This work was supported by grants from the Deutsche Forschungsgemeinschaft to SB (BR-2215; SFB 497/A9).

NOT: Tüm hayvan deneyleri Alman yasalarına uygun olarak yürütülmüştür ve Tübingen devlet daireleri tarafından onaylandı. Mikropipetler, Çözümler ve Membran 1. Hazırlık <ol><li> Mikropipetler hazırlanması <ol><li> Aşağıdaki program ile bir mikropipet çektirmenin kullanarak cam mikropipetler çekin: Heat: 540, Pull: 125, Hız: 20 ve Gecikme: 140. iğne uzunluğu miktarda 5,5 cm. </li><li> Bir microgrinder kullanılarak Konik iğneleri 4 mm, uygun bir uç boyutu elde edildi. Ipuçları zarar görmemesi için bir kutu ya da 15 cm Petri kabındaki iğneler saklayın. </li></ol></li><li> Çözümler hazırlanması <ol><li> Plazmid DNA Çözelti <ol><li> Üreticinin protokolüne göre bir Endotoksin serbest Maxi prep kiti kullanarak istenen cDNA, konstrüktünü ihtiva eden plazmid DNA hazırlanması. </li><li> DNA (GFP başak vektör olmaksızın) 3 ug / ul nihai konsantrasyona kadar çözelti veya 4 ayarlama ug /ul endotoksinde (GFP başak vektörünün 1 ug) Hızlı Green (nihai konsantrasyon% 0.05) ihtiva eden Tris-EDTA tampon maddesi boşaltın. </li></ol></li><li> Laminin Stok çözümü <ol><li> 1 ml&#39;lik bir son hacme kadar steril su içinde laminin, 1 mg eritin. -80 ° C&#39;de 100 ul alikotları ve mağaza hazırlayın. </li></ol></li><li> Poli-L-Lizin Stok Çözeltisi <ol><li> 1 mg / ml&#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar steril su, 50 ml poli-L-lisin, 50 mg eritin. -20 ° C&#39;de 1 ml&#39;lik numuneler hazırlayın ve mağaza hazırlayın. </li></ol></li><li> Hank Dengeli Tuz Çözeltisi doldurun (Tam HBSS) <ol><li> CaCl2, 10 mi, 100 mM MgSO 4 10x HBSS 100 mi, 1 M HEPES tamponu, 2.5 ml (pH 7.4), 1 M, D-glikoz, 30 mi, 100 mM, 10 ml birleştirilerek tam HBSS hazırlayın ve 4 1 ml M NaHCO 3. 4 ° C&#39;de 1 L ve saklamak için steril su ekleyin. NOT: Otoklav tüm çözümler 1 M HEPES tampon bekliyoruz ve 1 M D-glikoz, fil vardırter sterilize. </li></ol></li><li> Dilim Kültür Orta <ol><li> Bazal Orta Eagle 35 ml tam HBSS 12.9 mi (1.2.4), 1 M, D-glikoz, 1.35 ml, 200 mM L-glutamin, 250 ul ve 500 ul ekleyerek dilim kültür ortamı hazırlayın penisilin-streptomisin 50 ml&#39;lik bir nihai hacim elde etmek. 4 ° C&#39;de bir son% 5 konsantrasyon ve saklamak için at serumu ekleyin. </li></ol></li><li> Düşük bir erime noktası (SAT) Agaroz <ol><li> Agaroz yüksek güçte 1-2 dakika boyunca bir mikrodalga fırın içinde ısıtılması ve ardından tam HBSS, 50 ml (1.2.4) LMP 2 g ekleyerek% 4 LMP agaroz çözelti hazırlayın. 39 ° C - 37 ° C&#39;deki bir su banyosu içinde, bu çözüm tutun. 4 ° C ve yeniden de çözüm saklayın. </li></ol></li><li> Paraformaldehyde Çözüm <ol><li> Bir çeker ocak içinde 1 x PBS, 100 ml paraformaldeid 4 g ekleyerek% 4 paraformaldehit (PFA) solüsyon hazırlanır. 60 ° C&#39;ye ısıtın çözeltisi ve çözelti C olana kadar, 1 N NaOH ile bir kaç damlaemizle. </li></ol></li><li> Permeabilizasyon Çözüm <ol><li> 4 ° C&#39;de% 0.3 Triton X-100 ve mağaza içeren 1x PBS 300 ml BSA, 9 g eritin. Uzun süreli depolama için% 10 sodyum azid ekleyin. </li></ol></li></ol></li><li> Membran Ek&#39;lerin Kaplama <ol><li> 12 ml&#39;lik bir son hacme kadar laminin stok çözeltisi (1.2.2) ve steril su içinde poli-L-lisin stok çözeltisi (1.2.3) bir alikotu bir kısım seyreltin. </li><li> Steril su içeren her 2 ml 6 yuvalı plakalara membran geçme yerleştirin. Zarın üzerine kaplama solüsyonu 1 ml ilave edilir ve bir% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de O / N inkübe edin. </li><li> İnkübasyondan sonra membran steril su ve kuru, 1 ml ile üç kez ekler yıkayın. Kuru 6 oyuklu bir plaka içerisinde dört hafta boyunca 4 ° C&#39;de aynı gün ya da mağaza Kaplanmış zar, monte edilmelidir. </li></ol></li></ol> 2. DNA Enjeksiyon ve E15.5 Elektroporasyon ve E18.5 Embriyolar <ol><li&gt;% 5 izofluran ile doyurulmuş ve bir buharlaştıncıya bağlı bir anestezi bölmesi içine yerleştirilerek dişi fare şeklindeki bir saat anestezisi. 1 L / dakikalık bir hızda, izofluran ve oksijen sirküle. 2-4 dakika ya da fare pençeleri arasında sıkıştırarak test edildiği bilinçsiz kadar kutuya hayvan tutun. </li><li> Embriyonik gün servikal dislokasyon (E) 15.5 18.5 veya tarafından bilinçsiz fare Euthanize. Embriyoları 13 içeren rahim inceleyin ve soğuk komple HBSS 15-20 ml içeren bir Petri kabı içine yerleştirin. NOT: Bu noktadan itibaren, buz üzerinde embriyo ve dokuları tutmak. </li><li> Soğuk tam HBSS içeren ikinci bir Petri kabı içine uterin boynuz ve yerden her embriyo ayırmak için bir makas kullanın. </li><li> Bir mikroskop altında, rahim kas duvarı ve ince forseps (# 55) ve bir makas kullanarak plasentayı sever. Dikkatle sarısı kesesi embriyo serbest bırakın. </li><li> Decapitat Bonn bir makas kullanınSadece 60 ° açıyla ön ayakları üzerinde e embriyolar. Deney embriyoların genotipleme gerektiriyorsa, genomik DNA izolasyonu için bir doku numunesi (kuyruk küçük bir parça) toplar. </li><li> Temiz ve kuru bir Petri kabı baş aktarın. Kafası 60 ° açı decapitated olmuştu Çünkü sırt tarafı yukarı yerleştirildiğinde, baş bir tarafa eğin gerekir. </li><li> Bregmaya hemisfer yakın ortasına dikkatli bir iğne yerleştirin (Şekil 1A, B). 