This work was supported by grants from the Deutsche Forschungsgemeinschaft to SB (BR-2215; SFB 497/A9).

注：全ての動物実験は、ドイツの法律に基づいて実施し、テュービンゲンの政府のオフィスによって承認された。 マイクロピペット、ソリューションおよび膜の作製<ol><li>マイクロピペットの作製<ol><li>プル、540：125、ベロシティを：熱：以下のプログラムでマイクロピペットプラーを用いてガラスマイクロピペットを引いて20とディレイ：140針の長さは5.5センチメートルにのぼる。 </li><li> microgrinderを用いてベベル針は4mmの適切なチップサイズを取得する。先端の損傷を防ぐために、ボックス内の針または15センチメートルペトリ皿に保管してください。 </li></ol></li><li>溶液の調製<ol><li>プラスミドDNAソリューション<ol><li>製造業者のプロトコルに従ってエンドトキシンフリーマキシプレップキットを用いて、所望のcDNA構築物を含むプラスミドDNAを調製する。 </li><li> （GFPスパイクベクトルなし）/μL3または4μg/最終濃度をプラスミドDNA溶液を調整しますファストグリーン（最終濃度0.05％）を含有するエンドトキシンフリーのTris-EDTA緩衝液中で（GFPスパイクベクター1μgを有する）ずつ。 </li></ol></li><li>ラミニン原液<ol><li>最終容量1mlに滅菌水でラミニン1mgを溶解させる。 -80℃で100μlのアリコートとストアを準備します。 </li></ol></li><li>ポリ-L-リシンストック溶液<ol><li> 1mg / mlの最終濃度に滅菌水50ml中のポリ-L-リジン50mgを溶解する。 -20℃で1ミリリットルアリコートとストアを準備します。 </li></ol></li><li>ハンクス液を完了します（完全HBSS） <ol><li>のCaCl 2を10mlの100mMの硫酸マグネシウムを 10×HBSS 100mlを、1 M HEPES緩衝液を2.5ml（pH7.4）中、1 M D-グルコースを30ml、100ミリモル、10mlのを組み合わせることにより、完全なHBSSを作成し、4 1 mlのMのNaHCO 3。 4℃で1 Lとストアに滅菌水を上に追加します。 NOTE：フィルであるオートクレーブ全ての溶液を1M HEPES緩衝液、1MのD-グルコースを期待TERは、滅菌した。 </li></ol></li><li>スライス培養培地<ol><li>基礎培地イーグル35mlの完全HBSS（1.2.4）12.9 mlの1 M D-グルコース、200mMのL-グルタミンを250μl、およびペニシリン - ストレプトマイシンを500μlの1.35を加えて、スライス培養培地を調製50ミリリットルの最終容量を得る。 4℃で最終濃度5％とストアにウマ血清を加える。 </li></ol></li><li>低融点（LMP）アガロース<ol><li>ハイパワーで1〜2分間電子レンジで加熱して完全なHBSS（1.2.4）の50ミリリットルにアガロースLMPの2グラムを追加することで、4％LMPアガロース溶液を準備します。 39℃ - 37℃の水浴中でこのソリューションを保管してください。 4℃と再利用で溶液を保管してください。 </li></ol></li><li>パラホルムアルデヒド溶液<ol><li>ドラフト内で1×PBS 100mlにパラホルムアルデヒドを4g添加することにより、4％パラホルムアルデヒド（PFA）溶液を調製する。 60°Cまで溶液を加熱し、溶液をcになるまで1 NのNaOHを数滴加えるリア。 </li></ol></li><li>透過処理ソリューション<ol><li> 4℃で0.3％Trition X-100およびストアを含む1×PBS 300mlにBSAを9gに溶解する。長期保存のために10％のアジ化ナトリウムを加える。 </li></ol></li></ol></li><li>メンブレンインサートのコーティング<ol><li>ラミニンストック溶液（1.2.2）の一方のアリコートおよび12 ​​mlの最終容積に滅菌水でポリ-L-リシンストック溶液（1.2.3）のいずれかのアリコートを希釈する。 </li><li>滅菌水を含む各ウェル2mlで6ウェルプレートに膜インサートを配置します。膜の上にコーティング液1 mLを加え、5％CO 2インキュベーター中、37℃でO / Nインキュベートする。 </li><li>インキュベーション後、膜が滅菌水とドライの1ミリリットルで三回を挿入洗う。ドライ6ウェルプレートに4週間まで4℃で同日またはストア上にコーティング膜インサートを使用してください。 </li></ol></li></ol> 2. DNA注入及びE15.5のエレクトロポレーションおよびE18.5胚<ol><li&gt; 5％イソフルランで飽和させ、気化器に接続された麻酔ケースにそれを置くことによって、雌マウスを交配時間を麻酔。 1 L /分の速度でイソフルランと酸素を循環させる。マウスの足の間でつまんでテストされて2-4分間または無意識になるまでボックスに動物を保管してください。 </li><li>胚日（E）15.5または18.5に頸椎脱臼によって無意識のマウスを安楽死させる。胚13を含む子宮を解剖し、冷たい完全なHBSS 15〜20 mlを含有するペトリ皿に入れてください。 注：この時点以降から、氷上で胚組織を保つ。 </li><li>冷たい完全なHBSSを含む第二のペトリ皿に子宮角と場所から各胚を分離するためにハサミを使用してください。 </li><li>解剖顕微鏡下では、子宮筋壁と細かい鉗子（＃55）とハサミを使用して胎盤を断つ。慎重に卵黄嚢から胚をリリース。 </li><li> decapitatするボンハサミを使用してくださいちょうど60°の角度で前肢上記電子胚。