wochen), um die Ansäuerung-resistenten Zellen durch Gegen diejenigen ausgewählt werden, die dem Elternsäureempfindlichen Phänotyp (1B) umgeschaltet haben kann beibehalten. </li></ol> 2. Intrazelluläre pH-Messungen 2.1) Fluoreszenz pH Imaging <ol><li> Verwenden Sie die ratiometrische pH-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff BCECF / AM, der pH-empfindlich ist, wenn bei 490 nm angeregt und besitzt eine 445 nm isosbestischen Punkt nach Herstellerprotokolle. <ol><li> Alternativ können Sie auch andere pH-empfindliche Sonden, nach Herstellerprotokolle. </li></ol></li><li> Verwenden Sie eine Bild gesetzt conbestehend aus einem umgekehrten Mikroskop auf eine hohe Empfindlichkeit Videokamera gekoppelt ist. Rüsten Sie dieses Set mit 450 nm und 490 nm Schmalband-Interferenzfilter, gepaart mit entsprechenden Quarz-Neutraldichtefilter zur Anregung. <ol><li> Wenn möglich, verwenden Sie die entsprechende Reihe von Filtern und Beleuchtungsbedingungen die Einrichtung vergleichbarer Fluoreszenzwerte für λ1 und λ2, dass das Verhältnis nähert 1. Vermeiden Sie auch basale Fluoreszenzwerte, die gesetzt werden, entweder gesättigt oder zu niedrig ist, sowohl für λ1 und / oder λ2. Dies kann wichtige Artefakte ergeben, wie dann kann das Verhältnis nicht nachweisbar, obwohl intrazellulären pH-Wert verändert sich. HINWEIS: Das System muss schnell Perfusion, Zeitraffer-Anregung bei den beiden oben genannten Wellenlängen und Übernahmen in der richtigen Emissionswellenlänge (535 nm für BCECF) zu ermöglichen. Rüsten Sie das System mit Software, die automatische Datenerfassung und -speicherung. </li></ol></li></ol> 2.2) Messung der NHE Zukunfts Aktivität (Extrusion vonProtonen aus dem Cytosol) <ol><li> Anzusäuern Zellen durch einen 1-stündigen Inkubation in der NH 4 + Loading-Lösung (siehe Schritt 1.4) in Abwesenheit von CO 2. </li><li> Fügen BCECF-AM (5 uM Endkonzentration) zu der Lösung in den letzten fünf Minuten und dann spülen Sie ihn mit NH 4 + Beladungslösung, die extrazelluläre Sonde zu entfernen. </li><li> Montieren Sie die Zellen unter dem Mikroskop an, um mehrere Bilder auf eine stabile Basislinie aufzuzeichnen. Versorgen die Spüllösung (siehe oben). Dies führt zu einem Abfall der Fluoreszenz, die der Ansäuerung. </li><li> Nach pH-Stabilisierung, durchströmen eine der unten angegebenen Lösungen für pH Rückgewinnungsraten von Li + / H +, Na + / H + oder K + / H + Austausch vermittelte messen. Jede Lösung enthält eine potentielle Kopplung Kation für H + Austausch getestet werden. Wenn eine dieser transportiert wird, wird dies in einer Zunahme der Fluoreszenz bei 495 nm, die entspr resultierenond zu einer Erhöhung des intrazellulären pH-Wert: 120 mM LiCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 5 mM Glucose und 15 mM HEPES bei pH 7,4, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 5 mM Glucose und 15 mM HEPES bei pH 7,4, 125 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 5 mM Glucose und 15 mM HEPES bei pH 7,4, </li></ol> 2.3) Messung der NHE Rückwärtsaktivitäts ANMERKUNG: Das Prinzip dabei ist, die Transmembran-Ionengradienten invertieren. <ol><li> Vor der Messung laden die Zellen mit der intrazelluläre Kation von Interesse (siehe unten). </li><li> Inkubieren Sie sie für 5 min mit BCECF / AM (siehe Schritt 2.2.2); spülen Sie sie, hängen Sie sie auf dem Videomikroskop. </li><li> Versorgen die Beladungslösung an, um mehrere Bilder auf eine stabile Basislinie aufzuzeichnen. </li><li> Nach der Grundlinienstabilisierung Bild die pH-Schwankungen, wenn die Zellen mit einer extrazellulären sauren Medium, das 120 m perfundiertM Cholinchlorid, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 5 mM Glucose und 15 mM MES bei pH 6,5. </li><li> Für LiCl Lade inkubieren Zellen für 2 h in einer Lösung von 120 mM LiCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 5 mM Glucose und 15 mM HEPES bei pH 7,4 zusammengesetzt. Intrazellulärem Lithium durch Atomabsorptionsspektroskopie gemessen ergibt einen Wert von etwa 60 mM. </li><li> Für Na + Lade inkubieren Zellen für zwei Stunden in einer Lösung aus 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 5 mM Glucose und 15 mM HEPES bei pH 7,4 zusammengesetzt ist, in Gegenwart von 1 mM Ouabain die Na / K-ATPase zu blockieren. Unter diesen Bedingungen ist die intrazelluläre Na + Konzentration im Bereich von 40 mM. HINWEIS: K + Belasten nicht notwendig