ويدعم هذا البحث من قبل منحة التنمية الوطنية ساينتست (13SDG14420049) إلى AA من جمعية القلب الأميركية وأموال بدء من جامعة ولاية واين. نحن مدينون للدكتور رونالد دبليو هولز والدكتورة ماري بيتنر لتقديم المشورة بشأن التحضيرات الكظرية البقري والدكتور دانيال أكسلرود للحصول على المساعدة مع pTIRFM انشاء وتعليقات مفيدة على المخطوطة. كان يستخدم SYT-1 مع pHluorin إذن الدكتور جيرو Miesenbock (جامعة أكسفورد). تم الحصول عليها من خلال GCAMP5G Addgene. نشكر جيمس ت. تايلور، Tejeshwar راو، راشيل L. ايكمان، وPraneeth Katrapti مع مساعدة فى تحسين مختلف مراحل الإجراءات المذكورة.

<ol>
	<li>Chernomordik, L. V., Zimmerberg, J., Kozlov, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Membranes of the world unite! Cell Biol. 175, 201-207 (2006).</li><li>Chapman, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+does+synaptotagmin+trigger+neurotransmitter+release.">How does synaptotagmin trigger neurotransmitter release.</a> Annu. Rev. Biochem. 77, 615-641 (2008).</li><li>Hinshaw, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin+and+its+role+in+membrane+fission.">Dynamin and its role in membrane fission.</a> Annu. Cell Dev. Biol. 16, 483-519 (2000).</li><li>Lang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+-triggered+peptide+secretion+in+single+cells+imaged+with+green+fluorescent+protein+and+evanescent-wave+microscopy.">Ca2+-triggered peptide secretion in single cells imaged with green fluorescent protein and evanescent-wave microscopy.</a> Neuron. 18 (6), 857-863 (1997).</li><li>Steyer, J. A., Horstman, H., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport,+docking+and+exocytosis+of+single+secretory+granules+in+live+chromaffin+cells.">Transport, docking and exocytosis of single secretory granules in live chromaffin cells.</a> Nature. 388, 474-478 (1997).</li><li>Allersma, M. W., Wang, L., Axelrod, D., Holz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+regulated+exocytosis+with+a+granule-membrane+probe+using+total+internal+reflection+microscopy.">Visualization of regulated exocytosis with a granule-membrane probe using total internal reflection microscopy.</a> Mol. Biol. Cell. 15, 4658-4668 (2004).</li><li>Toomre, D., Steyer, J. A., Keller, P., Almers, W., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+constitutive+membrane+traffic+with+the+cell+surface+observed+by+evanescent+wave+microscopy.">Fusion of constitutive membrane traffic with the cell surface observed by evanescent wave microscopy.</a> J. Cell Biol. 149, 33-40 (2000).</li><li>Schmoranzer, J., Goulian, M., Axelrod, D., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+constitutive+exocytosis+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Imaging constitutive exocytosis with total internal reflection fluorescence microscopy.</a> J. Cell Biol. 149, 23-32 (2000).</li><li>Heinemann, C., Chow, R. H., Neher, E., Zucker, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+the+secretory+response+in+bovine+chromaffin+cells+following+flash+photolysis+of+caged+Ca2.">Kinetics of the secretory response in bovine chromaffin cells following flash photolysis of caged Ca2.</a> Biophys. J. 67, 2546-2557 (1994).</li><li>Heidelberger, R., Heinemann, C., Neher, E., Matthews, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dependence+of+the+rate+of+exocytosis+in+a+synaptic+terminal.">Calcium dependence of the rate of exocytosis in a synaptic terminal.</a> Nature. 371 (6497), 513-515 (1994).</li><li>Chow, R. H., Klingauf, J., Heinemann, C., Zucker, R. S., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+determining+the+time+course+of+secretion+in+neuroendocrine+cells.">Mechanisms determining the time course of secretion in neuroendocrine cells.</a> Neuron. 16, 369-376 (1996).</li><li>Thompson, N. L., McConnell, H. M., Burhardt, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Order+in+supported+phospholipid+monolayers+detected+by+the+dichroism+of+fluorescence+excited+with+polarized+evanescent+illumination.">Order in supported phospholipid monolayers detected by the dichroism of fluorescence excited with polarized evanescent illumination.</a> Biophys. J. 46, 739-747 (1984).</li><li>Sund, S. E., Swanson, J. A., Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+membrane+orientation+visualized+by+polarized+total+internal+reflection+fluorescence.">Cell membrane orientation visualized by polarized total internal reflection fluorescence.</a> Biophys. J. 77, 2266-2283 (1999).</li><li>Zenisek, D., Steyer, J. A., Feldman, M. E., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+membrane+marker+leaves+synaptic+vesicles+in+milliseconds+after+exocytosis+in+retinal+bipolar+cells.">A membrane marker leaves synaptic vesicles in milliseconds after exocytosis in retinal bipolar cells.</a> Neuron. 35, 1085-1097 (2002).</li><li>Anantharam, A., Axelrod, D., Holz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+plasma+membrane+deformations+reveals+pre-fusion+membrane+curvature+changes+and+a+role+for+dynamin+in+the+regulation+of+fusion+pore+expansion.">Real-time imaging of plasma membrane deformations reveals pre-fusion membrane curvature changes and a role for dynamin in the regulation of fusion pore expansion.</a> J. Neurochem. , 10-1111 (2012).</li><li>Anantharam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+role+for+the+dynamin+GTPase+in+the+regulation+of+fusion+pore+expansion.">A new role for the dynamin GTPase in the regulation of fusion pore expansion.</a> Mol. Biol. Cell. 22, 1907-1918 (2011).</li><li>Anantharam, A., Axelrod, D., Holz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+TIRFM+reveals+changes+in+plasma+membrane+topology+before+and+during+granule+fusion.">Polarized TIRFM reveals changes in plasma membrane topology before and during granule fusion.</a> Cell Mol. Neurobiol. 30, 1343-1349 (2010).</li><li>Anantharam, A., Onoa, B., Edwards, R. H., Holz, R. W., Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+topological+changes+of+the+plasma+membrane+upon+exocytosis+visualized+by+polarized+TIRFM.">Localized topological changes of the plasma membrane upon exocytosis visualized by polarized TIRFM.</a> J. Cell. 188, 415-428 (2010).</li><li>Wick, P. W., Senter, R. A., Parsels, L. A., Holz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+transfection+studies+of+secretion+in+bovine+chromaffin+cells+and+PC12+cells:+generation+of+kainate-sensitive+chromaffin+cells.">Transient transfection studies of secretion in bovine chromaffin cells and PC12 cells: generation of kainate-sensitive chromaffin cells.</a> J. Biol. Chem. 268, 10983-10989 (1993).</li><li>O'Connor, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+bovine+chromaffin+cells.">Primary culture of bovine chromaffin cells.</a> Nat. Protoc. 2, 1248-1253 (2007).</li><li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noise+Ca2++composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noise Ca2+ composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging.">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