実験は、胚の遺伝子型決定を必要とする場合、ゲノムDNAの単離のための組織試料（尾の小片）を収集する。 </li><li>清潔で乾燥したペトリ皿に頭を転送します。ヘッドは60°の角度で断頭されていたので、背側を上に置かれたとき、頭が片側に傾けなければならない。 </li><li>ブレグマに半球近いの中央に慎重に針を置きます（ 図1A、B）。 5-8パルスを印加する、パルスあたり10〜15ミリ秒の間、圧力の30ポンドを使用してpicospritzer IIIのペダルを踏んでDNA溶液の（3または4μgの/μLで）約2〜3μLを注入。パルスの持続時間及び数は、より多くの時間を必要とする小さな開口部を有する針開口部の直径に依存する。各パルスの間隔は1秒に達する。 </li><li>電極を配置する前に、EMBRの頭の上に完全なHBSSの数滴を適用ヨーヨー。 「負」の端末が注入心室および胚の頭部（ 図1C、D）の耳の下に注入された心室の反対側に「正」電極と同じ側になるように電極を配置する。 50 Vの5パルスを適用します<ol><li> E 18.5のためのE 15.5と5ミリメートル電極用の3mmの電極を使用してください。 </li></ol></li></ol>脳の3.解剖<ol><li>エレクトロポレーション後、細かいピンセットの助けを借りて、頭から皮膚をはがし。春のハサミを使用すると、頭蓋骨の正中線での小脳の真ん中に小さな切開を作る。 </li><li>切開部に春のはさみを挿入し、矢状縫合に沿って縦に切断。頭蓋骨をはがし、微細な鉗子を使用して頭蓋骨から脳を切り離す。 15〜20ミリリットル冷たい完全なHBSS溶液中に脳全体を転送します。 </li><li>一方、4％LMPアガロースを注ぐ剥ぎ取り金型に、水浴中で37〜39℃に保った。 </li><li>小さなスクープスパチュラで完全なHBSSの中から脳を取り、細かいティッシュペーパーやキムワイプを使用してHBSSの過剰を排出。 </li><li>アガロースに優しく全脳を置き、細い針との位置を調整します。アガロースが固化され、ブロックは（冠状切片のために嗅球はポイントアップ）区分されるまで氷上に金型を保管してください。 </li></ol> 4.ビブラトームセクショニングとスライス文化<ol><li> LMPアガロースブ​​ロックをトリミングし、「スーパーグルー」を使用して試料ステージにそれらを接着。ブロックが溶液に浸漬されるまでHBSSを完了コールドグルーの後ビブラトームのバッファトレイに試料ステージ乾式転写され、氷で埋める。 注：セクショニング前に70％エタノールですべての楽器や機器の表面を滅菌する。 </li><li>続いて、新しいブレードを使用して250μmの厚さのビブラトーム切片を準備します。 <ol><li>ブロックのWiトリム以下の設定番目。周波数 - 60Hzの、振幅 - 0.7μmで、速度16〜18ミリメートル/秒。低速（9ミリメートル/秒）での上記の設定で所望の組織を含むセクションをカット。後脳から切片を開始し、大脳から5-7のセクションを集める。 </li><li>曲がったへらの助けを借りてHBSSを完了し、すべてのセクションが（ 図1E）を収集するまで氷上に保つの氷冷5ミリリットルを含むクリーンな6ウェル培養皿にセクションを転送します。 </li></ol></li><li>セクションの向きを容易にするために、膜上のセクションを配置する前に完全なHBSS100μlのクロスファッションで膜を湿らせます。 </li><li> （鉗子でセクションのコーナーをピックアップし、へらの上に引っ張ると、膜上にセクションをプッシュする鉗子を使用してください）​​メンブレン上に曲がったへらを使用してセクションを転送します。 1膜上の5つのセクションにまで配置し、鉗子を使用して手配します（ 図1F）。互いに部分を重複しない。 <ol><li>ピペットを用いて膜からHBSSの過剰を取る。ここで使用される特定の膜は、フレームに取り付けられ、組織が接触することを可能にするが、媒体によって覆われていない組織培養プレートに挿入される。 </li></ol></li><li>スライス培養培地の1.8ミリリットル（1.2.5）（ 図1G、H）を含む6ウェルプレートに膜インサートを配置します。 11 DIVまたは14 DIV 5％CO 2、37℃で培養皿をインキュベートする。半分培地（0.9ミリリットル）ごとに二日を変更します。 注：;標識は培養時間の最初の20時間のメディアに増殖している細胞については、この段階では、ブロモデオキシウリジン（10μM最終濃度のBrdU）のような試薬を追加します。 </li></ol>免疫蛍光染色したセクションの5.固定<ol><li>の向きに応じて膜をカットしてトリミングするクリーンでシャープなメスの刃を使用して、セクション。 </li><li> 4％PFA（1.2.7）の1ミリリットルを含む24ウェルプレートに膜と一緒にセクションを転送します。 15分ごとに、1×PBSで3回洗浄し、室温で1時間のセクションをインキュベートします。静かに撹拌しながら4℃で透過処理溶液でのセクションのO / Nをインキュベートする。 </li><li>翌日、透過処理溶液中に希釈された適切な一次抗体と共に切片をインキュベートし、O / Nまたは穏やかに撹拌しながら4℃で48時間。 </li><li> 1×PBSで15分間、切片を3回洗浄し、透過処理溶液中に希釈された適切な二次抗体と共に4℃でO / Nインキュベートする。 </li><li>二次抗体とのインキュベーション後、10分間DAPI染色に続いて15分間1×PBSで一回のセクションを洗う。 </li><li>セクション15分間1X PBSで3回ずつ洗浄し、スライドを顕微鏡に移す。 ImmunoMountを加え、穏やかにセクションの上にカバースリップを配置。 4℃、それ自体でスライドO / Nを乾かしマニキュアとアル。 注：常に4℃でスライドしてください。 <ol><li>共焦点顕微鏡（ 図1I）でスライス培養を分析します。 </li></ol></li></ol>

