The authors are deeply indebted to all the members of the scientific community working on pH and ion transport, who have originated and improved the measurements described here. They particularly thank Dr. Jacques Pouyss&#233;gur who originated the H+-killing selection technique used here. They acknowledge the University of Nice-Sophia Antipolis, the CNRS, the ANR (JCJC SVSE1 NHEint) and the ICST Labex for support.

1. H +キリングセレクション<ol><li>細胞株<ol><li>安定的にNHE欠損細胞をトランスフェクト（ 例えば 、CCL39由来PS120細胞株16）線維芽細胞株で効率的なトランスフェクション収率及び選択を生成する哺乳動物発現ベクターおよびトランスフェクション方法の任意の組み合わせを使用して。 注：長年、リン酸カルシウム沈殿19が良いトランスフェクション収率で使用された。これは、リポフェクタミン2000などの市販の試薬によって、より最近で置換された、トランスフェクションは、製造業者の説明書に従って行われる。 </li></ol></li><li>ソリューション<ol><li>以下のように説明する3つの滅菌溶液を準備します。ろ過（0.22μm）とすることで、これらのソリューションを滅菌する。 <ol><li> 50mMのNH 4 Clを、70 mMの塩化コリン、5mMの塩化カリウム、1mMのMgCl 2、2のCaCl 2、5mMのglのからなるNH 4 +のロード液（pH7.4）を調製ucoseとpH7.4の15mMのMOPS。 </li><li> 120 mMの塩化コリン、5のKCl、1mMのMgCl 2、2のCaCl 2、pH7.0の5 mMグルコースおよび15 mMのHEPESから成るすすぎ液（pH 7.0）を準備します。 </li><li> pH7.4の120mMのNaCl、5mMのKCl、1mMのMgCl 2、2のCaCl 2、5mMグルコースおよび15mMのHEPESからなる回収液（pH7.4）を調製。 </li></ol></li></ol></li><li>選択を開始する前に、外部タンクのない追加のCO 2と共に37℃で使用することができる細胞培養インキュベーターを得る（CO 2と呼ばれる- 「フリー」インキュベーター）、5％とCO 2を損なうことがバッファリングをもたらす酸性化。約2×10 8細胞（典型的には約20コンフルエント100mmのプレート）に関心までのNHEを発現する細胞株を増幅する。 </li><li> H +手続きを殺す： <ol><li> 3で、ローディング溶液中で1時間関心の細胞内NHEを発現する細胞をインキュベートCO 2を含まないインキュベーターで7°C。 </li><li>ローディング溶液を吸引した後、上記の-リンス溶液中で二度、それらをすすぐ。酸性化が生成されます急なNH 4 +勾配の作成 ​​を損なう残留細胞外NH 4 Cl のを排除するために効率的にこの手順を実行します。 </li><li>吸引によるすすぎ媒体を除去し、CO 2フリーのインキュベーター中で37℃で再び回復ソリューションで1時間細胞をインキュベート。 </li><li>定期的な培養液（7.5％FCSを含む一般的にDMEM）を使用してリカバリメディアを交換し、（5％CO 2、95％空気の加湿雰囲気中で37℃）、標準的な培養条件で細胞を増殖させる。 </li></ol></li><li>安定なクローンが出現するまで、週2回の選択のこのサイクルを繰り返します。 注：細胞培養​​および選択条件に関する特別な注意を払ってください。仕事の月数がoになりやすい任意の汚染によって台無しにすることができます文化と繰り返し、細胞操作の長い期間の後ccur。 <ol><li>ここでは、クローンを増幅し、個別にさらにセクション2-3で説明し、それらを特徴づける、または特性化の前に細胞集団を生成するために、それらを一緒にプールするかどうかを選択します。 </li></ol></li><li>カウンターを選択する親の酸感受性表現型（ 図1B）に復帰した可能性があるものをすることによって酸性化耐性細胞を保持するために臨時の選択（約2週間に1回）を適用します。 </li></ol> 2.細胞内pH測定 2.1）蛍光性pHイメージング<ol><li> 490 nmで励起したときのpH感受性であり、製造者のプロトコルに従って、445 nmの等吸収点を有しているレシオメトリックpH感受性蛍光色素BCECF / AMを使用します。 <ol><li>また、製造者のプロトコルに従って他のpH感受性プローブ​​を、使用しています。 </li></ol></li><li> CON設定された撮影に使用します高感度ビデオカメラに接続された倒立顕微鏡のsisting。 450nmの励起に適した石英中性密度フィルタと対に490nmの狭帯域干渉フィルタと、このセットを装備する。 <ol><li>可能であれば比も両方λ1および/またはλ2のために、どちらが飽和または低すぎる設定されている基底蛍光値を避けるため1に近づくように、λ1とλ2のセットアップ同等の蛍光値にフィルタや照明条件の適切なセットを使用します。これは、その後、細胞内pHが変化しているものの、比率は検出されていない重要なアーティファクトをもたらすことができる。 注：このシステムは、適切な発光波長（BCECFための535 nm）における急速な灌流、タイムラプス2上記の波長で励起し、取得を有効にする必要があります。ソフトウェアは自動データ収集と保存を可能にしてシステムを装備。 </li></ol></li></ol> NHEフォワード活動の2.2）測定（の押出サイトゾルからのプロトン） <ol><li> NH 4 +のロード溶液中で1時間のインキュベーションによって細胞を酸性CO 2の非存在下で（ステップ1.4参照）。 </li><li>最後の5分間溶液にBCECF-AM（5μM最終濃度）を追加した後、細胞外のプローブを除去するためにNH 4 +ローディング溶液でそれをすすいでください。 </li><li>顕微鏡で細胞をマウントし、安定したベースラインを記録するために複数の画像を取る。リンス液（上記参照）を灌流する。これは、酸性化に対応する蛍光の低下をもたらす。 </li><li> pHが安定した後、リチウム+ / H +のNa + / H +またはK + / H +交換によって媒介されるpH回復速度を測定するために、下記の溶液のいずれかを灌流。各溶液をH +交換のために試験される潜在的結合カチオンを含んでいる。それらの一つは、輸送される場合、これはcorrespます495 nmでの蛍光増加をもたらす二の細胞内のpHの昇給へ： pH7.4の120mMのLiClを、5mMのKClを、1mMのMgCl 2、2のCaCl 2、5mMグルコースおよび15mMのHEPES pH7.4で120mMのNaCl、5mMのKCl、1mMのMgCl 2、2のCaCl 2、5mMグルコースおよび15mMのHEPES pH7.4での125mMのKCl、1mMのMgCl 2、2のCaCl 2、5mMグルコースおよび15mMのHEPES </li></ol> NHEリバース活動の2.3）測定注：ここでの原則は、膜貫通イオン性勾配を反転させることである。 <ol><li>測定前に、興味のある細胞内カチオンで細胞をロードする（下記参照）。 </li><li> （ステップ2.2.2を参照）BCECF / AMで5分間それらをインキュベートする。それらをすすぎ、ビデオ顕微鏡にマウント。 </li><li>ローディング溶液を灌流し、安定なベースラインを記録するために複数の画像を撮る。 </li><li>ベースラインが安定した後、画像セルが120メートルを含む細胞外酸性媒体で灌流されたpH変化Mの塩化コリン、5mMのKClを、1mMのMgCl 2、2のCaCl 2、pH6.5の5 mMグルコースおよび15 mMのMES。 </li><li> LiClをローディングのため、pH7.4の120mMのLiClを、5のKCl、1mMのMgCl 2、2のCaCl 2、5mMグルコースと15mMのHEPESからなる溶液中で2時間細胞をインキュベート。原子吸光分光法によって測定された細胞内のリチウムは、約60mMの値が得られる。 </li><li>のNa +をロードするために、1mMのウアバインの存在下で、pH7.4の120mMのNaCl、5mMのKCl、1mMのMgCl 2、2のCaCl 2、5mMグルコースおよび15mMのHEPESからなる溶液中で2時間細胞をインキュベートのNa / K ATPアーゼをブロックする。これらの条件において、細胞内のNa +濃度は、40mMの範囲である。 注：細胞質ゾルK +濃度が140 mMの範囲にあり、外側に指向K +勾配を達成するのは容易であるようにK +ローディングが不要である。 </li></ol> 2.4）データの処理と校正： 注：このステップでは、順方向および逆方向の測定値の両方に適用されます。 <ol><li>各実験の最後に、140ミリモルのKCl、20mMのHEPESおよび6.5と7.4の間のpH値に調整し、5μMナイジェリシンの溶液で細胞を灌流する。 </li><li>テキスト形式の下での画像（強度レベルを表すグレーレベル）と輸出から蛍光測定などのデータを収集し、スプレッドシートプログラムを用いて以下に説明するように扱う。 </li><li>個々のセルまたは次の式を使用して、関心領域のための細胞内pH値を計算する。 でpH = pKaは+（ログ（R-Rminを）/（R 最大 -R））×F 分（λ2）/ F MAX（λ2） </li><li> Fの分（λ2）/ FのMA×（λ2）実験を通して450 nmの蛍光の減少、その結果、プローブの漂白や漏れがあった場合の比率を使用してください。しかし、これは非常にまれにDESで使用される条件で観察されないcribed実験。 </li><li>較正データは、各pH測定の終了時に存在するように、対応する計算値を較正のために使用されるpH値と異なるかどうかをチェックする。それが事実である場合、次の手順を使用してキャリブレーションへのすべての実験的に決定されたpH値を調整します。 <ol><li>以下の商（Q、キャリブレーション値の間で測定された値/差と差）を計算します。計算値は、対応するキャリブレーション値と等しくなるように加算または減算することによって最終的な調整を行いますQ.によって全データセットを掛けます。 </li></ol></li></ol>ファストLi +の取り込みによるNHE7の初期速度の3測定<ol><li>マルチウェルプレート上の種子細胞（6ウェル-24）および上記または20に記載の交互ナイジェリシン/ウシ血清アルブミン（BSA）酸性記載NH 4 +ローディング技法のいずれかを使用して酸性化する。 </li><li&gt;の所望の量のために、上述したリンス液を用いて急速に二回、プレートを洗浄した後、（若干のKm値以下）1〜10 mMのリチウムを含有する取り込み溶液中で細胞をインキュベートし、カチオンおよび/または関心のある阻害剤の所望の濃度時間の。 </li><li>トランスポートが初期速度条件で動作することを保証するために短いと一貫性の取り込み期間（通常は1分以下）を維持します。また、取り込みのために使用されるすべてのソリューションが等張であることを確認してください。 </li><li>取り込み時間の終わりに、慎重に取り込み培地を除去し、氷冷リン酸緩衝食塩水（PBS）で細胞を4回洗浄する。 （そのうち4が理想的であるために10秒未満）リチウム流出を防ぐために可能な限り速く、これらの洗浄を行う。 </li><li>溶解する25％の硝酸のセル。 25％の硝酸のウェル当たり250μlのを適用し、それがピペットチップの端部と各ウェルを廃棄し、新しいミシガン州全体の井戸サスペンションを転送した後、少なくとも1時間放置crocentrifugeチューブ。 </li><li>細胞破片を除去するために15000 XG（室温）で5分間、それらを遠心分離、1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブにライセートを転送します。 </li><li>原子吸光分光法21により上清のリチウム含有量を測定します。 注：異なる企業がリチウム中空陰極ランプを装備する必要は原子吸光分光計を提供する。これらのマシンは非常に正確なだけでなく、非常に繊細であるように、メーカーの指示に従ってください。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