5-8 bakliyat uygulayarak, darbe başına 10-15 milisaniye süresince basınç 30 £ kullanarak Picospritzer III pedala basarak DNA çözüm (3 veya 4 ug / ul at) yaklaşık 2-3 ul enjekte edilir. puls süresi ve sayısı, daha fazla zaman gerektiren küçük açıklıklar iğne açıklığının çapına bağlıdır. Her darbe arasındaki aralık 1 sn tutarlar. </li><li> Elektrotlar yerleştirerek önce EMBR kafasına tam HBSS birkaç damla uygulamakyo. &quot;Negatif&quot; terminali enjekte ventrikül ve embriyonun kafasının (Şekil 1C, D) kulak altına enjekte ventrikül karşı tarafında &quot;pozitif&quot; elektrod ile aynı tarafta kalacak şekilde elektrotlar yerleştirin. 50 V 5 bakliyat uygulayın <ol><li> E 18.5 için E 15.5 için 3 mm elektrotları ve 5 mm elektrotları kullanın. </li></ol></li></ol> Beyin 3. Diseksiyon <ol><li> Elektroporasyondan sonra, ince forseps bir çift yardımı ile baş deri soyulabilir. Yay makas kullanılarak kafatasının orta hat beyincik ortasında küçük bir kesi yapmak. </li><li> Kesi içine yaylı makas yerleştirin ve sagital sütür boyunca uzunlamasına kesin. Kafatasını kalkmasına ve ince forseps kullanarak kafatası beyni ayırın. 15-20 ml soğuk komple HBSS çözeltisi içine bütün beyin aktarın. </li><li> Bu arada,% 4 LMP agaroz dökünAyrılabilen uzak kalıp içine, bir su banyosu içinde 37-39 ° C&#39;de tutuldu. </li><li> Küçük kepçe spatula ile tam HBSS dışarı beyin alın ve ince doku kağıt veya Kimwipes kullanarak HBSS aşırı boşaltın. </li><li> Agaroz içine yavaşça bütün beyin yerleştirin ve ince bir iğne ile konumunu ayarlamak. Agaroz katılaşmış ve blok (koronal bölümleri için koku ampuller kadar gelin) kesitli kadar buz üzerinde kalıp tutun. </li></ol> 4. Vibratome Kesit ve Dilim Kültür <ol><li> LMP agaroz blokları Trim ve &#39;süper tutkal&#39; kullanarak numune aşamasına tutkal onları. Tutkal sonra kuru transfer vibratome tampon tepsiye örnek aşamasıdır ve blok çözeltisi batırılır kadar HBSS tamamlamak soğuk buz ile doldurun. NOT: kesit önce% 70 etanol ile tüm enstrüman ve ekipman yüzeyleri sterilize edin. </li><li> Takip gibi yeni bir bıçak kullanarak 250 mikron kalınlığında vibratome bölümleri hazırlayın. <ol><li> Blok wi TrimAşağıdaki ayarları inci; Frekans - 60 Hz, genlik - 0.7 mikron, hız 16-18 mm / sn. Yavaş hızda (9 mm / sn) yukarıdaki ayarlarla istenilen doku içeren bölümleri kesin. Beyin gelen kesit başlayarak, beyin 5-7 bölümleri toplamak. </li><li> Bükük spatula yardımı ile HBSS tamamlamak ve tüm bölümleri (Şekil 1E) tahsil edilene kadar buz üzerinde tutmak soğuk buz 5 ml içeren bir temiz 6 kuyu kültür çanak bölümleri aktarın. </li></ol></li><li> Bölümlerin yönelimleri için, zar üzerinde bölümleri yerleştirmeden önce tam HBSS 100 ul ile çapraz bir şekilde membran ıslatın. </li><li> (Membran üzerine bölümüne itmek için forseps kullanabilir sonra forseps ile bölümün bir köşesini pick up ve spatula üzerine çekin ve) membran üzerine bükülmüş bir spatula kullanarak bölümleri aktarın. Bir zar üzerinde beş bölümden kadar yerleştirin ve (forseps kullanarak Şekil 1F düzenlemek). Birbirleri ile bölümleri üst üste etmeyin. <ol><li> Bir pipet kullanarak zarın kapalı HBSS fazlalığı alın. Burada kullanılan özel membranları ve çerçeveye bağlı olarak doku temas ancak orta kapsamadığı sağlar doku kültür plakasının içine yerleştirilir. </li></ol></li><li> Dilim kültür ortamında (1.2.5) (Şekil 1G, lH), 1.8 ml su ihtiva eden bir 6 yuvalı plaka halinde membran geçme yerleştirin. 11 DIV veya 14 DIV için% 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de kültür kaplarına inkübe edin. Yarım orta (0,9 ml), her ikinci gün değiştirin. NOT: Bu aşamada, bromodeoksiüridin gibi reaktifler ekleyerek (BrdU 10 uM nihai konsantrasyon) Etiketleme kültür zaman, ilk 20 saat boyunca ortama hücreler proliferasyon için. </li></ol> İmmünofloresan Boyama Ardından Bölüm 5. Sabitleme <ol><li> Kesmek için temiz ve keskin neşter bıçağı kullanın ve yönüne bağlı olarak membranlar Döşemebölümler. </li><li> % 4 PFA (1.2.7) 1 ml ihtiva eden bir 24 yuvalı plaka zar ile birlikte bölümleri aktarın. 