This work was supported by grants from the Deutsche Forschungsgemeinschaft to SB (BR-2215; SFB 497/A9).

הערה: כל הניסויים בבעלי החיים בוצעו בהתאם לחוק הגרמני ואושרו על ידי משרדי הממשלה בטובינגן. 1. הכנת Micropipettes, פתרונות וממברנות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת Micropipettes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך micropipettes זכוכית באמצעות חולץ micropipette עם התכנית הבאה: חום: 540, משוך: 125, מהירות: 20 ועיכוב: 140. כמויות אורך המחט ל -5.5 סנטימטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחטי פוע באמצעות microgrinder להשיג גודל קצה מתאים של 4 מ&quot;מ. אחסן את המחטים בקופסא או 15 סנטימטר צלחת פטרי כדי למנוע פגיעה של הטיפים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה של פתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלסמיד דנ&quot;א פתרון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את ה- DNA פלסמיד המכיל את מבנה cDNA הרצוי באמצעות ערכת Maxi-הכנת רעלן פנימית ללא על פי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם פתרון פלסמיד DNA לריכוז סופי של 3 מיקרוגרם / μl (ללא וקטור ספייק GFP) או 4 מיקרוגרם /μl (עם 1 מיקרוגרם של וקטור ספייק GFP) ברעלן פנימי לשחרר חיץ טריס-EDTA המכיל גרין המהיר (ריכוז סופי של 0.05%). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון במלאי Laminin <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר 1 מ&quot;ג של laminin במים סטריליים כדי נפח סופי של 1 מיליליטר. הכן 100 aliquots וחנות μl ב -80 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פולי-L ליזין פתרון במלאי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר 50 מ&quot;ג של פולי-L ליזין ב 50 מיליליטר של מים סטריליים לריכוז סופי של 1 מ&quot;ג / מיליליטר. הכן 1 מיליליטר aliquots ולאחסן ב-20 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלם מאוזן תמיסת מלח של האנק (שלם HBSS) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן HBSS השלם על ידי שילוב של 10x HBSS 100 מיליליטר, 2.5 מיליליטר של חיץ 1 M HEPES (pH 7.4), 30 מיליליטר של 1 M D-גלוקוז, 10 מיליליטר של 100 מ&quot;מ CaCl 2, 10 מיליליטר של 100 מ&quot;מ MgSO 4, ו -4 מיליליטר של 1 M NaHCO 3. מוסיף מים עד לסטרילי 1 ליטר ולאחסן ב 4 ° C. הערה: החיטוי כל הפתרונות מצפים 1 M HEPES חיץ ו1 M D-גלוקוז, אשר filter מעוקר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Slice תרבות בינוני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מדיום התרבות פרוסה על ידי הוספת 35 מיליליטר של Basal נשר בינוני, 12.9 מיליליטר של HBSS המלא (1.2.4), 1.35 מיליליטר של 1 M D-גלוקוז, 250 μl של L-גלוטמין 200 מ&quot;מ, ו -500 μl של פניצילין, סטרפטומיצין ל להשיג נפח סופי של 50 מיליליטר. להוסיף סרום סוס לריכוז סופי של 5% וחנות על 4 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקודת התכה נמוכה (LMP) Agarose <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 4% פתרון agarose LMP על ידי הוספת 2 גרם של LMP agarose 50 מיליליטר של HBSS המלא (1.2.4) ואחריו על ידי חימום במיקרוגל במשך 1-2 דקות בעצמה גבוהה. שמור פתרון זה באמבט מים ב 37 - C ° 39. אחסן את הפתרון ב 4 ° C. והשימוש חוזר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון paraformaldehyde <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במנדף להכין פתרון paraformaldehyde 4% (PFA) על ידי הוספת 4 גרם של paraformaldehyde לשל 1x PBS 100 מיליליטר. מחממים את הפתרון עד 60 ° C ולהוסיף כמה טיפות של 1 N NaOH עד הפתרון הופך גליר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilization פתרון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר 9 גרם של BSA ב300 מיליליטר של 1x PBS המכיל Trition 0.3% X-100 ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. הוסף 10% אזיד הנתרן לאחסון ארוך טווח. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציפוי של הוספת ממברנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל aliquot אחד פתרון מניות laminin (1.2.2) וaliquot אחד פתרון poly-L ליזין מניות (1.2.3) במים סטריליים כדי נפח סופי של 12 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח מוסיף קרום ל6 צלחות גם עם כל 2 מיליליטר המכיל גם של מים סטריליים. הוסף 1 מיליליטר של תמיסת ציפוי על גבי קרום דגירה O / N ב 37 מעלות צלזיוס בחממה של 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה לשטוף את הקרום מוסיף שלוש פעמים עם 1 מיליליטר של מים סטריליים ויבשים. השתמש מוסיף קרום מצופה באותו היום או בחנות ב 4 מעלות צלזיוס במשך עד ארבעה שבועות בצלחת גם יבשה 6. </li></ol></li></ol> 2. הזרקת DNA וElectroporation של E15.5 וE18.5 עוברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li&gt; להרדים זמן הזדווגו עכבר נשי על ידי הצבת אותו לחדר הרדמה רווי isoflurane 5% ומחובר למכשיר אדים. הפיצו isoflurane וחמצן בשיעור של 1 ליטר / דקה. לשמור על בעלי החיים בתיבה במשך 2-4 דקות או עד שלא מודע שהוא נבדק על ידי צובט בין כפות של העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר הלא-מודע על ידי נקע בצוואר הרחם ביום עוברי (E) 15.5 או 18.5. לנתח את הרחם המכיל את העוברים 13 ולמקם אותו לתוך צלחת פטרי המכילה 15-20 מיליליטר של HBSS המלא הקר. הערה: מנקודה זו ואילך, לשמור על העוברים ורקמות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספריים כדי להפריד בין עובר מקרן הרחם והמקום לתוך צלחת