TIRFM القائم على الاستقطاب بالكشف، والتغيرات غير مرئي بالمجهر السريع في طوبولوجيا الغشاء. تنفيذ الأسلوب هو بسيط نسبيا، لا سيما إذا البصريات TIRF هي بالفعل في المكان. كل ما هو مطلوب هو لوحة الربع الموجة، واثنين من مكعبات استقطاب، ومصاريع لفصل ف ق بول وبول إضاءة مسارات. وعادة ما تمليه الموقف الدقيق لهذه المكونات على طاولة قرب المساحة المتوفرة. من أجل الحصول على المعلومات الطوبوغرافية الغشاء، يجب التحقيق الفلورسنت المستخدمة يقحم مع التوجه ثابتة أو معروفة. هذه التقنية، كما هو موضح في هذه المقالة، يفترض استخدام الأصباغ carbocyanine ولكن الأصباغ الأخرى، مثل FM1-43 14، ويمكن أيضا أن تستخدم. الإجراء تلطيخ غشاء نفسها واضح ومباشر. الخلايا المستزرعة تتطلب سوى التعرض قصيرة جدا (أقل من 10 ثانية) على كمية صغيرة من الجاذبة / هل للحصول على وضع العلامات مندفعا من الغشاء. مضيفا الصبغة الزائدة يؤدي إلى تشتت الضوء المجاميع وآتش على الزجاج الذي يقلل من جودة الصورة. الإفراط في احتضان الخلايا مع صبغة يؤدي إلى صبغ الداخلي والتي لها آثار ضارة على جودة الصورة، وربما بقاء الخلية. إذا اتسخت خلية جيدا، وسوف يكون هناك تمييز واضح في الصور الانبعاثات P و S، كما هو مبين في الشكل 2A، فإن الانبعاثات P تسليط الضوء بشكل واضح مجالات الغشاء المائل التي هي ساترة (أي حواف البصمة الخلية) في حين أن كثافة الانبعاثات S سوف تكون موحدة تقريبا خلال البصمة الخلية. إذا هناك تمييز واضح بين P و S ليست واضحة، فمن الممكن أن الخلية يتم الالتزام سيئة إلى الركيزة أو غشاء الخلية ليست صحية، وعدم استخدام الخلايا للتجارب. لدينا دراسات سابقة تصف pTIRFM تستخدم الجاذبة كما المسبار الغشاء الفلورسنت. هنا، ونحن لم تستخدم لأنها مناسبة للتجارب التصوير ثنائي اللون التي توظف GFP / pHluorin كما fluorophore الأخرى. نحن لم تثير وايال ليزر 561 نانومتر بدلا من 640 نانومتر ليزر (والذي هو أقرب إلى ذروة الإثارة به) لأن التبييض fluorophore بسرعة أكبر في 640 نانومتر. على الرغم من حقيقة أن نانومتر ليزر 561 على ذيل هل في الطيف الإثارة المنشورة، تنبعث مضان بكفاءة. ميزة أخرى من الليزر نانومتر 561 هو أنه يثير على حد سواء والجاذبة لم تمكننا من استخدام نفس الإعداد الاستقطاب لكلا تحقيقات. نلاحظ أن التوجه من fluorophore في الغشاء سوف تؤثر على تفسير طوبولوجيا الغشاء. على سبيل المثال، إذا كانت موجهة لfluorophore مع ثنائيات الاقطاب انتقالها عموديا على مستوى الغشاء (بدلا من موازية، أو موازية تقريبا، كما هو الحال مع الجاذبة أو لم)، ثم المناطق غشاء nonplanar سيتم تسليط الضوء من قبل S بسهولة أكبر بدلا من انبعاث P. وصفناها أيضا تقنيات لعزل و electroporation الخلايا أليفة الكروم الكظرية البقري. الخلية أليفة الكروم البقري هو ق ممتازةنموذج ecretory. أنه يحتوي على مزايا كونها سهلة للحفاظ في الثقافة، استجابة لمجموعة متنوعة من secretogogues، وحيازة حويصلات إفرازية الكبيرة التي هي تصور بسهولة مع المجهر الضوئي التقليدية. للتعبير عن البروتينات الفلورية، وelectroporated الخلايا في التعليق قبل الطلاء على أطباق ثقافة المعالجة الكولاجين. في تجربتنا، وكفاءة التعبير هو أعلى من ذلك بكثير مع التثقيب الكهربائي مع أي من كا 2 + فوسفات أو الكواشف Lipofectamine. العيب من التثقيب الكهربائي هو أنه يتطلب المزيد من الخلايا (كما العديد من البقاء على قيد الحياة لا عملية) والكواشف التجارية باهظة الثمن. وذلك لأسباب غير واضحة لنا، يشتمل يست كل غشاء فعلت. بالإضافة إلى ذلك، و transfected سوى جزء صغير من الخلايا على الطبق. يمكن العثور على الخلايا التي وو transfected ملطخة بشكل جيد مع هل يكون مضيعة للوقت وهذا هو السبب تحسين الظروف لتلطيخ و electroporation تستحق الجهد. باختصار، هذايصف rticle كيفية تنفيذ pTIRFM لرصد تشوهات غشاء السريع والمترجمة التي تحدث أثناء اندماج الحويصلات الأساسية في الخلايا أليفة الكروم كثيفة البقري. على الرغم من أن تناقش طلب واحد فقط، هي مناسبة بشكل مثالي لهذه التقنية لدراسة العمليات البيولوجية الأخرى التي تنطوي على تغييرات في شكل الغشاء، بما في ذلك الإلتقام، الانقسام السيتوبلازمي، وحركية الخلية.