15 dakika her biri için 1 x PBS ile 3 kez yıkanmasından sonra, oda sıcaklığında 1 saat boyunca bölümler inkübe edin. Hafifçe çalkalama ile 4 ° C&#39;de permeabilizasyon çözeltisi ile bölümleri O / N inkübe edin. </li><li> Ertesi gün, permeabilizasyon çözeltisi içinde seyreltilmiş uygun primer antikorlar ile bölümleri inkübe O / N veya yumuşak çalkalama ile 4 ° C&#39;de 48 saat karıştırıldı. </li><li> 1x PBS ile 15 dakika boyunca bölümleri 3 kez yıkayın ve permeabilizasyon çözeltisi içinde seyreltilmiş uygun ikincil antikorlar ile 4 ° C&#39;de O / N inkübe edin. </li><li> Sekonder antikor ile inkübe edildikten sonra, 10 dakika süre ile DAPI lekelemesi yoluyla, ardından 15 dakika boyunca 1 x PBS ile bir kez bölümleri yıkayın. </li><li> 15 dakika her biri için bölümleri 1x PBS ile 3 kez yıkayın ve slaytlar mikroskop transfer. ImmunoMount ekleyin ve yavaşça bölümlerin üstüne bir lamel. 4 ° C ve se de slaytlar O / N kurulayınoje ile ark. NOT: Her zaman 4 ° C&#39;de slaytlar tutun. <ol><li> Konfokal mikroskopi (Şekil 1I) tarafından dilim kültürleri analiz. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Milestones+of+neuronal+development+in+the+adult+hippocampus.">Milestones of neuronal development in the adult hippocampus.</a> Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).</li><li>Frotscher, M., Zhao, S., Forster, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+cell+and+fiber+layers+in+the+dentate+gyrus.">Development of cell and fiber layers in the dentate gyrus.</a> Prog Brain Res. 163, 133-142 (2007).</li><li>Muramatsu, R., Ikegaya, Y., Matsuki, N., Koyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatally+born+granule+cells+numerically+dominate+adult+mice+dentate+gyrus.">Neonatally born granule cells numerically dominate adult mice dentate gyrus.</a> Neuroscience. 148, 593-598 (2007).</li><li>Li, G., Pleasure, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+the+dentate+gyrus:+what+we+are+learning+from+mouse+mutants.">Morphogenesis of the dentate gyrus: what we are learning from mouse mutants.</a> Dev Neurosci. 27, 93-99 (2005).</li><li>Hsieh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchestrating+transcriptional+control+of+adult+neurogenesis.">Orchestrating transcriptional control of adult neurogenesis.</a> Genes Dev. 26, 1010-1021 (2012).</li><li>Li, G., Pleasure, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+regulation+of+dentate+gyrus+morphogenesis.">Genetic regulation of dentate gyrus morphogenesis.</a> Prog Brain Res. 163, 143-152 (2007).</li><li>Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+current+state+of+chromatin+immunoprecipitation.">The current state of chromatin immunoprecipitation.</a> Mol Biotechnol. 45, 87-100 (2010).</li><li>Simon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual+function+of+Bcl11b/Ctip2+in+hippocampal+neurogenesis.">A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis.</a> Embo J. 31, 2922-2936 (2012).</li><li>Pilaz, L. J., Silver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+mitosis+in+the+developing+mouse+embryonic+cortex.">Live imaging of mitosis in the developing mouse embryonic cortex.</a> J Vis Exp. (88), (2014).</li><li>Pacary, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+genetic+manipulation+of+dendrites+and+spines+in+the+mouse+cerebral+cortex+and+hippocampus+using+in+utero+electroporation.">Visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li><li>Hand, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+Neurogenin2+specifies+the+migration+properties+and+the+dendritic+morphology+of+pyramidal+neurons+in+the+neocortex.">Phosphorylation of Neurogenin2 specifies the migration properties and the dendritic morphology of pyramidal neurons in the neocortex.</a> Neuron. 48, 45-62 (2005).</li><li>Polleux, F., Ghosh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+slice+overlay+assay:+a+versatile+tool+to+study+the+influence+of+extracellular+signals+on+neuronal+development.">The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal development.</a> Sci STKE. (136), 19 (2002).</li><li>Shea, K., Geijsen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+6.5+dpc+mouse+embryos.">Dissection of 6.5 dpc mouse embryos.</a> J Vis Exp. (2), (2007).</li><li>Sugiyama, T., Osumi, N., Katsuyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+germinal+matrices+in+the+developing+dentate+gyrus+are+composed+of+neuronal+progenitors+at+distinct+differentiation+stages.">The germinal matrices in the developing dentate gyrus are composed of neuronal progenitors at distinct differentiation stages.</a> Dev Dyn. 242, 1442-1453 (2013).</li><li>Lechler, T., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desmoplakin:+an+unexpected+regulator+of+microtubule+organization+in+the+epidermis.">Desmoplakin: an unexpected regulator of microtubule organization in the epidermis.</a> J Cell Biol. 176, 147-154 (2007).</li><li>Nichols, A. J., O'Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+utero+electroporation+and+whole+hemisphere+explants:+a+simple+experimental+method+for+studies+of+early+cortical+development.">Ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development.</a> J Vis Exp. (74), (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