このプロトコルは、部位特異的突然変異誘発によって、その一次配列を変更することなく、原形質膜で細胞内のNa + / H +交換体を発現する細胞を選択する方法について説明します。これらの交換は今特徴付けることができる。 この方法は、原形質膜小胞でのNa + / H +交換体を発現する細胞株を選択するために、細胞内のプロトンの細胞毒性?...

ほとんどの細胞内区画は、タンパク質またはホルモンの成熟、人身売買、リサイクル、神経伝達物質の負荷のために重要なパラメータである酸性の管腔のpHを、表示します。これは、サイトゾルおよび小胞の内容の間のpH勾配が小胞のClC塩化物トランスポーター2に結合され、液胞型H + -ATPアーゼ1によって生成されることが示されている。ノックアウト（KO）マウスとヒト患者の両方で、これらのトランスポーターの重要性は、その遺伝子3-6の突然変異によって引き起こさ重い表現型によって強調されています。 ナトリウム-水素交換体SLC9Aファミリーのメンバー、またのNa + / H +交換体のためNHEsと呼ばれるが、細胞内pHと細胞容積調節において、ならびに上皮を横切る酸-塩基当量のベクトル輸送における重要なエフェクターであることが示されている。原形質膜NHEs、3つの高度に保存されのNa + / H +交換体、NHE 6,7に加えおよび9はトランスゴルジ網および初期エンドソーム7で表されている。それらの遺伝子の変異は、アンジェルマン様またはクリスチャンソン症候群8-9、家族ベースの自閉症10及び注意欠陥多動性障害11-12でリンクされている。これらの交換器はまた、アルツハイマー病感受性13とX連鎖精神遅滞隣接遺伝子症候群14などの神経変性の問題に関わってきた。まとめると、これらの研究は、脳の発達および/または機能のこれらの細胞内NHEsの重要性を強調している。 これらの交換器の細胞内局在化は、それらのイオン選択性、搬送方向、速度論的パラメータ、及び規制の正確な測定を妨げる。細胞内区画において発現すべてのトランスポーターの場合のように、それらの生化学的活性を評価するために、したがって、完全にそれらの生理学的役割とmechanを理解することは極めて困難である彼らの病理学的な意味を根底にあるISMS。高い細胞質ゾルK +濃度に基づいて、最も一般的に受け入れられて仮説は、彼らがK +結合したプロトン排出トランスポーターとして働いていたということでした。それは定常状態の水疱性pHを維持するために、V-ATPアーゼによってプロトンポンプを相殺できるようなプロトンリークの存在が仮定されていた。この視覚資料の目的は、それらの形質膜にこのような小胞輸送体を発現する細胞株の遺伝的選択を可能にする、および（ii）これらのトランスポーターの機能を測定するために、二つの独立したアプローチを示すための方法を実証するためには、（i）である。 30年前、PouysségurとフランキはNHEファミリー15のメンバーの分子クローニングおよび特性を有効に遺伝的アプローチを開拓してきた。これは、スクリーニング法として、細胞内のプロトンの毒性に基づいていた。最初のステップは、欠損細胞株を得ることであった任意のNa + / H +交換において、このトランスポーターの可逆性を用いて、原形質膜で発現する。線維芽細胞は、（CCL39細胞株）のNa +またはLi +でプリロードし、次いで2時間、酸性細胞外培地（pH6.5）中に入れた。これは、機能のNa + / H +交換体を発現する細胞の死およびアンチポーター欠損細胞（PS120細胞系）16の選択につながった。重炭酸塩を含まない培地中で培養した場合、これらの細胞は、急性細胞内酸性化に非常に敏感である。そのような細胞は、急性細胞acidificationsに提出された場合、結果として、原形質膜における任意の機能プロトン流出メカニズムの発現が正に（17を参照）が選択される。このような酸性化技術は、売買欠陥が原形質膜でWT細胞NHEsの強制発現を可能とする細胞株を単離することができる。 真核生物のNa + / Hとして+交換器は、彼らがチャンネルを測定するために大きな成功を収めて使用されている電気生理学的ア ​​プローチによって測定可能ではないが、電気的に中性である。この原稿は、したがって、細胞内pH測定及びリチウム取り込みの迅速な動態によって、この交換器の活性を測定する方法を示します。基礎となる概念が同じであるように、選択部のために開発プロセスの多くは、機能の測定のために直接使用されることに注意することは興味深い。 興味深いことに、我々は、この原稿に記載されたアプローチを使用して選択された細胞株に存在するトラフィッキング欠陥は、水疱性カリウムチャンネルTWIK1 18のように、原形質膜における他の小胞のタンパク質のより大きな発現をもたらすことを観察した。これは、小胞の膜貫通型タンパク質のための一般的なリテンション不良メカニズムの選択に向かって指摘している。したがって、この選択手順と、それが05を生成する細胞細胞内コンパートメントの膜タンパク質に取り組んで科学的なコミュニティのための有望なツールを構成している。同様にここで紹介する測定技術は、他の非起電性トランスポーターを研究するための適用可能な場合があります。

