وأيد هذا العمل من جانب صناديق من الغرب الأوسط الكلية الجامعية للعلوم الصحة منح البحوث تسهيل منح لEEH ومكتب جامعة الغرب الأوسط للبحوث والبرامج التي ترعاها منحت جماعية غرانت إلى KJL.

هذا البروتوكول يتوافق مع مبادئ الرعاية اخر احصاء الحيوان في رعاية واستخدام الحيوانات المختبرية وتمت الموافقة من قبل لجنة المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) في جامعة الغرب الأوسط. 1. إعداد التخدير، المعدات، والإعلام <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dechlorinate ما يقرب من 1.5 L من ماء الصنبور باستخدام إما وكيل تجاري dechlorinating (متوفر في محلات الحيوانات الأليفة) أو عن طريق السماح موقف المياه لمدة 24 ساعة. الحصول على ثلاثة أكواب 1 L وملء مع كل 500 مل إزالة الكلور المياه. تسمية واحدة لعقد الأسماك قبل أي إجراء واحد لتحقيق الانتعاش. إلى الدورق الثالث، إضافة 100 ميكروغرام / مل من تريكين methanesulfonate. يصبح هذا الكأس الذي سيتم تخدير الأسماك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء علبة الضحلة مع الثلج، تدفئة مستنبت (RPMI 1640، و 10٪ FBS (مصل بقري جنيني)، 50 ميكروغرام / مل الجنتاميسين، 100 ميكروغرام / مل الكانامايسين، 25 ملي HEPES) إلى RT، وجمع ملاقط الجواهري نظيفة و. ملاقط نظيفة عن طريق إميرالغناء النصائح في 70٪ من الإيثانول ويمر عبر ناسخ بنسن، والسماح للإيثانول ليحرق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقرر ما إذا كان سيتم تنفيذ الإجراء بدون تكبير، مع التجاري، فوق المنضدة مضاءة العدسة المكبرة مع 2 - 10X التكبير، أو تشريح المجهر (هذا يعتمد كليا على تفضيل شخصي). </li></ol> 2. إنشاء الثقافات يزدرع <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبض على العدد المرغوب فيه من السمك ووضعه في كوب القابضة. نقل سمكة واحدة إلى كوب التخدير. فمن الأفضل لتخدير الأسماك بشكل فردي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رصد آثار التخدير من خلال مراقبة السباحة والخيشومية حركة الأسماك. كما تقدم التخدير، وحركة الخيشومية تبطئ وسوف الأسماك تسبح بطريقة متقطعة وكثيرا رأسا على عقب. نظر الأسماك تخدير في أقرب وقت توقف حركة الخيشومية. لا تترك الأسماك لفترات أطول في الحمام التخدير لأن ذلك قد يؤدي إلى وفاة الأسماك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الأسماك من كوب التخدير ونقلإلى جليد، ووضع الأسماك أفقيا مع الذيل التي تواجه يد تمسك ملاقط. إذا شهدت مع هذه التقنية وإذا الأسماك متعددة يجب أن تستخدم لجعل إإكسبلنتس، والنظر في وضع الأسماك القادمة في الكأس التخدير في هذا الوقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإزالة المقاييس، ملاقط موقف موازية للأسماك مع تلميح عند حافة النطاق. خفض الجانب المسطح من ملاقط قليلا إلى جانب الأسماك للتسبب في نطاق لرفع من جسم السمكة. فهم على نطاق ومع ملاقط، نتف، ومكان (بدون قلب) في صحن زراعة الأنسجة. كرر الإجراء، وإزالة بحد أقصى 12 المقاييس من الكبار كبير (6 من كل جانب)، وتجنب المنطقة الخيشومية، والخط الجانبي، وزعانف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع السمك في دورق الانتعاش ومراقبة للتأكد من أنه يتعافى من آثار التخدير. في هذا الوقت، والأسماك يمكن نقل مرة أخرى إلى خزان فردي. السماح للأسماك لاستعادة لمدة 21 يوما على الأقل للسماح لكامل تجديد النطاق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبعا لالتصميم التجريبي، وضع ما يصل إلى 20 في موازين البلاستيك 35 ملم الأنسجة طبق المعالجة الثقافة أو 4-6 المقاييس في الزجاج طبق السفلي. تسمح المقاييس على الانضمام إلى الطبق قبل أن يضيف بلطف وسائل الإعلام حتى لا فصل المقاييس من الطبق. ملاحظة: مع الخبرة، يمكن معالجة الأسماك متعددة قبل إضافة وسائل الإعلام إلى الطبق الأول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1.2 مل من وسائل الإعلام كاملة (انظر 1.2 أعلاه) في كل 35 مم الطبق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويفضل احتضان الثقافات يزدرع في 28 ° C في CO 2 5٪ للفترة من الوقت المطلوب مع أو بدون معالجة إضافية. بدلا من ذلك، احتضان الثقافات على خشبة المسرح المجهر ساخنة أو داخل غرفة زراعة الخلايا الحية للفحص المجهري الفيديو. </li></ol> 3. Brightfield والفيديو المجهر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أطباق موقف تحتوي على أوراق خلية على خشبة المسرح المجهر والبداية التركيز باستخدام عدسة الهدف 4X. يمكن أن تستخدم ارتفاع تكبير، اعتمادا على التجربة: ملاحظة. بمناسبة موقعوكل ورقة خلية و / أو توجيه الطبق على المسرح تسهيل التقاط الصور مع مرور الوقت مع الأوراق في تقريبا نفس التوجه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة أطباق من الحاضنة وصورة في نقاط زمنية مختلفة، وفقا لكل بروتوكول تجريبي ووضع مرة أخرى في حاضنة إذا كانت هناك حاجة الصور الثابتة فقط على الإطار الزمني التجريبي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أثناء أداء المجهري الفيديو، والانتباه إلى ما يلي: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع / ورقة خلية الناشئة على نطاق وداخل مجال الرؤية من هذا القبيل أن ورقة خلية المهاجرة يبقى في مجال الرؤية لمدة شريط الفيديو. ملاحظة: هذا قد يستغرق بعض الخبرة في مراقبة كيف تهاجر الخلايا