حسن تنفيذ إيماس يتطلب تغييرات متطرفة في شكل طبقة ثنائية الغشاء أن مدبرة بدقة. قبل الانصهار، الانحناء المحلية من غشاء البلازما تحت الحبيبية يحدث، في جزء منه للحد من حاجز الطاقة للتفاعل من طبقات ثنائية. في وقت لاحق، ودمج الأغشية، يتم إنشاء مناطق للانحناء عالية ويجب أن يستقر. أخيرا، يجب أن تكون عازمة الأغشية تنصهر من شكلها الأولي لتوسيع المسام والانصهار تمكين المحتوى الإفراج 1. لأن الأغشية وحده من غير المحتمل أن تخضع مثل هذه التغيرات الهائلة والمنسقة، والبروتينات ضرورية للتوسط الأحداث. ولكن كيف يتصرفون في التأثير على التغيرات في الغشاء طوبولوجيا أثناء عملية الانصهار لا يزال هناك الكثير جدا مسألة مفتوحة. ممتازة في المختبر وجود نماذج لتصور انحناء الغشاء. استخدام السلبي وصمة عار EM، على سبيل المثال، كانت مهمة لتشكيل النماذج الجزيئية الحالي عن تصرفات الرئيسيتين الاتجار عroteins - synaptotagmin وdynamin (للمشاركات، انظر تشابمان 2 و 3 هينشو). معظم المقايسات في الوقت الحقيقي من إيماس عدم الكشف عن انحناء مباشرة. بدلا من ذلك، يتم الاستدلال على ذلك من انحناء المقايسات أن يقدم تقريرا عن حركية lumenal الإفراج البضائع 4-8 أو تغييرات في منطقة الغشاء 9-11. PTIRFM يسد الفجوة بين المجراة في الدراسات المختبرية من خلال تمكين، والقياسات في الوقت الحقيقي مباشرة من التغييرات في micromorphology الغشاء. PTIRFM، في وضع nonimaging، كان رائدها أكسلرود وزملاؤه لقياس اتجاه NPD-PE أدرجت ضمن غشاء نموذج 12. ثم تم تطبيق هذه التقنية لتصور التغيرات الدينامية في الخلايا الحية المسمى مع الجاذبة وFM1-43 13-18. في pTIRFM، وتستخدم اثنين من الاستقطابات الحقل زائل لإثارة بالتتابع وجزءا لا يتجزأ من غشاء التحقيق: ف الاستقطاب (في الطائرة من الإصابة) وو الاستقطاب (عمودي على الطائرة من الإصابة). قبل التصوير، والتحقيق - في هذه الحالة، هل - يضاف لفترة وجيزة إلى المتوسطة خارج الخلية ويسمح ليقحم في أغشية البلازما من الخلايا لدراستها. في المناطق التي تكون فيها غشاء هو غير متوازي إلى ساترة (كما هو الحال في غشاء كشكش أو المسافة البادئة)، وهل سيكون أيضا غير متوازي. وبالتالي، فإن هذه المناطق تكون منفعل بواسطة شعاع ف بول. سوف شعاع ف بول تثير أقل فعالية في مناطق لم الغشاء الذي يتم في الغالب موازية لساترة. الصور نسبة بكسل إلى بكسل (P / S) الإبلاغ عن الانبعاثات من الإثارة متتابعة-p و ق بول من ولتسليط الضوء على وجه التحديد سوف لم مناطق تشوه الغشاء. من الناحية النظرية، وP / S نسبة الصور حساسة لحتى زوايا صغيرة من البلازما انحراف الغشاء من ساترة، مع اتساع التغييرات التي تنبأ بها المحاكاة الحاسوبية 18. P / S الصور هي أيضا مستقلة عن مسافة fluorophore من سطح ساترة و fluorophore المحليةالتركيز. وبدلا من ذلك قدمت تركيز fluorophore المحلية من خلال الصور الإبلاغ عن مجموع بكسل إلى بكسل من الانبعاثات P و 2 أضعاف الانبعاثات S (P +2 S). ف S +2 قياس حساسة للهندسة دقيقة من المسافة البادئة، مع بعض، قليلا، أو أي تغيير ممكن. هذا يمكن أن تظهر من خلال المحاكاة الحاسوبية أن التحولات نموذج لالمسام الانصهار من المبكر (أي مع العنق الضيق) إلى دولة في وقت لاحق 16،18. ف +2 S من حويصلة تنصهر تعلق على غشاء البلازما عبر العنق الضيق (ومع أكثر لم مقربة من الواجهة) ومن المتوقع أن تكون أكبر، على سبيل المثال، من أن من حويصلة تنصهر مع المسام أوسع بكثير (حيث هل هو ضمن الأكثر خفوت جزء من حقل زائل). في هذه المقالة، ونحن نناقش كيفية تنفيذ pTIRFM والاستفادة منها لدراسة، والتغيرات السريعة في الشكل المترجمة الغشاء التي تحدث أثناء الانصهار المسام تمدد. في حين طلب واحد فقط هو صراحة ديscussed، وأساليب قابلة للتعميم لمجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية الخلايا الأخرى التي تنطوي بصورة مباشرة أو غير مباشرة إعادة الغشاء.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="817">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:277px;">iXon3 EMMCD Camera</td>
			<td style="width:179px;">Andor</td>
			<td style="width:147px;">897</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">IX81 Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Side-mounted Filtercube Assembly</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">43 Series Ar-Ion Laser</td>
			<td>CVI Milles Griot Laser Optics</td>
			<td>543-AP-A01</td>
			<td>Tunable to 488nm</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Sapphire 561 LP Diode Laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
			<td>561nm</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Scanning Galvo Mirror System</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>GVS102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">VC3 Channel Focal Perfusion System</td>
			<td>ALA Scientific Instruments</td>
			<td>ALA VC3X4PP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">QMM Quartz MicroManifold</td>
			<td>ALA Scientific Instruments</td>
			<td>ALA QMM-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">10 PSI Pressure Regulator</td>
			<td>ALA Scientific Instruments</td>
			<td>ALA PR10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Manipulator</td>
			<td>Burleigh</td>
			<td>TS 5000-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Mounted Achromatic Quarter-Wave Plate</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AQWP05M-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">420-680nm Polarizing Beamsplitter Cube</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PBS201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Six Station Neutral Density Wheel</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FW1AND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Stepper-motor Driven SmartShutter</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>IQ25-1219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">HQ412lp Dichroic Filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>NC255583</td>
			<td>Joins 488nm and 561nm beams</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Coated Plano-Concave Lens</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>PCV 100mm VIS 0</td>
			<td>Diverges 488nm beam</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Coated Plano-Concave Lens</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>PCV 250mm VIS 0</td>
			<td>Diverges 561nm beam</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Coated Plano-Convex Lens</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>PCX 125mm VIS 0</td>
			<td>Focuses both beams</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Coated Plano-Convex Lens</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>PCX 50mm VIS 0</td>
			<td>Cemented to filter cube assembly</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">z488/561rpc Dichroic</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>z488/561rpc</td>
			<td>Filtercube dichroic</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">z488/561_TIRF Emission Filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>z488/561m_TIRF</td>
			<td>Filtercube emission</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">UIS2 60x Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO 60XO</td>
			<td>NA 1.37</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Neon Transfection System</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MPK 5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MetaMorph Imaging Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">DiI Membrane Dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>V-22885</td>
			<td>For Alignment Purposes</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TH Liberase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401135001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TL Liberse</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">DNAse I Type IV from bovine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Hemocytometer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>0267110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">DiD Membrane Dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D-7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Rhodamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">.22 &#956;m Membrane Syringe Filter Unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGS033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Fluoresbrite Polychromatic Red Microspheres</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>19507</td>
			<td>0.5 microns</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Immersion Oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>56822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">LabVIEW</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Controlls galvo mirrors</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Spinner Flask</td>
			<td>Bellco</td>
			<td>1965-00250</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging plasma membrane deformations with ptirfm