<table><tbody><tr><td>Standard cell culture equipement</td><td></td><td></td><td>Used for H+ killing selection composed of many devices with different catalog numbers</td></tr><tr><td>Incubator with CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sanyo</td><td>MCO15A</td><td></td></tr><tr><td>Incubator without CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Heraeus instrument</td><td>BB6220</td><td></td></tr><tr><td>Laminar flow hood PSM1200NF</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>52010120</td><td></td></tr><tr><td>DMEM medium</td><td>sigma</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>FBS gold</td><td>GE Healthcare</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin/streptomycin</td><td>PAA</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 10x</td><td>PAA</td><td>L11-003</td><td></td></tr><tr><td>Atomic Absorption spectrometer with Zeeman furnace system</td><td>Thermo Scientific</td><td>ICE 3500 GFZ</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>sigma</td><td>L4408</td><td></td></tr><tr><td>Nitric Acid</td><td>sigma</td><td>438073</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence videomicroscopy set</td><td>Leica</td><td></td><td>Composed of many devices with different catalog numbers</td></tr><tr><td>Inverted automated microscope</td><td>Leica</td><td>DMI6000B</td><td></td></tr><tr><td>microscope stand</td><td>leica</td><td>11888906</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888911</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11505180</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888377</td><td></td></tr><tr><td>incident fluorescence</td><td>leica</td><td>11888901</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11504166</td><td></td></tr><tr><td>motor bracket</td><td>leica</td><td>11888379</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11505234</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521505</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11522106</td><td></td></tr><tr><td>LED transmission light&amp;nbsp;</td><td>leica</td><td>8097321</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>8102034</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521580</td><td></td></tr><tr><td>motorized plate</td><td>leica</td><td>11522068</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11531172</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521734</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521719</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888423</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888424</td><td></td></tr><tr><td>camera output</td><td>leica</td><td>11888373</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11507807</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888393</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888259</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888258</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11541510</td><td></td></tr><tr><td>images acquisition/analysis software</td><td>leica</td><td>11888375</td><td></td></tr><tr><td>optics</td><td>leica</td><td>11506507</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11506243</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11506203</td><td></td></tr><tr><td>fluorescence Xenon lamp</td><td>leica</td><td>DMI6000</td><td></td></tr><tr><td>camera</td><td>hamamatsu</td><td>8100601</td><td></td></tr><tr><td>metafluor/Mmfluor software</td><td></td><td>11640905</td><td></td></tr><tr><td>pH sensitive probe, BCECF-AM</td><td>life technologies</td><td>B1170</td><td></td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Sigma</td><td>N7143</td><td></td></tr></tbody></table>

functional characterization of na+/h+ exchangers of intracellular compartments using proton-killing selection to express them at the plasma membrane

エンドソームの酸性化は、タンパク質のリサイクルと劣化、受容体の脱感作、およびシナプス小胞における神経伝達物質の負荷などのプロセス、幅広いするために重要である。この酸性化のClC塩化物輸送体に結合されたプロトンATPアーゼによって媒介されることが記載されている。電気的中性のプロトン輸送体を高度に保存された、のNa + / H +交換体（NHE）6、7及び9は、これらのコンパートメントにおいて発現される。それらの遺伝子の変異は、人間の認知と神経変性疾患にリンクされています。それらの細胞内局在化は、詳細な機能解析を妨げているように逆説的に、彼らの役割は、とらえどころのないまま。この原稿は、この問題を解決する方法を示している。これは、原形質膜で細胞内NHEsを保持することにより急性のサイトゾル酸性化の生存可能な変異体細胞系の選択から成る。次に、イオン選択性および活性を測定するために二つの相補的なプロトコルを示している（i）1種の蛍光ビデオ顕微鏡を用いて細胞内pH測定値に基づいて、および（ii）1つのリチウムの取り込みの迅速な動態に基づくこ​​れらの交換器。そのようなプロトコルは、他の非起電性輸送を測定するために外挿することができる。さらに、ここで提示選択手順は、細胞内の保持不良表現型を有する細胞を生成する。従って、これらの細胞は、原形質膜における他の小胞の膜タンパク質を発現する。ここに示された実験戦略は、したがって、その後の選択のために使用される小胞のNa + / H +の交換とともに原形質膜で発現される他の細胞内タンパク質を研究するための潜在的に強力なツールを構成することができる。

選択： 図1Aに示すように、選択を殺すH +は 、アンモニウム弱塩基の拡散に基づいている。細胞内のpHに弱塩基および酸拡散の効果がウォルターホウ素及び共同研究者22によって開拓されました。ポジティブ遺伝子選択のための致命的な酸性化を生成するために、この現象を使用するには、エレガントなアイデアは、その後ジャック·Pouyssé...

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Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers.

ナの機能的特徴<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup細胞膜でそれらを表現するためにプロトン殺す選択を使用した細胞内区画の&gt;交換器

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and ...

functional-characterization-na-h-exchangers-intracellular

Research

JoVE Journal

Biology

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

9.2K ビュー.  Université Nice-Sophia Antipolis, Laboratoire de Physiomédecine Moléculaire, CNRS UMR7370, and Laboratories of Excellence Ion Channel Science and Therapeutics. The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers. 