cytosolischen K + -Konzentration in einem Bereich von 140 mm und einen nach außen gerichteten K + -Gradienten ist daher leicht zu erreichen. </li></ol> 2.4) Datenreinigung und Kalibrierung: HINWEIS: Dieser Schritt gilt sowohl für die Vorwärts- und Rückwärtsmessung. <ol><li> Am Ende jedes Experiments perfundieren Zellen mit einer Lösung von 140 mM KCl, 20 mM HEPES und 5 &amp; mgr; M Nigericin auf pH-Werte zwischen 6,5 und 7,4 eingestellt. </li><li> Sammeln Sie Daten, wie Fluoreszenzmessungen aus den Bildern (Graustufen, die Intensitätsstufen) und Export unter Text-Format und zu behandeln, wie unten mit einem Tabellenkalkulationsprogramm erläutert. </li><li> Berechnen intrazellulären pH-Wert für jede einzelne Zelle oder eine Region von Interesse unter Verwendung der folgenden Gleichung: pH = pKa + (Log (R-R min) / (R max -R)) x F min (λ2) / F max (λ2) </li><li> Durch Drücken der F min (λ2) / F ma x (λ2) -Verhältnis, wenn es Sonde Bleichen oder Leckage, was zu einer Abnahme der 450 nm-Fluoreszenz während der gesamten Experimente. Dies ist aber nur sehr selten in den in der des verwendeten Bedingungen beobachtetcribed Experimente. </li><li> Da die Kalibrierungsdaten am Ende jedes der pH-Messung vorhanden sind, zu überprüfen, ob die entsprechenden berechneten Werte die pH-Werte für die Kalibrierung verwendet werden, unterscheiden. Wenn dies der Fall ist, stellen Sie dann alle experimentell bestimmten pH-Werte für die Kalibrierung mit dem folgenden Verfahren: <ol><li> Berechnen des folgenden Quotienten (Q, die Differenz zwischen der gemessenen Werte / Unterschied zwischen der Kalibrierungswerte). Multiplizieren Sie die gesamte Datenmenge von Q. Nehmen Sie die endgültige Einstellung durch Addition oder Subtraktion, so dass die berechneten Werte werden die entsprechenden Kalibrierungswerten entsprechen. </li></ol></li></ol> 3. Messungen der Anfangsgeschwindigkeiten von NHE7 von Fast Li + Uptake <ol><li> Saatgutzellen auf Multi-Well-Platten (6 bis 24 Vertiefungen) und säuert sie entweder mit der oben oder abwechselnd die Nigericin / Rinderserumalbumin (BSA) in 20 beschrieben Ansäuerung beschrieben NH 4 + Beladungstechnik. </li><li&gt; Rinse Platten zweimal schnell unter Verwendung der oben beschriebenen Spüllösung und dann Inkubieren der Zellen in die Aufnahme Lösungen enthaltend 1-10 mM Lithium (leicht unterhalb Km-Werte) und die gewünschten Konzentrationen der Kationen und / oder Inhibitoren von Interesse für die gewünschte Menge der Zeit. </li><li> Halten Sie kurz und konsistente Aufnahme Dauer (in der Regel 1 Minute oder weniger), um sicherzustellen, dass der Transport ist im Anfangsgeschwindigkeiten Bedingungen. Stellen Sie außerdem sicher, dass alle für die Aufnahme verwendeten Lösungen sind isotonisch. </li><li> Am Ende der Aufnahmezeit, sorgfältig beseitigt die Aufnahmemedium und die Zellen werden viermal mit eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Führen Sie diese wäscht so schnell wie möglich (weniger als 10 Sekunden für die vier von ihnen ist ideal), um Lithium-Efflux verhindern. </li><li> Lyse der Zellen in 25% ige Salpetersäure. Apply 250 ul pro Vertiefung von 25% Salpetersäure und lassen Sie es für mindestens 1 h sitzen, dann Schrott jede Vertiefung mit dem Ende der Pipettenspitze und überweisen Sie den ganzen gut Suspension in einem neuen microcentrifuge Rohr. </li><li> Übertragen des Lysats in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, Zentrifugieren 5 Minuten lang bei 15.000 × g (Raumtemperatur), um die Zelltrümmer zu entfernen. </li><li> Messung der Lithiumgehalt der Überstände durch Atomabsorptionsspektroskopie 21. HINWEIS: Verschiedene Unternehmen bieten Atomabsorptionsspektrometer, das mit einer Lithium-Hohlkathodenlampe ausgestattet werden müssen. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers, wie diese Maschinen sind sehr präzise, ​​sondern auch sehr empfindlich. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Dieses Protokoll beschreibt, wie Zellen, die intrazelluläre Na + / H + Austauscher an der Plasmamembran, ohne dass ihre Primärsequenz durch ortsgerichtete Mutagenese ausgewählt. Diese Austauscher kann nun charakterisiert werden. Dieses Verfahren basiert auf der zellulären Toxizität von intrazellulärem Protonen basierend auf Zelllinien, die vesikulären Na + / H + Austauscher an der Plasmamembran exprimieren wählt. Es könnte möglich sein, i...