hipokampus öğrenme ve hafızada önemli bir işleve sahiptir. dentat girus da nöron gelişimi sırasında aynı zamanda yetişkinlik boyunca sadece oluşur iki beyin bölgelerinden biridir. Doğum sonrası ve bir çok yaygın faktörleri söz konusu eden benzer bir şekilde, yetişkin hipokampal nöron ilerler. Bu faktörlerin düzenleyici mekanizmaların tanımlanması da yeni tedaviler ve önleyici tedbirlere yol açacaktır nörodejeneratif hastalıkların anlaşılmasında çok yararlı olacaktır. Bu bilgiyi edi...

hipokampus bir hafıza ve öğrenmede önemli rol yanı sıra duygusal davranış oynar. Bir ana işlevi sinir sisteminin yüksek plastisite gerektiren uzun süreli belleğe kısa süreli hafıza konsolidasyon oluşur. hipokampus dentat girus giriş bilgileri için birincil ağ geçidi gibi davranır ve yetişkinlik 1,2 genelinde de devam eden nöron iki beyin bölgelerinden biri olduğunu. Hipokampal yapının geliştirilmesi geç embriyojenez sırasında ve özellikle de ilk 3-4 hafta postnatal 3 sırasında meydana gelir. Dentate erken gelişimi sırasında kök hücre havuzu yetişkin nöron 4 yanı sıra postnatal için gerekli kurdu olan gyrus. Gelişmekte nöronlar postnatal yanı sıra yetişkin nöron sırasında olgunlaşmamış ve nihayet olgun nöron progenitör hücrelerin çeşitli aşamalardan kök hücreden, çeşitli aşamalardan geçer. Nöron ifadesi farklı aşamalarındaBelirli genler hipokampal devresi 5,6 içine olgunlaşmasını ve yeni nöronların entegrasyonu sağlamak için gereklidir. Bu genlerin çoğunun ifade desen ve fonksiyon tanımlayan izin fare genetik ve immünohistokimyasal olarak fenotip analizinin yanı sıra moleküler yöntemler kullanılarak. Ilave mikroarray analizi gibi kromatin immunoprecipitation (ChIP) potansiyel doğrudan ve dolaylı hedef genlerin 7,8 hakkında bilgi verdi. Ancak, kıvrımlarının gelişiminde özellikle hipokampal gelişim düzenleyici mekanizmaları ile ilgili pek çok açık sorular, hala vardır. Aşağı veya yukarı-regülasyonu faiz ve / veya hedef genlerin ve gelişim sırasında kaderlerini takip geninin spesifik genlerin hücre az sayıda manipülasyon izin gerekli bir sistem nasıl düzenlendiği ileri fikir edinmek için. Utero elektroporasyon shRNAs, ilgi veya Cre recombina genlerinin cDNAse böyle bir araç sağlar. Elektroporasyon için kullanılmalıdır arzu edilen DNA ya da küçük RNA&#39;ların sentezleme plazmidlerin varlığını sağlamak. Bu yaklaşım çok başarılı nedeniyle derin beyin tabakalarında hipokampal yapıların konumuna dentat girus gelişimini inceleyen bir daha zorlu bir yaklaşım kortikal gelişimini 9,10 okuyan uygulanan, ancak mesafesindedir. Organotipik dilim kültür ardından Ex utero elektroporasyon bu sorunu aşmak 11,12 bir yaklaşımdır. Aksine utero elektroporasyon değil bütün embriyo ancak kafa nedenle hipokampus ve dentat girus doğru shRNA / DNA doğrudan daha uygun bir şekilde elektrotlar yerleştirmek için izin kullanılan mi. Grubumuz başarıyla dentat girus gelişimi 8 sırasında transkripsiyon faktörü Bcl11b rolünü incelemek için ex utero elektroporasyon istihdam. Bcl11b r tarafından dentat girus gelişiminde ikili bir rolü vardırimmünohistokimya ile gösterilmiş olduğu üzere, progenitör hücre çoğalması aynı zamanda farklılaşma egulating. Bundan başka, bu işlemlerde Bcl11b katılımı için bir mekanizma olarak tanımlamak için, Polleux grubunun 11,12 protokoller, protokol bölümünde aşağıda anlatıldığı gibi dentat girus çalışma ayarlanmıştır. İlk yaklaşımda soru Bcl11b özerk nöronal hücre farklılaşması hücre düzenleyen olup olmadığını ele alındı. İkinci bir yaklaşım Desmoplakin, Bcl11b doğrudan hedef gen, Bcl11b fenotip kurtarmak için yeterli olup olmadığı incelenmiştir.

