The authors are deeply indebted to all the members of the scientific community working on pH and ion transport, who have originated and improved the measurements described here. They particularly thank Dr. Jacques Pouyss&#233;gur who originated the H+-killing selection technique used here. They acknowledge the University of Nice-Sophia Antipolis, the CNRS, the ANR (JCJC SVSE1 NHEint) and the ICST Labex for support.

1. H +キリングセレクション<ol><li>細胞株<ol><li>安定的にNHE欠損細胞をトランスフェクト（ 例えば 、CCL39由来PS120細胞株16）線維芽細胞株で効率的なトランスフェクション収率及び選択を生成する哺乳動物発現ベクターおよびトランスフェクション方法の任意の組み合わせを使用して。 注：長年、リン酸カルシウム沈殿19が良いトランスフェクション収率で使用された。これは、リポフェクタミン2000などの市販の試薬によって、より最近で置換された、トランスフェクションは、製造業者の説明書に従って行われる。 </li></ol></li><li>ソリューション<ol><li>以下のように説明する3つの滅菌溶液を準備します。ろ過（0.22μm）とすることで、これらのソリューションを滅菌する。 <ol><li> 50mMのNH 4 Clを、70 mMの塩化コリン、5mMの塩化カリウム、1mMのMgCl 2、2のCaCl 2、5mMのglのからなるNH 4 +のロード液（pH7.4）を調製ucoseとpH7.4の15mMのMOPS。 </li><li> 120 mMの塩化コリン、5のKCl、1mMのMgCl 2、2のCaCl 2、pH7.0の5 mMグルコースおよび15 mMのHEPESから成るすすぎ液（pH 7.0）を準備します。 </li><li> pH7.4の120mMのNaCl、5mMのKCl、1mMのMgCl 2、2のCaCl 2、5mMグルコースおよび15mMのHEPESからなる回収液（pH7.4）を調製。 </li></ol></li></ol></li><li>選択を開始する前に、外部タンクのない追加のCO 2と共に37℃で使用することができる細胞培養インキュベーターを得る（CO 2と呼ばれる- 「フリー」インキュベーター）、5％とCO 2を損なうことがバッファリングをもたらす酸性化。約2×10 8細胞（典型的には約20コンフルエント100mmのプレート）に関心までのNHEを発現する細胞株を増幅する。 </li><li> H +手続きを殺す： <ol><li> 3で、ローディング溶液中で1時間関心の細胞内NHEを発現する細胞をインキュベートCO 2を含まないインキュベーターで7°C。 </li><li>ローディング溶液を吸引した後、上記の-リンス溶液中で二度、それらをすすぐ。酸性化が生成されます急なNH 4 +勾配の作成 ​​を損なう残留細胞外NH 4 Cl のを排除するために効率的にこの手順を実行します。 </li><li>吸引によるすすぎ媒体を除去し、CO 2フリーのインキュベーター中で37℃で再び回復ソリューションで1時間細胞をインキュベート。 </li><li>定期的な培養液（7.5％FCSを含む一般的にDMEM）を使用してリカバリメディアを交換し、（5％CO 2、95％空気の加湿雰囲気中で37℃）、標準的な培養条件で細胞を増殖させる。 </li></ol></li><li>安定なクローンが出現するまで、週2回の選択のこのサイクルを繰り返します。 注：細胞培養​​および選択条件に関する特別な注意を払ってください。仕事の月数がoになりやすい任意の汚染によって台無しにすることができます文化と繰り返し、細胞操作の長い期間の後ccur。 <ol><li>ここでは、クローンを増幅し、個別にさらにセクション2-3で説明し、それらを特徴づける、または特性化の前に細胞集団を生成するために、それらを一緒にプールするかどうかを選択します。 </li></ol></li><li>カウンターを選択する親の酸感受性表現型（ 図1B）に復帰した可能性があるものをすることによって酸性化耐性細胞を保持するために臨時の選択（約2週間に1回）を適用します。 </li></ol> 2.細胞内pH測定 2.1）蛍光性pHイメージング<ol><li> 490 nmで励起したときのpH感受性であり、製造者のプロトコルに従って、445 nmの等吸収点を有しているレシオメトリックpH感受性蛍光色素BCECF / AMを使用します。 <ol><li>また、製造者のプロトコルに従って他のpH感受性プローブ​​を、使用しています。 </li></ol></li><li> CON設定された撮影に使用します高感度ビデオカメラに接続された倒立顕微鏡のsisting。 450nmの励起に適した石英中性密度フィルタと対に490nmの狭帯域干渉フィルタと、このセットを装備する。 <ol><li>可能であれば比も両方λ1および/またはλ2のために、どちらが飽和または低すぎる設定されている基底蛍光値を避けるため1に近づくように、λ1とλ2のセットアップ同等の蛍光値にフィルタや照明条件の適切なセットを使用します。これは、その後、細胞内pHが変化しているものの、比率は検出されていない重要なアーティファクトをもたらすことができる。 注：このシステムは、適切な発光波長（BCECFための535 nm）における急速な灌流、タイムラプス2上記の波長で励起し、取得を有効にする必要があります。ソフトウェアは自動データ収集と保存を可能にしてシステムを装備。 </li></ol></li></ol> NHEフォワード活動の2.2）測定（の押出サイトゾルからのプロトン） <ol><li> NH 4 +のロード溶液中で1時間のインキュベーションによって細胞を酸性CO 2の非存在下で（ステップ1.4参照）。 </li><li>最後の5分間溶液にBCECF-AM（5μM最終濃度）を追加した後、細胞外のプローブを除去するためにNH 4 +ローディング溶液でそれをすすいでください。 </li><li>顕微鏡で細胞をマウントし、安定したベースラインを記録するために複数の画像を取る。リンス液（上記参照）を灌流する。これは、酸性化に対応する蛍光の低下をもたらす。 </li><li> pHが安定した後、リチウム+ / H +のNa + / H +またはK + / H +交換によって媒介されるpH回復速度を測定するために、下記の溶液のいずれかを灌流。各溶液をH +交換のために試験される潜在的結合カチオンを含んでいる。それらの一つは、輸送される場合、これはcorrespます495 nmでの蛍光増加をもたらす二の細胞内のpHの昇給へ： pH7.4の120mMのLiClを、5mMのKClを、1mMのMgCl 2、2のCaCl 2、5mMグルコースおよび15mMのHEPES pH7.4で120mMのNaCl、5mMのKCl、1mMのMgCl 2、2のCaCl 2、5mMグルコースおよび15mMのHEPES pH7.4での125mMのKCl、1mMのMgCl 2、2のCaCl 2、5mMグルコースおよび15mMのHEPES </li></ol> NHEリバース活動の2.3）測定注：ここでの原則は、膜貫通イオン性勾配を反転させることである。 <ol><li>測定前に、興味のある細胞内カチオンで細胞をロードする（下記参照）。 </li><li> （ステップ2.2.2を参照）BCECF / AMで5分間それらをインキュベートする。それらをすすぎ、ビデオ顕微鏡にマウント。 </li><li>ローディング溶液を灌流し、安定なベースラインを記録するために複数の画像を撮る。 </li><li>ベースラインが安定した後、画像セルが120メートルを含む細胞外酸性媒体で灌流されたpH変化Mの塩化コリン、5mMのKClを、1mMのMgCl 2、2のCaCl 2、pH6.5の5 mMグルコースおよび15 mMのMES。 </li><li> LiClをローディングのため、pH7.4の120mMのLiClを、5のKCl、1mMのMgCl 2、2のCaCl 2、5mMグルコースと15mMのHEPESからなる溶液中で2時間細胞をインキュベート。原子吸光分光法によって測定された細胞内のリチウムは、約60mMの値が得られる。 </li><li>のNa +をロードするために、1mMのウアバインの存在下で、pH7.4の120mMのNaCl、5mMのKCl、1mMのMgCl 2、2のCaCl 2、5mMグルコースおよび15mMのHEPESからなる溶液中で2時間細胞をインキュベートのNa / K ATPアーゼをブロックする。これらの条件において、細胞内のNa +濃度は、40mMの範囲である。 注：細胞質ゾルK +濃度が140 mMの範囲にあり、外側に指向K +勾配を達成するのは容易であるようにK +ローディングが不要である。 </li></ol> 2.4）データの処理と校正： 注：このステップでは、順方向および逆方向の測定値の両方に適用されます。 <ol><li>各実験の最後に、140ミリモルのKCl、20mMのHEPESおよび6.5と7.4の間のpH値に調整し、5μMナイジェリシンの溶液で細胞を灌流する。 </li><li>テキスト形式の下での画像（強度レベルを表すグレーレベル）と輸出から蛍光測定などのデータを収集し、スプレッドシートプログラムを用いて以下に説明するように扱う。 </li><li>個々のセルまたは次の式を使用して、関心領域のための細胞内pH値を計算する。 でpH = pKaは+（ログ（R-Rminを）/（R 最大 -R））×F 分（λ2）/ F MAX（λ2） </li><li> Fの分（λ2）/ FのMA×（λ2）実験を通して450 nmの蛍光の減少、その結果、プローブの漂白や漏れがあった場合の比率を使用してください。しかし、これは非常にまれにDESで使用される条件で観察されないcribed実験。 </li><li>較正データは、各pH測定の終了時に存在するように、対応する計算値を較正のために使用されるpH値と異なるかどうかをチェックする。それが事実である場合、次の手順を使用してキャリブレーションへのすべての実験的に決定されたpH値を調整します。 <ol><li>以下の商（Q、キャリブレーション値の間で測定された値/差と差）を計算します。計算値は、対応するキャリブレーション値と等しくなるように加算または減算することによって最終的な調整を行いますQ.によって全データセットを掛けます。 </li></ol></li></ol>ファストLi +の取り込みによるNHE7の初期速度の3測定<ol><li>マルチウェルプレート上の種子細胞（6ウェル-24）および上記または20に記載の交互ナイジェリシン/ウシ血清アルブミン（BSA）酸性記載NH 4 +ローディング技法のいずれかを使用して酸性化する。 </li><li&gt;の所望の量のために、上述したリンス液を用いて急速に二回、プレートを洗浄した後、（若干のKm値以下）1〜10 mMのリチウムを含有する取り込み溶液中で細胞をインキュベートし、カチオンおよび/または関心のある阻害剤の所望の濃度時間の。 </li><li>トランスポートが初期速度条件で動作することを保証するために短いと一貫性の取り込み期間（通常は1分以下）を維持します。また、取り込みのために使用されるすべてのソリューションが等張であることを確認してください。 </li><li>取り込み時間の終わりに、慎重に取り込み培地を除去し、氷冷リン酸緩衝食塩水（PBS）で細胞を4回洗浄する。 （そのうち4が理想的であるために10秒未満）リチウム流出を防ぐために可能な限り速く、これらの洗浄を行う。 </li><li>溶解する25％の硝酸のセル。 25％の硝酸のウェル当たり250μlのを適用し、それがピペットチップの端部と各ウェルを廃棄し、新しいミシガン州全体の井戸サスペンションを転送した後、少なくとも1時間放置crocentrifugeチューブ。 </li><li>細胞破片を除去するために15000 XG（室温）で5分間、それらを遠心分離、1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブにライセートを転送します。 </li><li>原子吸光分光法21により上清のリチウム含有量を測定します。 注：異なる企業がリチウム中空陰極ランプを装備する必要は原子吸光分光計を提供する。これらのマシンは非常に正確なだけでなく、非常に繊細であるように、メーカーの指示に従ってください。 </li></ol>

