健康科学研究促進助成金の中西部の大学からの資金によってサポートされていたこの作品は、研究とスポンサープログラム学内グラントのオフィスKJLに授与EEHと中西部の大学に授与。

このプロトコルは、実験動物の管理と使用に関するAVMA動物福祉の原則に準拠しており、中西部の大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されています。 麻酔、機器、およびメディアの作製<ol><li>約1.5（ペット店で入手可能）のどちらか、市販の脱塩剤を使用した水道水のLまたは24時間水スタンドをさせることにより、脱塩素。 3 1Lのビーカーを取得し、水を脱塩素500ミリリットルでそれぞれを埋める。すべての手順の前に魚を保持するための1と回復のための1にラベルを付けます。第3のビーカーに、トリカインメタン100μg/ mlを追加します。これは魚が麻酔をされる中でビーカーになる。 </li><li>氷浅いトレイを埋める、培地を温める（RPMI 1640,10％FBS（ウシ胎児血清）、50μg/ mlのゲンタマイシン、100μg/ mlのカナマイシン、25mMのHEPES）RTにし、清潔な宝石商ピンセットを集める。イメルによるクリーンピンセット70％エタノールでのヒントを歌うとエタノールを燃焼させること、ブンゼンバーナーを通過する。 </li><li> 10倍の倍率、または顕微鏡（個人的な好みに完全に依存）を解剖 - 手順は2で、商業、卓上照明付きルーペで、倍率なしで実行するかどうかを決定します。 </li></ol> 2.体外培養物を確立<ol><li>保持ビーカーに魚や場所の所望の数をキャッチ。麻酔のビーカーに、単一の魚を移す。それは個別に魚を麻酔するのが最善です。 </li><li>魚の水泳と鰓の動きを観察することによって麻酔の影響を監視します。麻酔が進行すると、鰓の動きが遅くなり、魚は不規則に、頻繁に逆さまに泳ぎます。とすぐに鰓の動きが止まるように麻酔魚を検討してください。これは魚の死をもたらす可能性がある麻酔浴に長期間魚を放置しないでください。 </li><li>麻酔ビーカーと転送から魚を削除氷に、ピンセットを持つ手に直面して尾を水平に魚を置く。技術で、複数の魚が外植片を作るために使用される場合に経験した場合、この時点で麻酔をビーカー内の次の魚を配置することを検討。 </li><li>スケールを除去するために、位置ピンセットは、スケールの端に先端が魚に平行である。スケールは魚の体から昇格させるために少し魚の側にピンセットの平らな面を押します。摘む、ピンセットで規模を持ち、組織培養皿で（反転なし）の場所。鰓地域、側線、フィンを避け、（それぞれの側から6）大の大人から12のスケールの最大値を除去し、手順を繰り返します。 </li><li>回復ビーカーに魚を置き、麻酔の影響から回復することを確認するために監視する。この時点で、魚が個々のタンクに戻って転送することができる。魚が完全なスケールの再生を可能にするために、少なくとも21日間回復できるようにします。 </li><li>応じてガラスボトムディッシュあたり6スケール - 実験デザイン、プラスチック製の35mm組織培養処理皿当たり20スケールまたは4にまで配置します。スケールは皿からスケールを剥離しないように、静かにメディアを追加する前に皿に接着させる。 注：メディアが最初皿に添加される前に経験により、複数の魚を処理することができる。 </li><li>各35ミリメートル皿に完全なメディア（上記1.2を参照のこと）の1.2ミリリットルを追加します。 </li><li>好ましくは、または追加の処理なし所望の時間、5％CO 2で28℃、外植文化をインキュベートする。また、加熱された顕微鏡ステージ上またはビデオ顕微鏡のための生きた細胞培養チャンバ内の文化をインキュベートする。 </li></ol> 3.明とビデオ顕微鏡<ol><li>顕微鏡ステージ上に、最初は細胞シートを含むポジション料理は4X対物レンズを用いて焦点を合わせる。 注：より高い倍率は実験に応じて、使用することができる。の位置をマーク各細胞シート及び/又はステージ上皿の向きがほぼ同じ方向にシートを経時的に画像を撮影が容易になる。 </li><li>各実験プロトコルに従って、種々の時点でのインキュベーターと写真から料理を取り外し、静止画像のみが実験的な時間枠にわたって必要とされている場合は、インキュベーターに戻し置く。 </li><li>ビデオ顕微鏡の実行中に、次のように注意を払う： <ol><li>位置移行細胞シートは、ビデオの継続時間の視野に残るように、視野内の目盛り/新興の細胞シート。 注：これは、細胞が、スケールの下から移行方法を観察中にいくつかの経験がかかる場合があります。短いビデオでは、これは長いビデオのためのより関心の低い。 </li><li>短い時間枠の場合は、RTでインキュベートする。