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	<li>Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Milestones+of+neuronal+development+in+the+adult+hippocampus.">Milestones of neuronal development in the adult hippocampus.</a> Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).</li><li>Frotscher, M., Zhao, S., Forster, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+cell+and+fiber+layers+in+the+dentate+gyrus.">Development of cell and fiber layers in the dentate gyrus.</a> Prog Brain Res. 163, 133-142 (2007).</li><li>Muramatsu, R., Ikegaya, Y., Matsuki, N., Koyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatally+born+granule+cells+numerically+dominate+adult+mice+dentate+gyrus.">Neonatally born granule cells numerically dominate adult mice dentate gyrus.</a> Neuroscience. 148, 593-598 (2007).</li><li>Li, G., Pleasure, S. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+utero+electroporation+and+whole+hemisphere+explants:+a+simple+experimental+method+for+studies+of+early+cortical+development.">Ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development.</a> J Vis Exp. (74), (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

海馬は、学習および記憶において重要な機能を有している。歯状回も神経発生は、開発中だけでなく、成人期を通じてだけでなく、発生した2脳領域の一つです。産後と多くの共通の要因が関与する類似の方法で、大人の海馬の神経新生が進行する。これらの要因の調節機構を定義すると、今度は新たな治療法や予防措置につながる神経変性疾患を理解する上で非常に参考になります。この情...

海馬は記憶や学習に重要な役割だけでなく、感情的な行動を果たしている。一つの主な機能は、神経系の高い可塑性を必要とする長期記憶に短期記憶の統合、から構成されている。海馬の歯状回は、入力された情報のための主要なゲートウェイとして機能し、また成人期1,2を通じて継続的なニューロン新生と2脳領域の一つです。海馬の構造の開発が遅れて胚形成の間、特に最初の3〜4週間の生後3中に発生します。歯の早期開発中の幹細胞プールは、出生後だけでなく、大人の神経発生4に必要な確立されている回。現像ニューロンは、生後ならびに成体神経発生の間に、未成熟し、最終的に成熟したニューロンの前駆細胞のいくつかの段階を経て幹細胞から、様々なステージを通過する。神経発生の異なる段階での発現特定の遺伝子が海馬の回路5,6に新しい神経細胞の成熟と統合を可能にするために必要とされている。 免疫組織化学により、マウス遺伝学および表現型分析を用いて、ならびに分子的方法は、これらの遺伝子の多くの発現パターンおよび機能を定義することができた。さらにマイクロアレイ分析、ならびにクロマチン免疫沈降法（ChIP）の潜在的な直接的および間接的な標的遺伝子7,8についての情報を提供した。しかし、歯状回の特定の開発における海馬開発の調節機構に関する多くの未解決の問題は、まだあります。さらなる洞察を得るためにダウンや、興味のある遺伝子及び/又はその標的遺伝子のアップレギュレーションおよび開発中に、それらの運命を追跡する少数の細胞の操作を可能にする必要とされるどの特定の遺伝子系を規制されている。 子宮内エレクトロポレーションで shRNAは、目的の遺伝子のcDNAまたはCreリコンビナーゼのrecombinaSEはそのようなツールを提供しています。確実にするために、所望のDNAまたは低分子RNAの発現プラスミドの存在は、エレクトロポレーションのために使用されるべきである。このアプローチは非常に成功した皮質の開発9,10の勉強に実装されますが、より深い脳の層における海馬の構造の位置に起因する歯状回の開発を検討し、より挑戦的なアプローチです。 器官スライス培養に続いて子宮外エレクトロポレーションは、この問題11,12を回避する一つの方法です。 子宮内エレクトロポレーションではない全胚とは対照的にのみヘッドしたがって、海馬および歯状回に向けたshRNA / DNAを指示するためのより有利な方法で電極を配置することを可能に用いられる。私たちのグループは正常に歯状回の開発8時の転写因子Bcl11bの役割を研究するために子宮外エレクトロポレーションを採用。 Bcl11bは、rによる歯状回開発の二重の役割を持っている免疫組織化学によって実証されたように、前駆細胞の増殖ならびに分化をegulating。さらに、これらのプロセスにおけるBcl11bの関与のためのメカニズムを定義するには、Polleuxグループ11,12のプロトコルは、プロトコルセクションに下記のように歯状回を研究するために調整した。最初のアプローチでの質問はBcl11bが自律神経細胞分化細胞を規制されているかどうかに対処した。第二のアプローチは、デスモプラキン、Bcl11bの直接の標的遺伝子は、Bcl11b表現型を救出するのに十分であるかどうかを検討した。

<table><tbody><tr><td>Flaming/ Brown Micropipette Puller</td><td>Sutter Instruments Company (USA)</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Fine Glass Pipettes</td><td>Warner Instruments</td><td>G100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Microgrinder</td><td>Narishige, Japan</td><td>EG-44</td><td></td></tr><tr><td>Anesthetic Bracket unit</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PY2 34-0412</td><td></td></tr><tr><td>Halovet Vaporizer</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PY2 34-0398</td><td></td></tr><tr><td>Fluovac System</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PY2 34-0387</td><td></td></tr><tr><td>IMS Fluosorber</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PY2 34-0415</td><td></td></tr><tr><td>Anesthetizing Chamber</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PY2 34-0460</td><td></td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>BEX Company</td><td>CUY21 EDIT</td><td></td></tr><tr><td>Tweezers with disk electrodes</td><td>BEX Company</td><td>LF650P3</td><td>3 mm electrodes for E15.5</td></tr><tr><td>Tweezers with disk electrodes</td><td>BEX Company</td><td>LF650P5</td><td>5 mm electrodes for E18.5</td></tr><tr><td>Picospritzer III</td><td>Parker Hannifin Corporation</td><td>P/N 052-0500-900</td><td></td></tr><tr><td>HM 650 V Vibrating Blade Microtome, 230 V</td><td>Thermo Scientific</td><td>920120</td><td></td></tr><tr><td>Dissection Microscope</td><td>Carl Zeiss Microscopy Gmbh</td><td>Stemi SV8</td><td></td></tr><tr><td>Inverted Microscope</td><td>Leica</td><td>Leica DM IL LED</td><td></td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Leica</td><td>Sp5II</td><td></td></tr><tr><td>6 well dish</td><td>BD Falcon</td><td>#353502</td><td></td></tr><tr><td>6 well dish</td><td>CELLSTAR</td><td>#657160</td><td></td></tr><tr><td>Tissue culture inserts</td><td>BD Falcon</td><td>#353090</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Sigma</td><td>F7252</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>#L2020</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>Sigma</td><td>#P5899</td><td></td></tr><tr><td>Spring scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Extra Fine Bonn Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Dumont #55</td><td>11255-20 Inox</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 10x</td><td>Life Technology</td><td>14180-046</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Life Technology</td><td>41010-26</td><td></td></tr></tbody></table>

ex utero electroporation and organotypic slice culture of mouse hippocampal tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.

転写因子Bcl11bのアブレーションは、前駆細胞の増殖および減少歯状回のサイズと細胞数を生じる神経分化の障害を引き起こす。さらに、変異体ニューロンは、学習と記憶障害8を引き起こして海馬回路に統合することができない。 子宮外これらのプロセスでBcl11bの調節機構（複数可）に関する質問に答えるためにエレクトロポレーションを用いた。 <p class="jove_content"...

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Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.

子宮外エレクトロポレーションおよびマウスの海馬組織の器官型スライス培養

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

ex-utero-electroporation-organotypic-slice-culture-mouse-hippocampal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

9.4K ビュー.  University of Ulm. Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.

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Organotypic Slice Cultures for Studies of Postnatal Neurogenesis

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This method maintains the characteristic topographical morphology of the hippocampus while allowing direct application of pharmacological agents to the developing hippocampal dentate gyrus. Additionally, slice cultures can be maintained for up to 4 weeks and thus, allow one to study the maturation process of newborn granule neurons. Slice cultures allow for efficient pharmacological manipulation of hippocampal slices while excluding complex variables such as uncertainties related to the deep anatomic location of the hippocampus as well as the blood brain barrier. For these reasons, we sought to optimize organotypic slice cultures specifically for postnatal neurogenesis research.

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis using the organotypic slice culture technique. This method allows for in vitro manipulation of adult neurogenesis and allows for the direct application of pharmacological agents to the cultured hippocampus.

生後神経発生の研究のための器官型スライス培養

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This ...

発生生物学

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in which the enhanced version of the green fluorescent protein (EGFP) is exclusively expressed in all neurons of the developing central and peripheral nervous system1, allowing the possibility to both film the innervation of the forelimb and to manipulate this process with pharmacological and genetic techniques2. The most critical parameter in the successful cultivation of such slice cultures is the method by which the slices are prepared. After extensive testing of a variety of methods, we have found that a vibratome is the best possible device to slice the embryos such that they routinely result in a culture that demonstrates viability over a period of several days, and most importantly, develops in an age-specific manner. For mid-gestation embryos, this includes the normal outgrowth of spinal nerves from the spinal cord and the dorsal root ganglia to their targets in the periphery and the proper determination of skeletal and muscle tissue. 
In this work, we present a method for processing whole embryos of embryonic day (E) E10 to E12 into 300 - 400 micrometer slices for cultivation in a standard tissue culture incubator, which can be studied for up to two days after slice preparation. Critical for the success of this approach is the use of a vibratome to slice each agarose-embedded embryo. This is followed by the cultivation of the slices upon Millicell culture membrane inserts placed upon a small volume of medium, resulting in an interface culture technique. One litter with an average of 7 embryos routinely produces at least 14 slices (2-3 slices of the forelimb region per embryo), which varies slightly due to the age of the embryos as well as to the thickness of the slices. About 80% of the cultured slices show nerve outgrowth, which can be measured througout the culturing period2. Representative results using the tauGFP mouse line are demonstrated.

We present a method to prepare organotypic slices of mid-gestation mouse embryos for the cultivation and time-lapse imaging of peripheral nerve outgrowth.

末梢神経突起伸長のリアルタイムイメージングのためのGFP発現マウス胚の器官型スライス培養

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

神経科学

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

器官型海馬切片培養

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the first born neurons remain closer to the ventricle while the last born neurons migrate past the first born neurons towards the surface of the brain1. In addition to neuronal migration2, a key process for normal cortical function is the regulation of neuronal morphogenesis3. While neuronal morphogenesis can be studied in vitro in primary cultures, there is much to be learned from how these processes are regulated in tissue environments.
We describe techniques to analyze neuronal migration and/or morphogenesis in organotypic slices of the cerebral cortex4,6. A pSilencer modified vector is used which contains both a U6 promoter that drives the double stranded hairpin RNA and a separate expression cassette that encodes GFP protein driven by a CMV promoter7-9. Our approach allows for the rapid assessment of defects in neurite outgrowth upon specific knockdown of candidate genes and has been successfully used in a screen for regulators of neurite outgrowth8. Because only a subset of cells will express the RNAi constructs, the organotypic slices allow for a mosaic analysis of the potential phenotypes. Moreover, because this analysis is done in a near approximation of the in vivo environment, it provides a low cost and rapid alternative to the generation of transgenic or knockout animals for genes of unknown cortical function. Finally, in comparison with in vivo electroporation technology, the success of ex vivo electroporation experiments is not dependant upon proficient surgery skill development and can be performed with a shorter training time and skill.

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

To conduct a rapid assessment of the function of genes in the development of cerebral cortex, we describe methods involving the ex vivo electroporation of plasmids co-expressing inhibitory RNA (RNAi) and GFP in murine embryonic cortex. This protocol is amenable to the study of various aspects of neurodevelopment such as neurogenesis, neuronal migration and neuronal morphogenesis including dendrite and axon outgrowth.

神経形態形成の研究のための方法：<em&gt;エキソビボ</em胎児マウス大脳皮質&gt; RNAiのエレクトロポレーション

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and associated extracellular matrix. Because they provide a suitable organotypic environment, cortical slice explants are often used to investigate those interactions that control neuronal differentiation and development. Although beneficial, the slice explant model can suffer from drawbacks including aberrant cellular lamination and migration. Here we report a whole cerebral hemisphere explant system for studies of early cortical development that is easier to prepare than cortical slices and shows consistent organotypic migration and lamination. In this model system, early lamination and migration patterns proceed normally for a period of two days in vitro, including the period of preplate splitting, during which prospective cortical layer six forms. We then developed an ex utero electroporation (EUEP) approach that achieves ~80% success in targeting GFP expression to neurons developing in the dorsal medial cortex.
The whole hemisphere explant model makes early cortical development accessible for electroporation, pharmacological intervention and live imaging approaches. This method avoids the survival surgery required of in utero electroporation (IUEP) approaches while improving both transfection and areal targeting consistency. This method will facilitate experimental studies of neuronal proliferation, migration and differentiation.

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

This protocol describes an improved explant procedure that involves ex utero electroporation, dissection and culture of entire cerebral hemispheres from the embryonic mouse. The preparation facilitates pharmacological studies and assays of gene function during early cortical development.

exの子宮内エレクトロポレーションと全半球植：早期皮質の発達についての研究のための簡単な実験方法

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, their distinct dendritic morphologies, their specific patterns of axonal connectivity, and their selective firing responses. The molecular and cellular mechanisms responsible for these aspects of differentiation during development are still poorly understood.
Here, we describe combined protocols for labeling and characterizing the structural connectivity and excitability of cortical neurons. Modification of the in utero electroporation (IUE) protocol allows the labeling of a sparse population of neurons. This, in turn, enables the identification and tracking of the dendrites and axons of individual neurons, the precise characterization of the laminar location of axonal projections, and morphometric analysis. IUE can also be used to investigate changes in the excitability of wild-type (WT) or genetically modified neurons by combining it with whole-cell recording from acute slices of electroporated brains. These two techniques contribute to a better understanding of the coupling of structural and functional connectivity and of the molecular mechanisms controlling neuronal diversity during development. These developmental processes have important implications on axonal wiring, the functional diversity of neurons, and the biology of cognitive disorders.

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

This manuscript provides protocols that use in utero electroporation (IUE) to describe the structural connectivity of neurons at the single-cell level and the excitability of fluorescently labeled neurons. Histology is used to characterize dendritic and axonal projections. Whole-cell recording in acute slices is used to investigate excitability.

子宮内エレクトロポレーションは、神経部分集団の興奮とシングルセルの接続を研究するためのアプローチ

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It has helped to describe the different steps of radial migration and characterize the molecular mechanisms controlling this process. To directly and dynamically analyze migrating neurons they have to be traced over time. This protocol describes a workflow that combines in utero electroporation with organotypic slice culture and time-lapse confocal imaging, which allows for a direct examination and dynamic analysis of radially migrating cortical neurons. Furthermore, detailed characterization of migrating neurons, such as migration speed, speed profiles, as well as radial orientation changes, is possible. The method can easily be adapted to perform functional analyses of genes of interest in radially migrating cortical neurons by loss and gain of function as well as rescue experiments. Time-lapse imaging of migrating neurons is a state-of-the-art technique that once established is a potent tool to study the development of the cerebral cortex in mouse models of neuronal migration disorders.

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

This protocol provides instructions for direct observation of radially migrating cortical neurons. In utero electroporation, organotypic slice culture, and time-lapse confocal imaging are combined to directly and dynamically study the effects of overexpression or downregulation of genes of interest in migrating neurons and to analyze their differentiation during development.

胚性マウス脳の器官型スライス培養における移行ニューロンの経時的共焦点イメージング<em&gt;ウテロの</em&gt;エレクトロポレーション

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate tangentially from their place of origin in the ventral telencephalon (including from the medial and caudal ganglionic eminences (MGE, CGE)) to the dorsal cortical plate in response to a variety of intrinsic and extrinsic cues. Different methodologies have been developed over the years to genetically manipulate specific pathways and investigate how they regulate the dynamic cytoskeletal changes required for proper IN migration. In utero electroporation has been extensively used to study the effect of gene repression or overexpression in specific IN subtypes while assessing the impact on morphology and final position. However, while this approach is readily used to modify radially migrating pyramidal cells, it is more technically challenging when targeting INs. In utero electroporation generates a low yield given the decreased survival rates of pups when electroporation is conducted before e14.5, as is customary when studying MGE-derived INs. In an alternative approach, MGE explants provide easy access to the MGE and facilitate the imaging of genetically modified INs. However, in these explants, INs migrate into an artificial matrix, devoid of endogenous guidance cues and thalamic inputs. This prompted us to optimize a method where INs can migrate in a more naturalistic environment, while circumventing the technical challenges of in utero approaches. In this paper, we describe the combination of ex utero electroporation of embryonic mouse brains followed by organotypic slice cultures to readily track, image and reconstruct genetically modified INs migrating along their natural paths in response to endogenous cues. This approach allows for both the quantification of the dynamic aspects of IN migration with time-lapse confocal imaging, as well as the detailed analysis of various morphological parameters using neuronal reconstructions on fixed immunolabeled tissue.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Here, we provide a low-cost and reliable method to generate electroporated brain organotypic slice cultures from mouse embryos suitable for confocal microscopy and live-imaging techniques.

Ex 子宮エレクトロポレーションと gaba 作動性介在ニューロンの移行のライブ イメージング用マウス萌芽期の脳の脊髄スライス培養

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate ...