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</ol>

The authors have nothing to disclose.

このプロトコルは、部位特異的突然変異誘発によって、その一次配列を変更することなく、原形質膜で細胞内のNa + / H +交換体を発現する細胞を選択する方法について説明します。これらの交換は今特徴付けることができる。 この方法は、原形質膜小胞でのNa + / H +交換体を発現する細胞株を選択するために、細胞内のプロトンの細胞毒性に基づいている。それは、Li +、K +、Cs等+として輸送することが疑われ得る他のカチオンを使用することが、原理的に、可能であろう。しかし、これは不確実性のレベルを高めることができます。選択は、任意の陽性クローンが得られない場合は、それを試験し、陽イオンが輸送されないかどうかを評価することは困難であるか、交換が原形質膜ではない。これらの理由から、選択は、これは、細胞外のsubstrそのまま結合カチオンとしてのNa +を使用して実行されている生理的条件下で最も高い豊富に見出さ食べた。これは、原形質膜（詩人とCounillon、未発表の結果）でNHE7 18と同様に、NHE6とNHE9を表現する変異体の選択につながった。 この形質膜発現は、これまで、原形質膜輸送体のみを使用することができる方法によって、トランスポーター機能パラメータの測定を可能にする。もちろん、膜環境におけるそのような変化は、小胞NHEsの機能的特徴に影響を与え得ることを排除することは不可能である。しかし、この戦略は、少なくとも3つの理由のために使用して価値があるかもしれません：（I）NHE6の細胞内発現、7および9は、任意の詳細な機能の測定を排除、（II）膜環境およびタンパク質もしくは脂質パートナーは、主に規制の微妙な影響を与えることが示されているその他NHEsとしない彼らの非常に基本的なこれらのトランスポーターの特徴（結合陽イオンに対する親和性、選択性、方向性、pHがメカニズムarmacologicalの機能）。だから、それらは水疱NHEsの膜発現によって変わらない可能性が非常に高いです。 （iii）の機能的メカニズムおよび原形質膜小胞で発現機構の薬理学的プロファイルを知ることは、原形質膜小胞の発現との間のそれらの可能性の不一致に対処するために、水疱性pH測定を行うことが可能である。 この技術の別の潜在的な制限は、ここで説明する戦略は、例えば、原形質膜NHE、またはH + ATPアーゼのようなトランスフェクトされた小胞のNa + / H +交換体（以外のH +押し出す機構を発現する細胞の選択につながる可能性があることである）。それは実験室で観察されなかったが、実際には、目的のNHEが実際に原形質膜で発現することを確認するために、サイレンシングに結合された古典的な細胞表面標識を用いることが重要であるとNa +又はLi +を媒介</s依存性プロトン流出&gt;まで（例Milosavljevic ら 18を参照のこと）。 これらのトランスポーターの活性を特徴づけるために、それぞれの細胞内pH変化、イオンフラックスに基づいて、2つのプロトコルが記載されている。第一の方法は、pH感受性蛍光プローブ及び適切な蛍光ビデオ顕微鏡システムの使用を必要とする。フィールドに多くのグループによって使用され、この方法は、その後24をビデオ顕微鏡、蛍光励起および収集を結合することにより個々のセルを測定するためにデジタル取得を使用して、第一のサスペンション23の信号形式のセルを測定するために蛍光光度を使用して、1980年代に開発された。後者の技術は今のためのカメラ、照明、およびコンピュータシステムの高性能に、非常に高速かつ簡単になっている。興味深いことに、企業では通常、蛍光プローブで非常に有益な技術のシートを一緒に提供する。これらのpHの変化は重要な情報を提供プロトン流出と相まって細胞外カチオンの性質を決定する。これに関して、アンモニウムプレインキュベーションの期間は慎重に測定のために使用される細胞に応じて調整されなければならないことに留意することが重要である。 CCL39由来線維芽細胞は、50 mMのNH 4 Clで非常によく1時間のロードをサポート。これはNHE完全な活性化を可能にし、測定（Vmaxの条件）のための強力な信号を生成する非常に強い酸性化になる。しかし、心筋細胞または原発性腎細胞のような他の細胞は、このような重要なアンモニウムロードをサポートしません。これは、異なるインキュベーション時間またはNH 4 Cl の濃度は、いくつかの予備試験を行う価値がある。 NH 4 Clでの感度のような差異の理由は明らかではない。これらは、アンモニウム輸送システム25,26の可能な発現に関連することができる。同様にローディング溶液をすすぐために使用されているナトリウムを含まない溶液は許容されない場合があり例えば心筋細胞などの細胞による。初期速度はあまり正確に決定されるが、それはアンモニウム負荷後の復旧ソリューションと直接灌流する必要がある。 また、細胞内pHの測定は、リバースモードを容易にキャリブレーションを以下のpH値で表すことができるBCECF蛍光レベルの減少によって検出される酸性化を生成するように、これらの交換器の可逆的な特性を調べるための簡単​​な方法を提供。実験は、pH変化を測定するように、これらの実験の制限は、対数スケールで動作し、細胞内の緩衝能力によって制限され、輸送活性の正確な定量化の欠如である。後者は、測定されたpH変動が緩衝能力収量​​イオンフラックスによって乗算され得る。しかしながら、この方法は、pH測定、緩衝能の測定、及びCalibraで上に（いくつかの実験的誤差を兼ね備える）、したがって、非常に定量的ではない。トランスポーターを発現し、したがって原形質膜の酵素定数にアクセスするために、急速なイオンフラックス技術は、はるかに簡単で正確である。 細胞内の内容は、ミリモルの範囲にあるので、細胞質ゾルナトリウムでNHE媒介性変化を検出することは不可能である。後いつまで、年間など取り込み技術は、22 Na +のような放射性同位体の使用に基づいていた。この原稿はまたNHEsによって使用され、この陽イオンは、細胞質ゾルから存在せず、原子吸光分析法21を用いて、高い精度で測定することができる。理論的根拠に基づいて、22のNa +がリチウムによって置換された非放射性の方法を記載線形取り込み量（ すなわち 、初期速度状態にある）を測定するための適切な条件（時間およびリチウム濃度）が決定されると、他の潜在的な結合カチオンのための親和性および/ ​​または図3及び図4に示すように、阻害剤は、正確に測定することができる。最後の潜在的な制限は、興味の交換が大幅この陽イオンを輸送する場合には、リチウム取り込み方法はもちろんだけ機能することができることである。それ以外の場合は、実験者は、上記の細胞内pH測定または放射性ナトリウム摂取を使用する必要がありますいずれかに依存する必要があります。 実験のこのようなセットは、主導近年、当初考えられていたNHE7細胞内のNa + / H +交換体は、エンドソーム酸性化機構はナトリウムに結合された小胞をアルカリ性になりH + / K +輸送体、実際にあったことを観察するようになった18。これまでのところ、この役割はVH + ATPアーゼに専念されると考えられていたので、これは細胞内コンパートメントの深い意味を持っている。 NHEファミリーの各メンバーは、非常に特定の運動署名oを表示するために表示されるその生理的役割に翼は、それがNHE6とNHE9の特性評価は、その生理的機能をハイライト表示します新規で予想外の特徴を明らかにし、この資料に記載された方法を用いて、という仮説を立てたくなる。