<table><tbody><tr><td>Flaming/ Brown Micropipette Puller</td><td>Sutter Instruments Company (USA)</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Fine Glass Pipettes</td><td>Warner Instruments</td><td>G100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Microgrinder</td><td>Narishige, Japan</td><td>EG-44</td><td></td></tr><tr><td>Anesthetic Bracket unit</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PY2 34-0412</td><td></td></tr><tr><td>Halovet Vaporizer</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PY2 34-0398</td><td></td></tr><tr><td>Fluovac System</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PY2 34-0387</td><td></td></tr><tr><td>IMS Fluosorber</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PY2 34-0415</td><td></td></tr><tr><td>Anesthetizing Chamber</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PY2 34-0460</td><td></td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>BEX Company</td><td>CUY21 EDIT</td><td></td></tr><tr><td>Tweezers with disk electrodes</td><td>BEX Company</td><td>LF650P3</td><td>3 mm electrodes for E15.5</td></tr><tr><td>Tweezers with disk electrodes</td><td>BEX Company</td><td>LF650P5</td><td>5 mm electrodes for E18.5</td></tr><tr><td>Picospritzer III</td><td>Parker Hannifin Corporation</td><td>P/N 052-0500-900</td><td></td></tr><tr><td>HM 650 V Vibrating Blade Microtome, 230 V</td><td>Thermo Scientific</td><td>920120</td><td></td></tr><tr><td>Dissection Microscope</td><td>Carl Zeiss Microscopy Gmbh</td><td>Stemi SV8</td><td></td></tr><tr><td>Inverted Microscope</td><td>Leica</td><td>Leica DM IL LED</td><td></td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Leica</td><td>Sp5II</td><td></td></tr><tr><td>6 well dish</td><td>BD Falcon</td><td>#353502</td><td></td></tr><tr><td>6 well dish</td><td>CELLSTAR</td><td>#657160</td><td></td></tr><tr><td>Tissue culture inserts</td><td>BD Falcon</td><td>#353090</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Sigma</td><td>F7252</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>#L2020</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>Sigma</td><td>#P5899</td><td></td></tr><tr><td>Spring scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Extra Fine Bonn Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Dumont #55</td><td>11255-20 Inox</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 10x</td><td>Life Technology</td><td>14180-046</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Life Technology</td><td>41010-26</td><td></td></tr></tbody></table>