للحصول على أفكار جديدة في ديناميات إيماس، ويركز مجموعتنا على تغييرات في شكل طبقة ثنائية المادة الدهنية التي يجب أن تنظم على وجه التحديد خلال التحام حويصلة والبلازما الأغشية. وتتحقق هذه التغيرات السريعة والمترجمة بواسطة التفاعلات الدينامية بين الدهون والبروتينات المتخصصة التي تتحكم انحناء الغشاء. ان غياب مثل هذه التفاعلات لا نملك سوى عواقب مدمرة على الانصهار الحويصلة، ولكن مجموعة كبيرة من الوظائف الخلوية الأخرى التي تنطوي على السيطرة على شكل الغشاء. في السنوات الأخيرة، وقد تم تحديد هوية عدد من البروتينات مع خصائص تشكيل الغشاء. ما تبقى في عداد المفقودين هو خارطة طريق من متى وأين، وكيف أنها بمثابة الانصهار والتقدم الإفراج المحتوى. فهمنا من الأحداث الجزيئية التي تمكن إعادة غشاء تاريخيا محدودة بسبب عدم وجود الطرق التحليلية التي تعتبر حساسة للانحناء الغشاء أو لديك القرار الزماني لتراكك التغيرات السريعة. PTIRFM يرضي كلا من هذه المعايير. نناقش كيفية تنفيذ pTIRFM لتصور وتفسير السريع، والتغيرات submicron في اتجاه أغشية الخلايا أليفة الكروم خلال الحويصلة الأساسية كثيفة (DCV) الانصهار. الخلايا أليفة الكروم التي نستخدمها يتم عزل من الغدد الكظرية البقري. اتسخت الغشاء مع صبغة carbocyanine محبة للدهون، 1،1 &#39;-dioctadecyl-3، 3،3&#39;، 3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine، 4 chlorobenzenesulfonate، أو فعلت. لم intercalates في الطائرة الغشاء مع التوجه &quot;ثابت&quot; وبالتالي فهي حساسة لاستقطاب الحقل زائل. غشاء الخلية لم الملون هو متحمس بالتتابع مع الاستقطابات متعامدة ليزر 561 نانومتر (ف بول، ق بول). ويستخدم الليزر 488 نانومتر لتصور مكونات حويصلة والوقت لحظة الانصهار. يتم تشغيل إيماس بواسطة perfusing محليا الخلايا بمحلول بوكل إزالة إستقطاب. يتم إجراء تحليل متواجد حاليا باستخدام البرمجيات المكتوبة المخصصة لفهم كيفتغيرات كثافة الانبعاثات تتصل المسام الانصهار تمدد.