Single-Cell Electroporation across Different Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Excitatory and Class-Specific Inhibitory Neurons

Electroporation has established itself as a critical method for transferring specific genes into cells to understand their function. Here, we describe a single-cell electroporation technique that maximizes the efficiency (~80%) of in vitro gene transfection in excitatory and class-specific inhibitory neurons in mouse organotypic hippocampal slice culture. Using large glass electrodes, tetrodotoxin-containing artificial cerebrospinal fluid and mild electrical pulses, we delivered a gene of interest into cultured hippocampal CA1 pyramidal neurons and inhibitory interneurons. Moreover, electroporation could be carried out in cultured hippocampal slices up to 21 days in vitro with no reduction in transfection efficiency, allowing for the study of varying slice culture developmental stages. With interest growing in examining the molecular functions of genes across a diverse range of cell types, our method demonstrates a reliable and straightforward approach to in vitro gene transfection in mouse brain tissue that can be performed with existing electrophysiology equipment and techniques.

Presented here is a protocol for single-cell electroporation that can deliver genes in both excitatory and inhibitory neurons across a range of in vitro hippocampal slice culture ages. Our approach provides precise and efficient expression of genes in individual cells, which can be used to examine cell-autonomous and intercellular functions.

マウス海馬興奮性およびクラス特異的阻害ニューロンの異なるorganotypics Slice培養における単細胞エレクトロポレーション

Electroporation has established itself as a critical method for transferring specific genes into cells to understand their function. Here, we describe a ...

Preparation of Organotypic Slice Cultures from a Rat Pup&#39;s Hippocampus

Source: Mosa, A. J. et al., <a href="https://app.jove.com/v/52353">Organotypic Slice Cultures for Studies of Postnatal Neurogenesis.</a> J. Vis. Exp. (2015).
This video demonstrates a method for preparing organotypic hippocampal slice cultures from the brain of a rat pup. It outlines the steps involved in the dissection of the hippocampus, slicing, and culture conditions required to promote cell viability and growth in the hippocampal slices, ultimately generating organotypic slice cultures.

ラットの子犬の海馬からの器官型スライス培養物の調製

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

子宮外エレクトロポレーションおよびマウスの海馬組織の器官型スライス培養

要約

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生後神経発生の研究のための器官型スライス培養

末梢神経突起伸長のリアルタイムイメージングのためのGFP発現マウス胚の器官型スライス培養

器官型海馬切片培養

神経形態形成の研究のための方法：

exの子宮内エレクトロポレーションと全半球植：早期皮質の発達についての研究のための簡単な実験方法

子宮内エレクトロポレーションは、神経部分集団の興奮とシングルセルの接続を研究するためのアプローチ

胚性マウス脳の器官型スライス培養における移行ニューロンの経時的共焦点イメージング

Ex 子宮エレクトロポレーションと gaba 作動性介在ニューロンの移行のライブイメージング用マウス萌芽期の脳の脊髄スライス培養

マウス海馬興奮性およびクラス特異的阻害ニューロンの異なるorganotypics Slice培養における単細胞エレクトロポレーション

ラットの子犬の海馬からの器官型スライス培養物の調製

子宮外エレクトロポレーションおよびマウスの海馬組織の器官型スライス培養

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生後神経発生の研究のための器官型スライス培養

末梢神経突起伸長のリアルタイムイメージングのためのGFP発現マウス胚の器官型スライス培養

器官型海馬切片培養

神経形態形成の研究のための方法：

exの子宮内エレクトロポレーションと全半球植：早期皮質の発達についての研究のための簡単な実験方法

子宮内エレクトロポレーションは、神経部分集団の興奮とシングルセルの接続を研究するためのアプローチ

胚性マウス脳の器官型スライス培養における移行ニューロンの経時的共焦点イメージング

Ex 子宮エレクトロポレーションと gaba 作動性介在ニューロンの移行のライブ イメージング用マウス萌芽期の脳の脊髄スライス培養

マウス海馬興奮性およびクラス特異的阻害ニューロンの異なるorganotypics Slice培養における単細胞エレクトロポレーション

ラットの子犬の海馬からの器官型スライス培養物の調製

Ex 子宮エレクトロポレーションと gaba 作動性介在ニューロンの移行のライブイメージング用マウス萌芽期の脳の脊髄スライス培養