이 작품은 연구 촉진 그랜트 EEH 연구의 중서부 대학 Office 및 교내 그랜트 KJL에게 수여 스폰서 프로그램에게 수여 보건 과학 중서부 대학에서 기금에 의해 지원되었다.

이 프로토콜은 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 AVMA 동물 복지 원칙을 준수 중서부 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다. 마취, 장비, 및 미디어의 1. 준비 <ol><li> 상업 탈염 제 (애완 동물 상점에서 구입 가능) 또는 24 시간 동안 물 받침대를 시켜서 하나를 사용하여 수돗물의 약 1.5 L를 탈염 소화. 세 1 L 비커를 확보하고 물 탈 염소 500 ml의 각을 입력합니다. 모든 절차 전에 물고기를 잡고 하나 및 복구를 위해 하나의 레이블. 세 번째 비커에, tricaine 메탄의 100 ㎍ / ㎖의 추가; 이것은 물고기는 마취 될 것이다 비커된다. </li><li> 배양액을 따뜻하게, 얼음으로 얕은 트레이 채우기 (RPMI 1640, 10 % FBS (소 태아 혈청), 50 μg의를 / ㎖ 겐타 마이신, 100 ㎍ / ㎖의 카나마이신, 25 mM의 HEPES) RT, 그리고 깨끗한 보석의 족집게를 수집합니다. 임멜으로 청소 핀셋70 % 에탄올에 팁을 노래하고 에탄올 연소 할 수 있도록, 분젠 버너를 통해 전달합니다. </li><li> 10 배 확대, 또는 현미경 (개인 취향에 전적으로 의존)을 해부 - 프로 시저가 2 상업, 탁상 조명 돋보기, 확대없이 수행 될 것입니다 여부를 결정합니다. </li></ol> 2. 이식편 문화 구축 <ol><li> 유지 비커에 물고기와 장소의 수를 잡아라. 마취 비커에 하나의 물고기를 이동; 개별적으로 물고기를 마취하는 것이 가장 좋습니다. </li><li> 물고기의 수영과 아가미의 움직임을 관찰하여 마취의 효과를 모니터링합니다. 마취가 진행됨에 따라, 아가미 운동은 느려지고 물고기는 불규칙하게 자주 거꾸로 헤엄; 즉시 아가미 운동 중단으로 마취 물고기를 고려한다. 이 물고기의 사망을 초래할 수 있으므로 마취 욕조에서 오랜 기간 동안 물고기를 두지 마십시오. </li><li> 마취 비커 및 전송에서 물고기를 제거얼음, 핀셋을 잡는 손에 대향 꼬리 가로 배치 물고기. 기법 및 여러 경우가 발생하면 물고기, 이식편을 이때 마취 비이커에 다음 물고기를 배치하는 데 사용되는 것을 고려하여야한다. </li><li> 비늘을 제거하려면, 위치 핀셋 규모의 가장자리에 끝이 물고기에 평행. 스케일이 물고기의 몸에서 상승의 원인이 약간 물고기의 측면에 핀셋의 평평한면을 밟아. 조직 배양 접시에 핀셋, 당기기, 그리고 (반전 없음) 장소와 규모를 잡고. 아가미 지역, 측면 라인, 그리고 핀을 피하고, (각 측면에서 6) 큰 성인 12 스케일의 최대 제거 절차를 반복합니다. </li><li> 복구 비커에 물고기를 배치하고 마취의 영향에서 회복하기 위해 모니터링 할 수 있습니다. 이때, 물고기 개별 탱크로 다시 전송 될 수있다. 물고기가 완전한 규모의 재생을 허용하기 위해 최소 21 일 동안 복구 할 수 있습니다. </li><li> 에 따라유리 바닥 접시 당 6 저울 - 실험 설계, 플라스틱 35mm 조직 배양 처리 접시 당 20 저울 또는 최대 4 놓습니다. 저울 접시에서 스케일을 분리하지 않도록 부드럽게 용지를 추가하기 전에 접시에 부착 할 수 있습니다. 주 : 매체가 제 접시에 첨가되기 전에 경험, 여러 물고기 처리 될 수있다. </li><li> 각 35mm 접시에 완전한 미디어 (위의 1.2 참조)의 1.2 ML을 추가합니다. </li><li> 바람직하게 또는 추가 처리없이 시간의 원하는 기간 동안 5 % CO 2에서 28 ° C에서 이식편 문화를 배양한다. 대안 적으로, 가열 스테이지 상 현미경 또는 비디오 현미경 생균 배양 챔버 내에 배양 부화. </li></ol> 3. 브라이트 및 비디오 현미경 <ol><li> 처음 현미경 무대에 세포 시트를 포함하고 위치 요리는 4 배 대물 렌즈를 사용하여 초점을 맞 춥니 다. 주 : 높은 배율은 실험에 따라 사용될 수있다. 의 위치를​​ 표시각 셀 시트 및 / 또는 무대에서 접시의 방향은 거의 같은 방향으로 시트와 함께 시간이 지남에 촬영에 용이합니다. </li><li> 각 실험 프로토콜에 따라, 다양한 시점에서 인큐베이터와 사진에서 요리를 제거하고 만 정지 영상이 실험 기간에 걸쳐 필요한 경우 인큐베이터에 다시 배치합니다. </li><li> 비디오 현미경을 수행하는 동안, 다음에 주목 : <ol><li> 마이그레이션 세포 시트는 비디오의 지속 기간을 위해 시야에서 잔존하도록 시야 내의 스케일 / 신흥 세포 시트를 배치. 참고 :이 세포가 규모에서 마이그레이션하는 방법을 관찰하는 경험이 걸릴 수 있습니다. 짧은 동영상의 경우, 이것은 더 이상 동영상에 대한보다 우려의 적습니다. </li><li> 짧은 시간 프레임의 경우, RT에서 품어. 