The authors would also like to thank all participants who donated samples for this work. This work was funded by the Office of Justice Program, National Institute of Justice, Department of Justice under award number 2010-DN-BX-K139. The funding agencies had no involvement in the study design, in collection, analysis and interpretation of data, or in the writing of the report. Points of view in this document are those of the authors and do not necessarily represent the official positions of the U.S. Department of Justice.

ملاحظة: تم جمع سوائل الجسم من المتطوعين باستخدام الإجراءات المعتمدة من قبل جامعة المؤسسي المجلس المركزي في ولاية فلوريدا مراجعة. تم الحصول على موافقة خطية أبلغ من كل جهة مانحة. 1. جمع Bioparticles من كائنات تطرق والسطوح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع فيلم هلام إلى الحجم المطلوب. تأكد من أنه هو الحجم المناسب للشريحة ميكروسكوب زجاجية تستخدم باعتبارها دعما قويا. على سبيل المثال، ل3 &quot;س 1&quot; شريحة زجاجية، واستخدام حجم هلام فيلم 2 &quot;س 0.75&quot;. ملاحظة: طول وعرض المواد يمكن تخفيض، إذا رغبت في ذلك، ولكن لا ينبغي أن تتجاوز هذا الحجم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الدعم أبيض من فيلم جل وإرفاق فيلم الجل على شريحة المجهر (الشكل 1A). اضغط لأسفل بشدة لضمان الحجز كاملة. ملاحظة: هناك أعلى طبقة واضحة الوقائية التي يجب عدم إزالة الضغط للسماح ليتم تطبيقها على قطعة من هلام سن الفيلم دون تلويث سطح هلام الفيلم. الشرائح استعداد هلام فيلم (مع طبقة واقية المرفقة) ويمكن تخزين في درجة حرارة الغرفة لحين الحاجة إليها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة فيلم واقية أعلى واضح من فيلم الجل باستخدام ملاقط معقمة عند جاهزة للاستخدام (الشكل 1B) عينة هلام الفيلم. ضع سطح هلام فيلم في اتصال مباشر مع الكائن المطلوب لمسها أو السطح (الشكل 2). ضع كمية صغيرة من الضغط لضمان نقل فعال للجزيئات الحيوية إلى فيلم هلام. ملاحظة: إذا تم تطبيق الكثير من الضغوط، يمكن للشريحة زجاجية كسر. ملاحظة: عينات متعددة من نفس الكائن أو سطح يمكن جمعها على نفس قطعة من هلام الفيلم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكيد نقل جزيئات الحيوية على فيلم هلام (الشكل 3) عن طريق وضع شريحة على stereomicroscope (العابرة أو برنامج التحصين الموسع من الإضاءة يمكن استخدامها). استخدام التكبير من ~ 20X لأفضل عرض مساحات واسعة من فيلم هلام، والتكبير من ~ 200X للحصول على أفضل السادسالفردية جزيئات الحيوية يوينغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين عينة شريحة هلام الفيلم في درجة حرارة الغرفة في مربع الشريحة مغطاة أو استخدامها على الفور لتلطيخ و / أو جمع الحيوي الجسيمات. </li></ol> 2. تلطيخ اختياري من Bioparticles للمساعدة في التصور <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع عينة شريحة هلام فيلم أعدت في الخطوة 1 على رف الشريحة تلطيخ أكثر من بالوعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الماصة نقل القابل للتصرف، تغطية كامل سطح هلام الفيلم مع وصمة عار التريبان الأزرق (الشكل 4A). يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1-2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وصمة عار الزائدة عن طريق إمالة الشريحة للسماح للوصمة عار لاستنزاف قبالة في بالوعة (الشكل 4B). ملاحظة: الشريحة يمكن أن تشطف من الفيضانات لطيف مع الماء المعقم باستخدام الماصة نقل المتاح إذا لزم الأمر (الشكل 4C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح الشريحة الهواء الجاف قبل الشروع في عزل جزيئات الحيوية. عرض الشرائح باستخدام stereomicroscope (~ 20X للعرض الشامل و~ 200-300X إلى vbioparticles الفردية iew) لضمان تلطيخ السليم (الشكل 4D-E). ملاحظة: يمكن تخزين الشريحة في درجة حرارة الغرفة في مربع الشريحة مغطاة. </li></ol> 3. عزل Bioparticles الاهتمام لتحليل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع العدد المناسب من 0.2 مل أنابيب PCR في رفوف وتسمية الأنابيب بشكل مناسب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير مزيج STR التضخيم (انظر قائمة المواد) في PCR التضخيم غطاء محرك السيارة المعينة أو الوزراء للسلامة الأحيائية. دوامة مزيج الرئيسي أجهزة الطرد المركزي بشكل جيد لفترة وجيزة في أجهزة الطرد المركزي-مصغرة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حجم مزيج التضخيم اللازمة لكل عينة هو 3.5 ميكرولتر. إعداد حجم مناسب من مزيج الرئيسي لعدد المطلوب من العينات. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الماصة 3.5 ميكرولتر من مزيج التضخيم في كل أنبوب 0.2 مل. سقف كل أنبوب فضفاضة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع قطعة من شريط مزدوج عصا على نظيفة شريحة ميكروسكوب زجاجية أو مباشرة على كتلة الزجاج. ملاحظة: سيتم استخدام هذه لعقدأنبوب 0.2 مل في مكان أثناء جمع العينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع قطعة من شريط مزدوج عصا على نظيفة شريحة ميكروسكوب زجاجية. ضع قطعة من ذوبان في الماء الشريط موجة حام على رأس العصا الشريط المزدوج. ملاحظة: يمكن تخزين هذه الشريحة في مجفف لاستخدامها في المستقبل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أول أنبوب 0.2 مل على شريحة مزدوجة الشريط عصا أو كتلة أعدت في الخطوة 3.4. تعيين هذا الأنبوب جانبا حتى يتم جمع العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع موجة جندى الشريحة الشريط للذوبان في الماء تحت المجهر (تضخم منخفض). استخدام غيض من إبرة التنغستن، كشط بلطف من سطح الشريط من أجل جمع كمية صغيرة (أو &quot;الكرة&quot;) من مادة لاصقة في نهاية الإبرة (الشكل 5A). ملاحظة: حجم الكرة يمكن أن تكون مصنوعة صغيرة أو كبيرة اعتمادا على عدد من bioparticles التي سيتم جمعها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية الإبرة التنغستن بمادة لاصقة من تحت المجهر من دون إزعاج رأس الإبرة. الإبرة يمكنيكون مكان في رفوف إذا رغبت خلال وضع العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع عينة مستعدة هلام فيلم (من خطوات 1 و 2) على المسرح المجهر. ضبط التركيز والتكبير حتى bioparticles يمكن أن ينظر إليها بسهولة. التعرف على جزيئات الحيوية التي سيتم جمعها. ملاحظة: يمكن استخدام كتلة الزجاج لدعم الشريحة إذا لزم الأمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استرداد إبرة التنغستن مع الكرة لاصقة، ووضع إبرة على سطح هلام الفيلم حيث توجد جزيئات الحيوية من الفائدة. اضغط على رأس الإبرة (مع لاصق) أسفل بحيث يكون على اتصال مع الجسيمات الحيوية (الشكل 5B). رفع الإبرة حتى تأكد من أن الجسيمات الحيوية تم جمعها. كرر هذه العملية حتى يتم جمع العدد المطلوب من جزيئات الحيوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع إعداد 0.2 مل PCR أنبوب على المسرح المجهر. ضبط التكبير بحيث أسفل الأنبوب الذي يحتوي على مزيج التضخيم هو في التركيز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج بعناية needl التنغستنه إلى 0.2 مل PCR أنبوب حتى رأس الإبرة هو في مزيج التضخيم. ملاحظة: يتم تنفيذ هذا أفضل أثناء عرض من خلال المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد إبرة في مزيج التضخيم حتى يتم الإفراج يذوب لاصقة وbioparticles إلى حل (الشكل 5C). إزالة الإبرة، ضع 0.2 مل تستقيم وفضفاضة غطاء الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الإجراء جمع عينات إضافية. تنظيف إبرة التنغستن مع الكحول قبل مبلل (الأيزوبروبانول) تمسح بين العينات. </li></ol> 4. المشتركة Microvolume حمض النووي العزلة (المباشر تحلل) وراثي جسمي قصيرة جنبا إلى جنب كرر (STR) التنميط <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد العازلة تحلل (انظر المواد) في PCR التضخيم غطاء محرك السيارة المعينة أو الوزراء للسلامة الأحيائية. إضافة 1.5 ميكرولتر من تحلل العازلة لكل أنبوب لإجمالي حجم رد الفعل 5 ميكرولتر. إغلاق الأغطية أنبوب بإحكام. ملاحظة: 0.2 مل أنابيب تحتوي بالفعل 3.5 ميكرولتر منمزيج التضخيم وجمع الحيوي الجسيمات من الخطوة 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان العينات في cycler الحرارية وتضخيم عينات باستخدام الدراجات الظروف التالية: 75 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. 95 درجة مئوية لمدة 11 دقيقة. 34 دورات من 94 درجة مئوية لمدة 20 ثانية و 59 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. 60 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. و4 ° C الانتظار. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين المنتجات التضخيم في 4 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى القصير. </li></ol></li></ol> 5. كشف المنتج - شعري الكهربائي (CE) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في 96 لوحة جيدا، إضافة 10 ميكرولتر من CE تشغيل مزيج (9.7 ميكرولتر الفورماميد منزوع الأيونات و 0.3 ميكرولتر معيار حجم، وانظر المواد). إضافة 1 ميكرولتر من الناتج تضخيمها أو سلم أليلية إلى كل بئر. تنبيه: الفورماميد هو المغير المحتملين وينبغي التعامل في غطاء الكيميائية في حين ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الظروف الكهربي المحدد من قبل الشركة المصنعة في دليل عدة التضخيم أو internallذ التحقق من صحة الشروط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل البيانات الخام مع برامج التحليل STR. </li></ol>

<ol>
	<li>Hanson, E. K., Ballantyne, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+blood+from+a+stone':+ultrasensitive+forensic+DNA+profiling+of+microscopic+bio-particles+recovered+from+'touch+DNA'+evidence.">Getting blood from a stone': ultrasensitive forensic DNA profiling of microscopic bio-particles recovered from 'touch DNA' evidence.</a> Methods Mol.Biol. 1039, 3-17 (2013).</li><li>Balogh, M. K., Burger, J., Bender, K., Schneider, P. M., Alt, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STR+genotyping+and+mtDNA+sequencing+of+latent+fingerprint+on+paper.">STR genotyping and mtDNA sequencing of latent fingerprint on paper.</a> Forensic Sci Int. 137 (2-3), 188-195 (2003).</li><li>Barbaro, A., Cormaci, P., Teatino, A., La, M. A., Barbaro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anonymous+letters?+DNA+and+fingerprints+technologies+combined+to+solve+a+case.">Anonymous letters? DNA and fingerprints technologies combined to solve a case.</a> Forensic Sci Int. 146, S133-S134 (2004).</li><li>Bright, J. A., Petricevic, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+trace+DNA+and+its+application+to+DNA+profiling+of+shoe+insoles.">Recovery of trace DNA and its application to DNA profiling of shoe insoles.</a> Forensic Sci.Int. 145 (1), 7-12 (2004).</li><li>Castello, A., Alvarez, M., Verdu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+from+a+Computer+Keyboard.">DNA from a Computer Keyboard.</a> Forensic Science Communications. 6 (3), (2004).</li><li>Horsman-Hall, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+STR+profiles+from+firearms+and+fired+cartridge+cases.">Development of STR profiles from firearms and fired cartridge cases.</a> Forensic Sci Int. Genet. 3 (4), 242-250 (2009).</li><li>Petricevic, S. F., Bright, J. A., Cockerton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+profiling+of+trace+DNA+recovered+from+bedding.">DNA profiling of trace DNA recovered from bedding.</a> Forensic Sci. Int. 159 (1), 21-26 (2006).</li><li>Oorschot, R. A., Jones, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+fingerprints+from+fingerprints.">DNA fingerprints from fingerprints.</a> Nature. 387 (6635), 767 (1997).</li><li>Sewell, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+DNA+and+fingerprints+from+touched+documents.">Recovery of DNA and fingerprints from touched documents.</a> Forensic Sci Int.Genet. 2 (4), 281-285 (2008).</li><li>Raymond, J. J., van Oorschot, R. A., Gunn, P. R., Walsh, S. J., Roux, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trace+evidence+characteristics+of+DNA:+A+preliminary+investigation+of+the+persistence+of+DNA+at+crime+scenes.">Trace evidence characteristics of DNA: A preliminary investigation of the persistence of DNA at crime scenes.</a> Forensic Sci Int Genet. 4 (1), 26-33 (2009).</li><li>Wickenheiser, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trace+DNA:+a+review,+discussion+of+theory,+and+application+of+the+transfer+of+trace+quantities+of+DNA+through+skin+contact.">Trace DNA: a review, discussion of theory, and application of the transfer of trace quantities of DNA through skin contact.</a> J.Forensic Sci. 47 (3), 442-450 (2002).</li><li>Sweet, D., Lorente, M., Lorente, J. A., Valenzuela, A., Villanueva, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+to+recover+saliva+from+human+skin:+the+double+swab+technique.">An improved method to recover saliva from human skin: the double swab technique.</a> J. Forensic Sci. 42 (2), 320-322 (1997).</li><li>Darmon, M. M., Blumenberg, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biology of the Skin - the Keratinocyte. , (1993).</li><li>Daly, D. J., Murphy, C., McDermott, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transfer+of+touch+DNA+from+hands+to+glass,+fabric+and+wood.">The transfer of touch DNA from hands to glass, fabric and wood.</a> Forensic Sci Int Genet. 6 (1), 41-46 (2012).</li><li>Goray, M., Eken, E., Mitchell, R. J., van Oorschot, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+DNA+transfer+of+biological+substances+under+varying+test+conditions.">Secondary DNA transfer of biological substances under varying test conditions.</a> Forensic Sci Int Genet. 4 (2), 62-67 (2010).</li><li>Goray, M., Mitchell, R. J., van Oorschot, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+secondary+DNA+transfer+of+skin+cells+under+controlled+test+conditions.">Investigation of secondary DNA transfer of skin cells under controlled test conditions.</a> Leg.Med.(Tokyo). 12 (3), 117-120 (2010).</li><li>Lowe, A., Murray, C., Whitaker, J., Tully, G., Gill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+propensity+of+individuals+to+deposit+DNA+and+secondary+transfer+of+low+level+DNA+from+individuals+to+inert+surfaces.">The propensity of individuals to deposit DNA and secondary transfer of low level DNA from individuals to inert surfaces.</a> Forensic Sci Int. 129 (1), 25-34 (2002).</li><li>Phipps, M., Petricevic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tendency+of+individuals+to+transfer+DNA+to+handled+items.">The tendency of individuals to transfer DNA to handled items.</a> Forensic Sci Int. (2-3), 168-162 (2007).</li><li>Zoppis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+fingerprinting+secondary+transfer+from+different+skin+areas:+Morphological+and+genetic+studies.">DNA fingerprinting secondary transfer from different skin areas: Morphological and genetic studies.</a> Forensic Sci Int Genet. 11, 137-143 (2014).</li><li>Gill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Misleading DNA Evidence: Reasons for Miscarriages of Justice. , (2014).</li><li>Haas, C., Hanson, E., Ballantyne, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+electrophoresis+of+a+multiplex+reverse+transcription-polymerase+chain+reaction+to+target+messenger+RNA+markers+for+body+fluid+identification.">Capillary electrophoresis of a multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction to target messenger RNA markers for body fluid identification.</a> Methods Mol. Biol. 830, 169-183 (2012).</li><li>Hanson, E., Ballantyne, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Profiling+for+the+Identification+of+the+Tissue+Origin+of+Dried+Stains+in+Forenic+Biology.">RNA Profiling for the Identification of the Tissue Origin of Dried Stains in Forenic Biology.</a> Forensic Sci Rev. , 22145-22157 (2010).</li><li>Hanson, E., Haas, C., Jucker, R., Ballantyne, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+and+sensitive+mRNA+biomarkers+for+the+identification+of+skin+in+'touch+DNA'+evidence.">Specific and sensitive mRNA biomarkers for the identification of skin in 'touch DNA' evidence.</a> Forensic Sci Int Genet. 6, 548-558 (2012).</li><li>Hanson, E. K., Ballantyne, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+specific+mRNA+biomarkers+for+the+identification+of+vaginal+secretions+in+sexual+assault+investigations.">Highly specific mRNA biomarkers for the identification of vaginal secretions in sexual assault investigations.</a> Sci Justice. 53 (1), 14-22 (2013).</li><li>Juusola, J., Ballantyne, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Messenger+RNA+profiling:+a+prototype+method+to+supplant+conventional+methods+for+body+fluid+identification.">Messenger RNA profiling: a prototype method to supplant conventional methods for body fluid identification.</a> Forensic Sci Int. 135 (2), 85-96 (2003).</li><li>Juusola, J., Ballantyne, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+mRNA+profiling+for+the+identification+of+body+fluids.">Multiplex mRNA profiling for the identification of body fluids.</a> Forensic Sci Int. 152 (1), 1-12 (2005).</li><li>Fleming, R. I., Harbison, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+a+mRNA+multiplex+RT-PCR+assay+for+the+definitive+identification+of+body+fluids.">The development of a mRNA multiplex RT-PCR assay for the definitive identification of body fluids.</a> Forensic Sci Int Genet. 4 (4), 244-256 (2010).</li><li>Haas, C., Klesser, B., Maake, C., Bar, W., Kratzer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+profiling+for+body+fluid+identification+by+reverse+transcription+endpoint+PCR+and+realtime+PCR.">mRNA profiling for body fluid identification by reverse transcription endpoint PCR and realtime PCR.</a> Forensic Sci Int Genet. 3 (2), 80-88 (2009).</li><li>Lindenbergh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+(m)RNA-profiling+system+for+the+forensic+identification+of+body+fluids+and+contact+traces.">A multiplex (m)RNA-profiling system for the forensic identification of body fluids and contact traces.</a> Forensic Sci Int Genet. 6 (2), 565-577 (2012).</li><li>Richard, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+mRNA+marker+specificity+for+the+identification+of+five+human+body+fluids+by+capillary+electrophoresis.">Evaluation of mRNA marker specificity for the identification of five human body fluids by capillary electrophoresis.</a> Forensic Sci Int Genet. 6 (4), 452-460 (2012).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

هنا وصفناها أساليب لجمع وتعزيز التحليل الجيني للbioparticles تعافى من أدلة الحمض النووي اللمس. النهج المتقدمة يشمل ما يلي: 1) مجموعة من المواد البيولوجية (أي bioparticles) عن طريق هلام فيلم من الأشياء لمست والسطوح، والملابس البالية أو الجلد البشري المباشر، 2) الفحص المجهري للمواد البيولوجية تعافى لضمان جمع من إمكانات المواد البشرية البيولوجية، و3) المجهرية من bioparticles واحد أو عدد قليل باستخدام مادة لاصقة للذوبان في الماء، و4) التنميط جسمية DNA-STR من bioparticles جمعها باستخدام microvolume (5 ميكرولتر) من خطوة واحدة تحلل / رد فعل التضخيم. استخدام خطوة واحدة أنبوب مغلق رد فعل يقلل من احتمال تلوث العينة وخسارة من التلاعب عينة إضافية أو نقلها إلى أنابيب رد فعل الأخرى. لتعزيز خطوة واحدة microvolume (5 ميكرولتر) تحلل / ردود فعل التضخيم STR تسمح استرداد كامل أو probativالبريد STR ملامح من الجهات المانحة للbioparticles واحد أو عدد قليل. وقد تم تطوير هذا النهج للحصول على واحدة ملامح STR مصدر من لمسة أدلة الحمض النووي المفرد ومتعددة المصادر (مثل البنود البالية الملابس والأدوات المنزلية الأخرى، لمست / الأجسام التعامل معها والسطوح، مخاليط الجلد / الجلد). وقد تم بنجاح استخدامه للكشف عن الجهة المانحة الذكور في محاكاة عينات خليط الاعتداء الجسدي. ويمكن زيادة تقييم هذا النهج في سيناريوهات إضافية خليط الجسم السوائل / الأنسجة مثل ضحية الخدش له / لها المعتدي، والذي سوى عدد قليل من bioparticles من المعتدي أن تكون موجودة بين مبلغ هائل من المواد البيولوجية من الضحية. بالإضافة إلى ذلك، لأن هذا النهج المتقدمة في الدراسة الحالية يسمح التحليل على مستوى bioparticle واحد، يمكن استخدامها للحصول على فهم أفضل لطبيعة ومدى نقل الثانوي 14-19، التي وسيط ينقل لمحة DNA على المعالم، الكائن أو الشخص إلى كائن آخر السطحية أو شخص 20. قد تفشل نهج أعمى ينظف لتحليل نقل الثانوي لتحديد كميات ضئيلة من المواد المتبرع الثانوي. النهج وضعت هنا يسمح تحليل bioparticles واحد أو عدد قليل، وبالتالي لا مرتبك النتائج وفقا لوجود الكم الهائل من المواد البيولوجية من الجهات المانحة الأساسية. المنهجيات التي وضعت في هذا العمل قد يكون لها أيضا آثار على تحليل المواد البيولوجية أثر في حالات الاعتداء الجنسي مثل تلك التي تنطوي على اختراق الرقمية من المهبل حيث تحديد الإيجابي لكميات ضئيلة من خلايا الجلد من الجاني يمكن أن يكون حاسما لإثبات أن الاتصال الجنسي وقعت. في حين جمع bioparticles من عينة هلام الفيلم لا تنطوي على التلاعب صعبة ومعقدة، وهناك خطوات حاسمة في هذا الإجراء الذي يجب أن تنجز بعناية كبيرة لضمان سونقل ccessful من bioparticles إلى وعاء التفاعل المصب. جمع bioparticles مع لاصقة للذوبان في الماء يجب أن ينظر مجهريا (أي stereomicroscope في تضخم عالية (~ 200-300X) لضمان أن فقط bioparticles من الفائدة التي تم جمعها. واعتمادا على حجم لاصقة &quot;الكرة&quot; المستخدمة، هناك هي القدرة على جمع المواد المحيطة إضافية والتي قد تشمل المواد على حد سواء البيولوجية وغير البيولوجية (على سبيل المثال، والألياف، وغيرها من الحطام). قد يؤدي جمع bioparticles إضافية غير مقصود في الانتعاش من الحمض النووي ممزوجة، وجمع المواد غير البيولوجية قد يعرض مثبطات في تحلل الصغيرة الحجم / ردود الفعل STR. إذا تم جمعها bioparticles متعددة مع نفس اصقة &quot;الكرة&quot;، هناك إمكانية لbioparticles تم جمعها سابقا لتصبح غير مرتبط من المواد اللاصقة. لا وحظ هذا في كثير من الأحيان، ولكن يمكن أن يحدث عندما أعداد أكبر من bioparticlوفاق يتم جمع (على سبيل المثال، أكثر من 50) مع مادة لاصقة &quot;الكرة&quot; واحدة. إذا استهدفت عدد كبير من bioparticles، فمن المستحسن أن يتم إجراء مجموعات متعددة من عدد أقل من bioparticles ولكن كل نقلها في نفس أنبوب 0.2 مل. مرة واحدة تم جمعها bioparticles، يجب توخي الحذر أثناء إزالة الشريحة هلام فيلم من مرحلة المجهر ووضع أنبوب 0.2 مل بحيث لا تشعر بالانزعاج غيض من الإبرة. أثناء وضع غيض من الإبرة في مزيج التضخيم في الجزء السفلي من الأنبوب 0.2 مل، ينبغي أن رأس الإبرة لا اجراء اتصالات مع الجانبين من أنبوب من أجل تجنب فقدان المواد على جانبي الأنبوب. في حين أن الإذابة لاصقة سريع عادة (~ 30 ثانية أو أقل اعتمادا على حجم لاصقة &quot;الكرة&quot;)، ويمكن رصدها خلال الفحص المجهري، ورأس الإبرة يجب إزالة ببطء من مزيج التضخيم لضمان كاملة الإذابةلاصقة تم إنجازه. إذا لاصقة لم حلت تماما، ويمكن إرجاع الإبرة إلى السائل للسماح بحل كاملة. وقد تم تحسين البروتوكولات وصفها هنا للاستخدام مع bioparticles والخلايا البشرية من الأدلة البيولوجية الطب الشرعي. المخزن المؤقت تحلل المحدد هو متوافق مع DNA-STR التضخيم مجموعة مختارة. بينما قد يكون هناك مناسبة مخازن تحلل البديلة، يجب التحقق من كفاءتها من حيث تحلل الخلايا والتوافق مع تحليل المصب من قبل المستخدم. بالإضافة إلى ذلك، وقد تم تحسين عدد عدة STR التضخيم ودورة التضخيم الموصوفة في هذا البروتوكول للاستخدام مع bioparticles واحد أو عدد قليل. تم اختيار الجيل القادم عدة STR التضخيم مع ذكرت زيادة متانة والحساسية وتم التدليل على أن يؤدي انتعاش ملامح STR جودة عالية من bioparticles واحد أو عدد قليل. بينما العديد من مجموعات STR أخرى، مع اختلاف amplifi الموصى بهاأرقام دورة الموجبة، المتاحة، فإنها قد لا تمتلك حساسية مناسبة، وبالتالي سوف تحتاج إلى تقييم صحيح قبل استخدامها في هذه البروتوكولات. وعلى الرغم من نجاح استخدام الأساليب المذكورة لمحات الانتعاش STR من bioparticles واحد أو عدد قليل، فإن نسبة نجاح الانتعاش الشخصية لا يكون 100٪. لذلك، بالنسبة لبعض عينات DNA لمحة جزئي محدود أو لا يوجد ملف تعريف يمكن ملاحظة. لا يمكن تجنب هذا بسبب عدم القدرة على تحديد قاطع بصريا معظم bioparticles كمادة الخلوية، والدولة المتدهورة المحتملة من المواد النووية في bioparticles أو فقدان المواد عينة من المواد اللاصقة التي تم جمعها قبل نقل إلى وعاء التفاعل. ولذلك، لا ينصح تحليل عينة bioparticle واحدة لكل عنصر DNA التي تعمل باللمس. ونحن في كثير من الأحيان جمع 20 عينة مجموعات من عينة هلام فيلم الفردية وسوف جمع مجموعات عينة إضافية حسب الحاجة إذا لم يتم الحصول على لمحة STR مناسبة. تيوالقيد الوحيد لمجموعات هي كمية المواد البيولوجية موجودة على عينة هلام فيلم (وعلى الأرجح تكلفة التحليل، على الرغم من أن ردود الفعل microvolume توفر الفرصة لجمع عينات إضافية بتكلفة مماثلة أو أقل كوحدة تخزين رد فعل موحد واحد ( على سبيل المثال، 25 ميكرولتر). أساليب التنميط DNA وضعت تصف هنا توفر النهج القائم على الجزيئي على توصيف وتحليل وتفسير المواد البيولوجية أثر تعافى من عينات DNA التي تعمل باللمس. ومع ذلك، هناك معلومات وراثية الإضافية التي يمكن الحصول عليها من bioparticles تعافى بالإضافة إلى تحديد الجهات المانحة (أي، لمحة STR) الجهة المانحة للمواد البيولوجية. مصدر السائل الأنسجة أو هيئة من أصل (على سبيل المثال، والجلد مقابل اللعاب) قد توفر معلومات سياقية حاسمة لتحقيق جنائي. بدون مثل هذا القرار، غموض المصدر الأنسجة الأصلية يمكن EXPLOكما ited الظروف بديلة للجريمة (على سبيل المثال، كيف قد أودعت السوائل في الجسم) يمكن اقتراحها. البروتوكولات جمع bioparticle والعزلة الموصوفة هنا يمكن أن تستخدم لجمع bioparticles أو خلايا أخرى (على سبيل المثال، الشدق، المهبل) لاستخدامها في تحديد مصدر الأنسجة (مرنا التنميط 21-30) الاستراتيجية التي ينطوي الصغيرة الحجم عكس النسخ (RT) و ردود الفعل التضخيم. مع مزيد من التحسين قد يكون من الممكن أيضا لتطوير / RNA استراتيجية التعاون عزل الحمض النووي للسماح نوع من الخلايا تحديد (RNA) والتنميط STR من نفس العينة، بما في ذلك bioparticles من أدلة الحمض النووي التي تعمل باللمس.

DNA اللمس هو شكل من أشكال الأدلة البيولوجية أثر الذي هو نقل مباشر من المواد الخلوية (على سبيل المثال، تسليط خلايا الجلد) من الفرد إلى كائن أو شخص آخر خلال الاتصال الجسدي 1. القدرة على الحصول على الحمض النووي من مجموعة متنوعة من الكائنات تطرق (وثائق، والفراش، والأحذية، والأسلحة النارية، وحاويات الشرب، والأقلام، مقابض حقيبة) وقد أبلغ في الأدب 2-9. وثمة عامل حاسم في تحليل الأدلة DNA مسة انتعاش الناجح لأثر المواد البيولوجية الحاضر. اللمس هو جمع أدلة الحمض النووي عادة من قبل ينظف منطقة يشتبه مع مسحة القطن المعقمة (المشار إليها باسم &quot;ينظف أعمى&quot;). باستخدام هذا النهج، وطبيعة المواد البيولوجية التي تم جمعها من غير المعروف ويتم تنفيذ أخذ العينات من منطقة المعمم. وجود أخاديد السطح أو الشقوق قد تعوق الانتعاش الناجح لكمية صغيرة في كثير من الأحيان بالفعل السياالمواد استثارة الحاضر. بالإضافة إلى ذلك، سوف نهج &#39;أعمى ينظف &quot;المواد الخلوية بالضرورة شارك في عينة من مختلف الأفراد الذين خلايا موجودة على هذا البند، حتى لو وتقع خلايا الأفراد في مواقع متميزة مكانيا على هذا البند. التعافي من الحمض النووي ممزوجة، والتي غالبا ما تتحدى لحل لا سيما مع عينات من الحمض النووي قالب منخفض، وكثيرا ما لوحظ 8،10،11 وفي كثير من الحالات سيكون قطعة أثرية تبعية لعملية ينظف نفسه. إذا كان فقط كمية صغيرة من المواد الحالي من إحدى الجهات المانحة، قد تفشل تقنيات استخراج وتحليل القياسية لاستعادة الملف من المساهم طفيفة. بالإضافة إلى ذلك، نوع مسحة أو ما إذا كان يستخدم الجاف أو الرطب (قبل مبلل بالماء المعقم) قد تؤثر على كمية المواد البيولوجية التي يتم جمعها بسبب الاختلافات في الامتصاصية وadsorptivity وكفاءة الافراج عن المواد البيولوجية 12. Sأساليب الاستخراج tandard قد يؤدي إلى فقدان عينة إضافية بسبب التلاعب المطلوبة المادي للعينة أو نقل عينة الخطوات. كما هو موضح أعلاه، تقنيات ينظف بسيطة لاسترداد المواد البيولوجية قد يؤدي إلى فقدان كميات ضئيلة من عينة بيولوجية فضلا عن حدوث زيادة لمحات ممزوجة بسبب عدم فصل المكونات البيولوجية الفردية. ولذلك، سعينا إلى تطوير استراتيجيات الانتعاش أكثر انتقائية وفعالة لجمع المجهرية الدقيقة الخلوية الحالية على الأشياء لمسها. الاستراتيجية التي وضعت لتحليل المواد البيولوجية من أدلة الحمض النووي اتصال (المشار إليها هنا باسم &quot;bioparticles&quot; يرجع ذلك إلى حقيقة أن نواة ليست واضحة دائما منذ أغلبية الخلايا الموجودة في طبقة البشرة الخارجية للجلد ميتة أو تموت الكيراتينية 13)، تتضمن ما يلي: 1) مجموعة من المواد البيولوجية (أي bioparticles) عن طريق هلام فيلم الابام تطرق الأجسام والسطوح، الملابس البالية أو الجلد البشري المباشر، 2) الفحص المجهري للمواد البيولوجية تعافى لضمان جمع المواد البيولوجية البشرية المحتملة، و3) المجهرية الحيوي الجسيمات واحدة أو عدد قليل باستخدام مادة لاصقة للذوبان في الماء، و 4) راثي التنميط DNA-STR من جمعها الحيوية الجزيئات باستخدام microvolume (5 ميكرولتر) من خطوة واحدة تحلل / رد فعل التضخيم. يوفر هذا الإجراء مزايا عديدة أكثر من طرق التحليل المستخدمة تقليديا. انتعاش bioparticles باستخدام فيلم هلام يسمح الفحص المجهري للحاضر المواد البيولوجية في العينة قبل التحليل. في حين أن الغالبية العظمى من bioparticles تعافى من أدلة الحمض النووي اللمس قد لا تكون خلايا الأنوية مما يجعلها أكثر صعوبة لتحديد أي أو كم ينبغي اختيار جزيئات الحيوية، والفحص المجهري لهذه العينات قبل يوفر التحليل إلى فرصة للبحث عن خلايا الأنوية وبالتالي maximizجي احتمال انتعاش الحمض النووي. جمع bioparticles استخدام المياه القابلة للذوبان المجهرية بمساعدة لاصق يسمح بنقل مباشر من bioparticles المستهدفة في أنابيب رد فعل. هو تصور هذا الإجراء تحت المجهر لضمان نجاح نقل المواد البيولوجية. رد فعل تخفيض أو microvolume يزيد من حساسية في حين خفض تكلفة التحليل في العينة. هذا يسمح تحليل أعداد متزايدة من عينات من الفرد قطعة من الأدلة. نظرا لمجموعة في ولاية الوراثية للجزيئات الحيوية في أدلة الحمض النووي تعمل باللمس، ينصح عينات متعددة من الأصناف الفردية. هنا، علينا أن نظهر نجاح استخدام البروتوكولات المتقدمة للحصول على لمحات الوراثية الثبوتية للغاية من المانحين من المواد البيولوجية في أدلة الحمض النووي اللمس. أساليب التنميط جمع bioparticle المتقدمة وDNA توفر شامل &quot;الذكية&quot; (أي ومحددة وقابلة للقياس، عطانهج inable وواقعية وفي الوقت المناسب) الجزيئي استنادا إلى توصيف وتحليل وتفسير المواد البيولوجية أثر. في حين وضعت أصلا لتطبيقها على التحليل الجنائي للأدلة الحمض النووي تعمل باللمس، والاستراتيجيات التي وضعت هنا يمكن تطبيقها على مصادر أخرى من المواد البيولوجية وتقديم فرصة للحصول على المعلومات وتحديد الفردية على مستوى خلية واحدة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="998">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:147px;">Company</td>
			<td style="width:139px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:320px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:395px;">SealRite 1.5 mL natural microcentrifuge tubes, sterile</td>
			<td style="width:147px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:139px;">1615-5510</td>
			<td style="width:320px;">numerous altnerative suppliers are available, but tubes should be sterile</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">0.2 mL PCR tubes with flat cap, natural</td>
			<td style="width:147px;">Phenix Research</td>
			<td style="width:139px;">MPX-200F</td>
			<td style="width:320px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:395px;">Kimwipes</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">06-666 and/or 06-666-11C</td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:395px;">Alcohol prep pads</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">06-669-62</td>
			<td style="width:320px;">alternative is 06-665-24 (Fisher Sci); canister of larger alcohol wipes rather than individual pads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Sterile water</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:320px;">18.2 mega-ohm, autoclaved</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Glass microscope slides, frosted, 3&#34; x 1&#34;: 1mm</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">12-544-3</td>
			<td style="width:320px;">alternative brands or sizes are acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Disposable transfer pipet</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">13-711-9D</td>
			<td style="width:320px;">alternatives are acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Trypan blue solution</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">T8154</td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Pipets: 0.2-2, 2-20, 10-100, 100-1,1000 mL</td>
			<td style="width:147px;">various</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Sterile, aerosol-resistant pipet tips</td>
			<td style="width:147px;">various</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Mini-centrifuge</td>
			<td style="width:147px;">various</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:395px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:147px;">Leica</td>
			<td style="width:139px;">M205C</td>
			<td style="width:320px;">others are suitable, but must be capable of magifications up to 350X</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:395px;">GeneAmp PCR system 9700 thermal cycle (silver or gold block)</td>
			<td style="width:147px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:139px;">N8050200 or 4314878</td>
			<td style="width:320px;">other models and manufacturers can be used, but performance with the STR amplification kit must be verified</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:395px;">3130 Genetic Analyzer</td>
			<td style="width:147px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:139px;">3130-01</td>
			<td style="width:320px;">Alternatives: 310 or 3500 Genetic Aanlyzers (Life Technologies)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:395px;">GeneMapper software</td>
			<td style="width:147px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:139px;">various</td>
			<td style="width:320px;">Various versions of the software are available and can be used</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:395px;">WF Gel-Film , x8 retention level</td>
			<td style="width:147px;">Gel-Pak</td>
			<td style="width:139px;">WF-40-x8-A</td>
			<td style="width:320px;">4&#34; x 4&#34; wafer film; can be ordered in other size specifications</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Double sided tape</td>
			<td style="width:147px;">various</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:395px;">Glass block, 3&#34; x 1.5&#34; x 3/8&#34;</td>
			<td style="width:147px;">McCrone Microscopes and Accessories</td>
			<td style="width:139px;">370-2</td>
			<td style="width:320px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:395px;">Tungsten needle with holder</td>
			<td style="width:147px;">McCrone Microscopes and Accessories</td>
			<td style="width:139px;">106</td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">3M&#160; water soluble wave solder tape, 5414 transparent</td>
			<td style="width:147px;">Allied Electronics</td>
			<td style="width:139px;">70113977</td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:395px;">Lysis buffer (forensicGEM Saliva, Zygem)</td>
			<td style="width:147px;">VWR</td>
			<td style="width:139px;">95043-992</td>
			<td style="width:320px;">Lysis buffer is prepared in 10 ml portions (prepare additional master mix portions as needed to accommodate the desired number of samples). 1.5 ml is used for each sample. To prepare 10 ml of lysis buffer (sufficient for ~6 samples): 6.9 mL sterile water, 2.1 mL 10x buffer - blue, 1 mL forensicGEM.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="210">
			<td height="210" style="height:210px;width:395px;">STR Amplification kit, AmpFlSTR Identifiler Plus PCR amplification kit</td>
			<td style="width:147px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:139px;">4427368</td>
			<td style="width:320px;">Alternative STR amplification kits can be used, but performance would have to be verified by user. The amplification mix is prepared as follows (volumes per sample): 2.2 ml PCR reaction mix, 1.1 ml Primer set, 0.2 ml (1U) AmpliTaq Gold DNA polymerase. A master mix sufficient for the desired number of samples should be prepared. 3.5 ml of the prepared mix is added to the 0.2 mL tube for bio-particle collection.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">AmpliTaq Gold DNA polymerase</td>
			<td style="width:147px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:139px;">N808-0245</td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">HiDi formamide</td>
			<td style="width:147px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:139px;">4311320</td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">GeneScan 500 LIZ size standard</td>
			<td style="width:147px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:139px;">4322682</td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">96 well optical reaction plates</td>
			<td style="width:147px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:139px;">N8010560</td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Plate septa, 96 well</td>
			<td style="width:147px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:139px;">4315933</td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Performance-optimized polymer, POP-7</td>
			<td style="width:147px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:139px;">4363785</td>
			<td style="width:320px;">Alternatives such as POP-4 are acceptable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enhanced genetic analysis of single human bioparticles recovered by simplified micromanipulation from forensic &#8216;touch dna&#8217; evidence

ويمكن الحصول على الحمض النووي من الأدلة &quot;لمسة DNA&quot;، الذي يضم آثار مجهرية من المواد البيولوجية البشرية. الأساليب الحالية لاسترداد DNA أثر مسحات توظيف القطن أو شريط لاصق لأخذ عينات مساحة من الاهتمام. ومع ذلك، فإن هذا النهج &quot;أعمى ينظف&quot; ك-عينة المواد الخلوية من مختلف الأفراد، حتى لو وتقع خلايا الأفراد في مواقع متميزة جغرافيا على هذا البند. وهكذا، وبعض من خليط الحمض النووي التي واجهتها في عينات DNA تعمل باللمس يتم إنشاؤها بشكل مصطنع من قبل ينظف نفسه. في بعض الحالات، DNA الضحية يمكن الاطلاع عليها في فائض كبير وبالتالي اخفاء DNA أي مرتكب محتمل ل. من أجل الالتفاف على التحديات مع وسائل التعافي وتحليل القياسية، وقد وضعنا بتكلفة أقل، وطريقة &quot;التحليل الذكي&quot; التي تؤدي إلى تعزيز التحليل الجيني للأدلة الحمض النووي التي تعمل باللمس. نحن تصف والأمثلاستراتيجية الإنعاش المجهرية الفعالة د لجمع الحيوي الجزيئات الموجودة في عينات DNA تعمل باللمس، وكذلك استراتيجية التضخيم تعزيز تنطوي على خطوة واحدة 5 ميكرولتر microvolume تحلل / STR التضخيم للسماح استعادة ملامح STR من الجهة المانحة الحيوي الجسيمات (ق). استخدام فرد أو عدد قليل (أي &quot;كتل&quot;) النتائج bioparticles في القدرة على الحصول على لمحات مصدر واحد. وتمثل هذه الإجراءات تقنيات محسنة بديلة لعزل وتحليل bioparticles واحد من الطب الشرعي أدلة الحمض النووي التي تعمل باللمس. في حين ليس من الضروري في كل تحقيقات الطب الشرعي، يمكن أن يكون مفيدا للغاية طريقة لاستعادة لمحة DNA الجاني مصدر واحد في الحالات التي تنطوي على الاعتداء الجسدي (على سبيل المثال، الخنق) التي قد لا يكون ممكنا باستخدام تقنيات التحليل القياسية. بالإضافة إلى ذلك، الاستراتيجيات التي وضعت هنا تقدم فرصة للحصول على المعلومات الجينية على مستوى خلية واحدة من مجموعة متنوعة من سذر أثر غير الشرعي المواد البيولوجية.

وتظهر الصور التمثيلية للbioparticles الفردي وتجمعت التي تم استردادها من طوق القميص (100٪ البوليستر) التي يرتديها متبرع الذكور في الشكل 6 (bioparticles الفردي) والشكل 7 (bioparticles تجمعت). وقد استعاد bioparticles من ذوي الياقات البيضاء قميص باستخدام بروتوكول الموصوفة هنا: نقل bioparticles من طوق القميص إلى هلام الفيلم من خلال الاتصال المباشر، وتلطيخ للbioparticles تعافى مع الأزرق التريبان، وجمع عينات bioparticle باستخدام إبرة التنغستن والمياه لاصقة قابلة للذوبان وتحليل STR باستخدام التضخيم 5 ميكرولتر الصغيرة الحجم تحلل / STR. أرقام 6 و 7 تمثل عينة نموذجية من bioparticles التي سيجري تحليلها من عنصر DNA اتصال فردي (20 bioparticles واحد / الفردية و 20 bioparticles تجمعت). وصفت وbioparticle (ق) التي جمعت في كل صورة مع طول وعرض القياسات (في ميكرون). والايثيلينوتقدم entage الأليلات STR تعافى من كل من bioparticle جمعها (ق) على كل صورة فردية للتدليل على درجات متفاوتة من النجاح الذي يمكن المتوقع الحصول عليها من bioparticles مع هذا النوع من الأدلة. وbioparticles تعافى من عينات DNA تعمل باللمس لقوا حتفهم إلى حد كبير أو يموتون الخلايا الكيراتينية، وبالتالي لا الحصول على لمحة STR ثبوتية من كل bioparticle التي تم جمعها، كما يمكن أن يرى في أرقام 6 و 7. لهذه العينة طوق القميص، تم الحصول عليها ملامح STR من 14/20 (70٪) من bioparticles الفردي و15/20 (75٪) تجمعت bioparticles. ومع ذلك، كل من لمحات تعافى يتراوح في القيمة الإثباتية: 3-97٪ الانتعاش أليل لمحات الفردية bioparticles و3-100٪ الانتعاش أليل لمحات bioparticle تجمعت. بسبب التباين في معدلات النجاح، ويوصى جمع العديد من bioparticles من كل بند DNA التي تعمل باللمس. وهذا يضمن فرصة أفضل للحصول على درجة عالية من probatiلقد STR الشخصية. يتم عرض الملف الشخصي STR تم الحصول عليها من أحد نماذج bioparticle الفردية من طوق القميص في الشكل 8 (يظهر bioparticle التي الشخصى نشأت إلى اليسار). تقريبا تم الحصول على لمحة STR الكامل (28 من أصل 30 الأليلات، وانخفاض موضع واحد من أصل، دقة البيانات الشخصية التي تم الحصول عليها التحقق من خلال المقارنة إلى ملف تعريف مرجع) من هذا bioparticle الفرد. البيانات الشخصية التي تم الحصول عليها هي ذات جودة عالية مع متوازنة إلى حد معقول بين موضع مرتفعات الذروة وانخفاض لا أليلية بها. أليلية التسرب وكلاهما كثيرا ما لوحظ ارتفاع غير المتوازنة التحف الذروة مع عينات من الحمض النووي قالب منخفض. يتم عرض الملف الشخصي STR تم الحصول عليها من أحد نماذج bioparticle تجمعت من طوق القميص في الشكل 9. لمحة كاملة STR (30/30 الأليلات، دقة البيانات الشخصية التي تم الحصول عليها التحقق من خلال المقارنة إلى ملف تعريف مرجع) تم الحصول عليها. وكما ذكر سابقا، لا يتم استردادها لمحة STR من أي وقت مضىذ bioparticle التي تم جمعها. ويرد مثال التنميط DNA غير ناجحة لbioparticle احد (3٪ الانتعاش أليل، 1/30 الأليلات) في الشكل رقم 10 (bioparticle فرد). في حين كان هذا bioparticle الفرد لم تكن ناجحة، تم الحصول على لمحات أس تي آر الثبوتية للغاية من الجهات المانحة للbioparticles في هذه العينة من bioparticles الآخرين تعافى من نفس العينة. وهذا يوضح الحاجة إلى إجراء عدة عينات خلية واحدة / أجمة من نفس الكائن. وقد استخدمت المتقدمة &quot;الذكية&quot; طرق التحليل موضح هنا عن أدلة الحمض النووي اتصال بنجاح لاسترداد الثبوتية لمحات من مصدر واحد واحد و&quot;تجمعت&quot; bioparticles من مختلف مست الأشياء والملابس (على سبيل المثال، تصلح كرسي، عجلات توجيه السيارة، والهواتف الخلوية، فناجين القهوة والسجائر، والأقلام، والقمصان، والسراويل، والسترات الصوفية). ومع ذلك، والأهم، كما تم استخدام هذا النهج للكشف والتنميط د الذكورonor DNA (مصدر واحد) في عينات البدني خليط الاتصال / الاعتداء محاكاة (على سبيل المثال، الجاني الاستيلاء على الضحية الرسغ، الرقبة أو الملابس، أو الاتصال مع الفراش الضحية كما في الاعتداءات الجنسية). <img alt="الشكل (1)" src="/files/ftp_upload/52612/52612fig1.jpg" /> الشكل 1: إعداد الشرائح هلام الفيلم لجمع bioparticle. تتم إزالة (A) والغطاء الواقي الخلفي الأبيض باستخدام ملاقط معقمة من قطعة من هلام الفيلم لفضح دعم لاصقة. ثم يتم الالتزام بها للفيلم هلام إلى شريحة المجهر والزجاج مع الضغط على الشركة. (B) عندما العينة هلام فيلم مستعدة لاستخدامها لجمع bioparticle، فيلم وقائي واضح أعلى وإزالتها باستخدام ملاقط معقمة. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/52612/52612fig2.jpg" /> الشكل 2: جمع Bioparticle باستخدام هلام-film من مختلف ركائز. الشرائح هلام الفيلم يمكن استخدامها لجمع bioparticles من مجموعة متنوعة من السطوح. يتم وضع فيلم هلام في اتصال مباشر مع الكائن أو السطحية المثيرة للاهتمام. يتم تطبيق ضغط لطيف من أجل نقل bioparticles على سطح هلام الفيلم. مجموعة من bioparticles من (A) العناصر البالية الملابس (معطف طوق)، (B) تطرق الكائنات (سفر فنجان القهوة)، و (C) الجلد البشري المباشر (الرسغ الذكور) ترد. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52612/52612fig3.jpg" /> يتم نقل Bioparticles على قطعة الملابس البالية (داخل بانت الساق) Bioparticles إلى هلام الفيلم من خلال الاتصال المباشر مع سطح القطعة: الرقم 3. Bioparticles يمكن العثور باسم &quot;كتل&quot; أو bioparticles واحد / الفرد (المشار إليها مع السهام الحمراء). <img<html> ALT = &quot;الشكل 4&quot; SRC = &quot;/ الملفات / ftp_upload / 52612 / 52612fig4.jpg&quot; /&gt; الرقم 4: تلطيخ اختياري من bioparticles على الشرائح هلام الفيلم لتصور أفضل للbioparticles، وعينات هلام الفيلم يمكن ملطخة صمة عار التريبان الأزرق. يتم تغطية كامل سطح هلام فيلم الأزرق التريبان (A). وبعد 1-2 دقائق من تلطيخ، يميل الشريحة بلطف للسماح صمة عار الزائدة لتشغيل خارج الشريحة (B). الفيضانات لطيف مع الماء المعقم (C) يمكن استخدامها لإزالة وصمة عار الزائدة. بعد الشريحة والهواء المجففة، ويمكن الاطلاع على الشريحة تحت المجهر للتأكد من تلطيخ السليم (D، E). ملاحظة: سوف تظهر ليس كل bioparticles الملون (أي والأزرق في اللون) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52612/52612fig4large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> OAD / 52612 / 52612fig5.jpg &quot;/&gt; الشكل 5: جمع وتحليل Bioparticle. (A) وهناك كمية صغيرة (أو &quot;الكرة&quot;) من ذوبان في الماء الشريط موجة حام (&quot;لاصقة&quot;) يتم جمعها إلى غيض من إبرة التنغستن عن طريق كشط لطيف. (B) ثم تطرق لاصق على gel- سطح الفيلم من أجل جمع bioparticles من الفائدة. bioparticles فردية أو متعددة يمكن جمعها مع الكرة لاصقة واحدة. (C) مرة واحدة وقد تم جمع bioparticles المطلوب، يتم وضع رأس الإبرة إلى مزيج التضخيم في 0.2 مل PCR أنبوب. يقام إبرة في السائل حتى يذوب ويلاحظ إطلاق سراح bioparticles إلى حل. يتم تنفيذ جميع الخطوات في عملية جمع وينظر تحت المجهر لضمان جمع bioparticle ناجحة ونقلها. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52612/52612fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض لار</a>نسخة الالماني من هذا الرقم. <img alt="الشكل (6)" src="/files/ftp_upload/52612/52612fig6.jpg" /> الشكل 6: bioparticles الفردي في عينة طوق القميص تم انتشال Bioparticles باستخدام هلام فيلم من داخل طوق القميص الذي ترتديه إحدى الجهات المانحة الذكور. كانت ملطخة bioparticles باستخدام الأزرق التريبان والصور من عشرين bioparticles الفردية مختلفة تم تحديدها في العينة ترد. في كل صورة، وحلقت في bioparticle التي تم جمعها (الدوائر الحمراء تشير bioparticles التي تم استردادها لمحة، الدوائر السوداء تشير bioparticles التي لم يعثر على الملف الشخصي). ويظهر الانتعاش في المئة أليل (عدد الأليلات لوحظ من الممكن 30) أعلاه صورة bioparticle الذي تم انتشال ملف تعريف. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52612/52612fig6large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a><html><img alt="الرقم 7" src="/files/ftp_upload/52612/52612fig7.jpg" /> الرقم 7: تجمعت bioparticles في عينة طوق القميص تم انتشال Bioparticles باستخدام هلام فيلم من داخل طوق القميص الذي ترتديه إحدى الجهات المانحة الذكور. كانت ملطخة bioparticles باستخدام الأزرق التريبان والصور من عشرين bioparticles تجمعت مختلفة تم تحديدها في العينة ترد. في كل صورة، وحلقت في bioparticle التي تم جمعها (الدوائر الحمراء تشير bioparticles التي تم استردادها لمحة، الدوائر السوداء تشير bioparticles التي لمحة لم يعثر على الانتعاش في المئة أليل (عدد الأليلات لوحظ من الممكن 30). ويظهر لكل bioparticle الذي تم انتشال ملف تعريف. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52612/52612fig7large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> رقيقة الصفحة = &quot;دائما&quot;&gt; <img alt="الرقم 8" src="/files/ftp_upload/52612/52612fig8.jpg" /> الرقم 8: نبذة عن جسمي STR تم الحصول عليها من bioparticle احد من طوق القميص الذكور وتم الحصول على البيانات الشخصية جسمية STR من bioparticle احد (كما هو موضح على اليسار) باستخدام 5 ميكرولتر تحلل المباشر / رد فعل التضخيم. تم تحديد دقة هذا الملف من خلال المقارنة على عينة مرجعية المانحة. خمسة عشر جسمية STR مواضع وأميلوجينين (تحديد الجنس) هم شارك في تضخيم في رد فعل واحد، ومفصولة الكهربائي الشعري. يتم عرض النتائج هنا باعتبارها رحلاني. أرقام أليل هي تسمية أسفل كل الذروة في كل مكان. يمثل محور س حجم جزء (أزواج القواعد، بي بي) والمحور العمودي يمثل كثافة إشارة (RFU وحدات مضان النسبي؛ شريطة تحت كل رقم أليل المقابلة). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52612/52612fig8highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من</a><html> هذا الرقم. <img alt="الرقم 9" src="/files/ftp_upload/52612/52612fig9.jpg" /> الرقم 9: نبذة عن جسمي STR تم الحصول عليها من bioparticle تجمعت من طوق القميص الذكور وتم الحصول على البيانات الشخصية جسمية STR من bioparticle تجمعت (كما هو موضح على اليسار) باستخدام 5 ميكرولتر تحلل المباشر / رد فعل التضخيم. تم تحديد دقة هذا الملف من خلال المقارنة على عينة مرجعية المانحة. خمسة عشر جسمية STR مواضع وأميلوجينين (تحديد الجنس) هم شارك في تضخيم في رد فعل واحد، ومفصولة الكهربائي الشعري. يتم عرض النتائج هنا باعتبارها رحلاني. أرقام أليل هي تسمية أسفل كل الذروة في كل مكان. يمثل محور س حجم جزء (أزواج القواعد، بي بي) والمحور العمودي يمثل كثافة إشارة (RFU وحدات مضان النسبي؛ شريطة تحت كل رقم أليل المقابلة).خريج &quot;الهدف =&quot; _ فارغة &quot;&gt; الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الرقم 10" src="/files/ftp_upload/52612/52612fig10.jpg" /> الشكل 10: مثال لعدم الحصول على لمحة جسمية STR تم الحصول عليها من bioparticle جمع bioparticle الفرد الذي يظهر على اليسار تم جمعها من طوق القميص عينة هلام الفيلم. كما يمكن أن يرى من التشكيل الجانبي STR الناتجة (كما هو موضح على اليمين)، تم الحصول على أليل واحد فقط (من أصل 30 ممكنة). أرقام أليل هي تسمية أسفل كل الذروة في كل مكان. يمثل محور س حجم جزء (أزواج القواعد، بي بي) والمحور العمودي يمثل كثافة إشارة (RFU وحدات مضان النسبي؛ شريطة تحت كل رقم أليل المقابلة). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52612/52612fig10highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Genetic Analysis of Single Human Bioparticles Recovered by Simplified Micromanipulation from Forensic â€˜Touch DNAâ€™ Evidence at JoVE.com

Enhanced Genetic Analysis of Single Human Bioparticles Recovered by Simplified Micromanipulation from Forensic &amp;#8216;Touch DNA&amp;#8217; Evidence

نحن هنا وصف استراتيجية إزالة الأمثل وفعالة لجمع الحيوي الجزيئات الموجودة في &quot;لمس DNA&quot; العينات، جنبا إلى جنب مع بروتوكول التضخيم تعزيز تنطوي على خطوة واحدة 5 ميكرولتر الصغيرة الحجم تحلل / STR التضخيم، للسماح للانتعاش تكرار جنبا إلى جنب قصيرة (STR) لمحات من الجهات المانحة الحيوي الجسيمات (ق).

تحليل الوراثية المحسنة من واحدة Bioparticles الإنسان المستردة من قبل المجهرية المبسطة من الطب الشرعي الأدلة &quot;تاتش DNA&quot;

DNA profiles can be obtained from &#8216;touch DNA&#8217; evidence, which comprises microscopic traces of human biological material. Current methods for ...

enhanced-genetic-analysis-single-human-bioparticles-recovered

Research

JoVE Journal

Biology

Enhanced Genetic Analysis of Single Human Bioparticles Recovered by Simplified Micromanipulation from Forensic &#8216;Touch DNA&#8217; Evidence

15.4K Views.  University of Central Florida.  نحن هنا وصف استراتيجية إزالة الأمثل وفعالة لجمع الحيوي الجزيئات الموجودة في "لمس DNA" العينات، جنبا إلى جنب مع بروتوكول التضخيم تعزيز تنطوي على خطوة واحدة 5 ميكرولتر الصغيرة الحجم تحلل / STR التضخيم، للسماح للانتعاش تكرار جنبا إلى جنب قص?...

Video: Enhanced Genetic Analysis of Single Human Bioparticles Recovered by Simplified Micromanipulation from Forensic &#8216;Touch DNA&#8217; Evidence

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its remarkable neuronal cell plasticity, and its involvement in epilepsy, neurodegenerative diseases, and psychiatric disorders. The hippocampus is composed of distinct regions; the dentate gyrus, which comprises mainly granule neurons, and Ammon's horn, which comprises mainly pyramidal neurons, and the two regions are connected by both anatomic and functional circuits. Many different mRNAs and proteins are selectively expressed in the dentate gyrus, and the dentate gyrus is a site of adult neurogenesis; that is, new neurons are continually generated in the adult dentate gyrus. To investigate mRNA and protein expression specific to the dentate gyrus, laser capture microdissection is often used. This method has some limitations, however, such as the need for special apparatuses and complicated handling procedures. In this video-recorded protocol, we demonstrate a dissection technique for removing the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope. Dentate gyrus samples prepared using this technique are suitable for any assay, including transcriptomic, proteomic, and cell biology analyses. We confirmed that the dissected tissue is dentate gyrus by conducting real-time PCR of dentate gyrus-specific genes, tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO2) and desmoplakin (Dsp), and Ammon's horn enriched genes, Meis-related gene 1b (Mrg1b) and TYRO3 protein tyrosine kinase 3 (Tyro3). The mRNA expressions of TDO2 and Dsp in the dentate gyrus samples were detected at obviously higher levels, whereas Mrg1b and Tyro3 were lower levels, than those in the Ammon's horn samples. To demonstrate the advantage of this method, we performed DNA microarray analysis using samples of whole hippocampus and dentate gyrus. The mRNA expression of TDO2 and Dsp, which are expressed selectively in the dentate gyrus, in the whole hippocampus of alpha-CaMKII+/- mice, exhibited 0.037 and 0.10-fold changes compared to that of wild-type mice, respectively. In the isolated dentate gyrus, however, these expressions exhibited 0.011 and 0.021-fold changes compared to that of wild-type mice, demonstrating that gene expression changes in dentate gyrus can be detected with greater sensitivity. Taken together, this convenient and accurate dissection technique can be reliably used for studies focused on the dentate gyrus.

A dissection technique for removal of the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope was demonstrated in this video-recorded protocol.

تشريح التلفيف المسنن من الحصين ماوس الكبار

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell types exhibit heterogeneous biochemical makeup depending on their physiological conditions and interactions with the environment. Conventional methods of mass spectrometry (MS) used for the analysis of biomolecules in single cells rely on extensive sample preparation. Removing the cells from their natural environment and extensive sample processing could lead to changes in the cellular composition. Ambient ionization methods enable the analysis of samples in their native environment and without extensive sample preparation.1 The techniques based on the mid infrared (mid-IR) laser ablation of biological materials at 2.94 &mu;m wavelength utilize the sudden excitation of water that results in phase explosion.2 Ambient ionization techniques based on mid-IR laser radiation, such as laser ablation electrospray ionization (LAESI) and atmospheric pressure infrared matrix-assisted laser desorption ionization (AP IR-MALDI), have successfully demonstrated the ability to directly analyze water-rich tissues and biofluids at atmospheric pressure.3-11 In LAESI the mid-IR laser ablation plume that mostly consists of neutral particulate matter from the sample coalesces with highly charged electrospray droplets to produce ions. Recently, mid-IR ablation of single cells was performed by delivering the mid-IR radiation through an etched fiber. The plume generated from this ablation was postionized by an electrospray enabling the analysis of diverse metabolites in single cells by LAESI-MS.12 This article describes the detailed protocol for single cell analysis using LAESI-MS. The presented video demonstrates the analysis of a single epidermal cell from the skin of an Allium cepa bulb. The schematic of the system is shown in Figure 1. A representative example of single cell ablation and a LAESI mass spectrum from the cell are provided in Figure 2.

Single cell analysis is performed by mass spectrometry on plant and animal cells at atmospheric pressure by using a sharpened optical fiber to sample the cells for laser ablation electrospray ionization (LAESI) mass spectrometry.