Die meisten intrazellulären Kompartimenten Anzeige eine saure luminalen pH-Wert, der einer der wichtigsten Parameter für die Reifung, Menschenhandel, Recycling von Proteinen oder Hormonen und Neurotransmittern Laden ist. Es wurde gezeigt, dass der pH-Gradient zwischen Cytosol und vesikulärer Gehalt durch vakuoläre H + ATPasen 1 erzeugt, um vesikuläre ClC Chloridtransporter 2 gekoppelt. Sowohl in Knock-out (KO) Mäusen und menschlichen Patienten ist die Bedeutung dieser Transporter durch die schweren Phänotypen, die durch Mutationen in ihren Genen 3-6 verursacht hervorgehoben. Die Mitglieder des Sodium-Hydrogen Tauscher SLC9A Familie, genannt auch NHEs für Na + / H + Austauscher haben, dass sie Schlüssel Effektoren der intrazellulären pH-Wert und Zellvolumenregulation sowie in vektorieller Transport von Säure-Basenäquivalente durch das Zellgewebe sein . Neben der Plasmamembran NHEs drei hochkonservierten Na + / H + Austauscher NHE 6, 7und 9 sind in trans-Golgi Netzwerk und Anfang Endosomen 7 ausgedrückt. Mutationen in ihren Genen haben mit Angelman-like oder Christi Syndrome 8-9, familienbasierten Autismus 10 und Aufmerksamkeits-Defizit-Hyperaktivitäts-Störung 11-12 verbunden. Diese Tauscher auch bei neurodegenerativen Probleme wie Alzheimer Krankheitsanfälligkeit 13 und X-chromosomale geistige Retardierung zusammenhängenden Gene Syndrome 14 beteiligt. Zusammen genommen verdeutlichen auch diese Studien die Bedeutung dieser intrazellulären NHEs der Gehirnentwicklung und / oder Funktion. Die intrazelluläre Lokalisation dieser Tauscher verhindert genaue Messungen der Ionenselektivität, Transportrichtung, kinetische Parameter und Regulierung. Wie ist der Fall für alle Transporter in intrazellulären Kompartimenten ausgedrückt, äußerst schwierig, ihre biochemischen Aktivitäten zu bewerten und damit zu ihrer physiologischen Funktionen und die mechan vollständig zu verstehen istIsmen zugrunde liegenden pathologischen ihre Auswirkungen. Aufgrund der hohen cytosolische K + -Konzentration, war die allgemein akzeptierte Hypothese, dass sie als K + gekoppelten Protonen Efflux-Transporter arbeiten. Die Existenz einer solchen Protonenleck hatte Hypothese aufgestellt, wie es Protonenpumpen durch den V-ATPasen, um einen stationären Zustand vesikulären pH aufrechtzuerhalten leichen. Das Ziel dieser visuellen Gegenstand (i), ein Verfahren, das die genetische Selektion von Zelllinien, die solche vesikuläre Transporter an ihrer Plasmamembran zu exprimieren, und (ii) an zwei unabhängige Ansätze, um die Funktionen dieser Transporter messen zeigen ermöglicht demonstrieren. Vor drei Jahrzehnten Pouysségur und Franchi eine genetische Ansatz, der die molekulare Klonierung und Charakterisierung der Mitglieder der NHE Familie 15 aktiviert voran. Dies wurde auf die Toxizität von intrazellulärem Protonen als Screening Methode. Der erste Schritt war, um Zelllinien zu erhalten defizientenjeden Na + / H + -Austausch ausgedrückt in der Plasmamembran mit Hilfe der Reversibilität dieses Transporters. Fibroblasten (CCL39-Zellinie) wurden mit Na + oder Li + vorgespannt und dann in einer sauren extrazellulären Mediums (pH 6,5) für 2 Stunden platziert. Dies führte zu dem Tod von Zellen, die einen funktionellen Na + / H + -Austausch zu aktivieren und auf die Auswahl von Antiporter-defizienten Zellen (PS120 Zellinie) 16. Wenn Bicarbonat-freiem Medium kultiviert werden, diese Zellen sind sehr empfindlich gegenüber akuten intrazellulären Ansäuerung. Infolgedessen wird die Expression eines beliebigen Funktionsprotonen Effluxmechanismen an der Plasmamembran positiv gewählt werden (siehe 17), wenn diese Zellen in akuten intrazellulären Ansäuerungen eingereicht. Solche Versauerung Techniken können verwendet werden, um Zelllinien mit Handel Defekte ermöglicht die erzwungene Expression von WT intrazellulären NHEs an der Plasmamembran zu isolieren. Als eukaryontische Na + / H+ Tauscher sind elektro, sie sind nicht messbar durch die elektrophysiologische Ansätze, die mit großem Erfolg eingesetzt worden sind, um Kanäle zu messen. Dieses Manuskript daher demonstriert, wie die Aktivität dieses Tauscher durch intrazelluläre pH-Messungen und schnelle Kinetik der Lithiumaufnahme messen. Da die zugrunde liegenden Konzepte die gleichen sind, ist es interessant zu bemerken, daß viele der für den Auswahlabschnitt entwickelten Verfahren auch direkt für die funktionelle Messungen verwendet. Interessanterweise haben wir festgestellt, dass der Menschenhandel Defekt in der Zelllinien mit Hilfe der in dieser Handschrift beschriebenen Ansatz gewählt vorhanden führt zu einer größeren Expression von anderen vesikulären Proteine ​​an der Plasmamembran wie der vesikulären Kaliumkanal TWIK1 18. Dies weist darauf hin, in Richtung auf die Auswahl einer allgemeinen Retentionsdefektmechanismus vesicularis Transmembranproteine. Daher ist diese Auswahlverfahren und die Zellen, die es generiert Maistellen ein vielversprechendes Werkzeug für die wissenschaftliche Gemeinschaft der Arbeit an den Membranproteinen von intrazellulären Kompartimenten. Sowie die Messtechnik hier vorgestellten könnten anwendbar für die Untersuchung anderer nicht-elektroTransporter sein.