ほとんどの細胞内区画は、タンパク質またはホルモンの成熟、人身売買、リサイクル、神経伝達物質の負荷のために重要なパラメータである酸性の管腔のpHを、表示します。これは、サイトゾルおよび小胞の内容の間のpH勾配が小胞のClC塩化物トランスポーター2に結合され、液胞型H + -ATPアーゼ1によって生成されることが示されている。ノックアウト（KO）マウスとヒト患者の両方で、これらのトランスポーターの重要性は、その遺伝子3-6の突然変異によって引き起こさ重い表現型によって強調されています。 ナトリウム-水素交換体SLC9Aファミリーのメンバー、またのNa + / H +交換体のためNHEsと呼ばれるが、細胞内pHと細胞容積調節において、ならびに上皮を横切る酸-塩基当量のベクトル輸送における重要なエフェクターであることが示されている。原形質膜NHEs、3つの高度に保存されのNa + / H +交換体、NHE 6,7に加えおよび9はトランスゴルジ網および初期エンドソーム7で表されている。それらの遺伝子の変異は、アンジェルマン様またはクリスチャンソン症候群8-9、家族ベースの自閉症10及び注意欠陥多動性障害11-12でリンクされている。これらの交換器はまた、アルツハイマー病感受性13とX連鎖精神遅滞隣接遺伝子症候群14などの神経変性の問題に関わってきた。まとめると、これらの研究は、脳の発達および/または機能のこれらの細胞内NHEsの重要性を強調している。 これらの交換器の細胞内局在化は、それらのイオン選択性、搬送方向、速度論的パラメータ、及び規制の正確な測定を妨げる。細胞内区画において発現すべてのトランスポーターの場合のように、それらの生化学的活性を評価するために、したがって、完全にそれらの生理学的役割とmechanを理解することは極めて困難である彼らの病理学的な意味を根底にあるISMS。高い細胞質ゾルK +濃度に基づいて、最も一般的に受け入れられて仮説は、彼らがK +結合したプロトン排出トランスポーターとして働いていたということでした。それは定常状態の水疱性pHを維持するために、V-ATPアーゼによってプロトンポンプを相殺できるようなプロトンリークの存在が仮定されていた。この視覚資料の目的は、それらの形質膜にこのような小胞輸送体を発現する細胞株の遺伝的選択を可能にする、および（ii）これらのトランスポーターの機能を測定するために、二つの独立したアプローチを示すための方法を実証するためには、（i）である。 30年前、PouysségurとフランキはNHEファミリー15のメンバーの分子クローニングおよび特性を有効に遺伝的アプローチを開拓してきた。これは、スクリーニング法として、細胞内のプロトンの毒性に基づいていた。最初のステップは、欠損細胞株を得ることであった任意のNa + / H +交換において、このトランスポーターの可逆性を用いて、原形質膜で発現する。線維芽細胞は、（CCL39細胞株）のNa +またはLi +でプリロードし、次いで2時間、酸性細胞外培地（pH6.5）中に入れた。これは、機能のNa + / H +交換体を発現する細胞の死およびアンチポーター欠損細胞（PS120細胞系）16の選択につながった。重炭酸塩を含まない培地中で培養した場合、これらの細胞は、急性細胞内酸性化に非常に敏感である。そのような細胞は、急性細胞acidificationsに提出された場合、結果として、原形質膜における任意の機能プロトン流出メカニズムの発現が正に（17を参照）が選択される。このような酸性化技術は、売買欠陥が原形質膜でWT細胞NHEsの強制発現を可能とする細胞株を単離することができる。 真核生物のNa + / Hとして+交換器は、彼らがチャンネルを測定するために大きな成功を収めて使用されている電気生理学的ア ​​プローチによって測定可能ではないが、電気的に中性である。この原稿は、したがって、細胞内pH測定及びリチウム取り込みの迅速な動態によって、この交換器の活性を測定する方法を示します。基礎となる概念が同じであるように、選択部のために開発プロセスの多くは、機能の測定のために直接使用されることに注意することは興味深い。 興味深いことに、我々は、この原稿に記載されたアプローチを使用して選択された細胞株に存在するトラフィッキング欠陥は、水疱性カリウムチャンネルTWIK1 18のように、原形質膜における他の小胞のタンパク質のより大きな発現をもたらすことを観察した。これは、小胞の膜貫通型タンパク質のための一般的なリテンション不良メカニズムの選択に向かって指摘している。したがって、この選択手順と、それが05を生成する細胞細胞内コンパートメントの膜タンパク質に取り組んで科学的なコミュニティのための有望なツールを構成している。同様にここで紹介する測定技術は、他の非起電性トランスポーターを研究するための適用可能な場合があります。

<table><tbody><tr><td>Standard cell culture equipement</td><td></td><td></td><td>Used for H+ killing selection composed of many devices with different catalog numbers</td></tr><tr><td>Incubator with CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sanyo</td><td>MCO15A</td><td></td></tr><tr><td>Incubator without CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Heraeus instrument</td><td>BB6220</td><td></td></tr><tr><td>Laminar flow hood PSM1200NF</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>52010120</td><td></td></tr><tr><td>DMEM medium</td><td>sigma</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>FBS gold</td><td>GE Healthcare</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin/streptomycin</td><td>PAA</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 10x</td><td>PAA</td><td>L11-003</td><td></td></tr><tr><td>Atomic Absorption spectrometer with Zeeman furnace system</td><td>Thermo Scientific</td><td>ICE 3500 GFZ</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>sigma</td><td>L4408</td><td></td></tr><tr><td>Nitric Acid</td><td>sigma</td><td>438073</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence videomicroscopy set</td><td>Leica</td><td></td><td>Composed of many devices with different catalog numbers</td></tr><tr><td>Inverted automated microscope</td><td>Leica</td><td>DMI6000B</td><td></td></tr><tr><td>microscope stand</td><td>leica</td><td>11888906</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888911</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11505180</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888377</td><td></td></tr><tr><td>incident fluorescence</td><td>leica</td><td>11888901</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11504166</td><td></td></tr><tr><td>motor bracket</td><td>leica</td><td>11888379</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11505234</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521505</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11522106</td><td></td></tr><tr><td>LED transmission light&amp;nbsp;</td><td>leica</td><td>8097321</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>8102034</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521580</td><td></td></tr><tr><td>motorized plate</td><td>leica</td><td>11522068</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11531172</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521734</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521719</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888423</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888424</td><td></td></tr><tr><td>camera output</td><td>leica</td><td>11888373</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11507807</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888393</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888259</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888258</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11541510</td><td></td></tr><tr><td>images acquisition/analysis software</td><td>leica</td><td>11888375</td><td></td></tr><tr><td>optics</td><td>leica</td><td>11506507</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11506243</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11506203</td><td></td></tr><tr><td>fluorescence Xenon lamp</td><td>leica</td><td>DMI6000</td><td></td></tr><tr><td>camera</td><td>hamamatsu</td><td>8100601</td><td></td></tr><tr><td>metafluor/Mmfluor software</td><td></td><td>11640905</td><td></td></tr><tr><td>pH sensitive probe, BCECF-AM</td><td>life technologies</td><td>B1170</td><td></td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Sigma</td><td>N7143</td><td></td></tr></tbody></table>

functional characterization of na+/h+ exchangers of intracellular compartments using proton-killing selection to express them at the plasma membrane