من تحت نطاق. لأشرطة الفيديو القصيرة، وهذا هو أقل أهمية من لأشرطة الفيديو أطول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لأطر زمنية أقصر، في احتضان RT. لأطر زمنية أطول (18+ ساعة)، استخدم مرحلة ساخنة أو غرفة الحضانة للحفاظ على درجة الحرارة، وتوازن درجة الحموضة، وتقليل التبخر من ثقافة مedium. </li></ol></li></ol> 4. التثبيت لالمناعي المجهر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد وقبل الدافئة جميع الحلول إلى 28 ° C. من أجل عرض keratocytes تحت مضان، وتنمو الثقافات يزدرع كما هو موضح أعلاه باستخدام 35 مم أطباق زراعة الأنسجة من الزجاج السفلي. بدلا من ذلك، استخدم الشرائح غرفة زجاجية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.8 مل من 4٪ بارافورمالدهيد في 1.1x PBS إلى كل طبق. لا تقم بإزالة سائل الإعلام والثقافة أولا. في احتضان RT لمدة 5 دقائق ثم نضح لإزالة الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.8 مل من 4٪ بارافورمالدهيد في 1.1x PBS إلى كل طبق. في احتضان RT لمدة 5 دقائق ثم نضح لإزالة الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلا باستخدام بروابط خارجية أو الحواتم الخارجية، وخلايا permeabilize بإضافة 0.5 مل من 0.2٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني 1X. في احتضان RT لمدة 5 دقائق ثم نضح لإزالة الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.5 مل من 1٪ BSA في برنامج تلفزيوني 1X واحتضان لمدة 1 ساعة (في RT) أو O / N (في 4 درجات مئوية). ملاحظة: اعتمادا على الظروف التجريبية، فاويمكن أن يضاف lloidin في هذه الخطوة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحضانة، ونضح لإزالة الحل والمضي قدما في تلوين الأجسام المضادة. بدلا من ذلك، تخزين الأطباق الثقافة عن طريق إضافة على الأقل 1 - 2 مل من 1٪ BSA في برنامج تلفزيوني 1X ل3-4 أسابيع في 4 درجات مئوية. </li></ol> بروتوكول 5. المناعي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد حلول الأجسام المضادة الأولية والثانوية وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. ملاحظة: إذا توصيات الشركة المصنعة ليست متاحة، لتخفيف بداية جيدة من الأجسام المضادة الأولية (في 1٪ BSA في برنامج تلفزيوني 1X) هو 1: 500 لبولكلونل و1: 1،000 لالاجسام المضادة. لتخفيف انطلاق جيدة لالأجسام المضادة الثانوية هو 1: 1،000. ضبط هذه التخفيفات من الأوراق المالية الأصلية التي تم الحصول عليها من الشركة المصنعة أعلى إذا كانت الإشارة ضعيفة وأقل عند إشارة قوية وخلفية مشكلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح BSA 1٪ في حل برنامج تلفزيوني 1X. إضافة 0.5 مل من محلول الأجسام المضادة الأولية واحتضان لمدة 1 ساعة (في RT) أو O / N (في 4 درجات مئوية). </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة حل الأجسام المضادة الأولية، ضع في نظيفة والمسمى 1.5 مل أنبوب microcentrifuge، وتجميد في -20 ° C. ملاحظة: هذا يسمح لإعادة استخدام الأجسام المضادة الأولية، إذا لزم الأمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الطبق 3-5 مرات مع 1X PBS، وإزالة والتخلص من PBS بعد كل غسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.5 مل من محلول الأجسام المضادة الثانوية. إذا رغبت في ذلك، إضافة phalloidin fluorescently المسمى (التالية أوصى تركيز أي الشركة المصنعة) خلال هذه الخطوة. احتضان لمدة 1 ساعة (في RT) أو O / N (في 4 درجات مئوية). ملاحظة: استخدام phalloidin fluorescently المسمى-تسمح لرؤية خيوط الأكتين. لقد وجدنا أن phalloidin المسمى 488 يعمل بشكل أفضل في keratocytes الزرد لدينا، ولكن fluorophores أخرى يمكن استخدامها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة والتخلص من حل الضد الثانوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الطبق 3-5 مرات مع 1X PBS، وإزالة والتخلص من PBS بعد كل غسل. ملاحظة: يمكن تخزين طبق، مغطاة بعيدا عن الضوء، في 4 درجات مئوية إذا كان غير قادر على المنافسةث فورا؛ تأكد من إضافة برنامج تلفزيوني 1X في طبق قبل تخزينها لضمان الخلايا لا تجف ولكن الحار لRT (20 - 30 دقيقة)، ثم إزالة PBS فقط قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما تصبح جاهزة لمراقبة، إضافة 2-3 قطرات من المتوسطة المتزايدة، مع أو بدون دابي، اعتمادا على احتياجات التجريبية، في طبق وترك الجلوس لمدة 10 دقيقة في RT. ملاحظة: نحن نستخدم المتاحة تجاريا، القائم على الجلسرين المتوسطة المتزايدة مع دابي، ولكن وسائل الإعلام الأخرى المتصاعدة يمكن استخدامها. السماح 10 دقيقة للالمتوسطة المتزايدة للجلوس في صحن يسهل إزالة سهلة من ساترة الزجاج من قاع الطبق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحضانة، والضغط برفق على جانبي الطبق لتخفيف وإزالة ساترة. إضافة قطرة إضافية من وسائل الاعلام المتزايدة على شريحة زجاجية ووضع ساترة، وخلايا أسفل، على الشريحة. ملاحظة: فكر ختم ساترة إلى الشريحة استخدام طلاء الأظافر واضح إذا تحتاج الشريحة إلى أن تبقى لمدة أطول من 1 - 2 أيام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة الشريحة تحت المجهر مضان. ملاحظة: وقد أخذت معظم صورنا باستخدام 40X 63X أو عدسة موضوعية تحت الغمر النفط، ولكن عدسة موضوعية محددة تستخدم سوف تعتمد على بروتوكول تجريبي. </li></ol>