<table><tbody><tr><td>Standard cell culture equipement</td><td></td><td></td><td>Used for H+ killing selection composed of many devices with different catalog numbers</td></tr><tr><td>Incubator with CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sanyo</td><td>MCO15A</td><td></td></tr><tr><td>Incubator without CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Heraeus instrument</td><td>BB6220</td><td></td></tr><tr><td>Laminar flow hood PSM1200NF</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>52010120</td><td></td></tr><tr><td>DMEM medium</td><td>sigma</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>FBS gold</td><td>GE Healthcare</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin/streptomycin</td><td>PAA</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 10x</td><td>PAA</td><td>L11-003</td><td></td></tr><tr><td>Atomic Absorption spectrometer with Zeeman furnace system</td><td>Thermo Scientific</td><td>ICE 3500 GFZ</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>sigma</td><td>L4408</td><td></td></tr><tr><td>Nitric Acid</td><td>sigma</td><td>438073</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence videomicroscopy set</td><td>Leica</td><td></td><td>Composed of many devices with different catalog numbers</td></tr><tr><td>Inverted automated microscope</td><td>Leica</td><td>DMI6000B</td><td></td></tr><tr><td>microscope stand</td><td>leica</td><td>11888906</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888911</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11505180</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888377</td><td></td></tr><tr><td>incident fluorescence</td><td>leica</td><td>11888901</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11504166</td><td></td></tr><tr><td>motor bracket</td><td>leica</td><td>11888379</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11505234</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521505</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11522106</td><td></td></tr><tr><td>LED transmission light&amp;nbsp;</td><td>leica</td><td>8097321</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>8102034</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521580</td><td></td></tr><tr><td>motorized plate</td><td>leica</td><td>11522068</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11531172</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521734</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521719</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888423</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888424</td><td></td></tr><tr><td>camera output</td><td>leica</td><td>11888373</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11507807</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888393</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888259</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888258</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11541510</td><td></td></tr><tr><td>images acquisition/analysis software</td><td>leica</td><td>11888375</td><td></td></tr><tr><td>optics</td><td>leica</td><td>11506507</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11506243</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11506203</td><td></td></tr><tr><td>fluorescence Xenon lamp</td><td>leica</td><td>DMI6000</td><td></td></tr><tr><td>camera</td><td>hamamatsu</td><td>8100601</td><td></td></tr><tr><td>metafluor/Mmfluor software</td><td></td><td>11640905</td><td></td></tr><tr><td>pH sensitive probe, BCECF-AM</td><td>life technologies</td><td>B1170</td><td></td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Sigma</td><td>N7143</td><td></td></tr></tbody></table>