يتم تطبيق تقنيات التصوير TIRFM التقليدية والاستقطاب على الطاولة الهواء نفسه. تكوين العناصر البصرية يشبه، مع الفارق الكبير الذي الاستقطاب في ضوء الإثارة (الشكل 1A). الضوء المستقطب يثير تفضيلي fluorophores مع ثنائيات الاقطاب الاستيعاب في اتجاه الاستقطاب. وبالتالي، لpTIRFM أن تكون فعالة في رصد التغيرات الطوبوغرافية الغشاء، والتحقيق يجب أن يستخدم يقحم في الغشاء مع التوجه الثابتة. الأصباغ carbocyanine الفلورسنت (الجاذبة، لم) يقحم في طبقات ثنائية الدهون بطريقة المنحى مع ثنائيات الاقطاب الانتقال في الطائرة غشاء (الشكل 1B). الاستقطاب P الإضاءة (الشكل 1C) الأغشية هل المسمى يثير انتقائي-ساترة منحرف fluorophores (RED في أرقام 1B و 1D). ويتحقق وضع العلامات غشاء الخلايا أليفة الكروم مندفعا من أساسها بعدالحضانة مع ريف فعلت. 2A الشكل يظهر مثال على غشاء الخلية التي اتسخت أيضا. وهناك، خلية ملتصقة صحية تظهر اختلافات واضحة في P و S الانبعاثات. يظهر الصورة الانبعاثات P حدود الخلية أكثر إشراقا مع الاحترام لبقية الخلايا. يظهر الصورة S الانبعاثات مضان موحدة تقريبا في جميع أنحاء البصمة الخلية. تحسب بكسل إلى بكسل P / S و ف +2 S الصور حساسة للانحناء الغشاء وتركيز الصبغة، على التوالي. كما تم transfected الخلية أليفة الكروم تظهر مع Synaptotagmin-1 pHluorin (SYT-1) لتسمية حويصلات إفرازية (الشكل 2B). يتم تحفيز الخلايا أليفة الكروم مع 56 ملي بوكل ليزيل الاستقطاب في غشاء الخلية وتؤدي إيماس. وهناك عدد من البقع الفلورسنت الزاهية SYT-1 pHluorin تصبح فجأة كما يتضح DCVs الصمامات (الشكل 2B، اللوحة اليمنى). يتم رسم مربع أبيض حول الانصهار حدث واحد (الشكل 2B، اللوحة اليمنى). هذا أنا الحدث الانصهارق تحليلها في أرقام 2C و 2D. ويبين الشكل 2C الإطار حسب الإطار التغييرات في SYT-1-pHluorin، P / S، P و+2 شدة S الصورة. كثافة مضان من SYT-1 تتناقص بسرعة كما ينشر البروتين بعيدا عن موقع الانصهار (الشكل 2D). المسافة البادئة تمثل مجمع غشاء الحويصلة / البلازما تنصهر يقلل بمعدل أبطأ نسبيا (لاحظ الرسوم البيانية في الشكل 2D). التوضيح (الشكل 2E) يصور تفسير واحد من هذه القياسات. التشوهات غشاء السريع والمترجمة هو مبين في الشكل 2 هي نتيجة لأثار-التحفيز كا 2 + تدفق. ويظهر هذا في الشكل 3A. وtransfected خلية أليف للكروم مع الوراثية كا 2 + المؤشر GCaMP5G 21،22 وحفز مع 56 ملي بوكل. يسبب غشاء الاستقطاب زيادة كبيرة في GCaMP5G مضان ( <stro<html> نانوغرام&gt; أرقام 3A 3B و) مما يدل على زيادة في subplasmalemmal كا 2 + المستويات. يتم اختيار المنطقة بكسل 30 × 20 خلية ويتم عرض الإطار حسب الإطار التغييرات في GCaMP5G، P / S، P و+2 شدة S بكسل في الصور (الشكل 3B) والرسوم البيانية (الشكل 3C). الوقت &quot;0&quot; يعين الإطار قبل التغيير P / S هو واضح (أي الإطار قبل إيماس). وتشير السهام البيضاء التي تشوه الغشاء (زيادة في P / S) يرافقه انخفاض في الانبعاثات S P +2. يتم استبعاد البروتين GCaMP5G عصاري خلوي من منطقة من قبل DCV تنصهر. نلاحظ أيضا انخفاض مفاجئ في كثافة GCaMP5G في الوقت 0 في الشكل 3C، اللوحة اليسرى. زيادة طويلة الأمد في P / S وانخفاض P +2 S تشير المسام الانصهار أن يتوسع ببطء (الشكل 3D). / files/ftp_upload/51334/51334fig1.jpg &quot;/&gt; الشكل 1. الرسوم التوضيحية لتقنية pTIRFM. A) ويرد التخطيطي للجمع بين التقليدية مع القائم على الاستقطاب التصوير TIRF. يتم وضع ربع موجة (كو) لوحة أمام الياقوت الليزر 561 نانومتر إلى استقطاب إيجازا شعاع الليزر. ويستخدم المكعب الاستقطاب (PC1) لفصل الاستقطابات في خطي العمودي (ت) والأفقي (ح) المكونات. مكونات الرأسي والأفقي تصبح ف ق بول وبول الحزم الإثارة، على التوالي، على السطح النقل البري الدولي. وأغلقت مستقل مسارات ف ق بول وبول (S1 و S2). ومعاد أنهم مع المرايا ومكعب الاستقطاب الثاني (PC2). انضمامهم شعاع 488 نانومتر (كما أغلقت بشكل مستقل، S3) عن طريق توجيه شعاع عنصر يتكون من مرآة ومرآة مزدوج اللون nonpolarizing (DC). وتستخدم العدسات (L) لتوسيع وتركيز الحزم. يتم توجيه مجتمعة 488 نانومتر و 561 نانومتر الحزم إلى جانب منفذ إضاءة المجهر عبر GALVANOمتر المرايا (GM). أنها تركز على المستوى البؤري الخلفي (حزب الحرية) من الهدف. يتم تنفيذ يتم التقاط الفوتونات المنبعثة من fluorophores على الكاميرا EMCCD صله بجهاز كمبيوتر. B) هل وضع العلامات التي يحتضنها لفترة وجيزة مع خلايا الصبغة وغسل مرارا وتكرارا لإزالة الزائدة. لم intercalates في الغشاء مع لحظات ثنائي القطب انتقالها تقريبا في الطائرة الغشاء. C) والضوء الساقط الاستقطاب في الطائرة من الإصابة (ف بول) يخلق مجال زائل التي هي في الغالب طبيعية الاستقطاب إلى الواجهة، كما هو مبين. D) سوف يضيء غشاء هل المسمى مع الاستقطاب ع ضوء تثير انتقائي تلك fluorophores التي هي ساترة-منحرف (RED). إذا كان هذا حقل زائل الاستقطاب ثانية، تلك fluorophores التي هي موازية لساترة سيتم متحمس بدلا من ذلك (BLACK). <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/51334/51334fig2.jpg" /> الشكل 2. </s<html> ترونج&gt; خلية رصد التشوهات الغشاء مع pTIRFM. أ) ترد الخام P و S الانبعاثات الصور جنبا إلى جنب مع حساب P / S و ف +2 صور S الانبعاثات. شريط النطاق، 3.2 ميكرون. ب) يتم استقطابها خلية أليف للكروم معربا عن SYT-1 pHluorin مع بوكل. وهناك عدد من البقع الفلورسنت الزاهية (اللوحة اليمنى) تشير إلى انصهار DCVs الفردية. شريط النطاق، 3.2 ميكرون. C) الإطار حسب الإطار الصور من الصمامات SYT-1 pHluorin DCV. مرات (فوق الصور) هي في ثوان. الوقت 0 يعين الإطار قبل التحام DCV. وتبين ايضا المقابلة P / S و ف +2 صور الانبعاثات S. . شريط النطاق هو 1 ميكرون D) الرسوم البيانية للصور في خط منقط هو C. في الوقت 0 - يظهر الإطار الانصهار E) أحد التفسيرات المحتملة لنتائج في C و D.