פטרי המכילה HBSS שני מלא קר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ לנתח, לנתק את קיר שריר רחם והשליה באמצעות זוג מלקחיים בסדר (# 55) ומספריים. זהירות לשחרר את העובר מן שק החלמון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספרי בון לdecapitatדואר העוברים מעל forelimbs בזווית 60 מעלות. אם הניסוי דורש genotyping של העוברים, לאסוף דגימת רקמה לבידוד הדנ&quot;א הגנומי (חתיכה קטנה של זנב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הראש בצלחת פטרי נקייה ויבשה. בגלל הראש נערף בזווית 60 מעלות, הראש צריך להטות לצד אחד כאשר הניחו בצד את גב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח מחט בזהירות לתוך אמצע הקרוב חצי הכדור לגבחת (איור 1 א &#39;, ב&#39;). להזריק כ 2-3 μl (ב 3 או 4 מיקרוגרם / μl) של פתרון ה- DNA על ידי דריכה על הדוושה של Picospritzer III באמצעות 30 ק&quot;ג של לחץ למשך 10-15 אלפיות שני לכל דופק, החלת 5-8 קטניות. המשך ומספר הפעימות תלויים בקוטר של פתיחת המחט עם פתחים קטנים יותר הדורשים יותר זמן. המרווח בין דופק בכל מסתכם לסך של 1 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הנחת האלקטרודות, חלים כמה טיפות של HBSS המלא על ראשו של embrיו. הנח את האלקטרודות בצורה כזאת, כי המסוף &#39;השלילי&#39; הוא באותו הצד כמו החדר המוזרק ואלקטרודה &#39;החיובית&#39; בצד השני של החדר המוזרק מתחת לאוזן של ראשו של העובר (איור 1 ג, ד). החל 5 פולסים של 50 V. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 3 אלקטרודות מ&quot;מ לE 15.5 ו -5 מ&quot;מ אלקטרודות לE 18.5. </li></ol></li></ol> 3. Dissection של המוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר electroporation, לקלף את העור מהראש בעזרת זוג מלקחיים בסדר. באמצעות מספריים האביב לעשות חתך קטן באמצע של המוח הקטן בקו האמצע של הגולגולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את המספריים האביב לתוך החתך וחתך אורכית לאורך תפר sagittal. לקלף את הגולגולת ולנתק את המוח מהגולגולת באמצעות מלקחיים בסדר. העבר את המוח כולו לתוך 15-20 פתרון HBSS מלא קר מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> , בינתיים לשפוך 4% agarose LMP,המשיך ב37-39 מעלות צלזיוס באמבט מים, לתוך תבנית קליפה משם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את המוח של HBSS השלם על ידי מרית סקופ קטנה וניקוז עודף של HBSS באמצעות נייר טישו קנס או Kimwipes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המוח כולו בעדינות לתוך agarose ולשנות את המיקום שלה עם מחט דקה. שמור את התבנית על קרח עד agarose הוא מוצק והבלוק מחולק (לסעיפי העטרה נורות הריח מצביעות למעלה). </li></ol> 4. חתך vibratome וSlice תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתוך את אבני agarose LMP ולהדביק אותם לבמה הדגימה באמצעות &quot;דבק סופר&quot;. לאחר הדבק היא העברה יבשה שלב הדגימה למגש החיץ של vibratome ולמלא עם קרח קר להשלים HBSS עד הבלוק הוא שקוע בפתרון. הערה: לעקר את כל משטחי המכשיר וציוד עם אתנול 70% לפני חתך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 250 מיקרומטר סעיפי vibratome עבים באמצעות סכין חדש ואחרי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתוך את wi הבלוקה ההגדרות הבאות; תדירות - 60 הרץ, משרעת - 0.7 מיקרומטר, מ&quot;מ 16-18 מהירות / sec. חותך את הקטעים המכילים רקמה הרצויה עם ההגדרות לעיל במהירות איטית (9 מ&quot;מ / sec). החל חתך מהמוח האחורי, לאסוף 5-7 חלקים מהמוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את החלקים למנת תרבות נקייה 6 היטב המכילה 5 מיליליטר של קרח קר להשלים HBSS בעזרת מרית כפופה ולשמור על קרח עד שכל החלקים נאספים (איור 1E). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרטיב את הקרום באופן צולב עם של HBSS המלא 100 μl לפני הנחת הסעיפים על הקרום, כדי להקל על ההתמצאות של הסעיפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את החלקים בעזרת מרית כפופה על הממברנה (להרים פינה של הסעיף עם מלקחיים ולמשוך אל המרית ולאחר מכן להשתמש במלקחיים כדי לדחוף את הסעיף על הממברנה). הנח עד חמישה חלקים בקרום אחד ולארגן באמצעות מלקחיים (איור 1F). אינו חופף חלקים אחד עם השני. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את עודף HBSS את הקרום בעזרת פיפטה. הקרומים הספציפיים משמשים כאן מחוברים למסגרת ומוכנסים לתוך צלחת תרבית רקמה, המאפשרת לרקמה להיות בקשר אבל אינו מכוסות על ידי המדיום. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הקרום מוסיף לצלחת 6 היטב המכילה 1.8 מיליליטר של מדיום התרבות הפרוסה (1.2.5) (איור 1G, H). דגירה צלחת התרבות על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 במשך 11 או 14 DIV DIV. לשנות מחצית בינונית (0.9 מיליליטר) בכל יום שני. הערה: בשלב זה, להוסיף חומרים כימיים כמו Bromodeoxyuridine (BrdU; 10 מיקרומטר ריכוז סופי) לתיוג תאים מתרבים בתקשורת במשך 20 שעות הראשונות של זמן התרבות. </li></ol> 5. קיבוע של הסעיפים ואחריו Immunofluorescence מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בלהב סכין מנתחים נקי וחד לחתוך ולקצץ את הקרומים בהתאם לאורינטציה שלהחלקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את החלקים יחד עם הקרום לצלחת 24 היטב המכילה 1 מיליליטר של 4% PFA (1.2.7). דגירה הסעיפים עבור שעה 1 ב RT ואחריו 3 שוטף עם 1x PBS במשך 15 דקות כל אחד. דגירה הסעיפים O / N עם פתרון permeabilization על 4 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, דגירה הקטעים עם נוגדנים ראשוניים מתאימים, בדילול מלא בפתרון permeabilization, O / N או במשך 48 שעות על 4 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הסעיפים 3 פעמים למשך 15 דקות עם 1x PBS ודגירת O / N ב 4 ° C עם הנוגדנים משני המתאימים מדוללים בפתרון permeabilization. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה עם נוגדנים משני, לשטוף את החלקים פעם עם 1x PBS במשך 15 דקות ואחריו מכתים DAPI במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הסעיפים 3 פעמים עם 1x PBS במשך 15 דקות כל אחד ולהעביר לשקופיות מיקרוסקופ. להוסיף ImmunoMount ומניח בעדינות coverslip על גבי החלקים. ייבש את השקופיות O / N ב 4 ° C וseאל עם לק. הערה: שמור את השקופיות תמיד על 4 מעלות צלזיוס. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את התרבויות הפרוסה על ידי מיקרוסקופ confocal (איור 1 ט). </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Milestones+of+neuronal+development+in+the+adult+hippocampus.">Milestones of neuronal development in the adult hippocampus.</a> Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).</li><li>Frotscher, M., Zhao, S., Forster, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+cell+and+fiber+layers+in+the+dentate+gyrus.">Development of cell and fiber layers in the dentate gyrus.</a> Prog Brain Res. 163, 133-142 (2007).</li><li>Muramatsu, R., Ikegaya, Y., Matsuki, N., Koyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatally+born+granule+cells+numerically+dominate+adult+mice+dentate+gyrus.">Neonatally born granule cells numerically dominate adult mice dentate gyrus.</a> Neuroscience. 148, 593-598 (2007).</li><li>Li, G., Pleasure, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+the+dentate+gyrus:+what+we+are+learning+from+mouse+mutants.">Morphogenesis of the dentate gyrus: what we are learning from mouse mutants.</a> Dev Neurosci. 27, 93-99 (2005).</li><li>Hsieh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchestrating+transcriptional+control+of+adult+neurogenesis.">Orchestrating transcriptional control of adult neurogenesis.</a> Genes Dev. 26, 1010-1021 (2012).</li><li>Li, G., Pleasure, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+regulation+of+dentate+gyrus+morphogenesis.">Genetic regulation of dentate gyrus morphogenesis.</a> Prog Brain Res. 163, 143-152 (2007).</li><li>Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+current+state+of+chromatin+immunoprecipitation.">The current state of chromatin immunoprecipitation.</a> Mol Biotechnol. 45, 87-100 (2010).</li><li>Simon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual+function+of+Bcl11b/Ctip2+in+hippocampal+neurogenesis.">A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis.</a> Embo J. 31, 2922-2936 (2012).</li><li>Pilaz, L. J., Silver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+mitosis+in+the+developing+mouse+embryonic+cortex.">Live imaging of mitosis in the developing mouse embryonic cortex.</a> J Vis Exp. (88), (2014).</li><li>Pacary, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+genetic+manipulation+of+dendrites+and+spines+in+the+mouse+cerebral+cortex+and+hippocampus+using+in+utero+electroporation.">Visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li><li>Hand, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+Neurogenin2+specifies+the+migration+properties+and+the+dendritic+morphology+of+pyramidal+neurons+in+the+neocortex.">Phosphorylation of Neurogenin2 specifies the migration properties and the dendritic morphology of pyramidal neurons in the neocortex.</a> Neuron. 48, 45-62 (2005).</li><li>Polleux, F., Ghosh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+slice+overlay+assay:+a+versatile+tool+to+study+the+influence+of+extracellular+signals+on+neuronal+development.">The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal development.</a> Sci STKE. (136), 19 (2002).</li><li>Shea, K., Geijsen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+6.5+dpc+mouse+embryos.">Dissection of 6.5 dpc mouse embryos.</a> J Vis Exp. (2), (2007).</li><li>Sugiyama, T., Osumi, N., Katsuyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+germinal+matrices+in+the+developing+dentate+gyrus+are+composed+of+neuronal+progenitors+at+distinct+differentiation+stages.">The germinal matrices in the developing dentate gyrus are composed of neuronal progenitors at distinct differentiation stages.</a> Dev Dyn. 242, 1442-1453 (2013).</li><li>Lechler, T., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desmoplakin:+an+unexpected+regulator+of+microtubule+organization+in+the+epidermis.">Desmoplakin: an unexpected regulator of microtubule organization in the epidermis.</a> J Cell Biol. 176, 147-154 (2007).</li><li>Nichols, A. J., O'Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+utero+electroporation+and+whole+hemisphere+explants:+a+simple+experimental+method+for+studies+of+early+cortical+development.">Ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development.</a> J Vis Exp. (74), (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

יש היפוקמפוס תפקיד חשוב בלמידה וזיכרון. Gyrus המשונן הוא גם אחד משני אזורים במוח שבו neurogenesis מתרחשת לא רק בפיתוח, אלא גם בבגרות. לאחר לידה ותמורת neurogenesis היפוקמפוס מבוגרת באופן דומה מעורב גורמים משותפים רבים. הגדרת מנגנוני הפיקוח של גורמים אלה יהיו מועילות מאוד בהבנת מחל?...

ההיפוקמפוס ממלא תפקיד חשוב בזיכרון ולמידה, כמו גם התנהגות רגשית. פונקציה העיקרית אחת מורכבת מהאיחוד של זיכרון לטווח קצר לזיכרון לטווח ארוך, אשר דורש גמישות גבוהה של מערכת העצבים. Gyrus המשונן של ההיפוקמפוס פועל כשער העיקרית למידע קלט, והוא גם אחד משני אזורים במוח עם neurogenesis המתמשכת לאורך בגרות 1,2. הפיתוח של המבנה בהיפוקמפוס מתרחש במהלך עובר מאוחר ובמיוחד בלידה 3 עד 4 שבועות הראשון 3. במהלך ההתפתחות המוקדמת של המשונן gyrus בריכת תאי גזע הוקמה דרושה ללידה, כמו גם neurogenesis למבוגרים 4. נוירונים פיתוח עוברים דרך שלבים שונים, מתאי הגזע דרך מספר שלבים של תאי אב ללא בשלה ולבסוף נוירון הבוגר במהלך לידה, כמו גם neurogenesis למבוגרים. בשלבים שונים של neurogenesis הביטוי שלגנים ספציפיים נדרש כדי לאפשר ההבשלה ואינטגרציה של נוירונים חדשים לתוך המעגלים בהיפוקמפוס 5,6. שימוש בגנטיקת עכבר וניתוח הפנוטיפ על ידי אימונוהיסטוכימיה כמו גם שיטות מולקולריות אפשר הגדרת דפוס ביטוי ותפקודם של רבים מהגנים האלה. בניתוח microarray בנוסף, כמו גם immunoprecipitation הכרומטין (שבב) סיפק מידע על גני מטרה ישירים ועקיפים פוטנציאל 7,8. עם זאת, יש עדיין שאלות רבות פתוחות בנוגע למנגנוני הרגולציה של פיתוח בהיפוקמפוס, בפרט הפיתוח של הגירוס המשונן. כדי להשיג תובנה נוספת כיצד גנים מסוימים מוסדרים מערכת נדרש המאפשרים המניפולציה של מספר קטן של תאים על ידי למטה או למעלה-רגולציה של הגן של ריבית ו / או גני המטרה שלה ולעקוב אחרי גורלם בפיתוח. ברחם electroporation של shRNAs, cDNA של גנים של עניין או recombina Crese מספק כלי כזה. כדי להבטיח את הנוכחות של פלסמידים ביטוי ה- DNA הרצוי או RNA הקטן אמורים לשמש עבור electroporation. גישה זו מיושמת בהצלחה רבה בלימוד פיתוח קליפת המוח 9,10, אך היא גישה מאתגרת יותר בוחנת את התפתחות gyrus המשונן בשל המיקום של המבנים בהיפוקמפוס בשכבות עמוקות יותר במוח. electroporation ברחם לשעבר ואחריו התרבות הפרוסה organotypic הוא גישה אחת לעקוף בעיה זו 11,12. בניגוד לelectroporation ברחם לא כל העובר אלא רק את הראש משמש מאפשר לכן להציב את האלקטרודות באופן חיובי יותר לכוון את shRNA / DNA להיפוקמפוס והגירוס המשונן. הקבוצה שלנו מועסקות בהצלחה electroporation לשעבר הרחם כדי ללמוד את התפקיד של גורם שעתוק Bcl11b במהלך פיתוח gyrus המשונן 8. יש Bcl11b תפקיד כפול בפיתוח gyrus המשונן על ידי regulating התפשטות תאי אב, כמו גם בידול כפי שהודגם על ידי אימונוהיסטוכימיה. כדי להגדיר מנגנון למעורבות Bcl11b בתהליכים אלה נוספים, פרוטוקולים של קבוצת Polleux 11,12 הותאמו ללמוד gyrus המשונן כמתואר להלן בסעיף הפרוטוקול. בגישה ראשונה השאלה הופנתה אם Bcl11b הוא מסדיר תא התמיינות תאים עצבי אוטונומית. גישה שנייה בדקה האם Desmoplakin, גן המטרה ישיר של Bcl11b, די בכך כדי להציל את הפנוטיפ Bcl11b.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="271">
	<tbody>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:71px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:73px;">Company</td>
			<td style="width:63px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:64px;">Comments/ Description</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:71px;">Flaming/ Brown Micropipette Puller</td>
			<td style="width:73px;">Sutter Instruments Company (USA)</td>
			<td style="width:63px;">P-97</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:71px;">Fine Glass Pipettes</td>
			<td style="width:73px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:63px;">G100F-4</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:71px;">Microgrinder</td>
			<td style="width:73px;">Narishige, Japan</td>
			<td style="width:63px;">EG-44</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:71px;">Anesthetic Bracket unit</td>
			<td style="width:73px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:63px;">PY2 34-0412</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:71px;">Halovet Vaporizer</td>
			<td style="width:73px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:63px;">PY2 34-0398</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:71px;">Fluovac System</td>
			<td style="width:73px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:63px;">PY2 34-0387</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:71px;">IMS Fluosorber</td>
			<td style="width:73px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:63px;">PY2 34-0415</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:71px;">Anesthetizing Chamber</td>
			<td style="width:73px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:63px;">PY2 34-0460</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:71px;">Electroporator</td>
			<td style="width:73px;">BEX Company</td>
			<td style="width:63px;">CUY21 EDIT</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:71px;">Tweezers with disk electrodes</td>
			<td style="width:73px;">BEX Company</td>
			<td style="width:63px;">LF650P3</td>
			<td style="width:64px;">3 mm electrodes for E15.5</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:71px;">Tweezers with disk electrodes</td>
			<td style="width:73px;">BEX Company</td>
			<td style="width:63px;">LF650P5</td>
			<td style="width:64px;">5 mm electrodes for E18.5</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:71px;">Picospritzer III</td>
			<td style="width:73px;">Parker Hannifin Corporation</td>
			<td style="width:63px;">P/N 052-0500-900</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="148">
			<td height="148" style="height:148px;width:71px;">HM 650V Vibrating Blade Microtome, 230V</td>
			<td style="width:73px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:63px;">920120</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:71px;">Dissection Microscope</td>
			<td style="width:73px;">Carl Zeiss Microscopy Gmbh</td>
			<td style="width:63px;">Stemi SV8</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:71px;">Inverted Microscope</td>
			<td style="width:73px;">Leica</td>
			<td style="width:63px;">Leica DM IL LED</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:71px;">Confocal Microscope</td>
			<td style="width:73px;">Leica</td>
			<td style="width:63px;">Sp5II</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="42" rowspan="2" style="height:42px;width:71px;">6 well dish</td>
			<td rowspan="2" style="width:73px;">BD Falcon</td>
			<td rowspan="2" style="width:63px;">#353502</td>
			<td rowspan="2" style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:71px;">6 well dish</td>
			<td style="width:73px;">CELLSTAR</td>
			<td style="width:63px;">#657160</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:71px;">Tissue culture inserts</td>
			<td style="width:73px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:63px;">#353090</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:71px;">Fast Green</td>
			<td style="width:73px;">Sigma</td>
			<td style="width:63px;">F7252</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:71px;">Laminin</td>
			<td style="width:73px;">Sigma</td>
			<td style="width:63px;">#L2020</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:71px;">Poly-L-lysine</td>
			<td style="width:73px;">Sigma</td>
			<td style="width:63px;">#P5899</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:71px;">Spring scissors</td>
			<td style="width:73px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:63px;">15003-08</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:71px;">Extra Fine Bonn Scissors</td>
			<td style="width:73px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:63px;">14084-08</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:71px;">Forceps</td>
			<td style="width:73px;">Dumont #55</td>
			<td style="width:63px;">11255-20 Inox</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:71px;">HBSS 10X</td>
			<td style="width:73px;">Life Technology</td>
			<td style="width:63px;">14180-046</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:71px;">BME</td>
			<td style="width:73px;">Life Technology</td>
			<td style="width:63px;">41010-26</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex utero electroporation and organotypic slice culture of mouse hippocampal tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.