<ol>
	<li>Burton, K., Park, J. H., Taylor, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratocytes+generate+traction+forces+in+two+phases.">Keratocytes generate traction forces in two phases.</a> Molecular Biology of the Cell. 10, 3745-3769 (1999).</li><li>Keren, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+shape+determination+in+motile+cells.">Mechanism of shape determination in motile cells.</a> Nature. 453, 475-480 (2008).</li><li>Lacayo, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+large-scale+cell+morphology+and+movement+from+local+actin+filament+growth+dynamics.">Emergence of large-scale cell morphology and movement from local actin filament growth dynamics.</a> PLOS Biology. 5, 233 (2007).</li><li>Lee, J., Ishihara, A., Theriot, J. A., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+locomotion+for+simple-shaped+cells.">Principles of locomotion for simple-shaped cells.</a> Nature. 362, 167-171 (1993).</li><li>Kolega, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Movement+of+Cell+Clusters.">The Movement of Cell Clusters.</a> J. Cell Sci. 49, 15-32 (1981).</li><li>Kolega, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+mechanical+tension+on+protrusive+activity+and+microfilament+and+intermediate+filament+organization+in+an+epidermal+epithelium+moving+in+culture.">Effects of mechanical tension on protrusive activity and microfilament and intermediate filament organization in an epidermal epithelium moving in culture.</a> The Journal of Cell Biology. 102, 1400-1411 (1986).</li><li>Rapanan, J. L., Cooper, K. E., Leyva, K. J., Hull, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+migration+of+primary+zebrafish+keratocytes.">Collective cell migration of primary zebrafish keratocytes.</a> Experimental Cell Research. 326, 155-165 (2014).</li><li>Richardson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+Zebrafish+as+a+Model+System+for+Cutaneous+Wound-Healing+Research.">Adult Zebrafish as a Model System for Cutaneous Wound-Healing Research.</a> Journal of Investigative Dermatology. 133, 1655-1665 (2013).</li><li>Cheon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+pro-inflammatory+cytokines+and+metalloproteinase-1+by+TGF-b1+in+synovial+fibroblasts+from+rheumatoid+arthritis+and+normal+individuals.">Increased expression of pro-inflammatory cytokines and metalloproteinase-1 by TGF-b1 in synovial fibroblasts from rheumatoid arthritis and normal individuals.</a> Clinica., &amp; Experimental Immunology. 127, 547-552 (2002).</li><li>Sandeman, S. R., Faragher, R. G. A., Allen, M. C. A., Liu, C., Lloyd, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+MMP-2+expression+and+secretion+change+with+increasing+serial+passage+of+keratocytes+in+culture.">Does MMP-2 expression and secretion change with increasing serial passage of keratocytes in culture.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 122, 157-167 (2001).</li><li>Schnaper, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+extracellular+matrix+proteins+and+decreased+expression+of+matrix+proteases+after+serial+passage+of+glomerular+mesangial+cells.">Increased expression of extracellular matrix proteins and decreased expression of matrix proteases after serial passage of glomerular mesangial cells.</a> Journal of Cell Science. 109, 2521-2528 (1996).</li><li>Tondreau, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+study+of+matrix+metalloproteinase/tissue+inhibitor+of+metalloproteinase+production+by+mesenchymal+stromal+cells+in+response+to+inflammatory+cytokines:+the+role+of+their+migration+in+injured+tissues.">In vitro study of matrix metalloproteinase/tissue inhibitor of metalloproteinase production by mesenchymal stromal cells in response to inflammatory cytokines: the role of their migration in injured tissues.</a> Cytotherapy. 11, 559-569 (2009).</li><li>Zimmermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+rheumatoid+arthritis+synovial+fibroblasts+from+primary+culture+-+primary+culture+cells+markedly+differ+from+fourth-passage+cells.">Isolation and characterization of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts from primary culture - primary culture cells markedly differ from fourth-passage cells.</a> Arthritis Research. 3, 72-76 (2001).</li><li>McDonald, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+keratocyte+explant+cultures+as+a+wound+healing+model+system:+differential+gene+expressio.,+&amp;+morphological+changes+support+epithelial&#8211;mesenchymal+transition.">Zebrafish keratocyte explant cultures as a wound healing model system: differential gene expressio., &amp; morphological changes support epithelial&#8211;mesenchymal transition.</a> Experimental Cell Research. 319, 1815-1827 (2013).</li><li>Tan, B., Pascual, A., de Beus, A., Cooper, K., Hull, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFb+(transforming+growth+factor+b)+and+keratocyte+motility+in+24-hour+zebrafish+explant+cultures.">TGFb (transforming growth factor b) and keratocyte motility in 24-hour zebrafish explant cultures.</a> Cell Biology International. 35, 1131-1139 (2011).</li><li>Barut, B. A., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Realizing+the+potential+of+zebrafish+as+a+model+for+human+disease.">Realizing the potential of zebrafish as a model for human disease.</a> Physiological Genomics. 2, 49-51 (2000).</li><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nature Reviews Genetics. 8, 353-367 (2007).</li><li>Santoriello, C., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hooked!+Modeling+human+disease+in+zebrafish.">Hooked! Modeling human disease in zebrafish.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122, 2337-2343 (2012).</li><li>Etchin, J., Kanki, J. P., Look, A. T., Westerfield, M., Detric, H. W., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Cell Biology. 105, 309-337 (2011).</li><li>Li, P., White, R. M., Zon, L. I., Westerfield, M., White, H. W., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Cell Biology. 