functional characterization of na+/h+ exchangers of intracellular compartments using proton-killing selection to express them at the plasma membrane

Endosomalen Ansäuerung ist von entscheidender Bedeutung für eine Vielzahl von Prozessen, wie zB Protein-Recycling und Abbau, Rezeptordesensibilisierung und Neurotransmitter Belastung in synaptischen Vesikeln. Diese Ansäuerung wird beschrieben, dass durch Protonen-ATPasen, um ClC Chloridtransporter gekoppelt vermittelt werden. Hochkonservierten elektro Protonen Transporter sind die Na + / H + Austauscher (NHE) 6, 7 und 9 auch in diesen Kammern ausgedrückt. Mutationen in ihren Genen haben mit der menschlichen kognitiven und neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht worden. Paradoxerweise bleibt ihre Rolle schwer fassbar, da ihre intrazelluläre Lokalisation hat detaillierte funktionelle Charakterisierung verhindert. Diese Handschrift zeigt ein Verfahren, um dieses Problem zu lösen. Diese besteht aus der Auswahl der mutierten Zelllinien, fähig zu überleben akuten cytosolische Ansäuerung durch Halte intrazellulärem NHEs an der Plasmamembran. Es zeigt dann zwei sich ergänzenden Protokolle, um die Ionenselektivität und Aktivität zu messendieser Austauscher: (i) eine auf die intrazelluläre pH-Messungen unter Verwendung von Fluoreszenzvideomikroskopie, und (ii) eine auf der Basis der schnellen Kinetik der Lithiumaufnahme. Solche Protokolle können extrapoliert werden, um andere nicht-elektro Transporter zu messen. Darüber hinaus ist die hier vorgestellte Auswahlverfahren erzeugt Zellen mit einem intrazellulären Retention defekt Phänotyp. Daher werden diese Zellen exprimieren auch andere Vesikelmembran Proteine ​​an der Plasmamembran. Die hier dargestellte experimentelle Strategie kann daher eine potentiell leistungsfähiges Werkzeug, um andere intrazelluläre Proteine, die dann an der Plasmamembran zusammen mit der vesikulären Na + / H + Austauscher für die Auswahl verwendet ausdrücken zu studieren.

Auswahl: Die H + tötet Auswahl basiert auf der Diffusion des Ammonium schwachen Base basiert, wie in 1A dargestellt. Die Wirkung von schwachen Basen und Säuren Diffusion auf intrazelluläre pH wurde von Walter Boron und Mitarbeiter 22 Pionierarbeit geleistet. Das elegante Idee, dieses Phänomen zu nutzen, um zu produzieren eine tödliche Versauerung für positive genetische Selektion wurde dann von Jacques Pouysségur 17 entwickelt. Unter s...

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Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers.

Funktionelle Charakterisierung von Na<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; Wärmetauscher von intrazellulären Kompartimente Mit Proton-Tötung Selection man sie an der Plasmamembran Express

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and ...

functional-characterization-na-h-exchangers-intracellular

Research

JoVE Journal

Biology

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

9.2K Aufrufe.  Université Nice-Sophia Antipolis, Laboratoire de Physiomédecine Moléculaire, CNRS UMR7370, and Laboratories of Excellence Ion Channel Science and Therapeutics. The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers. 

Serie: Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also known as Band 3), the most abundant membrane protein in the red blood cells. The SLC4 family is homologous with borate transporters, which have been characterized in plants and fungi. It remains a significant technical challenge to express and purify membrane transport proteins to homogeneity in quantities suitable for&#160;structural or functional studies. Here we describe detailed procedures for the overexpression of borate transporters in Saccharomyces cerevisiae, isolation of yeast membranes, solubilization of protein by detergent, and purification of borate transporter homologs from S. cerevisiae, Arabidopsis thaliana, and Oryza sativa. We also detail a glutaraldehyde cross-linking experiment to assay multimerization of homomeric transporters. Our generalized procedures can be applied to all three proteins and have been optimized for efficacy. Many of the strategies developed here can be utilized for the study of other challenging membrane proteins.