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Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM c-Cyts) has recently emerged as a novel whole-cell analytical method to characterize the bacterial electron transport from the respiratory chain to the cell exterior, referred to as the extracellular electron transport (EET). While the pathway and kinetics of the electron flow during the EET reaction have been investigated, a whole-cell electrochemical method to examine the impact of cation transport associated with EET has not yet been established. In the present study, an example of a biochemical technique to examine the deuterium kinetic isotope effect (KIE) on EET through OM c-Cyts using a model microbe, Shewanella oneidensis MR-1, is described. The KIE on the EET process can be obtained if the EET through OM c-Cyts acts as the rate-limiting step in the microbial current production. To that end, before the addition of D2O, the supernatant solution was replaced with fresh media containing a sufficient amount of the electron donor to support the rate of upstream metabolic reactions, and to remove the planktonic cells from a uniform monolayer biofilm on the working electrode. Alternative methods to confirm the rate-limiting step in microbial current production as EET through OM c-Cyts are also described. Our technique of a whole-cell electrochemical assay for investigating proton transport kinetics can be applied to other electroactive microbial strains.

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Here we present a protocol of whole-cell electrochemical experiments to study the contribution of proton transport to the rate of extracellular electron transport via the outer-membrane cytochromes complex in Shewanella oneidensis MR-1.

電気化学検出の重水素速度論的同位体効果シェワネラ oneidensis氏 1 の細胞外電子輸送

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM ...

生化学

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. This method combines expression of proteins tagged with the fluorescent non-canonical amino acid ANAP, and FRET between ANAP and fluorescent (trinitrophenyl) nucleotide derivatives. We present examples of nucleotide binding to ANAP-tagged KATP ion channels measured in unroofed plasma membranes and excised, inside-out membrane patches under voltage clamp. The latter allows for simultaneous measurements of ligand binding and channel current, a direct readout of protein function. Data treatment and analysis are discussed extensively, along with potential pitfalls and artefacts. This method provides rich mechanistic insights into the ligand-dependent gating of KATP channels and can readily be adapted to the study of other nucleotide-regulated proteins or any receptor for which a suitable fluorescent ligand can be identified.

This protocol presents a method for measuring adenine nucleotide binding to receptors in real time in a cellular environment. Binding is measured as F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) between trinitrophenyl nucleotide derivatives and protein labeled with a non-canonical, fluorescent amino acid.

インタクトな機能的な膜タンパク質へのヌクレオチド結合をリアルタイムで測定

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane (SSM)-Based Electrophysiology

Single domain antibodies (nanobodies) have been extensively used in mechanistic and structural studies of proteins and they pose an enormous potential as tools for developing clinical therapies, many of which depend on the inhibition of membrane proteins such as transporters. However, most of the methods used to determine the inhibition of transport activity are difficult to perform in high-throughput routines and depend on labeled substrates availability thereby complicating the screening of large nanobody libraries. Solid-supported membrane (SSM) electrophysiology is a high-throughput method, used for characterizing electrogenic transporters and measuring their transport kinetics and inhibition. Here we show the implementation of SSM-based electrophysiology to select inhibitory and non-inhibitory nanobodies targeting an electrogenic secondary transporter and to calculate nanobodies inhibitory constants. This technique may be especially useful for selecting inhibitory nanobodies targeting transporters for which labeled substrates are not available.

Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane SSM-Based Electrophysiology

Nanobodies are important tools in structural biology and pose a great potential for the development of therapies. However, the selection of nanobodies with inhibitory properties can be challenging. Here we demonstrate the use of solid-supported-membrane (SSM)-based electrophysiology for the classification of inhibitory and non-inhibitory nanobodies targeting electrogenic membrane transporters.

固体支持膜(SSM)ベースの電気生理学によるトランスポーター標的阻害ナノボディの選択

Single domain antibodies (nanobodies) have been extensively used in mechanistic and structural studies of proteins and they pose an enormous potential as ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

異種哺乳動物細胞で発現したイオンチャネルの変異導入と機能解析

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

生物学

Recapitulation of an Ion Channel IV Curve Using Frequency Components

INTRODUCTION: Presently, there are no established methods to measure multiple ion channel types simultaneously and decompose the measured current into portions attributable to each channel type. This study demonstrates how impedance spectroscopy may be used to identify specific frequencies that highly correlate with the steady state current amplitude measured during voltage clamp experiments. The method involves inserting a noise function containing specific frequencies into the voltage step protocol. In the work presented, a model cell is used to demonstrate that no high correlations are introduced by the voltage clamp circuitry, and also that the noise function itself does not introduce any high correlations when no ion channels are present. This validation is necessary before the technique can be applied to preparations containing ion channels. The purpose of the protocol presented is to demonstrate how to characterize the frequency response of a single ion channel type to a noise function. Once specific frequencies have been identified in an individual channel type, they can be used to reproduce the steady state current voltage (IV) curve. Frequencies that highly correlate with one channel type and minimally correlate with other channel types may then be used to estimate the current contribution of multiple channel types measured simultaneously.
METHODS: Voltage clamp measurements were performed on a model cell using a standard voltage step protocol (-150 to +50 mV, 5mV steps). Noise functions containing equal magnitudes of 1-15 kHz frequencies (zero to peak amplitudes: 50 or 100mV) were inserted into each voltage step. The real component of the Fast Fourier transform (FFT) of the output signal was calculated with and without noise for each step potential. The magnitude of each frequency as a function of voltage step was correlated with the current amplitude at the corresponding voltages.
RESULTS AND CONCLUSIONS: In the absence of noise (control), magnitudes of all frequencies except the DC component correlated poorly (|R|&lt;0.5) with the IV curve, whereas the DC component had a correlation coefficient greater than 0.999 in all measurements. The quality of correlation between individual frequencies and the IV curve did not change when a noise function was added to the voltage step protocol. Likewise, increasing the amplitude of the noise function also did not increase the correlation. Control measurements demonstrate that the voltage clamp circuitry by itself does not cause any frequencies above 0 Hz to highly correlate with the steady-state IV curve. Likewise, measurements in the presence of the noise function demonstrate that the noise function does not cause any frequencies above 0 Hz to correlate with the steady-state IV curve when no ion channels are present. Based on this verification, the method can now be applied to preparations containing a single ion channel type with the intent of identifying frequencies whose amplitudes correlate specifically with that channel type.

There are technical obstacles to measuring current flux through multiple ion channels simultaneously, and later discerning what portion of the transmembrane current is due to each channel type. To address this need, this method presents a way to generate the IV curve of individual channel types using specific frequency components.

周波数成分を用いたイオンチャネルのIV曲線の要約

INTRODUCTION: Presently, there are no established methods to measure multiple ion channel types simultaneously and decompose the measured current into ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.

チャンネルロドプシンにおけるイオン選択性の電気生理学的測定のための全細胞パッチクランプ記録

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

神経科学

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase is more difficult to investigate. Many transport assays utilize radioisotopes to achieve a sufficient signal-to-noise ratio, however, the necessary security measures impose severe restrictions regarding human exposure or assay design. Furthermore, ion transport across cell membranes is critically influenced by the membrane potential, which is not straightforwardly controlled in cell culture or in proteoliposome preparations. Here, we make use of the outstanding sensitivity of atomic absorption spectrophotometry (AAS) towards trace amounts of chemical elements to measure Rb+ or Li+ transport by Na+,K+- or gastric H+,K+-ATPase in single cells. Using Xenopus oocytes as expression system, we determine the amount of Rb+ (Li+) transported into the cells by measuring samples of single-oocyte homogenates in an AAS device equipped with a transversely heated graphite atomizer (THGA) furnace, which is loaded from an autosampler. Since the background of unspecific Rb+ uptake into control oocytes or during application of ATPase-specific inhibitors is very small, it is possible to implement complex kinetic assay schemes involving a large number of experimental conditions simultaneously, or to compare the transport capacity and kinetics of site-specifically mutated transporters with high precision. Furthermore, since cation uptake is determined on single cells, the flux experiments can be carried out in combination with two-electrode voltage-clamping (TEVC) to achieve accurate control of the membrane potential and current. This allowed e.g. to quantitatively determine the 3Na+/2K+ transport stoichiometry of the Na+,K+-ATPase and enabled for the first time to investigate the voltage dependence of cation transport by the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase. In principle, the assay is not limited to K+-transporting membrane proteins, but it may work equally well to address the activity of heavy or transition metal transporters, or uptake of chemical elements by endocytotic processes.

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

We describe a method to quantify the activity of K+-countertransporting P-type ATPases by heterologous expression of the enzymes in Xenopus oocytes and measuring Rb+ or Li+ uptake into individual cells by atomic absorption spectrophotometry. The method is a sensitive and safe alternative to radioisotope flux experiments facilitating complex kinetic studies.

のNa、KとH、K-ATPaseのインによって陽イオン輸送を測定する<em&gt;アフリカツメガエル</em原子吸光法による&gt;卵母：アイソトープアッセイの代替

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating ...