אבלציה של גורם שעתוק Bcl11b גורמת לירידת ערך של התפשטות תאי אב והבחנה עצבית וכתוצאה מכך בגודל המוקטן המשונן gyrus ומספר תא. יתר על כן תאי עצב מוטציה אינם מצליחים להשתלב במעגל בהיפוקמפוס גורם למידה וזיכרון ירידת ערך 8. כדי לענות על שאלות הנוגעות למנגנון הרגולציה (ים) ש?...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue at JoVE.com

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.

Ex הרחם Electroporation וOrganotypic Slice תרבות של רקמות העכבר בהיפוקמפוס

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

ex-utero-electroporation-organotypic-slice-culture-mouse-hippocampal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

9.4K Views.  University of Ulm. Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.

Video: Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

Genetic deletion using the Cre-Lox system in transgenic mouse lines is a powerful tool used to study protein function. However, except in very specific Cre models, deletion of a protein throughout a tissue or cell population often leads to complex phenotypes resulting from multiple interacting mechanisms. Determining whether a phenotype results from disruption of a cell autonomous mechanism, which is intrinsic to the cell in question, or from a non-cell autonomous mechanism, which would result from impairment of that cell&#8217;s environment, can be difficult to discern. To gain insight into protein function in an in vivo context, in utero electroporation (IUE) enables gene deletion in a small subset of cells within the developing cortex or some other selected brain region. IUE can be used to target specific brain areas, including the dorsal telencephalon, medial telencephalon, hippocampus, or ganglionic eminence. This facilitates observation of the consequences of cell autonomous gene deletion in the context of a healthy environment. The goal of this protocol is to show how IUE can be used to analyze a defect in radial migration in a floxed transgenic mouse line, with an emphasis on distinguishing between the cell autonomous and non-cell autonomous effects of protein deletion. By comparing the phenotype resulting from gene deletion within the entire cortex versus IUE-mediated gene deletion in a limited cell population, greater insight into protein function in brain development can be obtained than by using either technique in isolation.

Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

Neuron migration is regulated by numerous cell autonomous and non-cell autonomous factors. This protocol shows how in utero electroporation can be used to determine whether a phenotype in a transgenic mouse is due to disruption of a cell intrinsic mechanism or impairment of interaction between the neuron and its environment.

אינדוקציה של חלבונים באמצעות מחיקה<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation להגדיר גירעונות בעצביים הגירה במודלים מהונדסים

Genetic deletion using the Cre-Lox system in transgenic mouse lines is a powerful tool used to study protein function. However, except in very specific ...

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying the biology of retinal neurons, particularly photoreceptors. The applications of this system go beyond basic research, as they can easily be adapted to high throughput technologies for drug development. However, genetic manipulation of retinal photoreceptors in these cultures has proven to be very challenging, posing an important limitation to the usefulness of the system. We have recently developed and validated an ex&#160;ovo plasmid electroporation technique that increases the rate of transfection of retinal cells in these cultures by five-fold compared to other currently available protocols1. In this method embryonic chick eyes are enucleated at stage 27, the RPE is removed, and the retinal cup is placed in a plasmid-containing solution and electroporated using easily constructed custom-made electrodes. The retinas are then dissociated and cultured using standard procedures. This technique can be applied to overexpression studies as well as to the downregulation of gene expression, for example via the use of plasmid-driven RNAi technology, commonly achieving transgene expression in 25% of the photoreceptor population. The video format of the present publication will make this technology easily accessible to researchers in the field, enabling the study of gene function in primary retinal cultures. We have also included detailed explanations of the critical steps of this procedure for a successful outcome and reproducibility.