Here we present a protocol to express, solubilize, and purify several eukaryotic borate transporters with homology to the SLC4 transporter family using yeast. We also describe a chemical cross-linking assay to assess the purified homomeric proteins for multimeric assembly. These protocols can be adapted for other challenging membrane proteins.

Ausdruck, Solubilisierung und Reinigung der eukaryotischen Borat-Transporter

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Forschung

Biochemie

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine exchangers in plants have not been identified. Here, we outline a method to characterize polyamine antiporters using membrane vesicles generated from the lysis of Escherichia coli cells heterologously expressing a plant antiporter. First, we heterologously expressed AtBAT1 in an E. coli strain deficient in polyamine and arginine exchange transporters. Vesicles were produced using a French press, purified by ultracentrifugation and utilized in a membrane filtration assay of labeled substrates to demonstrate the substrate specificity of the transporter. These assays demonstrated that AtBAT1 is a proton-mediated transporter of arginine, &#947;-aminobutyric acid (GABA), putrescine and spermidine. The mutant strain that was developed for the assay of AtBAT1 may be useful for the functional analysis of other families of plant and animal polyamine exchangers. We also hypothesize that this approach can be used to characterize many other types of antiporters, as long as these proteins can be expressed in the bacterial cell membrane. E. coli is a good system for the characterization of novel transporters, since there are multiple methods that can be employed to mutagenize native transporters.

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

We describe a method for the characterization of proton-driven membrane transporters in membrane vesicle preparations produced by heterologous expression in E. coli and lysis of cells using a French press.

Charakterisierung von Membrantransportern durch heterologen Ausdruck in E. coli und Herstellung von Membranvesikeln

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. This method combines expression of proteins tagged with the fluorescent non-canonical amino acid ANAP, and FRET between ANAP and fluorescent (trinitrophenyl) nucleotide derivatives. We present examples of nucleotide binding to ANAP-tagged KATP ion channels measured in unroofed plasma membranes and excised, inside-out membrane patches under voltage clamp. The latter allows for simultaneous measurements of ligand binding and channel current, a direct readout of protein function. Data treatment and analysis are discussed extensively, along with potential pitfalls and artefacts. This method provides rich mechanistic insights into the ligand-dependent gating of KATP channels and can readily be adapted to the study of other nucleotide-regulated proteins or any receptor for which a suitable fluorescent ligand can be identified.

This protocol presents a method for measuring adenine nucleotide binding to receptors in real time in a cellular environment. Binding is measured as F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) between trinitrophenyl nucleotide derivatives and protein labeled with a non-canonical, fluorescent amino acid.

Messung der Nukleotidbindung an intakte, funktionelle Membranproteine in Echtzeit

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane (SSM)-Based Electrophysiology

Single domain antibodies (nanobodies) have been extensively used in mechanistic and structural studies of proteins and they pose an enormous potential as tools for developing clinical therapies, many of which depend on the inhibition of membrane proteins such as transporters. However, most of the methods used to determine the inhibition of transport activity are difficult to perform in high-throughput routines and depend on labeled substrates availability thereby complicating the screening of large nanobody libraries. Solid-supported membrane (SSM) electrophysiology is a high-throughput method, used for characterizing electrogenic transporters and measuring their transport kinetics and inhibition. Here we show the implementation of SSM-based electrophysiology to select inhibitory and non-inhibitory nanobodies targeting an electrogenic secondary transporter and to calculate nanobodies inhibitory constants. This technique may be especially useful for selecting inhibitory nanobodies targeting transporters for which labeled substrates are not available.

Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane SSM-Based Electrophysiology

Nanobodies are important tools in structural biology and pose a great potential for the development of therapies. However, the selection of nanobodies with inhibitory properties can be challenging. Here we demonstrate the use of solid-supported-membrane (SSM)-based electrophysiology for the classification of inhibitory and non-inhibitory nanobodies targeting electrogenic membrane transporters.

Auswahl von Transporter-gezielten inhibitorischen Nanobodies durch Solid-Supported-Membrane (SSM)-basierte Elektrophysiologie

Single domain antibodies (nanobodies) have been extensively used in mechanistic and structural studies of proteins and they pose an enormous potential as ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenese und funktionale Analyse von Ionenkanälen heterolog in Säugerzellen exprimierten