ex utero electroporation and organotypic slice culture of mouse hippocampal tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.

Transkripsiyon faktörü Bcl11b ablasyonu projenitör hücre çoğalması ve azaltılmış dentat girus boyutu ve hücre sayısı ile sonuçlanan nöronal farklılaşma kayıplarına neden olur. Ayrıca mutant nöronlar öğrenme ve bellek bozukluğu 8 neden hipokampal devresine entegre başarısız. Eski utero elektroporasyon kullanılmıştır bu süreçlerde Bcl11b düzenleyici mekanizma (lar) ile ilgili soruları cevaplamak için. Soru hitaben Bcl11b hücre-özerk E15...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue at JoVE.com

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.

Fare Hipokampal Doku Ex Utero Elektroporasyon ve Organotipik Dilim Kültür

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

ex-utero-electroporation-organotypic-slice-culture-mouse-hippocampal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

9.5K Görüntüleme.  University of Ulm. Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.

Video: Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Organotypic Slice Cultures for Studies of Postnatal Neurogenesis

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This method maintains the characteristic topographical morphology of the hippocampus while allowing direct application of pharmacological agents to the developing hippocampal dentate gyrus. Additionally, slice cultures can be maintained for up to 4 weeks and thus, allow one to study the maturation process of newborn granule neurons. Slice cultures allow for efficient pharmacological manipulation of hippocampal slices while excluding complex variables such as uncertainties related to the deep anatomic location of the hippocampus as well as the blood brain barrier. For these reasons, we sought to optimize organotypic slice cultures specifically for postnatal neurogenesis research.

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis using the organotypic slice culture technique. This method allows for in vitro manipulation of adult neurogenesis and allows for the direct application of pharmacological agents to the cultured hippocampus.

POSTNATAL nöron Çalışmaları için organotipik Dilim Kültürler

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This ...

Gelişim Biyolojisi

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in which the enhanced version of the green fluorescent protein (EGFP) is exclusively expressed in all neurons of the developing central and peripheral nervous system1, allowing the possibility to both film the innervation of the forelimb and to manipulate this process with pharmacological and genetic techniques2. The most critical parameter in the successful cultivation of such slice cultures is the method by which the slices are prepared. After extensive testing of a variety of methods, we have found that a vibratome is the best possible device to slice the embryos such that they routinely result in a culture that demonstrates viability over a period of several days, and most importantly, develops in an age-specific manner. For mid-gestation embryos, this includes the normal outgrowth of spinal nerves from the spinal cord and the dorsal root ganglia to their targets in the periphery and the proper determination of skeletal and muscle tissue. 
In this work, we present a method for processing whole embryos of embryonic day (E) E10 to E12 into 300 - 400 micrometer slices for cultivation in a standard tissue culture incubator, which can be studied for up to two days after slice preparation. Critical for the success of this approach is the use of a vibratome to slice each agarose-embedded embryo. This is followed by the cultivation of the slices upon Millicell culture membrane inserts placed upon a small volume of medium, resulting in an interface culture technique. One litter with an average of 7 embryos routinely produces at least 14 slices (2-3 slices of the forelimb region per embryo), which varies slightly due to the age of the embryos as well as to the thickness of the slices. About 80% of the cultured slices show nerve outgrowth, which can be measured througout the culturing period2. Representative results using the tauGFP mouse line are demonstrated.

We present a method to prepare organotypic slices of mid-gestation mouse embryos for the cultivation and time-lapse imaging of peripheral nerve outgrowth.