105, 403-417 (2011).</li><li>Yen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+heterogeneity+and+mutational+burden+of+engineered+melanomas+in+zebrafish+models.">The genetic heterogeneity and mutational burden of engineered melanomas in zebrafish models.</a> Genome Biology. 14, R113 (2013).</li><li>Bouzaffour, M., Dufourcq, P., Lecaudey, V., Haas, P., Vriz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf+and+Sdf-1+Pathways+Interact+during+Zebrafish+Fin+Regeneration.">Fgf and Sdf-1 Pathways Interact during Zebrafish Fin Regeneration.</a> PLoS One. 4, e5824 (2009).</li><li>Dufourcq, P., Vriz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemokine+SDF-1+regulates+blastema+formation+during+zebrafish+fin+regeneration.">The chemokine SDF-1 regulates blastema formation during zebrafish fin regeneration.</a> Development Genes and Evolution. 216, 635-639 (2006).</li><li>Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf+signaling+instructs+position-dependent+growth+rate+during+zebrafish+fin+regeneration.">Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration.</a> Development. 132, 5173-5183 (2005).</li><li>Hyde, D. R., Godwin, A. R., Thummel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Electroporation+of+Morpholinos+into+the+Regenerating+Adult+Zebrafish+Tail+Fin.">In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin.</a> Journal of Visualized Experiments. 61, e3632 (2012).</li><li>Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromanipulation+of+Gene+Expression+in+the+Adult+Zebrafish+Brain+Using+Cerebroventricular+Microinjection+of+Morpholino+Oligonucleotides.">Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides.</a> Journal of Visualized Experiments. 75, e50415 (2013).</li><li>Konantz, J., Antos, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+Genetic+Morpholino+Approach+Using+Cardiac+Ventricular+Injection+to+Transfect+Multiple+Difficult-to-target+Tissues+in+the+Zebrafish+Larva.">Reverse Genetic Morpholino Approach Using Cardiac Ventricular Injection to Transfect Multiple Difficult-to-target Tissues in the Zebrafish Larva.</a> Journal of Visualized Experiments. 88, e51595 (2014).</li><li>Rambabu, K. M., Rao, S. H., Rao, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+expression+of+transgenes+in+adult+zebrafish+by+electroporation.">Efficient expression of transgenes in adult zebrafish by electroporation.</a> BMC Biotechnology. 5, 29 (2005).</li><li>Rapanan, J. L., Cooper, K. E., Leyva, K. J., Hull, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=During+collective+migration,+leader+keratocytes+generate+tension+in+sheet+and+may+become+follower+or+individually+migrating+cells.">During collective migration, leader keratocytes generate tension in sheet and may become follower or individually migrating cells.</a> Experimental Cell Research. In press, (2014).</li><li>Safferling, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing+revised:+A+novel+reepithelialization+mechanism+revealed+by+in+vitro+and+in+silico+models).">Wound healing revised: A novel reepithelialization mechanism revealed by in vitro and in silico models).</a> The Journal of Cell Biology. 203, 691-709 (2013).</li><li>McDonald, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinases+and+collective+cell+migration+in+24+primary+zebrafish+explant+cultures:+MMP13+plays+an+inhibitory+role+and+MMP14+may+respond+to+stretch+during+reepithelialisation.">Matrix metalloproteinases and collective cell migration in 24 primary zebrafish explant cultures: MMP13 plays an inhibitory role and MMP14 may respond to stretch during reepithelialisation.</a> Cell Biology International Reports. 20, 24-36 (2013).</li><li>Haage, A., Nam, D. H., Ge, X., Schneider, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase-14+is+a+mechanically+regulated+activator+of+secreted+MMPs+and+invasion.">Matrix metalloproteinase-14 is a mechanically regulated activator of secreted MMPs and invasion.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2014).</li><li>Sire, J. -. Y., Girondot, M., Babiar, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marking+zebrafish,+Danio+rerio+(cyprinidae),+using+scale+regeneration.">Marking zebrafish, Danio rerio (cyprinidae), using scale regeneration.</a> The Journal of Experimental Zoology. 286, 297-304 (2000).</li><li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Teleost+skin,+an+ancient+mucosal+surface+that+elicits+gut-like+immune+responses.">Teleost skin, an ancient mucosal surface that elicits gut-like immune responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, 13097-13102 (2013).</li><li>Keren, K., Yam, P. T., Kinkhabwala, A., Mogilner, A., Theriot, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+fluid+flow+in+rapidly+moving+cells.">Intracellular fluid flow in rapidly moving cells.</a> Nature Cell Biology. 11, 1219-1224 (2009).</li><li>Bereiter-Hahn, J., Strohmeier, R., Kunzenbacher, I., Beck, K., Voth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locomotion+of+Xenopus+epidermis+cells+in+primary+culture.">Locomotion of Xenopus epidermis cells in primary culture.</a> Journal of Cell Science. 52, 289-311 (1981).</li><li>Nishikawa, A., Shimizu-Nishikawa, K., Miller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+characterization,+and+in+vitro+culture+of+larval+and+adult+epidermal+cells+of+the+frog+Xenopus+laevis.">Isolation, characterization, and in vitro culture of larval and adult epidermal cells of the frog Xenopus laevis.</a> In Vitro Cellula., &amp; Developmental Biology. 26, 1128-1134 (1990).</li><li>Schober, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+adhesion+kinase+modulates+tension+signaling+to+control+actin+and+focal+adhesion+dynamics.">Focal adhesion kinase modulates tension signaling to control actin and focal adhesion dynamics.</a> The Journal of Cell Biology. 176, 667-680 (2007).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