더 긴 시간 프레임들 (18+ HR)의 경우, 가열 단계 또는 온도를 유지하기 위해 배양 챔버, PH 농도를 사용하여 배양 m의 증발을 최소화edium. </li></ol></li></ol> 면역 형광 현미경 4. 고정 <ol><li> 준비하고 28 ° C까지 사전 따뜻한 모든 솔루션을 제공합니다. 형광 하에서 각막을 볼 유리 바닥 35mm 조직 배양 접시를 사용하여 상기 한 바와 같이 체외 이식편 배양 물을 성장시키기 위해. 또한, 유리 챔버 슬라이드를 사용합니다. </li><li> 각각의 접시에 1.1 배 PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드의 0.8 ML을 추가합니다. 먼저 문화 매체를 제거하지 마십시오. 5 분 후, 용액을 흡인 제거하는 동안 실온에서 인큐베이션. </li><li> 각각의 접시에 1.1 배 PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드의 0.8 ML을 추가합니다. 5 분 후, 용액을 흡인 제거하는 동안 실온에서 인큐베이션. </li><li> 1X PBS 0.5 ml의 0.2 % 트리톤 X-100을 첨가함으로써 외부 리간드 또는 외부 에피토프 Permeabilize 하시려면 세포를 사용하지 않을 경우. 5 분 후, 용액을 흡인 제거하는 동안 실온에서 인큐베이션. </li><li> 1X PBS 0.5 ml의 1 % BSA를 추가하고 (4 ° C에서) 1 (실온에서) 시간 또는 O / N 동안 품어. 주 : 실험 조건에 따라, PHAlloidin를이 단계에서 첨가 될 수있다. </li><li> 배양 후, 흡인은 용액을 제거하고 항체 염색을 진행합니다. 4 ℃에서 3-4주 위해 1X PBS에 1 % BSA 2 ㎖ - 대안 적으로, 적어도 하나를 첨가하여 배양 접시를 저장한다. </li></ol> 5. 면역 형광 프로토콜 <ol><li> 제조업체의 권장 사항에 따라 기본 및 보조 항체 솔루션을 준비합니다. 참고 : 제조업체의 권장 사항을 사용할 수없는 경우, (1X PBS에 1 % BSA)에 차 항체의 좋은 시작 희석 1 : 클론 500 및 1 : 단일 클론 항체 1000; 이차 항체에 대한 좋은 시작 희석 1 : 1000. 신호가 강하고 배경에 문제가있는 경우 신호가 낮은 약한 경우 더 높은 제조업체에서 얻은 원래 주식이 희석을 조정합니다. </li><li> 1X PBS 용액 1 % BSA를 기음. 일차 항체 솔루션의 0.5 ML을 추가 (4 ° C에서) 또는 O / N (실온에서) 1 시간 동안 배양한다. </li&gt; <li> , 차 항체 용액을 제거 배치 깨끗한으로 1.5 ml의 microcentrifuge 관을 표시하고, -20 ℃에서 동결. 주 : 필요한 경우, 차 항체의 재사용을 허용한다. </li><li> 제거하고 각 세척 후 PBS를 폐기, 1X PBS로 5 회 - 요리 3을 씻으십시오. </li><li> 이차 항체 솔루션의 0.5 ML을 추가합니다. 원하는 경우,이 단계에서 (모든 제조업체에서 권장하는 농도 다음) 형광 표지 팔로이 딘을 추가합니다. (4 ° C에서) 또는 O / N (실온에서) 1 시간 동안 품어. 참고 : 사용 팔로이 딘 형광 표지는 액틴 필라멘트의 시각화 할 수 있습니다; 우리는 488 표지 팔로이 딘이 우리의 제브라 피쉬 각막에 가장 적합한 것을 발견하지만, 다른 형광 물질을 사용할 수있다. </li><li> 제거하고 차 항체 솔루션을 폐기합니다. </li><li> 제거하고 각 세척 후 PBS를 폐기, 1X PBS로 5 회 - 요리 3을 씻으십시오. 참고 : 접시는 4 ° C 경쟁 할 수없는 경우에, 빛 덮여, 저장 될 수있다바로 w; 확인 1X PBS는 세포가 있지만 따뜻한 RT에 건조하지 않도록하기 위해 보관하기 전에 접시에 추가되어 있는지 확인 (20-30 분), 후 바로 전에 다음 단계로 진행하기에 PBS를 제거합니다. </li><li> 접시에, 실험의 필요에 따라, 또는 DAPI하지 않고, 설치 매체의 3 방울 및 실온에서 10 분 동안 앉아 보자 - 준비가 관찰 할 때, (2)를 추가합니다. 주 : 우리는 DAPI와 시판, 글리세롤 계 장착 매체를 사용하지만, 다른 미디어를 장착 할 수 있습니다. 접시에 앉아 장착 매체 10 분을 허용하면 접시의 바닥에서 유리 커버 슬립 쉽게 제거를 용이하게한다. </li><li> 배양 후, 부드럽게 풀고 커버 슬립을 제거하기 위해 접시의 측면에 짜. 슬라이드에, 아래로, 세포를 유리 슬라이드에 장착 미디어의 추가 하락을 추가하고 coverslip에 배치합니다. 참고 : - 2 일 슬라이드 이상 1 보관해야하는 경우 분명 손톱 매니큐어를 사용하여 슬라이드에 커버 슬립을 밀봉 고려하십시오. </li><li> 형광 현미경 슬라이드를 관찰합니다. 주 : 우리는 대부분의 이미지 오일 침지 아래 또는 40X 63X 대물 렌즈를 이용하여 촬영 한하지만 특정 대물 렌즈는 실험 프로토콜 사용에 의존 할 것이다. </li></ol>

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+fluid+flow+in+rapidly+moving+cells.">Intracellular fluid flow in rapidly moving cells.</a> Nature Cell Biology. 11, 1219-1224 (2009).</li><li>Bereiter-Hahn, J., Strohmeier, R., Kunzenbacher, I., Beck, K., Voth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locomotion+of+Xenopus+epidermis+cells+in+primary+culture.">Locomotion of Xenopus epidermis cells in primary culture.</a> Journal of Cell Science. 52, 289-311 (1981).</li><li>Nishikawa, A., Shimizu-Nishikawa, K., Miller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+characterization,+and+in+vitro+culture+of+larval+and+adult+epidermal+cells+of+the+frog+Xenopus+laevis.">Isolation, characterization, and in vitro culture of larval and adult epidermal cells of the frog Xenopus laevis.</a> In Vitro Cellula., &amp; Developmental Biology. 26, 1128-1134 (1990).</li><li>Schober, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+adhesion+kinase+modulates+tension+signaling+to+control+actin+and+focal+adhesion+dynamics.">Focal adhesion kinase modulates tension signaling to control actin and focal adhesion dynamics.</a> The Journal of Cell Biology. 176, 667-680 (2007).</li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

배지의 첨가 전에 3 분 - 각막 이식편 배양의 성공을 위해 가장 중요한 단계는 스케일이 약 2 배양 접시에 부착 할 수있게된다. 비늘의 약 75 %가 부착하고 (각 실험에 대해 확립 된 배양의 수는 적절히 조절 될 필요가있을 것이다) 시트를 성장할 것이다. 각막 실질 세포 시트는 물고기에서 제거하고 여러 가지 이유로 문화에 배치 모든 규모의 주위에 형성하지 않는다. 첫째, 외식의 DAPI 염색 일부 규?...

<html> 세포 운동성의 연구는 전통적으로 개별적으로 마이그레이션하는 세포에 초점을 맞추고있다. 물고기와 양서류 외식에서 배양 된 각막 간질 세포는 1-6 접근 실험과 수학적 모두 모델링을 사용하여 세포 운동성의 메커니즘을 연구 할 수있는 강력한 모델 시스템을 입증했다. 균일 한 형상, 속도 및 방향을 유지하면서 개별적 세포 이주에 대한 실험은 세포의 빠른 부드러운 글라이딩 운동에 의해 도움을 받는다. 특히 배아, 상처 치유 및 전이 과정, 세포 - 세포 접합을 유지하면서 그러나, 생체 내에서 세포 자주 집단적으로 이동합니다. 따라서, 집단 세포 이동은 세포 이동의 분야 내에서 연구의 성장과 점점 더 눈에 띄는 지역이다. 이러한 세포의 집단 이주는 최근 7을 설명하고 그것이 상처 치유 모델에서 집단 세포의 이동을 연구 할 수있는 강력한 시스템을 만들어 많은 독특한 기능을 가지고 있습니다. ove_content &quot;&gt; 비늘이 마취 성인 지브라 피쉬로부터 축출 될 때, 어떤 상피 조직은 규모의 밑면에 부착 된 상태로 유지. 세포 배양 배지가 첨가되고, 이들 상피 세포 또는 각막을 스케일에서 집단 단위로 급속하게 이동한다.을 절편 배양 세포들이 손상 상피을 다시 침대 상처의 임시 매트릭스에 걸쳐처럼 절편에서 멀리 이동하는 상피 상처 치유 모델로 볼 수있다. 최근 데이터가 제안이 체외 배양 모방의 많은 기능이 생체 내에서 성인 제브라 피쉬 상처 치유. 상처 봉합 률 8 생체 시스템 (7)에서 관찰 된 것과 유사한 이동 속도를 번역. 또한, 생체 내 상처 모델 치유, 와파린 치료 지혈이 속도에 영향을 미치지 않는다는 점을 시사 하이드로 코르티손과 치료 면역 반응을 감소시키는 동안의 치유, 재 상피화 8을 지연시키지 않는다 </&gt; SUP. 규모가 동물로부터 제거 될 때 출혈 지브라 피쉬하지 않으므로, 지혈 주요 플레이어 아니다. 우리가 외식에 면역 세포를 발견했지만, 우리는 그들이 집단 세포의 이동에 미칠 수있는 영향을 연구하지 않았습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 많은 생물학적 분석에 사용 일관성과 재현성을 보장 제브라 피쉬 각막 이식편 문화를 구축하는 방법에 대해 설명합니다. 이 절편 문화는 여러 가지 이유로 집단 세포의 이동에 대한 체외 모델에서 특히 매력적인 있습니다. 첫째, 제브라 피쉬의 각막 간질 세포가 이식편 문화를 확립 시간 이내에 사용 일차 전지이다. 따라서, 이들 세포는 일차 전지 9-13의 통로와 관련된 형태 학적 및 유전자 발현 변화를 겪은 않았다. 둘째로,이 시스템은 상처에 대한 반응, 간엽 TR에 상피의 일부로서, 14 부상에 응답 상피화의 연구를위한 모델을 나타내고유전자 발현의 변화 및 세포 골격 재 배열 (14,15)에 의해 입증 ansition (EMT) 프로세스가 시작된다. 따라서, 처리하지 않은 세포에서 발생하는 유전자 발현 및 운동의 배경 변경 특징 및 치료와 변화를 해석하는 컨텍스트를 제공하고있다. 또한, 물고기 간질과 인간의 각질 세포는 기능적으로 동일; 모두는 각 종의 기본 상피 세포이며 상피 상처 치유에 중요한 역할을한다. 셋째, 성인 제브라 피쉬는 흑색 종 및 기타 암 19 ~ 21, 8, 14 및 조직 재생 22-24 치유 피부 상처를 포함하여 인간의 질병 16-18의 다양한 모델 시스템으로 인정 받고있다. 이 모델 시스템의 기술적 인 장점은 동일하게 강력한이다. 돌연변이와 유전자 변형 라인의 증가는 비영리, 중앙 집중화 된 시설에서 사용할 수 있습니다. 특히, Zebrafish의 돌연변이 프로젝트 (ZMP) 웰컴 트러스트 생어 연구소에서는 제브라 피쉬 게놈 유전자를 코딩 모든 단백질 녹아웃 대립 유전자를 작성하는 것을 목표로하고있다. 현재, 이들은 24,088 대립 특징으로 11,892 유전자, 게놈의 약 45 %의 변이있다. 또한, ZMP는 제안을 받아 무료로 녹아웃을 생성합니다. 애벌레와 성인 zebrafish의 25 ~ 28 유전자 최저의 최근 방법은 형질 전환 방법에 문제 또는 실용적이지 않은 발달 중요한 유전자의 기능을 연구 할 수있는 유연성을 제공한다. ~ 145 μm의 / hr의 운동성 자신의 매우 빠른 속도로 인해 곧 문화 (29)의 설립 후, 분석은 (일반적으로 24 시간 이내에) 신속하게 완료 할 수 있습니다. 실험은 신속하게 종료하고 배양, RT에서 잘 비디오 현미경을 포함하는 포유 동물 세포 이동 분석법이 회피와 관련된 몇몇 기술적 장애물을 재배 할 수있다. 또한, 연구 예산을 긴축의 시대에, zebraf틱은 쉽게 저렴하게 유지됩니다. 이식편의 구조 및 동작은 복잡하다. 스케일이 제거 될 때 출혈 물고기가 없기 때문에, 그것은 표면 상피층보다 훨씬 더 스케일 제거되는 것 같지는 않다. 세포의 대부분이 안티 E-cadherin의 항체 (14) 염색 나타나는 규모가 처음 물고기에서 제거 될 때 각막 간질 세포는 이식편에서 지배적 인 세포 유형으로 나타납니다. 또한, (14)에 의해 면역 염색 멘틴의 부재로 판단 초기 배양 섬유 아세포의 증거는 없다. 그러나 반복 스케일 제거와 함께, 이식편 수많은 호중구있을 표시 (비디오 1 참조). LPS에 노출 될 때 우리는 그 크기, 급속 운동성 및 세포 시트 점 이동의 형태 학적 관찰에 기초 호중구 이들 세포를 확인 하였다 (데이터는 보이지 않음). 또한 이러한 세포는 밝은 지혜를 얼룩호중구 세포질 인자뿐만 아니라 그들과 그 표면에 풍부한 FcR에있는 것을 나타낸다 IgG를 이차 항체의 다양성에 항체 (데이터 미기재) H. 여러 세포층 이식편 내에 존재한다. 초점 현미경을 위, 아래, 및 간질 세포 시트 사이 보이는 호중구와 스케일 근처 각막 2 층 이상에 전연 근처 단층의 존재를 드러낸다. 이른 시점에서, ~ 145 μm의 / hr의 초기 속도에서 각막 이식편에서의 집단적인 이동을 개시하는 다층 이식편을 편광의 에지에서 셀. 이식편 적용 지역은 급속하게 증가 시트 내에서 긴장을 확산 셀에 선도하고, 최첨단의 사전의 감소 속도. 지도자와 추종자 세포 사이의 빠른 상호 전환은 시트 (7) 내에서 자발적으로 형성된 구멍의 형성과 폐쇄시 첨단에서 관찰된다. 로절편으로 시작 EMT 과정은 시트 조각과 각막 자신의 전문, 빠른 운동성을 잃고 계속. 유전자 발현 및 EMT와 일치하는 형태 학적 변화, 상처 치유 및 염증 반응은 외식이 약 십일 (14)에 대한 실행 가능한 것으로 간주되는과 문화의 7 일 이내에 발생합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="777">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:320px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:267px;">35 mm Glass Bottom Culture Dishes (Poly-D Lysine Coated)&#160;</td>
			<td style="width:71px;">MatTek</td>
			<td style="width:119px;">P35GC-1.5-14-C</td>
			<td style="width:320px;">1.5 mm&#160; thickness is best for coverslip removal.&#160; 14 mm diameter provides more culture area.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Swiss Jewelers Style Forceps, Integra, Miltex 17-303</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">21909-460</td>
			<td style="width:320px;">We find that narrow, fine forceps work the best for scale removal.&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

zebrafish keratocyte explants to study collective cell migration and reepithelialization in cutaneous wound healing

때문에 고유 운동성 특성, 물고기 각막 간질 세포가 이식편 문화가 긴 하나의 세포 이동의 메커니즘을 연구하는 데 사용되었습니다에서 해리. 운동의 빠른 속도, 수직 굴지의 케이블로 광범위한 액틴 풍부한 라멜라, 비교적 일정한 속도 : 외식이 설정되어 그러나,이 세포는 개인이 마이그레이션 연구하는 매력적인 모델을 각막 간질 있도록 많은 기능을 유지, 집단적으로 이동 이주의 방향. 초기 이식편에서, 집합 적으로 이러한 마이그레이션 마이그레이션 개별적 세포의 신속한 상호 마이그레이션의 모드를 결정하는 단계에서 세포 - 세포 유착의 역할에 대한 연구를 허용하고, 이동의 두 모드 사이 분자 링크를 강조한다. 중간 엽 전환에 상피가 발생하여 상처 치유 및 염증과 관련된 유전자가 발현 된대로 나중에 절편의 세포는 신속하고 집단적으로 마이그레이션 할 수있는 능력을 상실. 따라서, 각막 이식편은 피부 상처 치유 중에 발생하며 유전자 발현 변화 정의 프로그램의 맥락에서 집단 세포 이동의 메커니즘을 연구하는 독특한 시스템을 나타낼 수 상피화위한 시험 관내 모델이 될 수있다. 돌연변이 형질 전환 제브라 피쉬 라인의 다양한 사용할 수 있습니다 외식 서로 다른 유전 적 배경을 가진 물고기를 설립 할 수있다. 이는 이들 공정 내에서 다른 단백질의 고유 역할 해결 될 수있다. 여기에 설명 된 프로토콜은 집단 세포 이동과 관련된 다양한 분석법에 사용하기 위해 이들 체외 이식편 배양 물을 형성하기위한 간단하고 효과적인 방법을 설명한다.

도 1에 도시 된 바와 같이, 각막 이식편 시트 배양을 설정 시간 이내에 스케일 아래로부터 이주 관찰 될 수있다. 때때로, 집단적으로 마이그레이션 시트에서 떨어져 고장이 개별적으로 마이그레이션 각막 간질 세포는 관찰 할 수있다. 이식편 이전 뽑아했다 물고기에서 설립되었습니다로 또한, 시트를 통해 마이그레이션 풍부한 호중구가있다. 긴 배양 기간에서 세포와 같은 각막 시트 ...

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Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing

Zebrafish의 각막 간질 세포는 외식에서 세포 시트에서 마이그레이션 상피 상처 치유의 맥락에서 집단 세포 이동의 메커니즘 연구를위한 체외 모델을 제공합니다. 이러한 프로토콜 세부 집단 세포 이동 분석에 사용하기위한 기본 이식편 배양 물을 확립 할 수있는 효과적인 방법.

Zebrafish의 각막 실질 세포의 Explants는 피부 상처 치유에 집단 셀 마이그레이션 및 재 상피화을 연구하는

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell ...

zebrafish-keratocyte-explants-to-study-collective-cell-migration

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.9K 조회수.  Midwestern University.  Zebrafish의 각막 간질 세포는 외식에서 세포 시트에서 마이그레이션 상피 상처 치유의 맥락에서 집단 세포 이동의 메커니즘 연구를위한 체외 모델을 제공합니다. 이러한 프로토콜 세부 집단 세포 이동 분석에 사용하기위한 기본 이식편 배양 물을 확립 할 수있는 효과적인 방법. 

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Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and inflammatory responses. Given the current interest in the role of mesenchymal stromal cells in mediating tissue repair, we are interested in quantifying the migratory capacity of these cells, and understanding how migratory capacity may be altered after damage. Optimization of a rigorously quantitative migration assay that is both easy to customize and cost-effective to perform is key to answering questions concerning alterations in cell migration in response to various stimuli. Current methods for quantifying cell migration, including scratch assays, trans-well migration assays (Boyden chambers), micropillar arrays, and cell exclusion zone assays, possess a range of limitations in reproducibility, customizability, quantification, and cost-effectiveness. Despite its prominent use, the scratch assay is confounded by issues with reproducibility related to damage of the cell microenvironment, impediments to cell migration, influence of neighboring senescent cells, and cell proliferation, as well as lack of rigorous quantification. The optimized scratch assay described here demonstrates robust outcomes, quantifiable and image-based analysis capabilities, cost-effectiveness, and adaptability to other applications.

The capacity to migrate is a key function of many different cell types, including mesenchymal stromal cells (MSCs). However, quantifying alterations in migratory capacity after damage is challenging. This protocol describes an easily adaptable migration assay that uses rigorous statistics to quantify changes in MSC migratory capacity after damage.

상처 스크래치 분석의 최적화 가용성 담배 연기 추출물에 의한 손상 후 쥐 중간 엽 기질 세포 이동의 변화를 감지 할

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

연구

발생학

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

줄기 세포처럼<em&gt; Xenopus의</em&gt; 배아의 Explants는 초기 신경 발달의 특징을 연구하는<em&gt; 체외</em&gt; 및<em&gt; 생체</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

분석<em&gt; 생체</em&gt; 셀 마이그레이션 Zebrafish의 배아에서 세포 이식 및 시간 경과 이미징을 사용하여

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading to cirrhosis with hepatocellular dysfunction. Among multiple hepatic insults, alcohol abuse can lead to significant health problems including liver failure and hepatocellular carcinoma. Nonetheless, the identity of endogenous cellular sources that regenerate hepatocytes in response to alcohol has not been properly investigated. Moreover, few studies have effectively modeled hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury. We recently reported on establishing an ethanol (EtOH)-induced fibrotic liver model in zebrafish in which hepatic progenitor cells (HPCs) gave rise to hepatocytes upon near-complete hepatocyte loss in the presence of fibrogenic stimulus. Furthermore, through chemical screens using this model, we identified multiple small molecules that enhance hepatocyte regeneration. Here we describe in detail the procedures to develop an EtOH-induced fibrotic liver model and to perform chemical screens using this model in zebrafish. This protocol will be a critical tool to delineate the molecular and cellular mechanisms of how hepatocyte regenerates in the fibrotic liver. Furthermore, these methods will facilitate potential discovery of novel therapeutic strategies for chronic liver disease in vivo.

Sustained fibrosis with deposition of excessive extracellular matrix proteins leads to cirrhosis. Alcohol abuse is one of the main causes of severe liver disease. We established an ethanol-induced zebrafish fibrotic liver model to study the mechanisms and strategies of promoting hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury.

Zebrafish의에서 에탄올에 의한 섬유 성 간 모델의 개발은 전구 세포 매개 간세포의 재생을 연구하는

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene therapy in organ-cultured corneas. The diabetic corneal disease is a complication of diabetes with frequent abnormalities of corneal nerves and epithelial wound healing. We have also documented significantly altered expression of several putative epithelial stem cell markers in human diabetic corneas. To alleviate these changes, adenoviral gene therapy was successfully implemented using the upregulation of c-met proto-oncogene expression and/or the downregulation of proteinases matrix metalloproteinase-10 (MMP-10) and cathepsin F. This therapy accelerated wound healing in diabetic corneas even when only the limbal stem cell compartment was transduced. The best results were obtained with combined treatment. For possible patient transplantation of normalized stem cells, an example is also presented of the optimization of gene transduction in stem cell-enriched cultures using polycationic enhancers. This approach may be useful not only for the selected genes but also for the other mediators of corneal epithelial wound healing and stem cell function.

An example of adenoviral gene therapy in the human diabetic organ-cultured corneas is presented towards the normalization of delayed wound healing and markedly reduced epithelial stem cell marker expression in these corneas. It also describes the optimization of this process in stem cell-enriched limbal epithelial cultures.

당뇨병 각막에 대한 아데노 바이러스 유전자 치료 : 인간 장기 배양 각막 및 윤부 상피 세포에 상처 치유에 효과 및 세포 마커의 발현 줄기

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The M&#252;ller glia re-enter the cell cycle and produce neuronal progenitor cells that undergo subsequent rounds of cell divisions and differentiate into the lost neuronal cell types. Both M&#252;ller glia and neuronal progenitor cell nuclei replicate their DNA and undergo mitosis in distinct locations of the retina, i.e. they migrate between the basal Inner Nuclear Layer (INL) and the Outer Nuclear Layer (ONL), respectively, in a process described as Interkinetic Nuclear Migration (INM). INM has predominantly been studied in the developing retina. To examine the dynamics of INM in the adult regenerating zebrafish retina in detail, live-cell imaging of fluorescently-labeled M&#252;ller glia/neuronal progenitor cells is required. Here, we provide the conditions to isolate and culture dorsal retinas from Tg[gfap:nGFP]mi2004 zebrafish that were exposed to constant intense light for 35 h. We also show that these retinal cultures are viable to perform live-cell imaging experiments, continuously acquiring z-stack images throughout the thickness of the retinal explant for up to 8 h using multiphoton microscopy to monitor the migratory behavior of gfap:nGFP-positive cells. In addition, we describe the details to perform post-imaging analysis to determine the velocity of apical and basal INM. To summarize, we established conditions to study the dynamics of INM in an adult model of neuronal regeneration. This will advance our understanding of this crucial cellular process and allow us to determine the mechanisms that control INM.

Zebrafish retinal regeneration has mostly been studied using fixed retinas. However, dynamic processes such as interkinetic nuclear migration occur during the regenerative response and require live-cell imaging to investigate the underlying mechanisms. Here, we describe culture and imaging conditions to monitor Interkinetic Nuclear Migration (INM) in real-time using multiphoton microscopy.

다중 광자 현미경으로 라이브 셀 이미징을위한 성인 형질 전환 Zebrafish의 망막의 Explants의 문화

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

A Device for Performing Cell Migration/Wound Healing in a 96-Well Plate

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor metastasis. In this assay, cells are grown to form a confluent monolayer and a mechanical wound is created by scratching with a device. Then the migration rate of the cells towards the denuded area can be monitored by imaging. Our 8-channel mechanical wounder is designed to tackle most of the problems associated with the cell migration assay. Firstly, our wounder can be easily sterilized by autoclaving or with common disinfectants. Secondly, the individual adjustable pins allow even contact with the cell culture plate so that sharp and reproducible wounds can be created. Thirdly, the guiding bars on both sides of the wounder ensure consistent wounding position in each well. The use of disposable plastic pipette tips for wounding can further provide better handling of the wounder as well as to minimize cross-contamination. In conclusion, our cell wounder can provide researchers with a user friendly and reproducible device for performing the cell migration assay using the standard 96-well culture plate.

Here, we present a protocol to perform a semi-high throughput cell migration assay on a 96-well cell culture plate. This protocol is a fast, simple and economical method to create consistent scratch wounds on a cell monolayer.

96 웰 플레이트에 세포 마이그레이션 / 상처 치유를 수행하기위한 장치

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in zebrafish during different developmental stages. To investigate the role of endoglin(eng) in vessel formation during the development of hereditary hemorrhagic telangiectasia&#160;(HHT), morpholino-mediated targeted knockdown of eng in zebrafish are used to study its temporal expression and associated functions. Here, whole-mount in situ RNA hybridization (WISH) is employed for the analysis of eng and its downstream genes in zebrafish embryos. Also, tube formation assays are performed in HHT patient-derived induced pluripotent stem cell-differentiated&#160;endothelial cells (iPSC-ECs; with eng mutations). A specific signal amplifying system using the whole amount In Situ Hybridization &#8211; WISH provides higher resolution and lower background results compared to traditional methods. To obtain a better signal, the post-fixation time is adjusted to 30 min after probe hybridization. Because fluorescence staining is not sensitive in zebrafish embryos, it is replaced with diaminobezidine (DAB) staining here. In this protocol, HHT&#160;patient-derived iPSC lines containing an eng mutation are differentiated into endothelial cells. After coating a plate with basement membrane matrix for 30 min at 37 &#176;C, iPSC-ECs are seeded as a monolayer into wells and kept at 37 &#176;C for 3 h. Then, the tube length and number of branches are calculated using microscopic images. Thus, with this improved WISH protocol, it is shown that reduced eng expression affects endothelial progenitor formation in zebrafish embryos. This is further confirmed by tube formation assays using iPSC-ECs derived from a patient with HHT. These assays confirm the role for eng in early vascular development.

Presented here is a protocol for whole-mount in situ RNA hybridization analysis in zebrafish and tube formation assay in patient-derived induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells to study the role of endoglin in vascular formation.

혈관 발달에서 엔도글린의 역할을 연구하기 위해 iPSC-ECs의 제브라피시 배아 및 튜브 형성 분석에서 시투 혼성화에 대한 전체 마운트

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

A Drosophila Model to Study Wound-induced Polyploidization

Polyploidy is a frequent phenomenon whose impact on organismal health and disease is still poorly understood. A cell is defined as polyploid if it contains more than the diploid copy of its chromosomes, which is a result of endoreplication or cell fusion. In tissue repair, wound-induced polyploidization (WIP) has been found to be a conserved healing strategy from fruit flies to vertebrates. WIP has several advantages over cell proliferation, including resistance to oncogenic growth and genotoxic stress. The challenge has been to identify why polyploid cells arise and how these unique cells function. Provided is a detailed protocol to study WIP in the adult fruit fly epithelium where polyploid cells are generated within 2 days after a puncture wound. Taking advantage of D. melanogaster&#39;s extensive genetic tool kit, the genes required to initiate and regulate WIP, including Myc, have begun to be identified. Continued studies using this method can reveal how other genetic and physiological variables including sex, diet, and age regulate and influence WIP&#39;s function.

A Drosophila Model to Study Wound-induced Polyploidization

Wound-induced polyploidization is a conserved tissue repair strategy where cells grow in size instead of dividing to compensate for cell loss. Here is a detailed protocol on how to use the fruit fly as a model to measure ploidy and its genetic regulation in epithelial wound repair.

상처로 인한 다중계를 연구하는 드로소필라 모델

Polyploidy is a frequent phenomenon whose impact on organismal health and disease is still poorly understood. A cell is defined as polyploid if it ...

Murine Excisional Wound Healing Model and Histological Morphometric Wound Analysis

The murine excisional wound model has been used extensively to study each of the sequentially overlapping phases of wound healing: inflammation, proliferation and remodeling. Murine wounds have a histologically well-defined and easily recognizable wound bed over which these different phases of the healing process are measurable. Within the field, it is common to use an arbitrarily defined &#8220;middle&#8221; of the wound for histological analyses. However, wounds are a three-dimensional entity and often not histologically symmetrical, supporting the need for a well-defined and robust method of quantification to detect morphometric defects with a small effect size. In this protocol, we describe the procedure for creating bilateral, full-thickness excisional wounds in mice as well as a detailed instruction on how to measure morphometric parameters using an image processing program on select serial sections. The two-dimension measurements of wound length, epidermal length, epidermal area, and wound area are used in combination with the known distance between sections to extrapolate the three-dimension epidermal area covering the wound, overall wound area, epidermal volume and wound volume. Although this detailed histological analysis is more time and resource consuming than conventional analyses, its rigor increases the likelihood of detecting novel phenotypes in an inherently complex wound healing process.

This protocol describes how to generate bilateral, full-thickness excisional wounds in mice and how to subsequently monitor, harvest, and prepare the wounds for morphometric analysis. Included is an in-depth description of how to use serial histological sections to define, precisely quantify and detect morphometric defects.