Organotipik Dilim Kültür GFP-Periferik Sinir akıbet Gerçek zamanlı Görüntüleme Fare Embriyolar ifade

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

Nörobilim

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

Organotipik Hipokampal Dilim Kültürler

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the first born neurons remain closer to the ventricle while the last born neurons migrate past the first born neurons towards the surface of the brain1. In addition to neuronal migration2, a key process for normal cortical function is the regulation of neuronal morphogenesis3. While neuronal morphogenesis can be studied in vitro in primary cultures, there is much to be learned from how these processes are regulated in tissue environments.
We describe techniques to analyze neuronal migration and/or morphogenesis in organotypic slices of the cerebral cortex4,6. A pSilencer modified vector is used which contains both a U6 promoter that drives the double stranded hairpin RNA and a separate expression cassette that encodes GFP protein driven by a CMV promoter7-9. Our approach allows for the rapid assessment of defects in neurite outgrowth upon specific knockdown of candidate genes and has been successfully used in a screen for regulators of neurite outgrowth8. Because only a subset of cells will express the RNAi constructs, the organotypic slices allow for a mosaic analysis of the potential phenotypes. Moreover, because this analysis is done in a near approximation of the in vivo environment, it provides a low cost and rapid alternative to the generation of transgenic or knockout animals for genes of unknown cortical function. Finally, in comparison with in vivo electroporation technology, the success of ex vivo electroporation experiments is not dependant upon proficient surgery skill development and can be performed with a shorter training time and skill.

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

To conduct a rapid assessment of the function of genes in the development of cerebral cortex, we describe methods involving the ex vivo electroporation of plasmids co-expressing inhibitory RNA (RNAi) and GFP in murine embryonic cortex. This protocol is amenable to the study of various aspects of neurodevelopment such as neurogenesis, neuronal migration and neuronal morphogenesis including dendrite and axon outgrowth.

Nöronal Morphogenesis Çalışması Yöntemleri:<em&gt; Ex vivo</emEmbriyonik Mürin Serebral Korteks olarak&gt; RNAi Elektroporasyon

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and associated extracellular matrix. Because they provide a suitable organotypic environment, cortical slice explants are often used to investigate those interactions that control neuronal differentiation and development. Although beneficial, the slice explant model can suffer from drawbacks including aberrant cellular lamination and migration. Here we report a whole cerebral hemisphere explant system for studies of early cortical development that is easier to prepare than cortical slices and shows consistent organotypic migration and lamination. In this model system, early lamination and migration patterns proceed normally for a period of two days in vitro, including the period of preplate splitting, during which prospective cortical layer six forms. We then developed an ex utero electroporation (EUEP) approach that achieves ~80% success in targeting GFP expression to neurons developing in the dorsal medial cortex.
The whole hemisphere explant model makes early cortical development accessible for electroporation, pharmacological intervention and live imaging approaches. This method avoids the survival surgery required of in utero electroporation (IUEP) approaches while improving both transfection and areal targeting consistency. This method will facilitate experimental studies of neuronal proliferation, migration and differentiation.

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

This protocol describes an improved explant procedure that involves ex utero electroporation, dissection and culture of entire cerebral hemispheres from the embryonic mouse. The preparation facilitates pharmacological studies and assays of gene function during early cortical development.

Eski utero Elektroporasyon ve Tüm Yarımküre Eksplantlarından: Erken Kortikal Kalkınma Çalışmaları İçin Basit Bir Deney Yöntemi

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, their distinct dendritic morphologies, their specific patterns of axonal connectivity, and their selective firing responses. The molecular and cellular mechanisms responsible for these aspects of differentiation during development are still poorly understood.
Here, we describe combined protocols for labeling and characterizing the structural connectivity and excitability of cortical neurons. Modification of the in utero electroporation (IUE) protocol allows the labeling of a sparse population of neurons. This, in turn, enables the identification and tracking of the dendrites and axons of individual neurons, the precise characterization of the laminar location of axonal projections, and morphometric analysis. IUE can also be used to investigate changes in the excitability of wild-type (WT) or genetically modified neurons by combining it with whole-cell recording from acute slices of electroporated brains. These two techniques contribute to a better understanding of the coupling of structural and functional connectivity and of the molecular mechanisms controlling neuronal diversity during development. These developmental processes have important implications on axonal wiring, the functional diversity of neurons, and the biology of cognitive disorders.

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

This manuscript provides protocols that use in utero electroporation (IUE) to describe the structural connectivity of neurons at the single-cell level and the excitability of fluorescently labeled neurons. Histology is used to characterize dendritic and axonal projections. Whole-cell recording in acute slices is used to investigate excitability.

Rahimde Elektroporasyon Nöronal alt popülasyonlar heyecanlanma ve Tek hücreli Bağlantı Eğitim Yaklaşımları

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It has helped to describe the different steps of radial migration and characterize the molecular mechanisms controlling this process. To directly and dynamically analyze migrating neurons they have to be traced over time. This protocol describes a workflow that combines in utero electroporation with organotypic slice culture and time-lapse confocal imaging, which allows for a direct examination and dynamic analysis of radially migrating cortical neurons. Furthermore, detailed characterization of migrating neurons, such as migration speed, speed profiles, as well as radial orientation changes, is possible. The method can easily be adapted to perform functional analyses of genes of interest in radially migrating cortical neurons by loss and gain of function as well as rescue experiments. Time-lapse imaging of migrating neurons is a state-of-the-art technique that once established is a potent tool to study the development of the cerebral cortex in mouse models of neuronal migration disorders.