الخطوة الأكثر أهمية لنجاح ثقافة خلية قرنية النباتى هو السماح للنطاق التمسك الطبق الثقافة لحوالي 2-3 دقائق قبل إضافة مستنبت. ما يقرب من 75٪ من المقاييس ستلتزم وتنمو ورقة (وعدد من الثقافات التي أنشئت لكل تجربة تحتاج إلى تعديل وفقا لذلك). أوراق خلية قرنية لا تشكل حول كل نطا...

<html> وقد ركزت دراسات الحركة خلية تقليديا على الخلايا المهاجرة بشكل فردي. وقد أثبتت Keratocytes مثقف من الأسماك والبرمائيات إإكسبلنتس أن يكون نظام نموذج قوي لدراسة آليات حركية الخلية باستخدام النمذجة كلا التجريبية والرياضية تقترب 1-6. وساعد العمل التجريبي على الخلايا المهاجرة بشكل فردي عن طريق السريع، وسلاسة الحركة مزلق من الخلايا، مع الحفاظ على شكل موحد، والسرعة، والاتجاه. ومع ذلك، في الجسم الحي، والخلايا في كثير من الأحيان تتحرك بشكل جماعي مع الحفاظ على تقاطعات خلية خلية، وخاصة خلال مرحلة التطور الجنيني، التئام الجروح، والانبثاث. وهكذا، الهجرة الخلية الجماعية هي منطقة النمو وبارزة على نحو متزايد من البحوث في مجال الهجرة الخلية. وقد تم مؤخرا وصف الهجرة الجماعية من هذه الخلايا 7 ولها العديد من المزايا الفريدة التي تجعل من نظام قوي لدراسة الهجرة الخلية الجماعية في نموذج التئام الجروح. ove_content &quot;&gt; وعندما التقطه جداول من الزرد الكبار تخدير، لا تزال بعض الأنسجة الظهارية التي تعلق على الجانب السفلي من الجدول. عند إضافة مستنبت الخلية، وهذه الخلايا الظهارية، أو keratocytes، تهاجر بسرعة كوحدة جماعية من الحجم الكبير. و يمكن الاطلاع على ثقافة يزدرع باعتبارها الظهارية الجرح نموذج الشفاء، حيث تقوم الخلايا تهاجر بعيدا عن يزدرع كما يفعلون عبر مصفوفة المؤقت جرح سرير لإعادة تأسيس ظهارة سليمة. وتشير البيانات الحديثة إلى أن هذا خارج الحي يقلد الثقافة العديد من الميزات لل في الجسم الحي التئام الجروح في الزرد الكبار. معدلات إغلاق الجرح 8 تترجم إلى سرعة هجرة مماثلة لتلك التي لوحظت في فيفو السابقين نظام 7. وبالإضافة إلى ذلك، في جرح في الجسم الحي الشفاء نموذج، والمعاملة مع الوارفارين تشير إلى أن الإرقاء ليس له تأثير على معدل للشفاء، بينما العلاج مع الهيدروكورتيزون لتقليل استجابة مناعية لا يؤخر عودة التظهرن 8 </سوب&gt;. كما لا تنزف الزرد عند إزالة نطاق من الحيوان، الارقاء ليست لاعبا رئيسيا. على الرغم من أننا قد وجدت خلايا المناعة في إإكسبلنتس، ونحن لم درست الآثار التي قد تترتب على الهجرة الخلية الجماعية. يصف بروتوكول المعروضة هنا كيفية تأسيس الزرد الثقافات خلية قرنية يزدرع أن ضمان الاتساق واستنساخ للاستخدام في العديد من المقايسات البيولوجية. هذه الثقافات يزدرع هي مقنعة خاصة في نموذج المختبر للهجرة الخلايا الجماعية لعدة أسباب. أولا، keratocytes الزرد هي الخلايا الأولية المستخدمة في غضون ساعات من إقامة الثقافات يزدرع. ولذلك، فإن هذه الخلايا لا خضعت لتغيرات مورفولوجية والتعبير الجيني المرتبط مرور الخلايا الأولية 9-13. ثانيا، هذا النظام يمثل نموذجا لدراسة عودة التظهرن ردا على إصابة 14، وكجزء من الاستجابة للإصابة، وهو الظهارية لالوسيطة TRيبدأ ansition (EMT) عملية كما يتضح من التغيرات في التعبير الجيني وإعادة ترتيب هيكل الخلية 14،15. وهكذا، تم التعرف على التغييرات خلفية في التعبير الجيني والحركة التي تحدث في الخلايا غير المعالجة وتوفير إطار لتفسير التغييرات مع العلاج. وعلاوة على ذلك، فإن خلية قرنية الأسماك والقرنية البشرية وتعادل وظيفيا. على حد سواء هي الخلايا الظهارية الأولية من الأنواع الخاصة بكل منها ولعب دورا رئيسيا في الظهارية التئام الجروح. الثالث، الزرد الكبار تكتسب الاعتراف كنظام نموذج لمجموعة متنوعة من الأمراض التي تصيب الإنسان 16-18 بما في ذلك سرطان الجلد وغيرها من أنواع السرطان 19-21، الجرح الجلدي الشفاء 8،14 والأنسجة تجديد 22-24. المزايا الفنية لهذا النظام النموذجي هي مقنعة على حد سواء. وتتوفر من غير الهادفة للربح، ومرافق مركزية وهناك عدد متزايد من خطوط متحولة والمعدلة وراثيا. على وجه التحديد، ومشروع الطفرة اسماك الزرد (ZMP) في معهد ويلكوم ترست سانجر يهدف إلى إنشاء أليل خروج المغلوب في كل بروتين الترميز الجينات في الجينوم الزرد. حاليا، فقد تحور الجينات 11892، ما يقرب من 45٪ من الجينوم، مع 24088 الأليلات يتميز. وبالإضافة إلى ذلك، ZMP تقبل المقترحات وسوف تولد تدق الرافضة مجانا. الطرق الحديثة في ضربة قاضية الجينات في اليرقات والكبار الزرد 25-28 توفر المرونة اللازمة لدراسة وظيفة الجينات الهامة تنمويا التي النهج المعدلة وراثيا هي إشكالية أو غير عملية. بسبب بمعدلات سريعة للغاية على من الحركة من ~ 145 ميكرون / ساعة بعد وقت قصير من إنشاء الثقافات 29، فحوصات يمكن أن تكتمل بسرعة (عادة في 24 ساعة أو أقل). كما التجارب يمكن أن تكتمل بسرعة والثقافات تنمو بشكل جيد في RT، العديد من العقبات التقنية المرتبطة يتم تجنب المقايسات الثدييات الهجرة الخلية التي تنطوي المجهري الفيديو. وبالإضافة إلى ذلك، في سن تشديد ميزانيات البحوث، zebrafوبسهولة وبتكلفة زهيدة الحفاظ على العش. هيكل وسلوك يزدرع معقد. وبما أن الأسماك لا تنزف عند إزالة النطاق، وأنه من غير المرجح أن أكثر بكثير من طبقات البشرة السطحية وإزالتها مع الحجم. تظهر Keratocytes أن يكون نوع من الخلايا السائد في يزدرع عندما تتم إزالة المقاييس في البداية من الأسماك كما تظهر الغالبية العظمى من الخلايا لوصمة عار مع الأجسام المضادة لمكافحة E-كادهيرين 14. وعلاوة على ذلك، ليس هناك أي دليل من الخلايا الليفية في ثقافة الأولية كما تقرره غياب فيمنتين تلطيخ المناعي 14. ومع ذلك، مع إزالة القشور المتكررة، يبدو أن هناك العديد من العدلات في النباتى (انظر فيديو 1). لقد حددنا هذه الخلايا كما العدلات بناء على الملاحظات الشكلية من حجمها، بسرعة الحركة، وهجرتهم من ورقة خلية عندما تتعرض لLPS (لا تظهر البيانات). بالإضافة إلى ذلك، هذه الخلايا وصمة عار الطرافة الزاهيةح أجسام مضادة لعامل عصاري خلوي العدلات وكذلك مع مجموعة متنوعة من الأجسام المضادة مفتش الثانوية، مما يدل على أن لديهم FcRs وفيرة على سطحها (لا تظهر البيانات). طبقات خلايا متعددة موجودة ضمن النباتى. المجهر متحد البؤر يكشف وجود طبقة واحدة بالقرب من الحافة الأمامية لأكثر من طبقتين من keratocytes بالقرب من النطاق مع العدلات مرئية فوق، تحت، وبين الأوراق خلية قرنية الخلية. في نقاط زمنية مبكرة، الخلايا على حافة متعدد الطبقات يزدرع استقطاب، وبدء الهجرة الجماعية للkeratocytes من يزدرع بأسعار الأولى من ~ 145 ميكرون / ساعة. المنطقة التي تغطيها يزدرع يزيد بسرعة، مما يؤدي إلى خلية نشر والتوتر داخل ورقة، وانخفاض معدل مسبقا من الحافة الأمامية. ويلاحظ interconversions السريع بين الخلايا القائد والتابعين على حافة الرائدة خلال تشكيل وإغلاق الثقوب تشكلت عفويا خلال ورقة 7. وبما أنوتستمر عملية EMT بدأت مع يزدرع، شظايا ورقة وتفقد keratocytes المتخصصة، والقدرة على الحركة السريعة لها. التعبير الجيني والتغيرات المورفولوجية تتفق مع EMT، التئام الجروح، والاستجابات الالتهابية تحدث خلال 7 أيام من الثقافة مع إإكسبلنتس التي يجري النظر فيها قابلة للحياة لنحو 10 أيام 14.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="777">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:320px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:267px;">35 mm Glass Bottom Culture Dishes (Poly-D Lysine Coated)&#160;</td>
			<td style="width:71px;">MatTek</td>
			<td style="width:119px;">P35GC-1.5-14-C</td>
			<td style="width:320px;">1.5 mm&#160; thickness is best for coverslip removal.&#160; 14 mm diameter provides more culture area.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Swiss Jewelers Style Forceps, Integra, Miltex 17-303</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">21909-460</td>
			<td style="width:320px;">We find that narrow, fine forceps work the best for scale removal.&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

zebrafish keratocyte explants to study collective cell migration and reepithelialization in cutaneous wound healing

نظرا لخصائص متحركة فريدة من نوعها، فصل keratocytes الأسماك من منذ فترة طويلة تستخدم الثقافات يزدرع لدراسة آليات الهجرة خلية واحدة. ومع ذلك، عندما يتم تأسيس إإكسبلنتس، وهذه الخلايا أيضا تتحرك بشكل جماعي، والحفاظ على العديد من الميزات التي تجعل الفرد keratocytes نموذجا جذابا لدراسة الهجرة: سرعة معدلات الحركة، واسعة النطاق، الأكتين الغنية صفاحات مع كابل الأكتين عمودي، وبسرعة ثابتة نسبيا و اتجاه الهجرة. في إإكسبلنتس وقت مبكر، وinterconversion السريع لخلايا المهاجرة بشكل فردي مع أولئك الذين يهاجرون جماعيا يسمح دراسة دور التصاقات خلية خلية في تحديد النمط من الهجرة، وتشدد على الروابط الجزيئية بين وضعي للهجرة. الخلايا في إإكسبلنتس في وقت لاحق تفقد قدرتها على الهجرة بسرعة وبشكل جماعي باعتباره الظهارية لالوسيطة الانتقال يحدث ويتم التعبير عن الجينات المرتبطة التئام الجروح والتهاب تفاضلي. وهكذا، يمكن إإكسبلنتس خلية قرنية بمثابة نموذج في المختبر لعودة التظهرن الذي يحدث أثناء الجلدي التئام الجروح ويمكن أن تمثل نظاما فريدا لدراسة آليات الهجرة الخلية الجماعية في سياق برنامج محدد للتغيرات التعبير الجيني. هي مجموعة متنوعة من خطوط الزرد متحولة والمعدلة وراثيا المتاحة، والتي تسمح إإكسبلنتس التي ستنشأ من السمك مع خلفيات وراثية مختلفة. وهذا يسمح للدور البروتينات المختلفة داخل هذه العمليات التي ينبغي معالجتها بشكل فريد. البروتوكولات المذكورة هنا تصف طريقة سهلة وفعالة لإقامة هذه الثقافات يزدرع لاستخدامها في مجموعة متنوعة من المقايسات المتعلقة بالهجرة خلية الجماعية.

كما هو موضح في الشكل رقم 1، ورقة من keratocytes يمكن ملاحظة المهاجرة خارج من تحت نطاق غضون ساعات من تأسيس ثقافة يزدرع. أحيانا، وهي خلية قرنية المهاجرة بشكل فردي والتي قد كسر بعيدا عن ورقة المهاجرة بشكل جماعي ويمكن ملاحظة. وبالإضافة إلى ذلك، كما تم تأسيس يزدرع من ال?...

Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing at JoVE.com

Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing

keratocytes الزرد الهجرة في أوراق خلية من إإكسبلنتس وتقديم نموذج في المختبر لدراسة آليات الهجرة الخلية الجماعية في سياق الظهارية التئام الجروح. هذه البروتوكولات بالتفصيل وسيلة فعالة لإقامة الثقافات يزدرع الأولية لاستخدامها في المقايسات الهجرة الجماعية الخلية.

الزرد خلية قرنية إإكسبلنتس لدراسة الهجرة الجماعية خلية وعودة التظهرن في شفاء الجروح الجلدية

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell ...

zebrafish-keratocyte-explants-to-study-collective-cell-migration

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.9K Views.  Midwestern University.  keratocytes الزرد الهجرة في أوراق خلية من إإكسبلنتس وتقديم نموذج في المختبر لدراسة آليات الهجرة الخلية الجماعية في سياق الظهارية التئام الجروح. هذه البروتوكولات بالتفصيل وسيلة فعالة لإقامة الثقافات يزدرع الأولية لاستخدامها في المقايسات ...

Video: Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and inflammatory responses. Given the current interest in the role of mesenchymal stromal cells in mediating tissue repair, we are interested in quantifying the migratory capacity of these cells, and understanding how migratory capacity may be altered after damage. Optimization of a rigorously quantitative migration assay that is both easy to customize and cost-effective to perform is key to answering questions concerning alterations in cell migration in response to various stimuli. Current methods for quantifying cell migration, including scratch assays, trans-well migration assays (Boyden chambers), micropillar arrays, and cell exclusion zone assays, possess a range of limitations in reproducibility, customizability, quantification, and cost-effectiveness. Despite its prominent use, the scratch assay is confounded by issues with reproducibility related to damage of the cell microenvironment, impediments to cell migration, influence of neighboring senescent cells, and cell proliferation, as well as lack of rigorous quantification. The optimized scratch assay described here demonstrates robust outcomes, quantifiable and image-based analysis capabilities, cost-effectiveness, and adaptability to other applications.

The capacity to migrate is a key function of many different cell types, including mesenchymal stromal cells (MSCs). However, quantifying alterations in migratory capacity after damage is challenging. This protocol describes an easily adaptable migration assay that uses rigorous statistics to quantify changes in MSC migratory capacity after damage.

تعظيم الاستفادة من الفحص الجرح خدش للكشف عن تغيرات في الفئران الوسيطة اللحمية الهجرة الخلية بعد الأضرار التي كتبها القابلة للذوبان استخراج دخان السجائر

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

الخلايا الجذعية مثل<em&gt; القيطم</em&gt; الجنينية إإكسبلنتس إلى الدراسة في وقت مبكر العصبية التنموية الميزات<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في فيفو</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

تحليل<em&gt; في فيفو</em&gt; الهجرة الخلية باستخدام الزرع خلية والتصوير الوقت الفاصل في الزرد الأجنة

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading to cirrhosis with hepatocellular dysfunction. Among multiple hepatic insults, alcohol abuse can lead to significant health problems including liver failure and hepatocellular carcinoma. Nonetheless, the identity of endogenous cellular sources that regenerate hepatocytes in response to alcohol has not been properly investigated. Moreover, few studies have effectively modeled hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury. We recently reported on establishing an ethanol (EtOH)-induced fibrotic liver model in zebrafish in which hepatic progenitor cells (HPCs) gave rise to hepatocytes upon near-complete hepatocyte loss in the presence of fibrogenic stimulus. Furthermore, through chemical screens using this model, we identified multiple small molecules that enhance hepatocyte regeneration. Here we describe in detail the procedures to develop an EtOH-induced fibrotic liver model and to perform chemical screens using this model in zebrafish. This protocol will be a critical tool to delineate the molecular and cellular mechanisms of how hepatocyte regenerates in the fibrotic liver. Furthermore, these methods will facilitate potential discovery of novel therapeutic strategies for chronic liver disease in vivo.

Sustained fibrosis with deposition of excessive extracellular matrix proteins leads to cirrhosis. Alcohol abuse is one of the main causes of severe liver disease. We established an ethanol-induced zebrafish fibrotic liver model to study the mechanisms and strategies of promoting hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury.

تطوير متليفة الكبد نموذج الناجم عن الإيثانول في الزرد لدراسة السلف بوساطة الخلايا الكبدية التجديد

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene therapy in organ-cultured corneas. The diabetic corneal disease is a complication of diabetes with frequent abnormalities of corneal nerves and epithelial wound healing. We have also documented significantly altered expression of several putative epithelial stem cell markers in human diabetic corneas. To alleviate these changes, adenoviral gene therapy was successfully implemented using the upregulation of c-met proto-oncogene expression and/or the downregulation of proteinases matrix metalloproteinase-10 (MMP-10) and cathepsin F. This therapy accelerated wound healing in diabetic corneas even when only the limbal stem cell compartment was transduced. The best results were obtained with combined treatment. For possible patient transplantation of normalized stem cells, an example is also presented of the optimization of gene transduction in stem cell-enriched cultures using polycationic enhancers. This approach may be useful not only for the selected genes but also for the other mediators of corneal epithelial wound healing and stem cell function.

An example of adenoviral gene therapy in the human diabetic organ-cultured corneas is presented towards the normalization of delayed wound healing and markedly reduced epithelial stem cell marker expression in these corneas. It also describes the optimization of this process in stem cell-enriched limbal epithelial cultures.

العلاج الجيني الفيروسة الغدانية لمرضى السكري اعتلال القرنية: التأثيرات على شفاء الجروح ووقف علامة الخلية التعبير في الإنسان القرنيات الجهاز مثقف والخلايا الظهارية الحوفي

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The M&#252;ller glia re-enter the cell cycle and produce neuronal progenitor cells that undergo subsequent rounds of cell divisions and differentiate into the lost neuronal cell types. Both M&#252;ller glia and neuronal progenitor cell nuclei replicate their DNA and undergo mitosis in distinct locations of the retina, i.e. they migrate between the basal Inner Nuclear Layer (INL) and the Outer Nuclear Layer (ONL), respectively, in a process described as Interkinetic Nuclear Migration (INM). INM has predominantly been studied in the developing retina. To examine the dynamics of INM in the adult regenerating zebrafish retina in detail, live-cell imaging of fluorescently-labeled M&#252;ller glia/neuronal progenitor cells is required. Here, we provide the conditions to isolate and culture dorsal retinas from Tg[gfap:nGFP]mi2004 zebrafish that were exposed to constant intense light for 35 h. We also show that these retinal cultures are viable to perform live-cell imaging experiments, continuously acquiring z-stack images throughout the thickness of the retinal explant for up to 8 h using multiphoton microscopy to monitor the migratory behavior of gfap:nGFP-positive cells. In addition, we describe the details to perform post-imaging analysis to determine the velocity of apical and basal INM. To summarize, we established conditions to study the dynamics of INM in an adult model of neuronal regeneration. This will advance our understanding of this crucial cellular process and allow us to determine the mechanisms that control INM.