より長い時間枠（18+時間）については、温度を維持するために加熱されたステージまたはインキュベーションチャンバーを使用してpHバランス、培養mの蒸発を最小限にするedium。 </li></ol></li></ol>免疫蛍光顕微鏡4.固定<ol><li>準備し、28℃に予熱暖かいすべてのソリューション。ガラスボトム35mmの組織培養皿を用いて、上記のように、蛍光下で角膜表示するために、外植片培養物を成長させる。また、ガラスチャンバースライドを使用しています。 </li><li>各ディッシュに1.1倍PBS中の4％パラホルムアルデヒドの0.8ミリリットルを追加します。最初の培養培地を削除しないでください。 溶液を除去するために吸引し、次いで室温で5分間インキュベートする。 </li><li>各ディッシュに1.1倍PBS中の4％パラホルムアルデヒドの0.8ミリリットルを追加します。溶液を除去するために吸引し、次いで室温で5分間インキュベートする。 </li><li> 1X PBS 0.5 mlを、0.2％トリトンX-100を添加することにより、外部のリガンドまたは外部のエピトープ、透過化細胞を使用しない場合。溶液を除去するために吸引し、次いで室温で5分間インキュベートする。 </li><li> 1×PBS中0.5ミリリットルの1％のBSAを追加し（4℃で）1（RTで）時間またはO / Nインキュベートする。 注：実験条件に依存して、のphalloidinこの工程で添加することができる。 </li><li>インキュベーション後、吸引して溶液を除去し、抗体染色を進める。 4℃で4週間 - 3用の1×PBS中の1％BSAを2ml - あるいは、少なくとも1を加算して培養皿を格納する。 </li></ol> 5.免疫蛍光プロトコル<ol><li>製造業者の推奨に従って一次および二次抗体溶液を準備します。 NOTE：ポリクローナル500および1：製造業者の推奨を使用できない場合は、（1×PBS中の1％BSA）で一次抗体の良い出発希釈は1 1,000モノクローナル抗体について、二次抗体のための良い出発希釈は1：千。信号が強く、バックグラウンドが問題となる場合には、信号が低く、弱い場合、より高い製造業者から入手したオリジナルの株式のこれらの希釈液を調整します。 </li><li> 1×PBS溶液中の1％BSAを吸引する。一次抗体溶液0.5mlを加え、（4℃で）またはO / N（RTで）1時間インキュベートする。 </li&gt; <li> 、一次抗体溶液を除去清潔に置き、1.5 mlマイクロチューブを標識し、-20℃で凍結する。 注：必要に応じてこれは、一次抗体の再利用が可能になります。 </li><li>各洗浄後、PBSを除去し、廃棄、1×PBSで5回 - ディッシュ3を洗ってください。 </li><li>二次抗体溶液の0.5ミリリットルを追加します。必要であれば、このステップの間に（どのメーカーの推奨濃度以下）蛍光標識ファロイジンを追加します。 （4℃で）またはO / N（RTで）1時間インキュベートする。 NOTE：蛍光標識ファロイジンの使用は、アクチンフィラメントの可視化を可能にする。我々は488標識ファロイジンは我々のゼブラフィッシュ角膜実質において最適に動作するが、他のフルオロフォアを使用することができることを見出した。 </li><li>二次抗体溶液を除去し、廃棄する。 </li><li>各洗浄後、PBSを除去し、廃棄、1×PBSで5回 - ディッシュ3を洗ってください。 注：皿4℃争うことができない場合に、光からカバーし、保存することができますすぐにワット。 （ - 30分20）、その後の直前次のステップに進むようにPBSを削除する1×PBSは、細胞が完全に乾くけどRTに暖かいないように格納する前に皿に追加されたことを確認してください。 </li><li>準備ができたら、観察する2追加するには - 皿に、実験的なニーズに応じて、DAPIの有無にかかわらず、封入剤の3滴を、室温で10分間放置します。 注：我々はDAPIで市販の、グリセロールベースの​​封入剤を使用していますが、他の取り付けメディアを使用することができます。皿に座って取り付け媒体10分を許可すると、皿の底からカバーガラスを容易に除去することが容易になります。 </li><li>インキュベーション後、軽く緩め、カバースリップを除去するための皿の側面に絞る。スライド上に、下に、細胞をスライドガラス上に取り付けメディアの追加のドロップを追加し、カバースリップを配置。 注： - 2日スライドよりも長い1保持する必要がある場合に明確な爪のポリッシュを使用してスライドにカバースリップを密封することを検討してください。 </li><li>蛍光顕微鏡下でスライドを観察します。 注：私たちの画像のほとんどは、油浸下40Xまたは63X対物レンズを用いて撮影したが、使用される特定の対物レンズは、実験プロトコルに依存します。 </li></ol>

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著者らは、開示することは何もない。

培地の添加の前に、3分間 - 角膜実質細胞移植片培養を成功させるために最も重要なステップは、スケールが約2の培養皿に付着させている。スケールの約75％が、シート（各実験のために確立培養の数はそれに応じて調整する必要がある）に付着し成長する。角膜実質細胞シートは、魚から除去し、いくつかの理由のために培養にあらゆる規模の周りに形成しない。まず、外植のDAPI染色は、?...

<html>細胞運動性の研究は、伝統的に、個別に移動する細胞に集中している。魚や両生類外植片からの培養された角膜実質1-6に近づく実験的および数学的モデリングの両方を使用して、細胞運動のメカニズムを研究するための強力なモデル系であることが判明している。均一な形状、速度、および方向を維持しながら、個別に移動する細胞に対する実験研究は、細胞の急速な、滑らかな滑走運動によって補助される。特に、胚形成、創傷治癒、および転移の間に、細胞間結合を維持しながら、しかし、 インビボにおいて 、細胞は、しばしば集合的に移動する。したがって、集合的な細胞移動、細胞遊走のフィールド内の研究の成長とますます顕著領域である。これらの細胞の集合的な移行は、最近7に記載されており、それは創傷治癒モデルにおいて、集団の細胞遊走を研究するための強力なシステムにする多くのユニークな特徴を有している。 ove_content &quot;&gt;スケールが麻酔され、成体ゼブラフィッシュから引き抜かれると、いくつかの上皮組織は、スケールの下側に取り付けられたままである。細胞培養培地は、これらの上皮細胞、または角膜を添加する場合、スケールからの集合的な単位として急速に移行する。ザ·移植片培養は、細胞が無傷の上皮を再確立するために離れて外植片から、彼らは、創傷床の暫定マトリックス全体に同じように移行するモデル治癒上皮創傷、と見ることができる。最近のデータは、このex vivoでの文化を模倣し、多くの機能を示唆しているin vivoで成体ゼブラフィッシュにおける創傷治癒。創傷閉鎖率は8 エキソビボ系7で観察されるものと同様の移動速度に変換する。また、 インビボでの創傷治癒モデル、ワルファリンによる治療は、止血率に影響を及ぼさないことを示唆している治癒、免疫応答を低下させるヒドロコルチゾンでの処置は再上皮8を遅らせていない間</SUP&gt;。スケールは動物から除去されたとき、ゼブラフィッシュが出血しないように、止血は主要なプレーヤーではない。私たちは外植で免疫細胞を発見したが、我々は彼らが集団的細胞遊走に与えるかもしれない影響を研究していません。 ここで紹介するプロトコルは、多くの生物学的アッセイで使用するための一貫性と再現性を確保するゼブラフィッシュ角膜実質植片培養を確立する方法について説明します。これらの外植片培養は、いくつかの理由のために集団的細胞移動のためのin vitroモデルでは特に魅力的である。まず、ゼブラフィッシュ角膜実質は外植文化を確立する時間以内に使用される主要な細胞である。したがって、これらの細胞は、初代細胞9-13の通路に関連付けられた形態学的および遺伝子発現の変化を受けていない。第二に、このシステムは、創傷への応答、間葉trの上皮の一部として、14が負傷に応答して、再上皮化の研究のためのモデルを表すと遺伝子発現の変化および細胞骨格再配列14,15によって証明されるようにansition（EMT）プロセスが開始される。したがって、未処理の細胞において生じる遺伝子発現と運動性の背景の変化が特徴づけおよび処置変化を解釈するためのコンテキストを提供してきた。また、魚の角膜実質とヒトケラチノサイトは、機能的に同等である。両方は、それぞれの種の主要な上皮細胞である上皮創傷治癒において重要な役割を果たしている。第三に、大人のゼブラフィッシュは、黒色腫および他の癌19-21、8,14および組織再生22-24治癒皮膚の創傷を含むヒト疾患16-18の様々なモデル系として認識を得ている。 このモデルシステムの技術的利点は、同じように魅力的である。突然変異体およびトランスジェニック系統が増え、非営利、集中型の施設から利用できます。具体的には、ゼブラフィッシュ変異プロジェクト（ZMP）ウェルカム·トラスト·サンガー研究所では、ゼブラフィッシュゲノム中のすべてのタンパク質をコードする遺伝子中にノックアウト対立遺伝子を作成することを目指しています。現在、彼らは特徴付け24088アレルで、11892遺伝子、ゲノムの約45％に変異している。また、ZMPは提案を受け入れ、無償でノックアウトを生成します。幼虫と大人のゼブラフィッシュ25-28における遺伝子ノックダウンの最近の方法は、トランスジェニックアプローチが問題か、非現実的であるために発生上重要な遺伝子の機能を研究するための柔軟性を提供する。 〜145ミクロン/ hrの運動性の彼らの非常に急速な速度に起因する間もなく文化29の設立後、アッセイは（通常は24時間以内に）迅速に完了することができます。実験は迅速に完了することができ、培養物を室温で十分に成長するにつれ、ビデオ顕微鏡を含む哺乳動物細胞遊走アッセイに関連する技術的なハードルのいくつかは回避される。また、研究予算を締めるの時代に、zebrafISHは、容易かつ安価に維持されている。 外植片の構造と動作は複雑である。スケールが除去されると、魚が出血しないように、表面的な表皮層よりもはるかに規模で除去するとは考えにくい。角膜実質細胞の大部分は抗E-カドヘリン抗体14を染色するために表示されるスケールは、最初に魚から除去されるときに、外植片における優勢な細胞型であるように見える。さらに、免疫蛍光14によってビメンチン染色の欠如によって判断されるように、最初の培養における線維芽細胞の証拠はない。しかし、繰り返しスケール除去と、（ ビデオ1を参照） を植片における多数の好中球があるように思われる。 LPSにさらされたとき、我々は、それらのサイズ、急速に運動性、および細胞シートのうち、それらの移動の形態学的観察に基づいて、好中球のような、これらの細胞を同定した（データは示さず）。さらに、これらの細胞は明るくウィットを染色好中球サイトゾル因子ならびにとともに、それらがその表面上に豊富なFcRを有することを示す二次IgG抗体の様々な抗体（データは示していない）時間。複数の細胞層が外植片内に存在する。共焦点顕微鏡は、上、下、及び細胞角膜実質細胞シート間の可視好中球スケール付近の角膜実質層以上の前縁付近単層の存在を明らかにする。 初期の時点では、〜145ミクロン/ hrの初期レートでの外植片から角膜実質の集合的な移行を開始する多層外植分極しの端に、上の細胞。外植片によって覆われる領域が急速に増加し、シート内で、張力を拡散セルにつながる、前縁の進行速度の低下。リーダーとフォロワー細胞との間の迅速な相互変換は、シート7内で自然発生的に形成されたホールの形成及び閉鎖時の前縁で観察される。として外植片を用いて開始EMTプロセスは、シート断片を継続し、角膜実質細胞は、特殊化した、迅速な運動性を失う。遺伝子発現とEMTと一致して形態変化、創傷治癒、および炎症反応は外植は約10日間14のための実行可能な検討されて培養7日以内に発生する。

<table><tbody><tr><td>35 mm Glass Bottom Culture Dishes (Poly-D Lysine Coated)</td><td>MatTek</td><td>P35GC-1.5-14-C</td><td>1.5 mm thickness is best for coverslip removal. 14 mm diameter provides more culture area.</td></tr><tr><td>Swiss Jewelers Style Forceps, Integra, Miltex 17-303</td><td>VWR</td><td>21909-460</td><td>We find that narrow, fine forceps work the best for scale removal.</td></tr></tbody></table>

zebrafish keratocyte explants to study collective cell migration and reepithelialization in cutaneous wound healing

それらの固有の運動特性のために、魚の角膜実質細胞は、外植片培養物から解離長い単一細胞移動のメカニズムを研究するために使用されている。植片が確立されている場合しかし、これらの細胞はまた、個体が、移行を研究するための魅力的なモデルを角膜実質にする機能の多くを維持し、一括して移動：運動性の急速な速度、垂直アクチンケーブルとの広範なアクチンに富むラメラ、かつ比較的一定の速度をと移動の方向。初期の外植片では、集合的に移行するものと個別に移動する細胞の迅速な相互変換は、移行のモードを決定する際に、細胞 - 細胞接着の役割の研究を可能にし、移動の二つのモードの間の分子リンクを強調している。間葉への移行上皮が発生し、創傷治癒および炎症に関連する遺伝子が差次的に発現されるように、後に外植片中の細胞を迅速かつ集合的に移行する能力を失う。したがって、角膜実質細胞の外植片、皮膚創傷治癒の間に起こる遺伝子発現の変化の定義されたプログラムのコンテキストで集合的細胞移動のメカニズムを研究するための独自のシステムを表すことができ、再上皮化のためのインビトロモデルとして働くことができる。変異体およびトランスジェニックゼブラフィッシュ系統の様々な、利用可能な外植片は、異なる遺伝的背景を持つ魚から確立されることを可能にする。これは、これらのプロセス内の異なるタンパク質の役割を一意にアドレス指定することを可能にする。ここで概説プロトコルは、集団細胞遊走に関連する種々のアッセイで使用するためにこれらの外植文化を確立するための簡単​​かつ効果的な方法を記載する。

図1に示すように、角膜実質細胞のシートは、移植片培養を確立するための時間以内にスケール直下からの移行を観察することができる。時折、集合的に移行するシートから離れて壊れて個別に移行する角膜実質を観察することができる。外植片が以前に摘み取られ​​ていた魚から確立されたように加えて、シートを通って移動する豊富な好中球があります。より長い培養期間...

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Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing

ゼブラフィッシュ角膜実質は植片から細胞シートに移行し、上皮の創傷治癒の文脈における集団的細胞移動のメカニズムの研究のためのin vitroモデルを提供する。これらのプロトコルの詳細集団細胞遊走アッセイにおいて使用するための一次外植片培養を確立するための効果的な方法。

ゼブラフィッシュ角膜実質外植片は皮膚創傷治癒における集団細胞の移動および再上皮化を研究するために

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell ...

zebrafish-keratocyte-explants-to-study-collective-cell-migration

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.9K ビュー.  Midwestern University. ゼブラフィッシュ角膜実質は植片から細胞シートに移行し、上皮の創傷治癒の文脈における集団的細胞移動のメカニズムの研究のためのin vitroモデルを提供する。これらのプロトコルの詳細集団細胞遊走アッセイにおいて使用するための一次外植片培養を確立するための効果的な方法。 

ビデオ: Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS expression system1 in zebrafish larvae, and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells. The KalTA4-ERT2/UAS system is both inducible and reversible which allows us to induce cell transformation with precise temporal/spatial resolution in vivo. This provides us with a unique opportunity to live image how individual preneoplastic cells interact with host tissues as soon as they emerge, then follow their progression as well as regression. Recent studies in zebrafish larvae have shown a trophic function of innate immunity in the earliest stages of tumorigenesis2,3. Our inducible system would allow us to live image the onset of cellular transformation and the subsequent host response, which may lead to important insights on the underlying mechanisms for the regulation of oncogenic trophic inflammatory responses. We also discuss how one might adapt our protocol to achieve temporal and spatial control of ectopic gene expression in any tissue of interest.

Studying the earliest events of preneoplastic cell progression and innate immune cell interaction is pivotal to understand and treat cancer. Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformations and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells in zebrafish larvae.

幼虫ゼブラフィッシュスキンにおける誘導GAL4 / UASの発現系を用いて自然免疫と前癌細胞の相互作用のライブイメージング

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

発生生物学

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes. External development and optical transparency make these embryos especially amenable to microscopy, and numerous transgenic lines that label specific cell types with fluorescent proteins are available, making the zebrafish embryo an ideal system for visualizing the interaction of vascular, hematopoietic, and other cell types during injury and repair in vivo. Forward and reverse genetics in zebrafish are well developed, and pharmacological manipulation is possible. We describe a mechanical vascular injury model using micromanipulation techniques that exploits several of these features to study responses to vascular injury including hemostasis and blood vessel repair. Using a combination of video and timelapse microscopy, we demonstrate that this method of vascular injury results in measurable and reproducible responses during hemostasis and wound repair. This method provides a system for studying vascular injury and repair in detail in a whole animal model.

This article describes a method for creating a mechanical vessel injury in zebrafish embryos. This injury model provides a platform for studying hemostasis, injury-related inflammation, and wound healing in an organism ideally suited for real-time microscopy.

ゼブラフィッシュ胚における機械的血管損傷

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

タイムラプス明実体顕微鏡でゼブラフィッシュ幼虫における組織修復をキャプチャ

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough understanding of the molecular and cellular mechanisms involved requires experimental tools that allow for inducible, tissue-specific manipulation of gene expression or signaling pathways. Therefore, we and others have recently adapted the TetON system for use in zebrafish. The TetON system facilitates temporally and spatially-controlled gene expression and we have recently used this tool to probe for tissue-specific functions of Wnt/beta&#8211;catenin signaling during zebrafish tail fin regeneration. Here we describe the workflow for using the TetON system to achieve inducible, tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin. This includes the generation of stable transgenic TetActivator and TetResponder lines, transgene induction and techniques for verification of tissue-specific gene expression in the fin regenerate. Thus, this protocol serves as blueprint for setting up a functional TetON system in zebrafish and its subsequent use, in particular for studying fin regeneration.

Here we outline the workflow for using the TetON system to achieve tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin.

ゼブラフィッシュ再生の分子機構を研究するためにテトンシステムの利用

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to follow and manipulate the wound response ex vivo in an environment that closely mimics that of epithelial tissue injury in vivo. This issue was addressed by creating a clinically relevant epithelial ex vivo injury-repair model based on cataract surgery. In this culture model, the response of the lens epithelium to wounding can be followed live in the cells&#8217; native microenvironment, and the molecular mediators of wound repair easily manipulated during the repair process. To prepare the cultures, lenses are removed from the eye and a small incision is made in the anterior of the lens from which the inner mass of lens fiber cells is removed. This procedure creates a circular wound on the posterior lens capsule, the thick basement membrane that surrounds the lens. This wound area where the fiber cells were attached is located just adjacent to a continuous monolayer of lens epithelial cells that remains linked to the lens capsule during the surgical procedure. The wounded epithelium, the cell type from which fiber cells are derived during development, responds to the injury of fiber cell removal by moving collectively across the wound area, led by a population of vimentin-rich repair cells whose mesenchymal progenitors are endogenous to the lens1. These properties are typical of a normal epithelial wound healing response. In this model, as in vivo, wound repair is dependent on signals supplied by the endogenous environment that is uniquely maintained in this ex vivo culture system, providing an ideal opportunity for discovery of the mechanisms that regulate repair of an epithelium following wounding.

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Described here is the establishment of a clinically relevant ex vivo mock cataract surgery model that can be used to investigate mechanisms of the injury response of epithelial tissues within their native microenvironment.

臨床的に関連の確立<em&gt;エクスビボ</emネイティブ微小環境における上皮創傷修復を調査するための&gt;モック白内障手術モデル

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to ...

Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for live high-resolution microscopic imaging of dynamic biological phenomena in space and time with cellular resolution. However, the traditional method of agarose encapsulation for live imaging can impede larval development and tissue regrowth. Therefore, this manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which was designed and fabricated as a functionally compartmentalized device to orient larvae for high-resolution microscopy while permitting caudal fin transection within the device and subsequent unrestrained tail development and re-growth. This device allows for wounding and long-term imaging while maintaining viability. Given that the zWEDGI mold is 3D printed, the customizability of its geometries make it easily modified for diverse zebrafish imaging applications. Furthermore, the zWEDGI offers numerous benefits, such as access to the larva during experimentation for wounding or for the application of reagents, paralleled orientation of multiple larvae for streamlined imaging, and reusability of the device.

This manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which is a compartmentalized device designed to orient and restrain zebrafish larvae. The design permits tail transection and long-term collection of high-resolution fluorescent microscopy images of wound healing and regeneration.

ゼブラフィッシュ幼虫の改良実験操作のための長期のライブ イメージング デバイス

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for ...

生物工学

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function. Our studies have found that dying cells send signals to their live neighbors to form and contract a ring of actin and myosin that ejects it out from the epithelial sheet while closing any gaps that might have resulted from its exit, a process termed cell extrusion1. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe a method to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis. To visualize extrusion, we inject a red fluorescent protein labeled probe for F-actin into one-cell stage transgenic zebrafish embryos expressing green fluorescent protein in the epidermis and induce apoptosis by addition of G418 to larvae. We then use time-lapse imaging on a spinning disc confocal microscope to observe actin dynamics and epithelial cell behaviors during the process of apoptotic cell extrusion. This approach allows us to investigate the extrusion process in live epithelia and will provide an avenue to study disease states caused by the failure to eliminate apoptotic cells.

Dying cells are extruded from epithelial tissues by concerted contraction of neighboring cells without disrupting barrier function. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe methods to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis at cellular resolution.

開発ゼブラフィッシュの表皮から細胞の押出のライブイメージング

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

生物学

<meta charset="utf8"></head><body>再生・開発研究のための堅牢なゼブラフィッシュ細胞移植

High-resolution Cell Transplantation in Embryonic and Larval Zebrafish

Development and regeneration occur by a process of genetically encoded spatiotemporally dynamic cellular interactions. The use of cell transplantation between animals to track cell fate and to induce mismatches in the genetic, spatial, or temporal properties of donor and host cells is a powerful means of examining the nature of these interactions. Organisms such as chick and amphibians have made crucial contributions to our understanding of development and regeneration, respectively, in large part because of their amenability to transplantation. The power of these models, however, has been limited by low genetic tractability. Likewise, the major genetic model organisms have lower amenability to transplantation. 
The zebrafish is a major genetic model for development and regeneration, and while cell transplantation is common in zebrafish, it is generally limited to the transfer of undifferentiated cells at the early blastula and gastrula stages of development. In this article, we present a simple and robust method that extends the zebrafish transplantation window to any embryonic or larval stage between at least 1 and 7 days post fertilization. The precision of this approach allows for the transplantation of as little as one cell with near-perfect spatial and temporal resolution in both donor and host animals. While we highlight here the transplantation of embryonic and larval neurons for the study of nerve development and regeneration, respectively, this approach is applicable to a wide range of progenitor and differentiated cell types and research questions.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:発生および再生中のゼブラフィッシュ神経系における細胞接続性のマッピング

Here we present a protocol to transplant cells with high spatial and temporal resolution in zebrafish embryos and larvae at any stage between at least 1 and 7 days post fertilization.

ゼブラフィッシュの胚および幼生における高分解能細胞移植

Development and regeneration occur by a process of genetically encoded spatiotemporally dynamic cellular interactions. The use of cell transplantation ...

ゼブラフィッシュ角膜実質外植片は皮膚創傷治癒における集団細胞の移動および再上皮化を研究するために

要約

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この動画の章

幼虫ゼブラフィッシュスキンにおける誘導GAL4 / UASの発現系を用いて自然免疫と前癌細胞の相互作用のライブイメージング

ゼブラフィッシュ胚における機械的血管損傷

タイムラプス明実体顕微鏡でゼブラフィッシュ幼虫における組織修復をキャプチャ

ゼブラフィッシュ再生の分子機構を研究するためにテトンシステムの利用

臨床的に関連の確立

ゼブラフィッシュ幼虫の改良実験操作のための長期のライブイメージングデバイス

開発ゼブラフィッシュの表皮から細胞の押出のライブイメージング

ゼブラフィッシュの胚および幼生における高分解能細胞移植

ゼブラフィッシュの胚および幼生における高分解能細胞移植

ゼブラフィッシュの胚および幼生における高分解能細胞移植

ゼブラフィッシュ角膜実質外植片は皮膚創傷治癒における集団細胞の移動および再上皮化を研究するために

要約

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幼虫ゼブラフィッシュスキンにおける誘導GAL4 / UASの発現系を用いて自然免疫と前癌細胞の相互作用のライブイメージング

ゼブラフィッシュ胚における機械的血管損傷

タイムラプス明実体顕微鏡でゼブラフィッシュ幼虫における組織修復をキャプチャ

ゼブラフィッシュ再生の分子機構を研究するためにテトンシステムの利用

臨床的に関連の確立

ゼブラフィッシュ幼虫の改良実験操作のための長期のライブ イメージング デバイス

開発ゼブラフィッシュの表皮から細胞の押出のライブイメージング

ゼブラフィッシュの胚および幼生における高分解能細胞移植

ゼブラフィッシュの胚および幼生における高分解能細胞移植

ゼブラフィッシュの胚および幼生における高分解能細胞移植

ゼブラフィッシュ幼虫の改良実験操作のための長期のライブイメージングデバイス