エンドソームの酸性化は、タンパク質のリサイクルと劣化、受容体の脱感作、およびシナプス小胞における神経伝達物質の負荷などのプロセス、幅広いするために重要である。この酸性化のClC塩化物輸送体に結合されたプロトンATPアーゼによって媒介されることが記載されている。電気的中性のプロトン輸送体を高度に保存された、のNa + / H +交換体（NHE）6、7及び9は、これらのコンパートメントにおいて発現される。それらの遺伝子の変異は、人間の認知と神経変性疾患にリンクされています。それらの細胞内局在化は、詳細な機能解析を妨げているように逆説的に、彼らの役割は、とらえどころのないまま。この原稿は、この問題を解決する方法を示している。これは、原形質膜で細胞内NHEsを保持することにより急性のサイトゾル酸性化の生存可能な変異体細胞系の選択から成る。次に、イオン選択性および活性を測定するために二つの相補的なプロトコルを示している（i）1種の蛍光ビデオ顕微鏡を用いて細胞内pH測定値に基づいて、および（ii）1つのリチウムの取り込みの迅速な動態に基づくこ​​れらの交換器。そのようなプロトコルは、他の非起電性輸送を測定するために外挿することができる。さらに、ここで提示選択手順は、細胞内の保持不良表現型を有する細胞を生成する。従って、これらの細胞は、原形質膜における他の小胞の膜タンパク質を発現する。ここに示された実験戦略は、したがって、その後の選択のために使用される小胞のNa + / H +の交換とともに原形質膜で発現される他の細胞内タンパク質を研究するための潜在的に強力なツールを構成することができる。

選択： 図1Aに示すように、選択を殺すH +は 、アンモニウム弱塩基の拡散に基づいている。細胞内のpHに弱塩基および酸拡散の効果がウォルターホウ素及び共同研究者22によって開拓されました。ポジティブ遺伝子選択のための致命的な酸性化を生成するために、この現象を使用するには、エレガントなアイデアは、その後ジャック·Pouysségur17によって開発されました。このようなプロトコルの下では、細胞内のpHは約5.5リンス工程の後に低下します。原形質膜における機能的NHEを発現しない細胞は、中性のpH値を回復し、扁平状と粒状細胞質ゾル（ 図1B）を有する典型的な酸性化の側面を示すことができない。 （手順/週を殺す約2個のH +）を繰り返し選択サ ​​イクルの後、完全に安定して、この酸性化（ 図1C）を生き残る細胞は、約10 -7の頻度で出現する。これは、個別に、又は所望であれば、細胞集団を得るためにプールすることができる個々の細胞クローンの形成をもたらす。そのような細胞表面ビオチン化またはRNAサイレンシングのような標準的な実験は、原形質膜で発現されたタンパク質が実際NHE7細胞内NHEようなものであることを制御する（例えばMilosavljevic ら 18を参照）に実施することができる。同様に、RT-PCRおよびその後の配列は、選択された細胞系において発現細胞NHEsのシーケンスにおける最終的な変異を確認するために行われるべきである。 機能的特徴： 蛍光ビデオ顕微鏡： 原形質膜で発現する細胞内NHEsの活性およびイオン選択性は、様々な条件でこれらのNHEsによって誘導される細胞内pHの変化を測定することによって特徴付けることができる。このために、ビデオ顕微鏡のセットは、照明AN装備画像dを取得設定は、BCECF / AMなどのレシオメトリックプローブは、 図2Aに図式化されている。 図2B及び図2Cは、NH 4 +酸性化をロードする。 図2Dの次の直接的490及び450nmでの励起について得られた蛍光値の典型的な変動を示し2.4で説明したデータ処理）以下、これらの蛍光値から得られたpH曲線を示す。 リチウム取り込み： 共に水素ナトリウムで、リチウムは、周期表の最初の列の一部を構成し、Na + / H +交換体のための効率的な結合のカチオンで ​​あることが示されている。これは、詳細には Na + / H +交換体の機能的パラメータを測定するために、リチウム取り込みの設定速い反応速度は、この情報を利用することが可能である。この陽イオンとしては、CYT時にその蓄積、細胞の細胞質には存在しないosolic酸性化は定量的に細胞膜NHEの活性を反映します。また、リチウムのピコモル濃度ナノモルは、原子吸光分析を使用して高い精度で測定することができる。原形質膜小胞で発現交換器の選択と組み合わせた場合にこのように、このアプローチは非常に強力であり、図3は、プロトコルセクション3に記載の測定プロトコル）を示す図 。前述のように、好ましくは、マルチウェルプレート（6〜24）に播種した細胞は、酸性化されている。運動は、リチウムを含有する培地中で細胞のインキュベーションを開始し、関心のある他のカチオンまたは阻害（ 図3A）。 取り込みを停止するには、その後、細胞を氷冷PBSで4急速リ​​ンスに提出されている。有意なリチウム流出が（ 図3B）が発生しないことを保証しながら急速に操作すると、すべての細胞外のリチウムを除去します。各ウェル中のリチウム濃度は、その後で原子吸光分析（ 図3C）を用いて測定し、直接、定常状態での交換の活性をもたらすリチウム取り込みの初期速度は、リチウム蓄積の時間経過（ 図3D）の傾き測定値として得られる。 酵素反応速度については、初期速度の用量反応は、阻害剤のKi値の基質に対するKm値（ 図4A）を導出するために使用することができる。トランスポーターの興味深い特徴は、異なる結合カチオンが輸送のために競合するということです。これは、リチウムの取り込み（ 図4B）との競合によってナトリウムのためのKmを測定する可能性をもたらす。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52453/52453fig1.jpg" /> 図1：細胞の選択は、細胞内のNa + / H +を表現する&lt;/ それらの原形質膜に強い&gt; 交換器。（A）戦略は、3つのステップのためのHは、原形質膜における機能的変異した非および非タグ付き細胞内NHEを発現する細胞を死滅させる選択を+。酸負荷に提出PS120親細胞の（B）位相差顕微鏡画像。スケールバー：酸負荷後の血漿膜での小胞の交換の発現のために選択されたPS120細胞を、25μmの（C）の位相差顕微鏡画像。スケールバー：25μmで<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52453/52453fig1large.jpg" target="_blank">、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52453/52453fig2.jpg" /> 図2：細胞内pH測定 pHのビデオ顕微鏡測定の（A）の原理。 （B）E490 nmでの励起後BCECFのpHプローブの放出された蛍光（595 nm）の旋回運動。 L：酸負荷は、R。すすぎ、RE：回復、Cal6.5：6.5の細胞内pHでキャリブレーション、Cal7.0：で励起以下のBCECFのpHプローブの放出された蛍光（595 nm）のキャリブレーション7.0の細胞内pHで（C）進化450 nmの。 L：酸負荷は、R。すすぎ、RE：回復、Cal6.5：6.5の細胞内pHでキャリブレーション、Cal7.0：BCECF PHの450分の490 nmの蛍光比から計算細胞内pHの7.0（D）の細胞内のpHで校正進化プローブとキャリブレーションポイントから。 L：酸負荷は、R。すすぎ、RE：回復、Cal6.5：6.5の細胞内pHでキャリブレーション、Cal7.0：7.0の細胞内pHで校正<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52453/52453fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 図3：のLi +の取り込みの初期速度によって測定NHE活性（A - C）小胞NHE7交換用リチウムの取り込みの測定された時間経過の測定技術（D）は、実施例の別の重要なステップを示すスキームは、プラズマで発現膜。初期速度の測定を確保し、実験条件内での運動の直線性に注意してください。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52453/52453fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52453/52453fig4.jpg" /> 図4：NHE7のための典型的な用量応答曲線（18から元のデータ）。リチウム取り込みの初期速度は、1分間の速度を用いて測定した。 （A）は、細胞外リチウムの用量反応曲線。 1mMの細胞外のリチウム取り込みに対する細胞外ナトリウムの異なる濃度の（B）コンテスト。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52453/52453fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers.