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Embryonic chick retinal cell cultures constitute valuable tools for the study of photoreceptor biology. We have developed an efficient gene transfer technique based on ex&#160;ovo plasmid electroporation of the retinas prior to culture. This technique considerably increases transfection efficiencies over currently available protocols, making genetic manipulation feasible for this system.

העברה יעילה ג&#39;ין בצ&#39;יק הרשתיות לסלולריים יסודי לימודי תרבות:<em&gt; אקס-אוב</em&gt; גישת Electroporation

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

תרבות של עוברי Explants שבלול העכבר וג&#39;ין העברה על ידי Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Organotypic Slice Cultures for Studies of Postnatal Neurogenesis

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This method maintains the characteristic topographical morphology of the hippocampus while allowing direct application of pharmacological agents to the developing hippocampal dentate gyrus. Additionally, slice cultures can be maintained for up to 4 weeks and thus, allow one to study the maturation process of newborn granule neurons. Slice cultures allow for efficient pharmacological manipulation of hippocampal slices while excluding complex variables such as uncertainties related to the deep anatomic location of the hippocampus as well as the blood brain barrier. For these reasons, we sought to optimize organotypic slice cultures specifically for postnatal neurogenesis research.

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis using the organotypic slice culture technique. This method allows for in vitro manipulation of adult neurogenesis and allows for the direct application of pharmacological agents to the cultured hippocampus.

תרבויות Organotypic Slice ללימודים של אחרי לידה נוירוגנזה

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This ...

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together within a basement membrane. A finite pool of follicles is laid down during embryonic development, when oocytes in meiotic arrest form a close association with flattened granulosa cells, forming primordial follicles. By or shortly after birth, mammalian ovaries contain their lifetime&#8217;s supply of primordial follicles, from which point onwards there is a steady release of follicles into the growing follicular pool.
The ovary is particularly amenable to development in vitro, with follicles growing in a highly physiological manner in culture. This work describes the culture of whole neonatal ovaries containing primordial follicles, and the culture of individual ovarian follicles, a method which can support the development of follicles from an immature through to the preovulatory stage, after which their oocytes are able to undergo fertilization in vitro. The work outlined here uses culture systems to determine how the ovary is affected by exposure to external compounds. We also describe a co-culture system, which allows investigation of the interactions that occur between growing follicles and the non-growing pool of primordial follicles.

This protocol describes the primary culture/co-culture of mouse ovarian tissue, using ovaries from neonatal mice and individual ovarian follicles from prepubertal mice. The culture techniques support development in a highly physiological manner, allowing investigation of the effect of extrinsic agents on the ovary, and of interactions between ovarian follicles.

תרבות ושיתוף התרבות של עכבר שחלות וזקיקים בשחלות

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying neuronal proliferation and differentiation. In addition, evolutionary modifications of its proliferative capability have been responsible for the dramatic expansion of cerebellar size in the amniotes, making the cerebellum an excellent model for evo-devo studies of the vertebrate brain. The constituent cells of the EGL, cerebellar granule progenitors, also represent a significant cell of origin for medulloblastoma, the most prevalent paediatric neuronal tumour. Following transit amplification, granule precursors migrate radially into the internal granular layer of the cerebellum where they represent the largest neuronal population in the mature mammalian brain. In chick, the peak of EGL proliferation occurs towards the end of the second week of gestation. In order to target genetic modification to this layer at the peak of proliferation, we have developed a method for genetic manipulation through ex vivo electroporation of cerebellum slices from embryonic Day 14 chick embryos. This method recapitulates several important aspects of in vivo granule neuron development and will be useful in generating a thorough understanding of cerebellar granule cell proliferation and differentiation, and thus of cerebellum development, evolution and disease.

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

The cerebellar external granule layer is the site of the largest transit amplification in the developing brain. Here, we present a protocol to target genetic modification to this layer at the peak of proliferation using ex vivo electroporation and culture of cerebellar slices from embryonic Day 14 chick embryos.

אקס תרבות Vivo של פרוסות המוח הקטן אפרוח וממוקד מרחבית Electroporation של מבשרי תא גרגיר

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying ...

Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate embryonic origins and functions &#8212; the neurohypophysis and the adenohypophysis. The developing mouse pituitary gland is tiny and delicate with an elongated oval shape. A coronal section is preferred to display both the adenohypophysis and neurohypophysis in a single slice of the mouse pituitary.
The goal of this protocol is to achieve proper pituitary coronal sections with well-preserved tissue architectures from developing mice. In this protocol, we describe in detail how to dissect and process pituitary glands properly from developing mice. First, mice are fixed by transcardial perfusion of formaldehyde prior to dissection. Then three different dissecting techniques are applied to obtain intact pituitary glands depending on the age of mice. For fetal mice aged embryonic days (E) 17.5 - 18.5 and neonates up to 4 days, the entire sella regions including the sphenoid bone, gland, and trigeminal nerves are dissected. For pups aged postnatal days (P) 5 - 14, the pituitary glands connected with trigeminal nerves are dissected as a whole. For mice over 3 weeks old, the pituitary glands are carefully dissected free from the surrounding tissues. We also display how to embed the pituitary glands in a proper orientation by using the surrounding tissues as landmarks to obtain satisfying coronal sections. These methods are useful in analyzing histological and developmental features of pituitary glands in developing mice.

We present a protocol to dissect pituitary glands and prepare pituitary coronal sections from developing mice.

ניתוח והכנת פרוסה הילתית בפיתוח העכבר בלוטת יותרת המוח

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate ...

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors of the diseases. To validate the contribution of a dysfunction of the mutated genes to disease development, the generation of animal models carrying the mutations is one obvious approach. While germline genetically engineered mouse models (GEMMs) are popular biological tools and exhibit reproducible results, it is restricted by time and costs. Meanwhile, non-germline GEMMs often enable exploring gene function in a more feasible manner. Since some brain diseases (e.g., brain tumors) appear to result from somatic but not germline mutations, non-germline chimeric mouse models, in which normal and abnormal cells coexist, could be helpful for disease-relevant analysis. In this study, we report a method for the induction of CRISPR-mediated somatic mutations in the cerebellum. Specifically, we utilized conditional knock-in mice, in which Cas9 and GFP are chronically activated by the CAG (CMV enhancer/chicken &#223;-actin) promoter after Cre-mediated recombination of the genome. The self-designed single-guide RNAs (sgRNAs) and the Cre recombinase sequence, both encoded in a single plasmid construct, were delivered into cerebellar stem/progenitor cells at an embryonic stage using in utero electroporation. Consequently, transfected cells and their daughter cells were labeled with green fluorescent protein (GFP), thus facilitating further phenotypic analyses. Hence, this method is not only showing electroporation-based gene delivery into embryonic cerebellar cells but also proposing a novel quantitative approach to assess CRISPR-mediated loss-of-function phenotypes.

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

Conventional loss-of-function studies of genes using knockout animals have often been costly and time-consuming. Electroporation-based CRISPR-mediated somatic mutagenesis is a powerful tool to understand gene functions in vivo. Here, we report a method to analyze knockout phenotypes in proliferating cells of the cerebellum.

בתיווך CRISPR אובדן ניתוח פונקציה גרגר אסטרוציטומה תאים באמצעות בתוך הרחם מבוסס-אלקטרופורציה את ההעברה של ג'ין

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ideal for experimentation. Currently, the study of these developmental pathways in the chicken embryo is conducted by applying inhibitors and drugs at localized sites and at low concentrations using a variety of methods. In vitro tissue&#160;culturing is a technique that enables the study of tissues separated from the host organism, while simultaneously bypassing many of the physical limitations present when working with whole embryos, such as the susceptibility of embryos to high doses of potentially lethal chemicals. Here, we present an organotypic culturing protocol for culturing the embryonic chicken half head in vitro, which presents new opportunities for the examination of developmental processes beyond the currently established methods.

Here, we present an organotypic culturing protocol to grow embryonic chicken organs in vitro. Using this method, the development of embryonic chicken tissue can be studied, while maintaining a high degree of control over the culture environment.

שיטת Organotypic תרבות ללמוד על התפתחות עובריים עוף רקמות

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, regulation occurs at the hypothalamic-pituitary-gonadal axis level and on developing follicles in the ovary. Despite active studies, follicle development mechanisms are not clear because of the several steps involved from the dormant primordial follicle activation to ovulation, and because of the regulation complexity that differs at each follicular stage. To investigate the mechanisms of follicle development, and the dynamics of follicles throughout the estrus cycle, we developed a mouse ovarian tissue culture model that can be used to observe follicle development using a microscope. Systematic follicle development, periodical ovulation, and follicle atresia can all be reproduced in the cultured ovary model, and the culture conditions can be experimentally modulated. Here, we demonstrate the usefulness of this method in the study of the regulatory mechanisms of follicle development and other ovarian phenomena.

Ovarian tissue cultures can be used as models of follicle development, ovulation, and follicle atresia and indicate regulatory mechanisms of dynamic ovarian processes.