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Biologie

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase is more difficult to investigate. Many transport assays utilize radioisotopes to achieve a sufficient signal-to-noise ratio, however, the necessary security measures impose severe restrictions regarding human exposure or assay design. Furthermore, ion transport across cell membranes is critically influenced by the membrane potential, which is not straightforwardly controlled in cell culture or in proteoliposome preparations. Here, we make use of the outstanding sensitivity of atomic absorption spectrophotometry (AAS) towards trace amounts of chemical elements to measure Rb+ or Li+ transport by Na+,K+- or gastric H+,K+-ATPase in single cells. Using Xenopus oocytes as expression system, we determine the amount of Rb+ (Li+) transported into the cells by measuring samples of single-oocyte homogenates in an AAS device equipped with a transversely heated graphite atomizer (THGA) furnace, which is loaded from an autosampler. Since the background of unspecific Rb+ uptake into control oocytes or during application of ATPase-specific inhibitors is very small, it is possible to implement complex kinetic assay schemes involving a large number of experimental conditions simultaneously, or to compare the transport capacity and kinetics of site-specifically mutated transporters with high precision. Furthermore, since cation uptake is determined on single cells, the flux experiments can be carried out in combination with two-electrode voltage-clamping (TEVC) to achieve accurate control of the membrane potential and current. This allowed e.g. to quantitatively determine the 3Na+/2K+ transport stoichiometry of the Na+,K+-ATPase and enabled for the first time to investigate the voltage dependence of cation transport by the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase. In principle, the assay is not limited to K+-transporting membrane proteins, but it may work equally well to address the activity of heavy or transition metal transporters, or uptake of chemical elements by endocytotic processes.

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

We describe a method to quantify the activity of K+-countertransporting P-type ATPases by heterologous expression of the enzymes in Xenopus oocytes and measuring Rb+ or Li+ uptake into individual cells by atomic absorption spectrophotometry. The method is a sensitive and safe alternative to radioisotope flux experiments facilitating complex kinetic studies.

Mess-Cation Transport von Na, K-und H, K-ATPase in<em&gt; Xenopus</em&gt; Oozyten mittels Atomabsorptionsspektrometrie: Eine Alternative zu Radioisotopen Assays

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating ...

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined lipid composition. We are studying the lipid-dependent gating effects in a prototype voltage-gated potassium (Kv) channel, and have worked out detailed procedures to reconstitute the channels into different membrane systems. Our reconstitution procedures take consideration of both detergent-induced fusion of vesicles and the fusion of protein/detergent micelles with the lipid/detergent mixed micelles as well as the importance of reaching an equilibrium distribution of lipids among the protein/detergent/lipid and the detergent/lipid mixed micelles. Our data suggested that the insertion of the channels in the lipid vesicles is relatively random in orientations, and the reconstitution efficiency is so high that no detectable protein aggregates were seen in fractionation experiments. We have utilized the reconstituted channels to determine the conformational states of the channels in different lipids, record electrical activities of a small number of channels incorporated in planar lipid bilayers, screen for conformation-specific ligands from a phage-displayed peptide library, and support the growth of 2D crystals of the channels in membranes. The reconstitution procedures described here may be adapted for studying other membrane proteins in lipid bilayers, especially for the investigation of the lipid effects on the eukaryotic voltage-gated ion channels.

Procedures for complete reconstitution of a prototype voltage-gated potassium channel into lipid membranes are described. The reconstituted channels are suitable for biochemical assays, electrical recordings, ligand screening and electron crystallographic studies. These methods may have general applications to the structural and functional studies of other membrane proteins.

Rekonstitution eines Kv-Kanal in Lipidmembranen für Strukturelle und Funktionelle Studien

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as from eukaryotes. This increase has been largely driven by the successful push to obtain structural information on membrane proteins. However, the ability to functionally interrogate these proteins has not advanced at the same rate and is often limited to qualitative assays of limited quantitative value, thereby limiting the mechanistic insights that they can provide. An assay to quantitatively investigate the transport activity of reconstituted Cl- channels or transporters is described. The assay is based on the measure of the efflux rate of Cl- from proteoliposomes following the addition of the K+ ionophore valinomycin to shunt the membrane potential. An ion sensitive electrode is used to follow the time-course of ion efflux from proteoliposomes reconstituted with the desired protein. The method is highly suited for mechanistic studies, as it allows for the quantitative determination of key properties of the reconstituted protein, such as its unitary transport rate, the fraction of active protein and the molecular mass of the functional unit. The assay can also be utilized to determine the effect of small molecule compounds that directly inhibit/activate the reconstituted protein, as well as to test the modulatory effects of the membrane composition or lipid-modifying reagents. Where possible, direct comparison between results obtained using this method were found to be in good agreement with those obtained using electrophysiological approaches. The technique is illustrated using CLC-ec1, a CLC-type H+/Cl- exchanger, as a model system. The efflux assay can be utilized to study any Cl- conducting channel/transporter and, with minimal changes, can be adapted to study any ion-transporting protein.

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

Proteoliposomes are used to study purified channels and transporters reconstituted in a well-defined biochemical environment. An experimental procedure to measure efflux mediated by these proteins is illustrated. The steps to prepare proteoliposomes, perform the recordings, and analyze data to quantitatively determine the functional properties of the reconstituted protein are described.

Ein Proteoliposom Basierte Efflux-Assay auf Einzelmoleküleigenschaften von Cl Bestimmen<sup&gt; -</sup&gt; Kanäle und Transporter

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as ...

Membrane Transport Processes Analyzed by a Highly Parallel Nanopore Chip System at Single Protein Resolution

Membrane protein transport on the single protein level still evades detailed analysis, if the substrate translocated is non-electrogenic. Considerable efforts have been made in this field, but techniques enabling automated high-throughput transport analysis in combination with solvent-free lipid bilayer techniques required for the analysis of membrane transporters are rare. This class of transporters however is crucial in cell homeostasis and therefore a key target in drug development and methodologies to gain new insights desperately needed.
The here presented manuscript describes the establishment and handling of a novel biochip for the analysis of membrane protein mediated transport processes at single transporter resolution. The biochip is composed of microcavities enclosed by nanopores that is highly parallel in its design and can be produced in industrial grade and quantity. Protein-harboring liposomes can directly be applied to the chip surface forming self-assembled pore-spanning lipid bilayers using SSM-techniques (solid supported lipid membranes). Pore-spanning parts of the membrane are freestanding, providing the interface for substrate translocation into or out of the cavity space, which can be followed by multi-spectral fluorescent readout in real-time. The establishment of standard operating procedures (SOPs) allows the straightforward establishment of protein-harboring lipid bilayers on the chip surface of virtually every membrane protein that can be reconstituted functionally. The sole prerequisite is the establishment of a fluorescent read-out system for non-electrogenic transport substrates.
High-content screening applications are accomplishable by the use of automated inverted fluorescent microscopes recording multiple chips in parallel. Large data sets can be analyzed using the freely available custom-designed analysis software. Three-color multi spectral fluorescent read-out furthermore allows for unbiased data discrimination into different event classes, eliminating false positive results.
The chip technology is currently based on SiO2 surfaces, but further functionalization using gold-coated chip surfaces is also possible.

The presented protocol describes the analysis of membrane protein mediated transport on the single transporter level using pore-spanning solvent-free lipid bilayers. This is achieved by the creation of bulk produced nanopore array chips, combined with highly parallel data acquisition and analysis, enabling the future establishment of membrane protein effector screenings.

Membrantransportprozesse durch eine hochparallele Nanopore Chip-System bei Einzel Protein Resolution Analysierte

Membrane protein transport on the single protein level still evades detailed analysis, if the substrate translocated is non-electrogenic. Considerable ...

Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. These transport mechanisms are mediated by the activities of specialized transporter proteins. Specifically,pH dynamics are finely controlled by plasma membrane proton (H+) extrusion systems, such as the Na+/H+ exchanger (NHE) protein family. Despite extensive efforts to study the mechanisms underlying NHE regulation, our current understanding of the biophysical and molecular properties of the NHE family is inadequate because of the limited availability of methods to effectively measure NHE activity. In this manuscript, we used H+-selective electrodes during whole-cell patch clamping recording to measure NHE-induced H+ flux. We proposed this approach to overcome some limitations of typically used methods to measure NHE activity, such as radioactive uptake and fluorescent membrane permeants. Measurement of NHE activity using the described method enables high sensitivity and time resolution and more efficient control of intracellular H+ concentrations. H+-selective electrodes are based on the fact that transporter activity creates an ion gradient in close proximity to the cell membrane. An H+-selective electrode moving up to and away from the cell membrane in a repetitive, oscillatory fashion records a voltage difference that is dependent on H+ flux. While H+-selective electrodes are used to detect H+ flux moving out of the cell, the patch clamp method in the whole-cell configuration is used to control the intracellular ion composition. Moreover, application of the giant patch clamp technique allows modification of the intracellular composition of not only ions but also lipids. The transporter activity of NHE isoform 3 (NHE3) was measured using this technical approach to study the molecular basis of NHE3 regulation by phosphoinositides.

This manuscript describes the applications of proton-selective electrodes and patch clamping methods to measure the activity of proton transport systems. These methods overcome some limitations of techniques commonly used to study proton transport activity, such as moderate sensitivity, time resolution and insufficient intracellular milieu control.

Anwendung der Elektrophysiologie Messung die Aktivität von Electro-neutralen Transporter zu studieren

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. ...

Funktionelle Charakterisierung von Na

Zusammenfassung

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