ナの機能的特徴<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup細胞膜でそれらを表現するためにプロトン殺す選択を使用した細胞内区画の&gt;交換器

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and ...

functional-characterization-na-h-exchangers-intracellular

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

9.2K ビュー.  Université Nice-Sophia Antipolis, Laboratoire de Physiomédecine Moléculaire, CNRS UMR7370, and Laboratories of Excellence Ion Channel Science and Therapeutics. The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers. 

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Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also known as Band 3), the most abundant membrane protein in the red blood cells. The SLC4 family is homologous with borate transporters, which have been characterized in plants and fungi. It remains a significant technical challenge to express and purify membrane transport proteins to homogeneity in quantities suitable for&#160;structural or functional studies. Here we describe detailed procedures for the overexpression of borate transporters in Saccharomyces cerevisiae, isolation of yeast membranes, solubilization of protein by detergent, and purification of borate transporter homologs from S. cerevisiae, Arabidopsis thaliana, and Oryza sativa. We also detail a glutaraldehyde cross-linking experiment to assay multimerization of homomeric transporters. Our generalized procedures can be applied to all three proteins and have been optimized for efficacy. Many of the strategies developed here can be utilized for the study of other challenging membrane proteins.

Here we present a protocol to express, solubilize, and purify several eukaryotic borate transporters with homology to the SLC4 transporter family using yeast. We also describe a chemical cross-linking assay to assess the purified homomeric proteins for multimeric assembly. These protocols can be adapted for other challenging membrane proteins.

式、可溶化、および真核生物ホウ酸輸送体の浄化

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

生化学

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine exchangers in plants have not been identified. Here, we outline a method to characterize polyamine antiporters using membrane vesicles generated from the lysis of Escherichia coli cells heterologously expressing a plant antiporter. First, we heterologously expressed AtBAT1 in an E. coli strain deficient in polyamine and arginine exchange transporters. Vesicles were produced using a French press, purified by ultracentrifugation and utilized in a membrane filtration assay of labeled substrates to demonstrate the substrate specificity of the transporter. These assays demonstrated that AtBAT1 is a proton-mediated transporter of arginine, &#947;-aminobutyric acid (GABA), putrescine and spermidine. The mutant strain that was developed for the assay of AtBAT1 may be useful for the functional analysis of other families of plant and animal polyamine exchangers. We also hypothesize that this approach can be used to characterize many other types of antiporters, as long as these proteins can be expressed in the bacterial cell membrane. E. coli is a good system for the characterization of novel transporters, since there are multiple methods that can be employed to mutagenize native transporters.

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

We describe a method for the characterization of proton-driven membrane transporters in membrane vesicle preparations produced by heterologous expression in E. coli and lysis of cells using a French press.

大腸菌における異種発現による膜トランスポーターの特性評価と膜小胞の産生

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. This method combines expression of proteins tagged with the fluorescent non-canonical amino acid ANAP, and FRET between ANAP and fluorescent (trinitrophenyl) nucleotide derivatives. We present examples of nucleotide binding to ANAP-tagged KATP ion channels measured in unroofed plasma membranes and excised, inside-out membrane patches under voltage clamp. The latter allows for simultaneous measurements of ligand binding and channel current, a direct readout of protein function. Data treatment and analysis are discussed extensively, along with potential pitfalls and artefacts. This method provides rich mechanistic insights into the ligand-dependent gating of KATP channels and can readily be adapted to the study of other nucleotide-regulated proteins or any receptor for which a suitable fluorescent ligand can be identified.

This protocol presents a method for measuring adenine nucleotide binding to receptors in real time in a cellular environment. Binding is measured as F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) between trinitrophenyl nucleotide derivatives and protein labeled with a non-canonical, fluorescent amino acid.