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined lipid composition. We are studying the lipid-dependent gating effects in a prototype voltage-gated potassium (Kv) channel, and have worked out detailed procedures to reconstitute the channels into different membrane systems. Our reconstitution procedures take consideration of both detergent-induced fusion of vesicles and the fusion of protein/detergent micelles with the lipid/detergent mixed micelles as well as the importance of reaching an equilibrium distribution of lipids among the protein/detergent/lipid and the detergent/lipid mixed micelles. Our data suggested that the insertion of the channels in the lipid vesicles is relatively random in orientations, and the reconstitution efficiency is so high that no detectable protein aggregates were seen in fractionation experiments. We have utilized the reconstituted channels to determine the conformational states of the channels in different lipids, record electrical activities of a small number of channels incorporated in planar lipid bilayers, screen for conformation-specific ligands from a phage-displayed peptide library, and support the growth of 2D crystals of the channels in membranes. The reconstitution procedures described here may be adapted for studying other membrane proteins in lipid bilayers, especially for the investigation of the lipid effects on the eukaryotic voltage-gated ion channels.

Procedures for complete reconstitution of a prototype voltage-gated potassium channel into lipid membranes are described. The reconstituted channels are suitable for biochemical assays, electrical recordings, ligand screening and electron crystallographic studies. These methods may have general applications to the structural and functional studies of other membrane proteins.

構造と機能研究のための脂質膜へのKvチャネルの再構築

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...

Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. These transport mechanisms are mediated by the activities of specialized transporter proteins. Specifically,pH dynamics are finely controlled by plasma membrane proton (H+) extrusion systems, such as the Na+/H+ exchanger (NHE) protein family. Despite extensive efforts to study the mechanisms underlying NHE regulation, our current understanding of the biophysical and molecular properties of the NHE family is inadequate because of the limited availability of methods to effectively measure NHE activity. In this manuscript, we used H+-selective electrodes during whole-cell patch clamping recording to measure NHE-induced H+ flux. We proposed this approach to overcome some limitations of typically used methods to measure NHE activity, such as radioactive uptake and fluorescent membrane permeants. Measurement of NHE activity using the described method enables high sensitivity and time resolution and more efficient control of intracellular H+ concentrations. H+-selective electrodes are based on the fact that transporter activity creates an ion gradient in close proximity to the cell membrane. An H+-selective electrode moving up to and away from the cell membrane in a repetitive, oscillatory fashion records a voltage difference that is dependent on H+ flux. While H+-selective electrodes are used to detect H+ flux moving out of the cell, the patch clamp method in the whole-cell configuration is used to control the intracellular ion composition. Moreover, application of the giant patch clamp technique allows modification of the intracellular composition of not only ions but also lipids. The transporter activity of NHE isoform 3 (NHE3) was measured using this technical approach to study the molecular basis of NHE3 regulation by phosphoinositides.

This manuscript describes the applications of proton-selective electrodes and patch clamping methods to measure the activity of proton transport systems. These methods overcome some limitations of techniques commonly used to study proton transport activity, such as moderate sensitivity, time resolution and insufficient intracellular milieu control.

電気生理学測定の電気中立運送者の活動を研究への応用

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. ...

Ion Exchange

Ion exchange chromatography separates charged molecules from a solution by reversibly exchanging them with mobile, or &#39;active&#39;, ions associated with the oppositely charged stationary phase. This method can be used to separate ions, soften and deionize water, and purify solutions. The polymers comprising the ion-exchange column are high-molecular-weight and chemically stable polymers, crosslinked to be porous and essentially insoluble. They are also functionalized with either acidic or basic groups. When functionalized with acidic groups, the columns or resin are known as cation exchangers and contain negatively charged polymers with positive counter ions. These allow cations to be exchanged from the mobile phase. When functionalized with basic groups, the columns or resin are known as anion exchangers, which contain positively charged polymers with negative counter ions and exchange anions from the solution.
During ion exchange, the counterions associated with the solid-phase polymers enter the solution while ions from the solution interact with the polymer in their place. Note that the ability to exchange ions increases as the extent of cross-linking increases and the number of ion-exchange groups increases in the polymer. This exchange is reversible and continues until equilibrium is established.
Acid cation exchangers can be functionalized with either strong acids, such as sulfonic acid (&#8722;SO3H), seen in polystyrene sulfonic acid, or weak acids, such as carboxylic acid (&#8722;COOH), seen in poly(methyl methylacrylic) acid. Similarly, anion exchangers are classified as either strong or weak. Strong anion exchangers often contain quaternary ammonium groups (&#8722;CH2N(CH3)3+), such as those in polystyrene quaternary ammonium chloride, and weak anion exchangers are often functionalized with substituted amines (&#8722;NH3+), such as those in polystyrene tertiary amine hydroxide.

ナの機能的特徴

要約

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