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

This protocol provides instructions for direct observation of radially migrating cortical neurons. In utero electroporation, organotypic slice culture, and time-lapse confocal imaging are combined to directly and dynamically study the effects of overexpression or downregulation of genes of interest in migrating neurons and to analyze their differentiation during development.

Embriyonik Fare Beyni Organotipik Dilim Kültüründe Nöronların Geçiş Sürekli Konfokal Görüntüleme Kullanımı<em&gt; Utero&#39;da</em&gt; Elektroporasyon

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate tangentially from their place of origin in the ventral telencephalon (including from the medial and caudal ganglionic eminences (MGE, CGE)) to the dorsal cortical plate in response to a variety of intrinsic and extrinsic cues. Different methodologies have been developed over the years to genetically manipulate specific pathways and investigate how they regulate the dynamic cytoskeletal changes required for proper IN migration. In utero electroporation has been extensively used to study the effect of gene repression or overexpression in specific IN subtypes while assessing the impact on morphology and final position. However, while this approach is readily used to modify radially migrating pyramidal cells, it is more technically challenging when targeting INs. In utero electroporation generates a low yield given the decreased survival rates of pups when electroporation is conducted before e14.5, as is customary when studying MGE-derived INs. In an alternative approach, MGE explants provide easy access to the MGE and facilitate the imaging of genetically modified INs. However, in these explants, INs migrate into an artificial matrix, devoid of endogenous guidance cues and thalamic inputs. This prompted us to optimize a method where INs can migrate in a more naturalistic environment, while circumventing the technical challenges of in utero approaches. In this paper, we describe the combination of ex utero electroporation of embryonic mouse brains followed by organotypic slice cultures to readily track, image and reconstruct genetically modified INs migrating along their natural paths in response to endogenous cues. This approach allows for both the quantification of the dynamic aspects of IN migration with time-lapse confocal imaging, as well as the detailed analysis of various morphological parameters using neuronal reconstructions on fixed immunolabeled tissue.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Here, we provide a low-cost and reliable method to generate electroporated brain organotypic slice cultures from mouse embryos suitable for confocal microscopy and live-imaging techniques.

Eski Utero Elektroporasyon ve embriyonik fare beyni canlı görüntüleme, GABAergic Interneurons geçiş için Organotypic dilim kültürleri

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate ...

Single-Cell Electroporation across Different Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Excitatory and Class-Specific Inhibitory Neurons

Electroporation has established itself as a critical method for transferring specific genes into cells to understand their function. Here, we describe a single-cell electroporation technique that maximizes the efficiency (~80%) of in vitro gene transfection in excitatory and class-specific inhibitory neurons in mouse organotypic hippocampal slice culture. Using large glass electrodes, tetrodotoxin-containing artificial cerebrospinal fluid and mild electrical pulses, we delivered a gene of interest into cultured hippocampal CA1 pyramidal neurons and inhibitory interneurons. Moreover, electroporation could be carried out in cultured hippocampal slices up to 21 days in vitro with no reduction in transfection efficiency, allowing for the study of varying slice culture developmental stages. With interest growing in examining the molecular functions of genes across a diverse range of cell types, our method demonstrates a reliable and straightforward approach to in vitro gene transfection in mouse brain tissue that can be performed with existing electrophysiology equipment and techniques.

Presented here is a protocol for single-cell electroporation that can deliver genes in both excitatory and inhibitory neurons across a range of in vitro hippocampal slice culture ages. Our approach provides precise and efficient expression of genes in individual cells, which can be used to examine cell-autonomous and intercellular functions.

Fare Hipokampal Uyarıcı ve Sınıfa Özgü inhibitör Nöronların Farklı Organotipik Dilim Kültürü boyunca Tek Hücreli Elektroporasyon

Electroporation has established itself as a critical method for transferring specific genes into cells to understand their function. Here, we describe a ...

Preparation of Organotypic Slice Cultures from a Rat Pup&#39;s Hippocampus

Source: Mosa, A. J. et al., <a href="https://app.jove.com/v/52353">Organotypic Slice Cultures for Studies of Postnatal Neurogenesis.</a> J. Vis. Exp. (2015).
This video demonstrates a method for preparing organotypic hippocampal slice cultures from the brain of a rat pup. It outlines the steps involved in the dissection of the hippocampus, slicing, and culture conditions required to promote cell viability and growth in the hippocampal slices, ultimately generating organotypic slice cultures.

Bir Sıçan Yavrusunun Hipokampusundan Organotipik Dilim Kültürlerinin Hazırlanması

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

Fare Hipokampal Doku Ex Utero Elektroporasyon ve Organotipik Dilim Kültür

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler