This work was supported by grants from the Deutsche Forschungsgemeinschaft to SB (BR-2215; SFB 497/A9).

وأجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للقانون الألماني وتمت الموافقة من قبل المكاتب الحكومية في توبنغن: ملاحظة. 1. إعداد بال micropipettes، حلول والأغشية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد بال micropipettes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب بال micropipettes الزجاج باستخدام مجتذب ممص مكروى مع البرنامج التالي: الحرارة: 540، سحب: 125، السرعة: 20 والتأخير: 140. المبالغ طول الإبرة إلى 5.5 سم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإبر شطبة باستخدام microgrinder للحصول على حجم غيض مناسب من 4 مم. تخزين الإبر في مربع أو 15 سم طبق بتري لمنع ضررا من النصائح. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد حلول <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البلازميد DNA الحل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد DNA البلازميد التي تحتوي على بناء كدنا] المطلوب باستخدام عدة المجانية-ماكسي الإعدادية الذيفان الداخلي وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط حل DNA البلازميد إلى تركيز النهائي من 3 ميكروغرام / ميكرولتر (بدون ناقلات GFP ارتفاع) أو 4 ميكروغرام /ميكرولتر (مع 1 ميكروغرام من GFP ارتفاع ناقلات) في الذيفان الداخلي سراح تريس، EDTA العازلة التي تحتوي على الأخضر السريع (تركيز النهائي 0.05٪). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Laminin سهم الحل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل 1 ملغ من laminin في الماء المعقم إلى الحجم النهائي من 1 مل. إعداد 100 مكل وتخزينها في -80 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بولي-L-ليسين محلول المخزون <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل 50 ملغ من بولي-L-يسين في 50 مل من الماء المعقم إلى تركيز النهائي من 1 ملغ / مل. إعداد 1 مل مأخوذة وتخزينها في -20 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استكمال محلول الملح هانك المتوازن (كامل HBSS) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد كاملة HBSS من خلال الجمع بين 100 مل من 10X HBSS 2.5 مل من 1 M HEPES عازلة (7.4 درجة الحموضة)، 30 مل من 1 M D-الجلوكوز، 10 مل من 100 ملي CaCl 2، 10 مل من 100 ملي MgSO 4، و 4 مل من 1 M NaHCO 3. إضافة الماء المعقم تصل إلى 1 L وتخزينها في 4 ° C. ملاحظة: الأوتوكلاف جميع الحلول يتوقعون 1 M HEPES العازلة و 1 M D-الجلوكوز، والتي هي سن الفيلثالثا تعقيمها. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الثقافة شريحة متوسطة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد شريحة مستنبت بإضافة 35 مل من بصل متوسطة النسر، 12.9 مل من HBSS كاملة (1.2.4)، 1.35 مل من 1 M D-الجلوكوز، 250 ميكرولتر من 200 ملي L-الجلوتامين، و 500 ميكرولتر من البنسلين، الستربتومايسين ل الحصول على الحجم النهائي من 50 مل. إضافة مصل الحصان إلى تركيز النهائي من 5٪ وتخزينها في 4 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقطة المنخفض الانصهار (LMP) الاغاروز <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 4٪ LMP الاغاروز حل عن طريق إضافة 2 غرام من LMP الاغاروز إلى 50 مل من HBSS كاملة (1.2.4)، يليه التدفئة في الميكروويف لمدة 1-2 دقيقة في عالية الطاقة. الحفاظ على هذا الحل في حمام مائي عند 37-39 درجة مئوية. تخزين الحل في 4 درجات مئوية وإعادة استخدامها. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> امتصاص العرق الحل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في غطاء الدخان إعداد محلول بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) وذلك بإضافة 4 غرام من بارافورمالدهيد إلى 100 مل من برنامج تلفزيوني 1X. الحرارة الحل إلى 60 درجة مئوية وإضافة بضع قطرات من 1 N هيدروكسيد الصوديوم حتى يصبح الحل جلير. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilization الحل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل 9 غرام من BSA في 300 مل من 1X PBS تحتوي على 0.3٪ Trition X-100 وتخزينها في 4 ° C. إضافة 10٪ أزيد الصوديوم للتخزين على المدى الطويل. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طلاء من غشاء إدراجات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع قسامة واحدة من محلول المخزون laminin (1.2.2) وقسامة واحدة من بولي-L-يسين حل سهم (1.2.3) في الماء المعقم إلى الحجم النهائي من 12 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع إدراج الغشاء إلى 6 لوحات جيدا مع بعضها يحتوي كذلك 2 مل من الماء المعقم. إضافة 1 مل من محلول طلاء على رأس الغشاء واحتضان O / N عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد مرور فترة الحضانة غسل غشاء إدراج ثلاث مرات مع 1 مل من الماء المعقم وجافة. استخدام إدراج غشاء المغلفة في نفس اليوم أو تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أربعة أسابيع في الجافة 6 لوحة جيدا. </li></ol></li></ol> 2. حقن الحمض النووي و Electroporation من E15.5 وE18.5 الأجنة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li&gt; تخدير وقت تزاوج الماوس الإناث عن طريق وضعها الى غرفة التخدير مشبعة 5٪ الأيزوفلورين ومتصلا المرذاذ. تعميم الأيزوفلورين والأكسجين بمعدل 1 لتر / دقيقة. حفاظ على الحيوانات في مربع لمدة 2-4 دقائق أو حتى فاقدا للوعي الذي يتم اختباره من قبل معسر بين الكفوف من الفأرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الماوس فاقد الوعي من قبل خلع عنق الرحم في يوم الجنينية (E) 15.5 18.5 أو. تشريح الرحم التي تحتوي على أجنة 13 ووضعه في طبق بتري تحتوي على 15-20 مل من البرد الكامل HBSS. ملاحظة: من هذه النقطة فصاعدا، والحفاظ على الأجنة والأنسجة على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام زوج من مقص للفصل بين كل الجنين من قرن الرحم ومكان في طبق بيتري الثاني تحتوي على البارد الكامل HBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت المجهر تشريح، قطع الجدار عضلة الرحم والمشيمة باستخدام زوج من ملقط غرامة (رقم 55) ومقص. الإفراج بعناية الجنين من الكيس المحي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام زوج من مقص بون إلى decapitatالبريد الأجنة فقط فوق الأمامية في زاوية 60 درجة. إذا كانت التجربة يتطلب التنميط الجيني للأجنة، وجمع عينة الأنسجة لعزل الحمض النووي الجيني (قطعة صغيرة من الذيل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الرأس إلى طبق بتري نظيف وجاف. لأن رئيس قد مقطوعة الرأس في زاوية 60 درجة، ينبغي للإمالة الرأس إلى جانب واحد عند وضعها حتى الجانب الظهري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع إبرة بعناية في منتصف ختام نصف الكرة إلى bregma (الشكل 1A، B). حقن حوالي 2-3 ميكرولتر (في 3 أو 4 ميكروغرام / ميكرولتر) من محلول الحمض النووي من قبل داس على دواسة من picospritzer III باستخدام 30 رطلا من الضغط لمدة 10-15 ميللي ثانية لكل نبضة، وتطبيق 5-8 البقول. مدة وعدد من النبضات تعتمد على قطر افتتاح إبرة مع فتحات صغيرة تتطلب المزيد من الوقت. الفاصل الزمني بين كل نبضة يصل إلى 1 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل وضع الأقطاب، وتطبيق بضع قطرات من كامل HBSS على رأس EMBRيو. وضع أقطاب كهربائية في مثل هذه الطريقة أن &#39;السلبية&#39; المحطة هو على الجانب نفس البطين حقن والقطب &quot;إيجابي&quot; على الجانب الآخر من البطين حقن أسفل الأذن رأس الجنين (الشكل 1C، D). تطبيق 5 نبضات من 50 V. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام 3 مم أقطاب لE 15.5 و 5 مم أقطاب لE 18.5. </li></ol></li></ol> 3. تشريح الدماغ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد Electroporation لل، تقشر الجلد من الرأس مع مساعدة من زوج من ملقط غرامة. باستخدام زوج من مقص الربيع إجراء شق صغير في منتصف المخيخ في خط الوسط من الجمجمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج مقص الربيع في شق وقطع طولي على طول الدرز السهمي. تقشر الجمجمة وفصل الدماغ من الجمجمة باستخدام ملقط غرامة. نقل الدماغ كله الى 15-20 البارد مل حل HBSS كاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وفي الوقت نفسه، صب 4٪ LMP الاغاروز،أبقى في 37-39 درجة مئوية في حمام مائي، في قالب قشر بعيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خذ الدماغ من HBSS الكامل من جانب ملعقة مغرفة صغيرة واستنزاف فائض من HBSS باستخدام المناديل الورقية أو الغرامة، أو Kimwipes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الدماغ كله برفق في الاغاروز وضبط موقفها مع إبرة رفيعة. الحفاظ على العفن على الجليد حتى الاغاروز هو طدت ومقطوع كتلة (لأقسام الاكليلية بصيلات الشم وتشير متابعة). </li></ol> 4. Vibratome باجتزاء والثقافة شريحة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقليم الكتل الاغاروز LMP ويوحدهم إلى مرحلة العينة باستخدام &#39;الغراء عظمى &quot;. بعد الغراء هو نقل الجاف المرحلة العينة إلى علبة عازلة للvibratome وملء مع الثلج الباردة استكمال HBSS حتى يتم مغمورة كتلة في الحل. ملاحظة: تعقيم جميع الأسطح أداة والمعدات مع الايثانول 70٪ قبل باجتزاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 250 ميكرون أقسام سميكة vibratome باستخدام شفرة جديدة النحو التالي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقليم واي كتلةعشر الإعدادات التالية. تردد - 60 هرتز، سعة - 0.7 ميكرون، والسرعة 16-18 ملم / ثانية. قطع المقاطع التي تحتوي على الأنسجة المطلوب مع الإعدادات أعلاه بسرعة بطيئة (9 ملم / ثانية). بدء باجتزاء من الدماغ المؤخر، وجمع 5-7 المقاطع من المخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل المقاطع لطبق ثقافة 6 جيدا نظيفة تحتوي على 5 مل من الجليد الباردة استكمال HBSS بمساعدة ملعقة عازمة والحفاظ على الجليد حتى يتم جمع جميع الأقسام (الشكل 1E). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترطيب الغشاء بطريقة الصليب مع 100 ميكرولتر من HBSS كاملة قبل وضع المقاطع على الغشاء، لتسهيل التوجه للأقسام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل أقسام باستخدام ملعقة عازمة على الغشاء (التقاط زاوية من القسم مع ملقط وسحب على ملعقة وثم استخدام ملقط لدفع القسم على الغشاء). وضع ما يصل إلى خمسة أقسام على غشاء واحد وترتيب باستخدام ملقط (الشكل 1F). لا تتداخل الأقسام مع بعضها البعض. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأخذ الفائض من HBSS قبالة غشاء باستخدام ماصة. وترد الأغشية المحددة المستخدمة هنا إلى إطار وإدراجها في لوحة زراعة الأنسجة، والتي تسمح الأنسجة لتكون على اتصال ولكن لا تغطيها المتوسط. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع إدراج الغشاء إلى لوحة 6 جيدا تحتوي على 1.8 مل من ثقافة شريحة المتوسطة (1.2.5) (الشكل 1G، H). احتضان الطبق الثقافة عند 37 درجة مئوية مع CO 2 5٪ لمدة 11 أو 14 DIV DIV. تغيير نصف المتوسط ​​(0.9 مل) كل يوم الثاني. ملاحظة: في هذه المرحلة، إضافة الكواشف مثل Bromodeoxyuridine (BrdU، و 10 ميكرومتر تركيز النهائي) لوصفها تكاثر الخلايا إلى وسائل الإعلام للساعة 20 الأولى من الوقت الثقافة. </li></ol> 5. التثبيت من أقسام تلاه سهم المناعي تلطيخ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام شفرة مشرط نظيفة وحادة لقطع وتقليم الأغشية اعتمادا على التوجه للالأقسام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل أقسام جنبا إلى جنب مع غشاء لوحة 24 جيدا تحتوي على 1 مل من 4٪ PFA (1.2.7). احتضان أقسام لمدة 1 ساعة على RT تليها 3 يغسل مع برنامج تلفزيوني 1X لمدة 15 دقيقة لكل منهما. احتضان أقسام O / N مع حل permeabilization في 4 درجات مئوية مع الإثارة لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي، واحتضان المقاطع مع الأجسام المضادة الأولية المناسبة، مخففة في حل permeabilization، O / N أو لمدة 48 ساعة في 4 درجات مئوية مع الإثارة لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل أقسام 3 مرات لمدة 15 دقيقة مع برنامج تلفزيوني 1X واحتضان O / N عند 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة مخففة في حل permeabilization. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحضانة مع الأجسام المضادة الثانوية، وغسل أقسام مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 1X لمدة 15 دقيقة تليها دابي تلطيخ لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل أقسام 3 مرات مع برنامج تلفزيوني 1X لمدة 15 دقيقة لكل منهما ونقل إلى شرائح المجهر. إضافة ImmunoMount ووضع بلطف ساترة على أعلى من أقسام. تجفيف الشرائح O / N عند 4 درجات مئوية وحد ذاتهاآل بطلاء الأظافر. ملاحظة: الحفاظ على الشرائح دائما في 4 درجات مئوية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل الثقافات شريحة بواسطة المجهر متحد البؤر (الشكل 1I). </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Milestones+of+neuronal+development+in+the+adult+hippocampus.">Milestones of neuronal development in the adult hippocampus.</a> Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).</li><li>Frotscher, M., Zhao, S., Forster, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+cell+and+fiber+layers+in+the+dentate+gyrus.">Development of cell and fiber layers in the dentate gyrus.</a> Prog Brain Res. 163, 133-142 (2007).</li><li>Muramatsu, R., Ikegaya, Y., Matsuki, N., Koyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatally+born+granule+cells+numerically+dominate+adult+mice+dentate+gyrus.">Neonatally born granule cells numerically dominate adult mice dentate gyrus.</a> Neuroscience. 148, 593-598 (2007).</li><li>Li, G., Pleasure, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+the+dentate+gyrus:+what+we+are+learning+from+mouse+mutants.">Morphogenesis of the dentate gyrus: what we are learning from mouse mutants.</a> Dev Neurosci. 27, 93-99 (2005).</li><li>Hsieh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchestrating+transcriptional+control+of+adult+neurogenesis.">Orchestrating transcriptional control of adult neurogenesis.</a> Genes Dev. 26, 1010-1021 (2012).</li><li>Li, G., Pleasure, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+regulation+of+dentate+gyrus+morphogenesis.">Genetic regulation of dentate gyrus morphogenesis.</a> Prog Brain Res. 163, 143-152 (2007).</li><li>Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+current+state+of+chromatin+immunoprecipitation.">The current state of chromatin immunoprecipitation.</a> Mol Biotechnol. 45, 87-100 (2010).</li><li>Simon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual+function+of+Bcl11b/Ctip2+in+hippocampal+neurogenesis.">A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis.</a> Embo J. 31, 2922-2936 (2012).</li><li>Pilaz, L. J., Silver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+mitosis+in+the+developing+mouse+embryonic+cortex.">Live imaging of mitosis in the developing mouse embryonic cortex.</a> J Vis Exp. (88), (2014).</li><li>Pacary, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+genetic+manipulation+of+dendrites+and+spines+in+the+mouse+cerebral+cortex+and+hippocampus+using+in+utero+electroporation.">Visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li><li>Hand, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+Neurogenin2+specifies+the+migration+properties+and+the+dendritic+morphology+of+pyramidal+neurons+in+the+neocortex.">Phosphorylation of Neurogenin2 specifies the migration properties and the dendritic morphology of pyramidal neurons in the neocortex.</a> Neuron. 48, 45-62 (2005).</li><li>Polleux, F., Ghosh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+slice+overlay+assay:+a+versatile+tool+to+study+the+influence+of+extracellular+signals+on+neuronal+development.">The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal development.</a> Sci STKE. (136), 19 (2002).</li><li>Shea, K., Geijsen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+6.5+dpc+mouse+embryos.">Dissection of 6.5 dpc mouse embryos.</a> J Vis Exp. (2), (2007).</li><li>Sugiyama, T., Osumi, N., Katsuyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+germinal+matrices+in+the+developing+dentate+gyrus+are+composed+of+neuronal+progenitors+at+distinct+differentiation+stages.">The germinal matrices in the developing dentate gyrus are composed of neuronal progenitors at distinct differentiation stages.</a> Dev Dyn. 242, 1442-1453 (2013).</li><li>Lechler, T., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desmoplakin:+an+unexpected+regulator+of+microtubule+organization+in+the+epidermis.">Desmoplakin: an unexpected regulator of microtubule organization in the epidermis.</a> J Cell Biol. 176, 147-154 (2007).</li><li>Nichols, A. J., O'Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+utero+electroporation+and+whole+hemisphere+explants:+a+simple+experimental+method+for+studies+of+early+cortical+development.">Ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development.</a> J Vis Exp. (74), (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

الحصين له وظيفة هامة في التعلم والذاكرة. التلفيف المسنن هي أيضا واحدة من منطقتين في الدماغ حيث يحدث تكوين الخلايا العصبية، ليس فقط خلال تطوير ولكن أيضا في جميع أنحاء مرحلة البلوغ. بعد الولادة والكبار عائدات تكوين الخلايا العصبية قرن آمون بطريقة مماثلة تنطوي على العد...

الحصين يلعب دورا هاما في الذاكرة والتعلم وكذلك السلوك العاطفي. وتتكون واحدة تتمثل المهمة الرئيسية للتوحيد الذاكرة القصيرة الأمد إلى ذاكرة طويلة الأمد، الأمر الذي يتطلب مرونة عالية في الجهاز العصبي. التلفيف المسنن من الحصين بمثابة بوابة رئيسية لإدخال المعلومات وهي أيضا واحدة من مناطق الدماغ مع اثنين من تكوين الخلايا العصبية المستمر طوال فترة البلوغ 1،2. تطوير البنية الحصين يحدث خلال أواخر مرحلة التطور الجنيني وخاصة خلال أول 3 إلى 4 أسابيع بعد الولادة 3. خلال التنمية في وقت مبكر من التلفيف المسنن يتم تأسيس تجمع الخلايا الجذعية اللازمة لبعد الولادة وكذلك تكوين الخلايا العصبية الكبار 4. الخلايا العصبية تطوير تمر عبر مراحل مختلفة، من الخلايا الجذعية من خلال عدة مراحل من الخلايا الاصلية لغير ناضجة، وأخيرا الخلايا العصبية الناضجة خلال بعد الولادة، فضلا عن تكوين الخلايا العصبية الكبار. في مراحل مختلفة من الخلايا العصبية التعبير عنمطلوب جينات معينة للسماح للنضوج والتكامل من الخلايا العصبية الجديدة في قرن آمون الدوائر 5،6. باستخدام الماوس علم الوراثة وتحليل النمط الظاهري من قبل المناعية وكذلك الأساليب الجزيئية يسمح تحديد نمط التعبير وظيفة العديد من هذه الجينات. وبالإضافة إلى ذلك تحليل ميكروأري وكذلك مناعي لونين (رقاقة) قدمت معلومات عن الجينات المحتملة المباشرة وغير المباشرة المستهدفة 7،8. ومع ذلك، لا يزال هناك العديد من الأسئلة المفتوحة بشأن الآليات التنظيمية للتنمية قرن آمون، وخاصة تطوير التلفيف المسنن. للحصول على مزيد من التبصر كيف يتم تنظيم الجينات المحددة نظاما مطلوب والسماح للتلاعب من عدد صغير من الخلايا أسفل-أو ما يصل التنظيم من الجين من الفائدة و / أو الجينات المستهدفة ومتابعة مصيرهم خلال التنمية. في الرحم Electroporation لل من shRNAs، كدنا] من الجينات في المصالح أو لجنة المساواة العرقية recombinaتوفر حد ذاتها مثل هذه الأداة. لضمان وجود الحمض النووي المطلوب أو الرنا صغيرة البلازميدات التعبير ينبغي أن تستخدم ل electroporation. ويتم تنفيذ هذا النهج بنجاح كبير في دراسة تطوير القشرية 9،10، ولكن هو نهج أكثر تحديا دراسة تطوير التلفيف المسنن بسبب الموقف من الهياكل قرن آمون في الدماغ طبقات أعمق. السابقين الرحم بعد Electroporation للثقافة شريحة عضوي النمط هو نهج واحد للتحايل على هذه المشكلة 11،12. وعلى النقيض من في الرحم Electroporation لللا الجنين كله ولكن فقط الرأس ويستخدم يسمح بالتالي لوضع الأقطاب الكهربائية بطريقة أكثر ملاءمة لتوجيه shRNA / DNA نحو الحصين والتلفيف المسنن. مجموعتنا يعمل بنجاح السابق الرحم Electroporation لللدراسة دور عامل النسخ Bcl11b خلال تطوير التلفيف المسنن 8. Bcl11b لها دور مزدوج في التنمية التلفيف المسنن التي كتبها regulating السلف تكاثر الخلايا وكذلك التمايز كما يتضح من المناعية. لزيادة تحديد آلية لمشاركة Bcl11b في هذه العمليات، تم تعديل بروتوكولات للمجموعة Polleux 11،12 لدراسة التلفيف المسنن كما هو موضح أدناه في قسم البروتوكول. في النهج الأول تم تناول مسألة ما إذا كان Bcl11b وتنظيم الخلايا العصبية خلية تمايز الخلايا بشكل مستقل. فحص والنهج الثاني سواء Desmoplakin، جين هدفا مباشرا للBcl11b، كافية لانقاذ النمط الظاهري Bcl11b.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="271">
	<tbody>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:71px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:73px;">Company</td>
			<td style="width:63px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:64px;">Comments/ Description</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:71px;">Flaming/ Brown Micropipette Puller</td>
			<td style="width:73px;">Sutter Instruments Company (USA)</td>
			<td style="width:63px;">P-97</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:71px;">Fine Glass Pipettes</td>
			<td style="width:73px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:63px;">G100F-4</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:71px;">Microgrinder</td>
			<td style="width:73px;">Narishige, Japan</td>
			<td style="width:63px;">EG-44</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:71px;">Anesthetic Bracket unit</td>
			<td style="width:73px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:63px;">PY2 34-0412</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:71px;">Halovet Vaporizer</td>
			<td style="width:73px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:63px;">PY2 34-0398</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:71px;">Fluovac System</td>
			<td style="width:73px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:63px;">PY2 34-0387</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:71px;">IMS Fluosorber</td>
			<td style="width:73px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:63px;">PY2 34-0415</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:71px;">Anesthetizing Chamber</td>
			<td style="width:73px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:63px;">PY2 34-0460</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:71px;">Electroporator</td>
			<td style="width:73px;">BEX Company</td>
			<td style="width:63px;">CUY21 EDIT</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:71px;">Tweezers with disk electrodes</td>
			<td style="width:73px;">BEX Company</td>
			<td style="width:63px;">LF650P3</td>
			<td style="width:64px;">3 mm electrodes for E15.5</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:71px;">Tweezers with disk electrodes</td>
			<td style="width:73px;">BEX Company</td>
			<td style="width:63px;">LF650P5</td>
			<td style="width:64px;">5 mm electrodes for E18.5</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:71px;">Picospritzer III</td>
			<td style="width:73px;">Parker Hannifin Corporation</td>
			<td style="width:63px;">P/N 052-0500-900</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="148">
			<td height="148" style="height:148px;width:71px;">HM 650V Vibrating Blade Microtome, 230V</td>
			<td style="width:73px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:63px;">920120</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:71px;">Dissection Microscope</td>
			<td style="width:73px;">Carl Zeiss Microscopy Gmbh</td>
			<td style="width:63px;">Stemi SV8</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:71px;">Inverted Microscope</td>
			<td style="width:73px;">Leica</td>
			<td style="width:63px;">Leica DM IL LED</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:71px;">Confocal Microscope</td>
			<td style="width:73px;">Leica</td>
			<td style="width:63px;">Sp5II</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="42" rowspan="2" style="height:42px;width:71px;">6 well dish</td>
			<td rowspan="2" style="width:73px;">BD Falcon</td>
			<td rowspan="2" style="width:63px;">#353502</td>
			<td rowspan="2" style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:71px;">6 well dish</td>
			<td style="width:73px;">CELLSTAR</td>
			<td style="width:63px;">#657160</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:71px;">Tissue culture inserts</td>
			<td style="width:73px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:63px;">#353090</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:71px;">Fast Green</td>
			<td style="width:73px;">Sigma</td>
			<td style="width:63px;">F7252</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:71px;">Laminin</td>
			<td style="width:73px;">Sigma</td>
			<td style="width:63px;">#L2020</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:71px;">Poly-L-lysine</td>
			<td style="width:73px;">Sigma</td>
			<td style="width:63px;">#P5899</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:71px;">Spring scissors</td>
			<td style="width:73px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:63px;">15003-08</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:71px;">Extra Fine Bonn Scissors</td>
			<td style="width:73px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:63px;">14084-08</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:71px;">Forceps</td>
			<td style="width:73px;">Dumont #55</td>
			<td style="width:63px;">11255-20 Inox</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:71px;">HBSS 10X</td>
			<td style="width:73px;">Life Technology</td>
			<td style="width:63px;">14180-046</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:71px;">BME</td>
			<td style="width:73px;">Life Technology</td>
			<td style="width:63px;">41010-26</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex utero electroporation and organotypic slice culture of mouse hippocampal tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.

الاجتثاث من عامل النسخ Bcl11b يتسبب في انخفاض قيمة تكاثر الخلايا الاصلية وتمايز الخلايا العصبية مما أدى إلى انخفاض حجم التلفيف المسنن وعدد الخلايا. وعلاوة على ذلك تفشل الخلايا العصبية متحولة إلى الاندماج في الدوائر قرن آمون مما تسبب في التعلم والذاكرة ضعف 8. للإج?...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue at JoVE.com

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.

السابق الرحم Electroporation للوعضوي النمط من الثقافة شريحة ماوس الحصين الأنسجة

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

ex-utero-electroporation-organotypic-slice-culture-mouse-hippocampal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

9.4K Views.  University of Ulm. Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.

Video: Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

Genetic deletion using the Cre-Lox system in transgenic mouse lines is a powerful tool used to study protein function. However, except in very specific Cre models, deletion of a protein throughout a tissue or cell population often leads to complex phenotypes resulting from multiple interacting mechanisms. Determining whether a phenotype results from disruption of a cell autonomous mechanism, which is intrinsic to the cell in question, or from a non-cell autonomous mechanism, which would result from impairment of that cell&#8217;s environment, can be difficult to discern. To gain insight into protein function in an in vivo context, in utero electroporation (IUE) enables gene deletion in a small subset of cells within the developing cortex or some other selected brain region. IUE can be used to target specific brain areas, including the dorsal telencephalon, medial telencephalon, hippocampus, or ganglionic eminence. This facilitates observation of the consequences of cell autonomous gene deletion in the context of a healthy environment. The goal of this protocol is to show how IUE can be used to analyze a defect in radial migration in a floxed transgenic mouse line, with an emphasis on distinguishing between the cell autonomous and non-cell autonomous effects of protein deletion. By comparing the phenotype resulting from gene deletion within the entire cortex versus IUE-mediated gene deletion in a limited cell population, greater insight into protein function in brain development can be obtained than by using either technique in isolation.

Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

Neuron migration is regulated by numerous cell autonomous and non-cell autonomous factors. This protocol shows how in utero electroporation can be used to determine whether a phenotype in a transgenic mouse is due to disruption of a cell intrinsic mechanism or impairment of interaction between the neuron and its environment.

تحريض حذف البروتين من خلال<em&gt; في الرحم</em&gt; Electroporation لللتحديد العجز في العصبية الهجرة في النماذج المعدلة وراثيا

Genetic deletion using the Cre-Lox system in transgenic mouse lines is a powerful tool used to study protein function. However, except in very specific ...

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying the biology of retinal neurons, particularly photoreceptors. The applications of this system go beyond basic research, as they can easily be adapted to high throughput technologies for drug development. However, genetic manipulation of retinal photoreceptors in these cultures has proven to be very challenging, posing an important limitation to the usefulness of the system. We have recently developed and validated an ex&#160;ovo plasmid electroporation technique that increases the rate of transfection of retinal cells in these cultures by five-fold compared to other currently available protocols1. In this method embryonic chick eyes are enucleated at stage 27, the RPE is removed, and the retinal cup is placed in a plasmid-containing solution and electroporated using easily constructed custom-made electrodes. The retinas are then dissociated and cultured using standard procedures. This technique can be applied to overexpression studies as well as to the downregulation of gene expression, for example via the use of plasmid-driven RNAi technology, commonly achieving transgene expression in 25% of the photoreceptor population. The video format of the present publication will make this technology easily accessible to researchers in the field, enabling the study of gene function in primary retinal cultures. We have also included detailed explanations of the critical steps of this procedure for a successful outcome and reproducibility.

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Embryonic chick retinal cell cultures constitute valuable tools for the study of photoreceptor biology. We have developed an efficient gene transfer technique based on ex&#160;ovo plasmid electroporation of the retinas prior to culture. This technique considerably increases transfection efficiencies over currently available protocols, making genetic manipulation feasible for this system.

كفاءة نقل الجينات في شبكية العين الفرخ عن الخلية الأولية دراسات الثقافة: ل<em&gt; السابقين البيضة</em&gt; Electroporation للمنهج

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

ثقافة الجنينية الماوس القوقعة إإكسبلنتس وجين نقل من قبل Electroporation لل

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Organotypic Slice Cultures for Studies of Postnatal Neurogenesis

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This method maintains the characteristic topographical morphology of the hippocampus while allowing direct application of pharmacological agents to the developing hippocampal dentate gyrus. Additionally, slice cultures can be maintained for up to 4 weeks and thus, allow one to study the maturation process of newborn granule neurons. Slice cultures allow for efficient pharmacological manipulation of hippocampal slices while excluding complex variables such as uncertainties related to the deep anatomic location of the hippocampus as well as the blood brain barrier. For these reasons, we sought to optimize organotypic slice cultures specifically for postnatal neurogenesis research.

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis using the organotypic slice culture technique. This method allows for in vitro manipulation of adult neurogenesis and allows for the direct application of pharmacological agents to the cultured hippocampus.

الثقافات شريحة عضوي النمط لدراسات ما بعد الولادة تكوين الخلايا العصبية

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This ...

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together within a basement membrane. A finite pool of follicles is laid down during embryonic development, when oocytes in meiotic arrest form a close association with flattened granulosa cells, forming primordial follicles. By or shortly after birth, mammalian ovaries contain their lifetime&#8217;s supply of primordial follicles, from which point onwards there is a steady release of follicles into the growing follicular pool.
The ovary is particularly amenable to development in vitro, with follicles growing in a highly physiological manner in culture. This work describes the culture of whole neonatal ovaries containing primordial follicles, and the culture of individual ovarian follicles, a method which can support the development of follicles from an immature through to the preovulatory stage, after which their oocytes are able to undergo fertilization in vitro. The work outlined here uses culture systems to determine how the ovary is affected by exposure to external compounds. We also describe a co-culture system, which allows investigation of the interactions that occur between growing follicles and the non-growing pool of primordial follicles.

This protocol describes the primary culture/co-culture of mouse ovarian tissue, using ovaries from neonatal mice and individual ovarian follicles from prepubertal mice. The culture techniques support development in a highly physiological manner, allowing investigation of the effect of extrinsic agents on the ovary, and of interactions between ovarian follicles.

الثقافة والمشارك ثقافة ماوس المبايض وحويصلات المبيض

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying neuronal proliferation and differentiation. In addition, evolutionary modifications of its proliferative capability have been responsible for the dramatic expansion of cerebellar size in the amniotes, making the cerebellum an excellent model for evo-devo studies of the vertebrate brain. The constituent cells of the EGL, cerebellar granule progenitors, also represent a significant cell of origin for medulloblastoma, the most prevalent paediatric neuronal tumour. Following transit amplification, granule precursors migrate radially into the internal granular layer of the cerebellum where they represent the largest neuronal population in the mature mammalian brain. In chick, the peak of EGL proliferation occurs towards the end of the second week of gestation. In order to target genetic modification to this layer at the peak of proliferation, we have developed a method for genetic manipulation through ex vivo electroporation of cerebellum slices from embryonic Day 14 chick embryos. This method recapitulates several important aspects of in vivo granule neuron development and will be useful in generating a thorough understanding of cerebellar granule cell proliferation and differentiation, and thus of cerebellum development, evolution and disease.

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

The cerebellar external granule layer is the site of the largest transit amplification in the developing brain. Here, we present a protocol to target genetic modification to this layer at the peak of proliferation using ex vivo electroporation and culture of cerebellar slices from embryonic Day 14 chick embryos.

فيفو السابقين الثقافة من الفرخ مخيخي شرائح المستهدفة ومكانيا Electroporation للمن الحبيبة السلائف الخلية

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying ...

Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate embryonic origins and functions &#8212; the neurohypophysis and the adenohypophysis. The developing mouse pituitary gland is tiny and delicate with an elongated oval shape. A coronal section is preferred to display both the adenohypophysis and neurohypophysis in a single slice of the mouse pituitary.
The goal of this protocol is to achieve proper pituitary coronal sections with well-preserved tissue architectures from developing mice. In this protocol, we describe in detail how to dissect and process pituitary glands properly from developing mice. First, mice are fixed by transcardial perfusion of formaldehyde prior to dissection. Then three different dissecting techniques are applied to obtain intact pituitary glands depending on the age of mice. For fetal mice aged embryonic days (E) 17.5 - 18.5 and neonates up to 4 days, the entire sella regions including the sphenoid bone, gland, and trigeminal nerves are dissected. For pups aged postnatal days (P) 5 - 14, the pituitary glands connected with trigeminal nerves are dissected as a whole. For mice over 3 weeks old, the pituitary glands are carefully dissected free from the surrounding tissues. We also display how to embed the pituitary glands in a proper orientation by using the surrounding tissues as landmarks to obtain satisfying coronal sections. These methods are useful in analyzing histological and developmental features of pituitary glands in developing mice.

We present a protocol to dissect pituitary glands and prepare pituitary coronal sections from developing mice.

تشريح وإعداد شريحة الاكليلية وضع الغدة النخامية الماوس

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate ...

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors of the diseases. To validate the contribution of a dysfunction of the mutated genes to disease development, the generation of animal models carrying the mutations is one obvious approach. While germline genetically engineered mouse models (GEMMs) are popular biological tools and exhibit reproducible results, it is restricted by time and costs. Meanwhile, non-germline GEMMs often enable exploring gene function in a more feasible manner. Since some brain diseases (e.g., brain tumors) appear to result from somatic but not germline mutations, non-germline chimeric mouse models, in which normal and abnormal cells coexist, could be helpful for disease-relevant analysis. In this study, we report a method for the induction of CRISPR-mediated somatic mutations in the cerebellum. Specifically, we utilized conditional knock-in mice, in which Cas9 and GFP are chronically activated by the CAG (CMV enhancer/chicken &#223;-actin) promoter after Cre-mediated recombination of the genome. The self-designed single-guide RNAs (sgRNAs) and the Cre recombinase sequence, both encoded in a single plasmid construct, were delivered into cerebellar stem/progenitor cells at an embryonic stage using in utero electroporation. Consequently, transfected cells and their daughter cells were labeled with green fluorescent protein (GFP), thus facilitating further phenotypic analyses. Hence, this method is not only showing electroporation-based gene delivery into embryonic cerebellar cells but also proposing a novel quantitative approach to assess CRISPR-mediated loss-of-function phenotypes.

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

Conventional loss-of-function studies of genes using knockout animals have often been costly and time-consuming. Electroporation-based CRISPR-mediated somatic mutagenesis is a powerful tool to understand gene functions in vivo. Here, we report a method to analyze knockout phenotypes in proliferating cells of the cerebellum.

فقدان وظيفة تحليل في الحبيبية للدماغ كريسبر بوساطة خلايا تستخدم في الرحم على أساس انهانسر نقل الجينات

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ideal for experimentation. Currently, the study of these developmental pathways in the chicken embryo is conducted by applying inhibitors and drugs at localized sites and at low concentrations using a variety of methods. In vitro tissue&#160;culturing is a technique that enables the study of tissues separated from the host organism, while simultaneously bypassing many of the physical limitations present when working with whole embryos, such as the susceptibility of embryos to high doses of potentially lethal chemicals. Here, we present an organotypic culturing protocol for culturing the embryonic chicken half head in vitro, which presents new opportunities for the examination of developmental processes beyond the currently established methods.

Here, we present an organotypic culturing protocol to grow embryonic chicken organs in vitro. Using this method, the development of embryonic chicken tissue can be studied, while maintaining a high degree of control over the culture environment.

أسلوب الثقافة أورجانوتيبيك لدراسة تطوير الأنسجة الجنينية الدجاج

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, regulation occurs at the hypothalamic-pituitary-gonadal axis level and on developing follicles in the ovary. Despite active studies, follicle development mechanisms are not clear because of the several steps involved from the dormant primordial follicle activation to ovulation, and because of the regulation complexity that differs at each follicular stage. To investigate the mechanisms of follicle development, and the dynamics of follicles throughout the estrus cycle, we developed a mouse ovarian tissue culture model that can be used to observe follicle development using a microscope. Systematic follicle development, periodical ovulation, and follicle atresia can all be reproduced in the cultured ovary model, and the culture conditions can be experimentally modulated. Here, we demonstrate the usefulness of this method in the study of the regulatory mechanisms of follicle development and other ovarian phenomena.

Ovarian tissue cultures can be used as models of follicle development, ovulation, and follicle atresia and indicate regulatory mechanisms of dynamic ovarian processes.