インタクトな機能的な膜タンパク質へのヌクレオチド結合をリアルタイムで測定

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane (SSM)-Based Electrophysiology

Single domain antibodies (nanobodies) have been extensively used in mechanistic and structural studies of proteins and they pose an enormous potential as tools for developing clinical therapies, many of which depend on the inhibition of membrane proteins such as transporters. However, most of the methods used to determine the inhibition of transport activity are difficult to perform in high-throughput routines and depend on labeled substrates availability thereby complicating the screening of large nanobody libraries. Solid-supported membrane (SSM) electrophysiology is a high-throughput method, used for characterizing electrogenic transporters and measuring their transport kinetics and inhibition. Here we show the implementation of SSM-based electrophysiology to select inhibitory and non-inhibitory nanobodies targeting an electrogenic secondary transporter and to calculate nanobodies inhibitory constants. This technique may be especially useful for selecting inhibitory nanobodies targeting transporters for which labeled substrates are not available.

Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane SSM-Based Electrophysiology

Nanobodies are important tools in structural biology and pose a great potential for the development of therapies. However, the selection of nanobodies with inhibitory properties can be challenging. Here we demonstrate the use of solid-supported-membrane (SSM)-based electrophysiology for the classification of inhibitory and non-inhibitory nanobodies targeting electrogenic membrane transporters.

固体支持膜(SSM)ベースの電気生理学によるトランスポーター標的阻害ナノボディの選択

Single domain antibodies (nanobodies) have been extensively used in mechanistic and structural studies of proteins and they pose an enormous potential as ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

異種哺乳動物細胞で発現したイオンチャネルの変異導入と機能解析

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

生物学

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase is more difficult to investigate. Many transport assays utilize radioisotopes to achieve a sufficient signal-to-noise ratio, however, the necessary security measures impose severe restrictions regarding human exposure or assay design. Furthermore, ion transport across cell membranes is critically influenced by the membrane potential, which is not straightforwardly controlled in cell culture or in proteoliposome preparations. Here, we make use of the outstanding sensitivity of atomic absorption spectrophotometry (AAS) towards trace amounts of chemical elements to measure Rb+ or Li+ transport by Na+,K+- or gastric H+,K+-ATPase in single cells. Using Xenopus oocytes as expression system, we determine the amount of Rb+ (Li+) transported into the cells by measuring samples of single-oocyte homogenates in an AAS device equipped with a transversely heated graphite atomizer (THGA) furnace, which is loaded from an autosampler. Since the background of unspecific Rb+ uptake into control oocytes or during application of ATPase-specific inhibitors is very small, it is possible to implement complex kinetic assay schemes involving a large number of experimental conditions simultaneously, or to compare the transport capacity and kinetics of site-specifically mutated transporters with high precision. Furthermore, since cation uptake is determined on single cells, the flux experiments can be carried out in combination with two-electrode voltage-clamping (TEVC) to achieve accurate control of the membrane potential and current. This allowed e.g. to quantitatively determine the 3Na+/2K+ transport stoichiometry of the Na+,K+-ATPase and enabled for the first time to investigate the voltage dependence of cation transport by the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase. In principle, the assay is not limited to K+-transporting membrane proteins, but it may work equally well to address the activity of heavy or transition metal transporters, or uptake of chemical elements by endocytotic processes.

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

We describe a method to quantify the activity of K+-countertransporting P-type ATPases by heterologous expression of the enzymes in Xenopus oocytes and measuring Rb+ or Li+ uptake into individual cells by atomic absorption spectrophotometry. The method is a sensitive and safe alternative to radioisotope flux experiments facilitating complex kinetic studies.

のNa、KとH、K-ATPaseのインによって陽イオン輸送を測定する<em&gt;アフリカツメガエル</em原子吸光法による&gt;卵母：アイソトープアッセイの代替

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating ...

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined lipid composition. We are studying the lipid-dependent gating effects in a prototype voltage-gated potassium (Kv) channel, and have worked out detailed procedures to reconstitute the channels into different membrane systems. Our reconstitution procedures take consideration of both detergent-induced fusion of vesicles and the fusion of protein/detergent micelles with the lipid/detergent mixed micelles as well as the importance of reaching an equilibrium distribution of lipids among the protein/detergent/lipid and the detergent/lipid mixed micelles. Our data suggested that the insertion of the channels in the lipid vesicles is relatively random in orientations, and the reconstitution efficiency is so high that no detectable protein aggregates were seen in fractionation experiments. We have utilized the reconstituted channels to determine the conformational states of the channels in different lipids, record electrical activities of a small number of channels incorporated in planar lipid bilayers, screen for conformation-specific ligands from a phage-displayed peptide library, and support the growth of 2D crystals of the channels in membranes. The reconstitution procedures described here may be adapted for studying other membrane proteins in lipid bilayers, especially for the investigation of the lipid effects on the eukaryotic voltage-gated ion channels.

Procedures for complete reconstitution of a prototype voltage-gated potassium channel into lipid membranes are described. The reconstituted channels are suitable for biochemical assays, electrical recordings, ligand screening and electron crystallographic studies. These methods may have general applications to the structural and functional studies of other membrane proteins.

構造と機能研究のための脂質膜へのKvチャネルの再構築

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as from eukaryotes. This increase has been largely driven by the successful push to obtain structural information on membrane proteins. However, the ability to functionally interrogate these proteins has not advanced at the same rate and is often limited to qualitative assays of limited quantitative value, thereby limiting the mechanistic insights that they can provide. An assay to quantitatively investigate the transport activity of reconstituted Cl- channels or transporters is described. The assay is based on the measure of the efflux rate of Cl- from proteoliposomes following the addition of the K+ ionophore valinomycin to shunt the membrane potential. An ion sensitive electrode is used to follow the time-course of ion efflux from proteoliposomes reconstituted with the desired protein. The method is highly suited for mechanistic studies, as it allows for the quantitative determination of key properties of the reconstituted protein, such as its unitary transport rate, the fraction of active protein and the molecular mass of the functional unit. The assay can also be utilized to determine the effect of small molecule compounds that directly inhibit/activate the reconstituted protein, as well as to test the modulatory effects of the membrane composition or lipid-modifying reagents. Where possible, direct comparison between results obtained using this method were found to be in good agreement with those obtained using electrophysiological approaches. The technique is illustrated using CLC-ec1, a CLC-type H+/Cl- exchanger, as a model system. The efflux assay can be utilized to study any Cl- conducting channel/transporter and, with minimal changes, can be adapted to study any ion-transporting protein.