<html> بياض &quot;&gt; الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الرقم 3" src="/files/ftp_upload/51334/51334fig3.jpg" /> الرقم 3. التشويهات هي نتيجة لأثار-التحفيز كا 2 + تدفق. أ) يتم استقطابها خلية أليف للكروم transfected مع GCaMP5G مع 56 ملي بوكل. الزيادة الناتجة في GCaMP5G مضان يعني زيادة في subplasmalemmal كا 2 + المستويات. ب) الإطار حسب الإطار الصور 30 × 20 بكسل المنطقة من الخلايا في A. تايمز أعلاه هي الصور في ثوان. السهام البيضاء تدل على وجود منطقة P / S الزيادة والنقصان S P +2. يتم استبعاد البروتين عصاري خلوي GCaMP5G من المنطقة بحلول DCV الصمامات. شريط النطاق، 1 ميكرون. C) الرسوم البيانية للصور هو مبين في B. D) يظهر أحد التفسيرات المحتملة لنتائج في B و C.3highres.jpg &quot;الهدف =&quot; _blank &quot;&gt; الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> iXon3 EMMCD كاميرا </td><td> أندور </td><td> 897 </td><td></td></tr><tr><td> IX81 مجهر مقلوب </td><td> اوليمبوس </td><td></td><td> الجمعية Filtercube الجانب محمولة </td></tr><tr><td> ليزر 43 سلسلة سورة ايون </td><td> السيدا ميلز Griot البصريات الليزر </td><td> 543-AP-A01 </td><td> الانضباطي إلى 488 نانومتر </td></tr><tr><td> الياقوت 561 ليرة لبنانية ليزر ديود </td><td> متماسك </td><td></td><td> 561 نانومتر </td></tr><tr><td> مسح Galvo نظام مرآة </td><td> Thorlabs </td><td> GVS102 </td><td></td></tr><tr><td> VC 3 قناة اتصال نظام الإرواء </td><td> ALA الأدوات العلمية </td><td> ALA VC3X4PP </td><td></td></tr><tr><td> QMM كوارتز MicroManifold </td><td> ALA الأدوات العلمية </td><td> ALA QMM-4 </td> &lt;الدفتيريا&gt; </td></tr><tr><td> 10 رطل منظم الضغط </td><td> ALA الأدوات العلمية </td><td> ALA PR10 </td><td></td></tr><tr><td> مناور </td><td> بيرلي </td><td> TS 5000-150 </td><td></td></tr><tr><td> شنت لا لونية ربع الموجة بلايت </td><td> Thorlabs </td><td> AQWP05M-600 </td><td></td></tr><tr><td> 420-680 نانومتر مكعب الإستقطاب Beamsplitter </td><td> Thorlabs </td><td> PBS201 </td><td></td></tr><tr><td> ستة محطة الكثافة المحايدة مدخل ل </td><td> Thorlabs </td><td> FW1AND </td><td></td></tr><tr><td> السائر بالمواتير SmartShutter </td><td> أدوات سوتر </td><td> IQ25-1219 </td><td></td></tr><tr><td> HQ412lp مزدوج اللون تصفية </td><td> صفاء </td><td> NC255583 </td><td> ينضم 488 نانومتر و 561 نانومتر الحزم </td></tr><tr><td> المغلفة بلانو عدسة مقعرة </td><td> ادموند البصريات </td><td> PCV 100MM VIS 0 </td><td> يحيد 488 نانومتر شعاع </td></tr> &lt;آر&gt; <td> المغلفة بلانو عدسة مقعرة </td><td> ادموند البصريات </td><td> PCV 250MM VIS 0 </td><td> يحيد 561 نانومتر شعاع </td></tr><tr><td> المغلفة بلانو عدسة محدبة </td><td> ادموند البصريات </td><td> PCX قذائف 125mm VIS 0 </td><td> ويركز كل من الحزم </td></tr><tr><td> المغلفة بلانو عدسة محدبة </td><td> ادموند البصريات </td><td> PCX 50MM VIS 0 </td><td> عزز لتصفية التجمع مكعب </td></tr><tr><td> z488/561rpc مزدوج اللون </td><td> صفاء </td><td> z488/561rpc </td><td> Filtercube مزدوج اللون </td></tr><tr><td> z488/561_TIRF الانبعاثات تصفية </td><td> صفاء </td><td> z488/561m_TIRF </td><td> الانبعاثات Filtercube </td></tr><tr><td> UIS2 60X الهدف </td><td> اوليمبوس </td><td> UPLSAPO 60XO </td><td> NA 1.37 </td></tr><tr><td> النيون نظام ترنسفكأيشن </td><td> إينفيتروجن </td><td> MPK 5000 </td><td></td></tr><tr><td> MetaMorph برامج التصوير </td><td> الأجهزة الجزيئية </td><td></td><td></الدفتيريا&gt; </tr><tr><td> الجاذبة غشاء صبغ </td><td> إينفيتروجن </td><td> V-22885 </td><td> لمحاذاة أغراض </td></tr><tr><td> TH Liberase </td><td> روش </td><td> 5401135001 </td><td></td></tr><tr><td> TL Liberse </td><td> روش </td><td> 5401020001 </td><td></td></tr><tr><td> الدناز أنا النوع الرابع من الأبقار </td><td> سيغما </td><td> D5025 </td><td></td></tr><tr><td> عدادة الكريات </td><td> الصياد </td><td> 0267110 </td><td></td></tr><tr><td> هل غشاء صبغ </td><td> إينفيتروجن </td><td> D-7757 </td><td></td></tr><tr><td> رودامين </td><td> إينفيتروجن </td><td> R634 </td><td></td></tr><tr><td> 0.22 ميكرون وحدة تصفية غشاء الحقنة </td><td> ميليبور </td><td> SLGS033SS </td><td></td></tr><tr><td> Fluoresbrite متعدد الألوان الحمراء المجهرية </td><td> Polysciences </td><td> 19507 </td><td> 0.5 ميكرومتر </td></tr><tr><td> النفط الغمر </td&gt; <td> سيغما </td><td> 56822 </td><td></td></tr><tr><td> ابفيف </td><td> الصكوك الوطنية </td><td></td><td> ضوابط galvo المرايا </td></tr><tr><td> الدوار قارورة </td><td> Bellco </td><td> 1965-00250 </td><td></td></tr></tbody></table> الجدول 1. المعدات pTIRF المجهر. <table style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> محتويات </td><td> الإعدادية-PSS </td><td> القاعدية PSS </td><td> STIM-PSS </td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم </td><td> 145 ملي </td><td> 145 ملي </td><td> 95 ملي </td></tr><tr><td> بوكل </td><td> 5.6 ملي </td><td> 5.6 ملي </td><td> 56 ملي </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> - </td><td> 0.5 ملي </td><td> 0.5 ملي </td></tr><tr><td> و CaCl 2 </td><td> - </td><td> 2.2 ملي </td><td> 5 ملي </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 15 ملي </td><td> 15 ملي </td><td> 15 ملي </td></tr><tr><td> درجة الحموضة </td><td> 7.4 </td><td> 7.4 </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td> جلوكوز </td><td> 2.8 ملي </td><td> 5.6 ملي </td><td> 5.6 ملي </td></tr><tr><td> القلم بكتيريا </td><td> 1X </td><td> - </td><td> - </td></tr></tbody></table> الجدول 2. الإرواء والحلول الإعدادية الخلايا أليفة الكروم. <table style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> محتويات </td><td> Electroporating وسائل الإعلام </td><td> طبيعي تصفيح وسائل الإعلام </td><td> 2X المضادات الحيوية وسائل الإعلام </td></tr><tr><td> 1X DMEM/F-12 </td><td> 1 مل / لوحة </td><td> 2 مل / لوحة </td><td> 1 مل / لوحة </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10٪ </td><td> 10٪ </td><td> 10٪ </td></tr><tr><td> السيتوزين Arabinofuranoside (CAF) </td><td> - </td><td> 1 ميكرولتر / مل من 10 ملي الأسهم </td><td> - </td></tr><tr><td> بنسلين </td><td> - </td><td> 100 وحدة / مل </td&gt; <td> 200 وحدة / مل </td></tr><tr><td> الستربتومايسين عقار طبي </td><td> - </td><td> 100 ميكروغرام / مل </td><td> 200 ميكروغرام / مل </td></tr><tr><td> الجنتاميسين </td><td> - </td><td> 25 ميكروغرام / مل </td><td> 50 ميكروغرام / مل </td></tr></tbody></table> الجدول 3. أليف للكروم وسائل الإعلام خلية. <table style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> محتويات </td><td> TH-PSS </td><td> TL-PSS </td></tr><tr><td> Liberase TH </td><td> 2 مل </td><td> - </td></tr><tr><td> Liberase TL </td><td> - </td><td> 0.85 مل </td></tr><tr><td> الإعدادية-PSS </td><td> 98.0 مل </td><td> 84.0 مل </td></tr><tr><td> الدناز </td><td> 8.75 ملغ </td><td> 7.4 ملغ </td></tr></tbody></table> الجدول 4. TH-PSS وTL-PSS حلول.