التحليل المباشر للخلايا واحدة بواسطة الطيف الكتلي في الضغط الجوي

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been understood at molecular level. One of the mechanisms mediating the effect of DNA variants on phenotypes is gene expression, which has been shown to be particularly relevant for complex traits1.
This method tests in a cellular context the effect of specific DNA sequences on gene expression. The principle is to measure the relative abundance of transcripts arising from the two alleles of a gene, analysing cells which carry one copy of the DNA sequences associated with disease (the risk variants)2,3. Therefore, the cells used for this method should meet two fundamental genotypic requirements: they have to be heterozygous both for DNA risk variants and for DNA markers, typically coding polymorphisms, which can distinguish transcripts based on their chromosomal origin (Figure 1). DNA risk variants and DNA markers do not need to have the same allele frequency but the phase (haplotypic) relationship of the genetic markers needs to be understood. It is also important to choose cell types which express the gene of interest. This protocol refers specifically to the procedure adopted to extract nucleic acids from fibroblasts but the method is equally applicable to other cells types including primary cells.
DNA and RNA are extracted from the selected cell lines and cDNA is generated. DNA and cDNA are analysed with a primer extension assay, designed to target the coding DNA markers4. The primer extension assay is carried out using the MassARRAY (Sequenom)5 platform according to the manufacturer's specifications. Primer extension products are then analysed by matrix-assisted laser desorption/ionization time of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS). Because the selected markers are heterozygous they will generate two peaks on the MS profiles. The area of each peak is proportional to the transcript abundance and can be measured with a function of the MassARRAY Typer software to generate an allelic ratio (allele 1: allele 2) calculation. The allelic ratio obtained for cDNA is normalized using that measured from genomic DNA, where the allelic ratio is expected to be 1:1 to correct for technical artifacts. Markers with a normalised allelic ratio significantly different to 1 indicate that the amount of transcript generated from the two chromosomes in the same cell is different, suggesting that the DNA variants associated with the phenotype have an effect on gene expression. Experimental controls should be used to confirm the results.

Genetic associations often remain unexplained at a functional level. This method aims to assess the effect of phenotype-associated genetic markers on gene expression by analyzing cells heterozygous for transcribed SNPs. The technology allows accurate measurement by MALDI-TOF mass spectrometry to quantify allele-specific primer extension products.

الأليل محددة التعبير الجيني الفحص لفحص الأسس الفنية للجمعيات الوراثية

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

Transduction of Human Cells with Polymer-complexed Ecotropic Lentivirus for Enhanced Biosafety

Stem and tumor cell biology studies often require viral transduction of human cells with known or suspected oncogenes, raising major safety issues for laboratory personnel. Pantropic lentiviruses, such as the commonly used VSV-G pseudotype, are a valuable tool for studying gene function because they can transduce many cell types, including non-dividing cells. However, researchers may wish to avoid production and centrifugation of pantropic viruses encoding oncogenes due to higher biosafety level handling requirements and safety issues. Several potent oncogenes, including c-Myc and SV40 large T antigen, are known to enhance production of induced pluripotent stem cells (iPSC). All other known iPSC-inducing genetic changes (OCT4, SOX2, KLF4, NANOG, LIN28, and p53 loss of function) also have links to cancer, making them of relatively high safety concern as well. 
While these cancer-related viruses are useful in studying cellular reprogramming and pluripotency, they must be used safely. To address these biosafety issues, we demonstrate a method for transduction of human cells with ecotropic lentivirus, with additional emphasis on reduced cost and convenient handling. We have produced ecotropic lentivirus with sufficiently high titer to transduce greater than 90% of receptor-expressing human cells exposed to the virus, validating the efficacy of this approach. 
Lentivirus is often concentrated by ultracentrifugation; however, this process takes several hours and can produce aerosols infectious to human biomedical researchers. As an alternative, viral particles can be more safely sedimented onto cells by complexation with chondroitin sulfate and polybrene (CS/PB). This technique increases the functional viral titer up to 3-fold in cells stably expressing murine retrovirus receptor, with negligible added time and cost. Transduction of human dermal fibroblasts (HDFs) is maximally enhanced using CS/PB concentrations approximately 4-fold lower than the optimal value previously reported for cancer cell lines, suggesting that polymer concentration should be titrated for the target cell type of interest. We therefore describe the use of methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT) to assay for polymer toxicity in a new cell type. We observe equivalent viability of HDFs after viral transduction using either polymer complexation or the standard dose of polybrene (PB, 6 &mu;g/ml), indicating minimal acute toxicity.
In this protocol, we describe the use of ecotropic lentivirus for overexpression of oncogenes in human cells, reducing biosafety risks and increasing the transduction rate. We also demonstrate the use of polymer complexation to enhance transduction while avoiding aerosol-forming centrifugation of viral particles.

Lentiviruses are a valuable research tool for exploring gene function; however, researchers may wish to avoid production of pantropic lentivirus encoding known or suspected oncogenes. As an alternative, we present a safer protocol for use of ecotropic lentivirus on human cells modified to express the ecotropic receptor mSlc7a1.

تنبيغ من خلايا الإنسان مع البوليمر المعقد Ecotropic الفيروسة البطيئة للسلامة الأحيائية المحسن

Stem and tumor cell biology studies often require viral transduction of human cells with known or suspected oncogenes, raising major safety issues for ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

الكيمياء الحيوية والعليا تقييم مجهرية مرت من كتلة الدهون في<em&gt; Caenorhabditis ايليجانس</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is essential first to generate functional human cardiomyocytes (CMs). The use of these cells in drug discovery and toxicology studies would also be highly beneficial, allowing new pharmacological molecules for the treatment of cardiac disorders to be validated pre-clinically on cells of human origin. Of the possible sources of CMs, induced pluripotent stem (iPS) cells are among the most promising, as they can be derived directly from readily accessible patient tissue and possess an intrinsic capacity to give rise to all cell types of the body 1. Several methods have been proposed for differentiating iPS cells into CMs, ranging from the classical embryoid bodies (EBs) aggregation approach to chemically defined protocols 2,3. In this article we propose an EBs-based protocol and show how this method can be employed to efficiently generate functional CM-like cells from feeder-free iPS cells.

Pluripotent stem cells, either embryonic or induced pluripotent stem (iPS) cells, constitute a valuable source of human differentiated cells, including cardiomyocytes. Here, we will focus on cardiac induction of iPS cells, showing how to use them to obtain functional human cardiomyocytes through an embryoid bodies-based protocol.

جيل من العضلية الإنسان: البروتوكول التمايز من خالية من الطاعم المستحثة الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Detecting Somatic Genetic Alterations in Tumor Specimens by Exon Capture and Massively Parallel Sequencing

Efforts to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The establishment of high-throughput, massively parallel "next-generation" sequencing has aided the discovery of many such mutations. To enhance the clinical and translational utility of this technology, platforms must be high-throughput, cost-effective, and compatible with formalin-fixed paraffin embedded (FFPE) tissue samples that may yield small amounts of degraded or damaged DNA. Here, we describe the preparation of barcoded and multiplexed DNA libraries followed by hybridization-based capture of targeted exons for the detection of cancer-associated mutations in fresh frozen and FFPE tumors by massively parallel sequencing. This method enables the identification of sequence mutations, copy number alterations, and select structural rearrangements involving all targeted genes. Targeted exon sequencing offers the benefits of high throughput, low cost, and deep sequence coverage, thus conferring high sensitivity for detecting low frequency mutations.

We describe the preparation of barcoded DNA libraries and subsequent hybridization-based exon capture for detection of key cancer-associated mutations in clinical tumor specimens by massively parallel "next generation" sequencing. Targeted exon sequencing offers the benefits of high throughput, low cost, and deep sequence coverage, thus yielding high sensitivity for detecting low frequency mutations.

الكشف عن التعديلات الوراثية الجسدية في عينات الورم عن طريق التقاط اكسون وتسلسلها الموازي واسع

Efforts  to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to  facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

الثقافات البديلة لافرة القوة البشرية الجذعية إنتاج الخلية، الصيانة، والتحليل الوراثي

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

برازي تحليل جلايكورتيكود: رصد الغدة الكظرية غير الغازية في الخيليات

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the invasion of non-indigenous species. However, an exact identification of field predator-prey interactions is difficult in many cases. These analyses are often based on a visual evaluation of gut content or the analysis of stable isotope ratios (&#948;15N and &#948;13C). Such methods require comprehensive knowledge about, respectively, morphologic diversity or isotopic signature from individual prey organisms, leading to obstacles in the exact identification of prey organisms. Visual gut content analyses especially underestimate soft bodied prey organisms, because maceration, ingestion and digestion of prey organisms make identification of specific species difficult. Hence, polymerase chain reaction (PCR) based strategies, for example the use of group-specific primer sets, provide a powerful tool for the investigation of food web interactions. Here, we describe detailed protocols to investigate the gut contents of macroinvertebrate consumers from the field using group-specific primer sets for nuclear ribosomal deoxyribonucleic acid (rDNA). DNA can be extracted either from whole specimens (in the case of small taxa) or out of gut contents of specimens collected in the field. Presence and functional efficiency of the DNA templates need to be confirmed directly from the tested individual using universal primer sets targeting the respective subunit of DNA. We also demonstrate that consumed prey can be determined further down to species level via PCR with unmodified group-specific primers combined with subsequent single strand conformation polymorphism (SSCP) analyses using polyacrylamide gels. Furthermore, we show that the use of different fluorescent dyes as labels enables parallel screening for DNA fragments of different prey groups from multiple gut content samples via automated fragment analysis.

Most common gut content analyses of macroinvertebrates are visual. Requiring intense knowledge about morphological diversity of prey organisms, they miss soft bodied prey and, due to strong comminution of prey, are nearly impossible for some organisms, including amphipods. We provide detailed, novel genetic approaches for macroinvertebrate prey identification in the diet of amphipods.

بروتوكول مختبر لتحليل محتوى الأمعاء الوراثية ماكروينفيرتيبراتيس المائية استخدام مجموعة محددة المتاشب كبسولة تفجير

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...