Zebrafish retinal regeneration has mostly been studied using fixed retinas. However, dynamic processes such as interkinetic nuclear migration occur during the regenerative response and require live-cell imaging to investigate the underlying mechanisms. Here, we describe culture and imaging conditions to monitor Interkinetic Nuclear Migration (INM) in real-time using multiphoton microscopy.

ثقافة الكبار المعدلة وراثيا الزرد الشبكية إإكسبلنتس التصوير خلية حية من قبل Multiphoton المجهر

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

A Device for Performing Cell Migration/Wound Healing in a 96-Well Plate

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor metastasis. In this assay, cells are grown to form a confluent monolayer and a mechanical wound is created by scratching with a device. Then the migration rate of the cells towards the denuded area can be monitored by imaging. Our 8-channel mechanical wounder is designed to tackle most of the problems associated with the cell migration assay. Firstly, our wounder can be easily sterilized by autoclaving or with common disinfectants. Secondly, the individual adjustable pins allow even contact with the cell culture plate so that sharp and reproducible wounds can be created. Thirdly, the guiding bars on both sides of the wounder ensure consistent wounding position in each well. The use of disposable plastic pipette tips for wounding can further provide better handling of the wounder as well as to minimize cross-contamination. In conclusion, our cell wounder can provide researchers with a user friendly and reproducible device for performing the cell migration assay using the standard 96-well culture plate.

Here, we present a protocol to perform a semi-high throughput cell migration assay on a 96-well cell culture plate. This protocol is a fast, simple and economical method to create consistent scratch wounds on a cell monolayer.

جهاز لأداء الهجرة خلية / شفاء الجروح في لوحة 96-حسنا

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in zebrafish during different developmental stages. To investigate the role of endoglin(eng) in vessel formation during the development of hereditary hemorrhagic telangiectasia&#160;(HHT), morpholino-mediated targeted knockdown of eng in zebrafish are used to study its temporal expression and associated functions. Here, whole-mount in situ RNA hybridization (WISH) is employed for the analysis of eng and its downstream genes in zebrafish embryos. Also, tube formation assays are performed in HHT patient-derived induced pluripotent stem cell-differentiated&#160;endothelial cells (iPSC-ECs; with eng mutations). A specific signal amplifying system using the whole amount In Situ Hybridization &#8211; WISH provides higher resolution and lower background results compared to traditional methods. To obtain a better signal, the post-fixation time is adjusted to 30 min after probe hybridization. Because fluorescence staining is not sensitive in zebrafish embryos, it is replaced with diaminobezidine (DAB) staining here. In this protocol, HHT&#160;patient-derived iPSC lines containing an eng mutation are differentiated into endothelial cells. After coating a plate with basement membrane matrix for 30 min at 37 &#176;C, iPSC-ECs are seeded as a monolayer into wells and kept at 37 &#176;C for 3 h. Then, the tube length and number of branches are calculated using microscopic images. Thus, with this improved WISH protocol, it is shown that reduced eng expression affects endothelial progenitor formation in zebrafish embryos. This is further confirmed by tube formation assays using iPSC-ECs derived from a patient with HHT. These assays confirm the role for eng in early vascular development.

Presented here is a protocol for whole-mount in situ RNA hybridization analysis in zebrafish and tube formation assay in patient-derived induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells to study the role of endoglin in vascular formation.

التهجين الكامل في الموقع في أجنة حمار وحشي وأنبوب تشكيل اساي في iPSC-ECs لدراسة دور Endoglin في التنمية الوعائية

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

A Drosophila Model to Study Wound-induced Polyploidization

Polyploidy is a frequent phenomenon whose impact on organismal health and disease is still poorly understood. A cell is defined as polyploid if it contains more than the diploid copy of its chromosomes, which is a result of endoreplication or cell fusion. In tissue repair, wound-induced polyploidization (WIP) has been found to be a conserved healing strategy from fruit flies to vertebrates. WIP has several advantages over cell proliferation, including resistance to oncogenic growth and genotoxic stress. The challenge has been to identify why polyploid cells arise and how these unique cells function. Provided is a detailed protocol to study WIP in the adult fruit fly epithelium where polyploid cells are generated within 2 days after a puncture wound. Taking advantage of D. melanogaster&#39;s extensive genetic tool kit, the genes required to initiate and regulate WIP, including Myc, have begun to be identified. Continued studies using this method can reveal how other genetic and physiological variables including sex, diet, and age regulate and influence WIP&#39;s function.

A Drosophila Model to Study Wound-induced Polyploidization

Wound-induced polyploidization is a conserved tissue repair strategy where cells grow in size instead of dividing to compensate for cell loss. Here is a detailed protocol on how to use the fruit fly as a model to measure ploidy and its genetic regulation in epithelial wound repair.

نموذج دروسوفيليا لدراسة البوليسبليد الناجم عن الجروح

Polyploidy is a frequent phenomenon whose impact on organismal health and disease is still poorly understood. A cell is defined as polyploid if it ...

Murine Excisional Wound Healing Model and Histological Morphometric Wound Analysis

The murine excisional wound model has been used extensively to study each of the sequentially overlapping phases of wound healing: inflammation, proliferation and remodeling. Murine wounds have a histologically well-defined and easily recognizable wound bed over which these different phases of the healing process are measurable. Within the field, it is common to use an arbitrarily defined &#8220;middle&#8221; of the wound for histological analyses. However, wounds are a three-dimensional entity and often not histologically symmetrical, supporting the need for a well-defined and robust method of quantification to detect morphometric defects with a small effect size. In this protocol, we describe the procedure for creating bilateral, full-thickness excisional wounds in mice as well as a detailed instruction on how to measure morphometric parameters using an image processing program on select serial sections. The two-dimension measurements of wound length, epidermal length, epidermal area, and wound area are used in combination with the known distance between sections to extrapolate the three-dimension epidermal area covering the wound, overall wound area, epidermal volume and wound volume. Although this detailed histological analysis is more time and resource consuming than conventional analyses, its rigor increases the likelihood of detecting novel phenotypes in an inherently complex wound healing process.

This protocol describes how to generate bilateral, full-thickness excisional wounds in mice and how to subsequently monitor, harvest, and prepare the wounds for morphometric analysis. Included is an in-depth description of how to use serial histological sections to define, precisely quantify and detect morphometric defects.