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM at JoVE.com

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

القائم على الاستقطاب الانعكاس الداخلي الكامل الإسفار الميكروسكوب (pTIRFM) يتيح الكشف في الوقت الحقيقي من ديناميات غشاء الخلية. توضح هذه المقالة تنفيذ pTIRFM لدراسة إعادة غشاء إيماس خلال التنظيم. والتقنية هي تعميم لعمليات أخرى في بيولوجيا الخلية التي تنطوي بصورة مباشرة أو غير مباشرة التغيرات في شكل الغشاء.

التصوير البلازما غشاء التشويهات مع pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

imaging-plasma-membrane-deformations-with-ptirfm

Research

JoVE Journal

Biology

13.4K Views.  Wayne State University.  القائم على الاستقطاب الانعكاس الداخلي الكامل الإسفار الميكروسكوب (pTIRFM) يتيح الكشف في الوقت الحقيقي من ديناميات غشاء الخلية. توضح هذه المقالة تنفيذ pTIRFM لدراسة إعادة غشاء إيماس خلال التنظيم. والتقنية هي تعميم لعمليات أخرى في بيولوجيا الخلي?...

Video: Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, increasing evidence suggests that astrocytes may also actively participate in brain function through functional interactions with neurons.  However, many fundamental aspects of astrocyte biology remain controversial, unclear and/or experimentally unexplored. One important issue is the dynamics of intracellular calcium transients in astrocytes. This is relevant because calcium is well established as an important second messenger and because it has been proposed that astrocyte calcium elevations can trigger the release of transmitters from astrocytes. However, there has not been any detailed or satisfying description of near plasma membrane calcium signaling in astrocytes. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful tool to analyze physiologically relevant signaling events within about 100 nm of the plasma membrane of live cells. Here, we use TIRF microscopy and describe how to monitor near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics almost simultaneously. The further refinement and systematic application of this approach has the potential to inform about the precise details of astrocyte calcium signaling. A detailed understanding of astrocyte calcium dynamics may provide a basis to understand if, how, when and why astrocytes and neurons undergo calcium-dependent functional interactions.

We describe how to measure near membrane and global intracellular calcium dynamics in cultured astrocytes using total internal reflection and epifluorescence microscopy.

قياس الأدنى غشاء البلازما والعالمية حيوية الكالسيوم بين الخلايا في الخلايا النجمية

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins is responsible for a variety of key cellular events, including nutrient delivery, cellular excitability, and chemical signaling.  Many plasma membrane proteins are dynamically regulated by endocytic trafficking, which modulates protein function by altering protein surface expression.  The mechanisms that facilitate protein endocytosis are complex and are not fully understood for many membrane proteins.  In order to fully understand the mechanisms that control the endocytic trafficking of a given protein, it is critical that the protein s endocytic rate be precisely measured.  For many receptors, direct endocytic rate measurements are frequently achieved utilizing labeled receptor ligands.  However, for many classes of membrane proteins, such as transporters, pumps and ion channels, there is no convenient ligand that can be used to measure the endocytic rate.  In the present report, we describe a reversible biotinylation method that we employ to measure the dopamine transporter (DAT) endocytic rate.  This method provides a straightforward approach to measuring internalization rates, and can be easily employed for trafficking studies of most membrane proteins.

Regulated endocytosis governs the cell surface expression levels of the majority of membrane proteins. Here we utilize reducible, membrane impermeant biotinylation reagents to measure the endocytic rate of the dopamine transporter (DAT), a polytopic membrane protein. The method facilitates a straightforward approach to measuring the endocytic rate of most plasma membrane proteins.

قياس معدلات بلازما بروتين الغشاء التقامي بواسطة Biotinylation عكسية

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

قياس الكمي GLUT4 إزفاء إلى غشاء البلازما التي التدفق الخلوي

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

الكمي من البروتينات عن طريق التخصيب الببتيد Immunoaffinity اقترن الطيف الكتلي

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at characterizing the complex organization and dynamics of the plasma membrane at single-molecule level, by developing analytic tools dedicated to Single-Particle Tracking (SPT) at high density: Multiple-Target Tracing (MTT)1. Single-molecule videomicroscopy, offering millisecond and nanometric resolution1-11, allows a detailed representation of membrane organization12-14 by accurately mapping descriptors such as cell receptors localization, mobility, confinement or interactions.
We revisited SPT, both experimentally and algorithmically. Experimental aspects included optimizing setup and cell labeling, with a particular emphasis on reaching the highest possible labeling density, in order to provide a dynamic snapshot of molecular dynamics as it occurs within the membrane. Algorithmic issues concerned each step used for rebuilding trajectories: peaks detection, estimation and reconnection, addressed by specific tools from image analysis15,16. Implementing deflation after detection allows rescuing peaks initially hidden by neighboring, stronger peaks. Of note, improving detection directly impacts reconnection, by reducing gaps within trajectories. Performances have been evaluated using Monte-Carlo simulations for various labeling density and noise values, which typically represent the two major limitations for parallel measurements at high spatiotemporal resolution.
The nanometric accuracy17 obtained for single molecules, using either successive on/off photoswitching or non-linear optics, can deliver exhaustive observations. This is the basis of nanoscopy methods17 such as STORM18, PALM19,20, RESOLFT21 or STED22,23, which may often require imaging fixed samples. The central task is the detection and estimation of diffraction-limited peaks emanating from single-molecules. Hence, providing adequate assumptions such as handling a constant positional accuracy instead of Brownian motion, MTT is straightforwardly suited for nanoscopic analyses. Furthermore, MTT can fundamentally be used at any scale: not only for molecules, but also for cells or animals, for instance. Hence, MTT is a powerful tracking algorithm that finds applications at molecular and cellular scales.

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Multiple-Target Tracing is a homemade algorithm developed for tracking individually labeled molecules within the plasma membrane of living cells. Efficiently detecting, estimating and tracing molecules over time at high-density provide a user-friendly, comprehensive tool to investigate nanoscale membrane dynamics.