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

Proteoliposomes are used to study purified channels and transporters reconstituted in a well-defined biochemical environment. An experimental procedure to measure efflux mediated by these proteins is illustrated. The steps to prepare proteoliposomes, perform the recordings, and analyze data to quantitatively determine the functional properties of the reconstituted protein are described.

プロテオリポソー​​ムベースの流出アッセイのClの単一分子特性を決定する<sup&gt; -</sup&gt;チャネルとトランスポーター

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as ...

Membrane Transport Processes Analyzed by a Highly Parallel Nanopore Chip System at Single Protein Resolution

Membrane protein transport on the single protein level still evades detailed analysis, if the substrate translocated is non-electrogenic. Considerable efforts have been made in this field, but techniques enabling automated high-throughput transport analysis in combination with solvent-free lipid bilayer techniques required for the analysis of membrane transporters are rare. This class of transporters however is crucial in cell homeostasis and therefore a key target in drug development and methodologies to gain new insights desperately needed.
The here presented manuscript describes the establishment and handling of a novel biochip for the analysis of membrane protein mediated transport processes at single transporter resolution. The biochip is composed of microcavities enclosed by nanopores that is highly parallel in its design and can be produced in industrial grade and quantity. Protein-harboring liposomes can directly be applied to the chip surface forming self-assembled pore-spanning lipid bilayers using SSM-techniques (solid supported lipid membranes). Pore-spanning parts of the membrane are freestanding, providing the interface for substrate translocation into or out of the cavity space, which can be followed by multi-spectral fluorescent readout in real-time. The establishment of standard operating procedures (SOPs) allows the straightforward establishment of protein-harboring lipid bilayers on the chip surface of virtually every membrane protein that can be reconstituted functionally. The sole prerequisite is the establishment of a fluorescent read-out system for non-electrogenic transport substrates.
High-content screening applications are accomplishable by the use of automated inverted fluorescent microscopes recording multiple chips in parallel. Large data sets can be analyzed using the freely available custom-designed analysis software. Three-color multi spectral fluorescent read-out furthermore allows for unbiased data discrimination into different event classes, eliminating false positive results.
The chip technology is currently based on SiO2 surfaces, but further functionalization using gold-coated chip surfaces is also possible.

The presented protocol describes the analysis of membrane protein mediated transport on the single transporter level using pore-spanning solvent-free lipid bilayers. This is achieved by the creation of bulk produced nanopore array chips, combined with highly parallel data acquisition and analysis, enabling the future establishment of membrane protein effector screenings.

単一のタンパク質解像度で高並列ナノ細孔チップシステムにより分析膜輸送プロセス

Membrane protein transport on the single protein level still evades detailed analysis, if the substrate translocated is non-electrogenic. Considerable ...

Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. These transport mechanisms are mediated by the activities of specialized transporter proteins. Specifically,pH dynamics are finely controlled by plasma membrane proton (H+) extrusion systems, such as the Na+/H+ exchanger (NHE) protein family. Despite extensive efforts to study the mechanisms underlying NHE regulation, our current understanding of the biophysical and molecular properties of the NHE family is inadequate because of the limited availability of methods to effectively measure NHE activity. In this manuscript, we used H+-selective electrodes during whole-cell patch clamping recording to measure NHE-induced H+ flux. We proposed this approach to overcome some limitations of typically used methods to measure NHE activity, such as radioactive uptake and fluorescent membrane permeants. Measurement of NHE activity using the described method enables high sensitivity and time resolution and more efficient control of intracellular H+ concentrations. H+-selective electrodes are based on the fact that transporter activity creates an ion gradient in close proximity to the cell membrane. An H+-selective electrode moving up to and away from the cell membrane in a repetitive, oscillatory fashion records a voltage difference that is dependent on H+ flux. While H+-selective electrodes are used to detect H+ flux moving out of the cell, the patch clamp method in the whole-cell configuration is used to control the intracellular ion composition. Moreover, application of the giant patch clamp technique allows modification of the intracellular composition of not only ions but also lipids. The transporter activity of NHE isoform 3 (NHE3) was measured using this technical approach to study the molecular basis of NHE3 regulation by phosphoinositides.

This manuscript describes the applications of proton-selective electrodes and patch clamping methods to measure the activity of proton transport systems. These methods overcome some limitations of techniques commonly used to study proton transport activity, such as moderate sensitivity, time resolution and insufficient intracellular milieu control.

電気生理学測定の電気中立運送者の活動を研究への応用

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. ...

ナの機能的特徴

要約

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式、可溶化、および真核生物ホウ酸輸送体の浄化

大腸菌における異種発現による膜トランスポーターの特性評価と膜小胞の産生

インタクトな機能的な膜タンパク質へのヌクレオチド結合をリアルタイムで測定

固体支持膜(SSM)ベースの電気生理学によるトランスポーター標的阻害ナノボディの選択

異種哺乳動物細胞で発現したイオンチャネルの変異導入と機能解析

のNa、KとH、K-ATPaseのインによって陽イオン輸送を測定する

構造と機能研究のための脂質膜へのKvチャネルの再構築

プロテオリポソームベースの流出アッセイのClの単一分子特性を決定する

単一のタンパク質解像度で高並列ナノ細孔チップシステムにより分析膜輸送プロセス

電気生理学測定の電気中立運送者の活動を研究への応用

ナの機能的特徴

要約

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式、可溶化、および真核生物ホウ酸輸送体の浄化

大腸菌における異種発現による膜トランスポーターの特性評価と膜小胞の産生

インタクトな機能的な膜タンパク質へのヌクレオチド結合をリアルタイムで測定

固体支持膜(SSM)ベースの電気生理学によるトランスポーター標的阻害ナノボディの選択

異種哺乳動物細胞で発現したイオンチャネルの変異導入と機能解析

のNa、KとH、K-ATPaseのインによって陽イオン輸送を測定する

構造と機能研究のための脂質膜へのKvチャネルの再構築

プロテオリポソー​​ムベースの流出アッセイのClの単一分子特性を決定する

単一のタンパク質解像度で高並列ナノ細孔チップシステムにより分析膜輸送プロセス

電気生理学測定の電気中立運送者の活動を研究への応用

プロテオリポソームベースの流出アッセイのClの単一分子特性を決定する