رسم خرائط الانتشار الجزيئي في غشاء البلازما من قبل متعددة الهدف، للبحث عن المفقودين (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs. Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and specific carrier of vitamin A in the blood. Here we describe an optimized technique to produce and purify holo-RBP and two real-time monitoring techniques to study the transport of vitamin A by the high-affinity RBP receptor STRA6. The first technique makes it possible to produce a large quantity of high quality holo-RBP (100%-loaded with retinol) for vitamin A transport assays. High quality RBP is essential for functional assays because misfolded RBP releases vitamin A readily and bacterial contamination in RBP preparation can cause artifacts. Real-time monitoring techniques like electrophysiology have made critical contributions to the studies of membrane transport. The RBP receptor-mediated retinol transport has not been analyzed in real time until recently. The second technique described here is the real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol release or loading. The third technique is real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol transport from holo-RBP to cellular retinol binding protein I (CRBP-I). These techniques provide high sensitivity and resolution in revealing RBP receptor's vitamin A uptake mechanism.

Here we describe an optimized technique to produce high-quality vitamin A/RBP complex and two real-time monitoring techniques to study vitamin A transport by STRA6, the RBP receptor.

في الوقت الحقيقي تحليلات النقل الريتينول بواسطة مستقبلات البروتين غشاء البلازما الريتينول ملزم

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

The Cell-based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. The cell based L-glutathione protection assays can be used to study endocytosis and recycling of protein receptors, channels, transporters, and adhesion molecules localized at the cell surface. The endocytic assay requires labeling of cell surface proteins with a cell membrane impermeable biotin containing a disulfide bond and the N-hydroxysuccinimide (NHS) ester at 4 &#186;C -&#160;a temperature at which membrane trafficking does not occur. Endocytosis of biotinylated plasma membrane proteins is induced by incubation at 37 &#186;C. Next, the temperature is decreased again to 4 &#186;C to stop endocytic trafficking and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins that have remained at the plasma membrane is reduced with L-glutathione. At this point, only proteins that were endocytosed remain protected from L-glutathione and thus remain biotinylated. After cell lysis, biotinylated proteins are isolated with streptavidin agarose, eluted from agarose, and the biotinylated protein of interest is detected by western blotting. During the recycling assay, after biotinylation cells are incubated at 37 &#176;C to load endocytic vesicles with biotinylated proteins and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins remaining at the plasma membrane is reduced with L-glutathione at 4 &#186;C as in the endocytic assay. Next, cells are incubated again at 37 &#176;C to allow biotinylated proteins from endocytic vesicles to recycle to the plasma membrane. Cells are then incubated at 4 &#186;C, and the disulfide bond in biotin attached to proteins that recycled to the plasma membranes is reduced with L-glutathione. The biotinylated proteins protected from L-glutathione are those that did not recycle to the plasma membrane.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. Methods described in this article are designed to study endocytosis and recycling of plasma membrane proteins.

في دراسة لالإلتقام وإعادة غشاء البلازما من البروتينات القائم على خلية L-الجلوتاثيون حماية فحوصات

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to dramatic leaps in our understanding of how cells function. The development and availability of super-resolution microscopy has considerably extended the limits of optical resolution from ~250-20 nm. Biologists are no longer limited to describing molecular interactions in terms of colocalization within a diffraction limited area, rather it is now possible to visualize the dynamic interactions of individual molecules. Here, we outline a protocol for the visualization and quantification of cellular proteins by ground-state depletion microscopy&#160;for fixed cell imaging. We provide examples from two different membrane proteins, an element of the endoplasmic reticulum translocon, sec61&#946;, and a plasma membrane-localized voltage-gated L-type Ca2+ channel (CaV1.2). Discussed are the specific microscope parameters, fixation methods, photo-switching buffer formulation, and pitfalls and challenges of image processing.

This article outlines a protocol for the detection of one or more plasma and/or intracellular membrane proteins using Ground State Depletion (GSD) super-resolution microscopy in mammalian cells. Here, we discuss the benefits and considerations of using such approaches for the visualization and quantification of cellular proteins.

الدولة الأرض استنفاد القرار فائقة التصوير في خلايا الثدييات

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein using the profiles of fluorescence intensity across the plasma membrane. Measured fluorescence profiles are fitted by a model for membrane and cytoplasm fluorescence distribution along a line applied perpendicularly to the cell periphery. This model is constructed from the fluorescence intensity values in reference cells expressing a fluorescently-tagged marker for cytoplasm and with FM 4-64-labeled plasma membrane. The method can be applied to various cell types and organisms; however, only plasma membranes of non-neighboring cells can be evaluated. This fast microscopy-based method is suitable for experiments, where subtle and dynamic changes of plasma membrane-associated markers are expected and need to be quantified, e.g., in the analysis of mutant versions of proteins, inhibitor treatments, and signal transduction observations. The method is implemented in a multi-platform R package that is coupled with an ImageJ macro that serves as a user-friendly interface.

Here, we present a protocol to perform a quantitative analysis of the level of plasma-membrane association for fluorescently-tagged peripherally-associated protein. The method is based on the computational decomposition of membrane and cytoplasmic component of signal observed in cells labeled with plasma membrane fluorescent marker.

تحديد التقسيم غشاء البلازما للبروتينات المرتبطة محيطيا

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

Characterization of MLKL-mediated Plasma Membrane Rupture in Necroptosis

Necroptosis is a programmed cell death pathway triggered by activation of receptor interacting protein kinase 3 (RIPK3), which phosphorylates and activates the mixed lineage kinase-like domain pseudokinase, MLKL, to rupture or permeabilize the plasma membrane. Necroptosis is an inflammatory pathway associated with multiple pathologies including autoimmunity, infectious and cardiovascular diseases, stroke, neurodegeneration, and cancer. Here, we describe protocols that can be used to characterize MLKL as the executioner of plasma membrane rupture in necroptosis. We visualize the process of necroptosis in cells using live-cell imaging with conventional and confocal fluorescence&#160;microscopy, and in fixed cells using electron microscopy, which together revealed the redistribution of MLKL from the cytosol to the plasma membrane prior to induction of large holes in the plasma membrane. We present in vitro nuclear magnetic resonance (NMR) analysis using lipids to identify putative modulators of MLKL-mediated necroptosis. Based on this method, we identified quantitative lipid-binding preferences and phosphatidyl-inositol phosphates (PIPs) as critical binders of MLKL that are required for plasma membrane targeting and permeabilization in necroptosis.

We report methods for characterization of MLKL-mediated plasma membrane rupture in necroptosis including conventional and confocal live-cell microscopy imaging, scanning electron microscopy, and NMR-based lipid binding.