The authors would also like to thank all participants who donated samples for this work. This work was funded by the Office of Justice Program, National Institute of Justice, Department of Justice under award number 2010-DN-BX-K139. The funding agencies had no involvement in the study design, in collection, analysis and interpretation of data, or in the writing of the report. Points of view in this document are those of the authors and do not necessarily represent the official positions of the U.S. Department of Justice.

NOTA: Os fluidos corporais foram coletadas de voluntários usando procedimentos aprovados pela University of Institutional Review Board da Flórida Central. Consentimento escrito informado foi obtido a partir de cada dador. 1. Recolha de biopartículas de objetos e superfícies tocadas <ol><li> Cortar o filme-gel para o tamanho desejado. Assegurar que é o tamanho apropriado para a lâmina de vidro a ser usado como suporte sólido. Por exemplo, para um &quot;x 1&quot; lâmina de vidro 3, usar um tamanho de gel de película de 2 &quot;x 0,75&quot;. NOTA: O comprimento e a largura do material pode ser reduzido, se desejado, mas não deverá exceder esse tamanho. </li><li> Retire a parte branca do filme-gel e anexar o filme-gel para a lâmina de microscópio (Figura 1A). Pressione firmemente para garantir um anexo completo. NOTA: Não é uma camada superior de protecção evidente que não deve ser removido para permitir que a pressão a ser aplicada ao longo do pedaço de gel-film sem contaminar a superfície de gel de película. Lâminas preparadas gel por película (com camada protetora em anexo) podem ser armazenados à temperatura ambiente até ser necessário. </li><li> Remover a película transparente top de proteção do filme-gel, usando uma pinça estéreis quando estiver pronto para usar (Figura 1B), a amostra gel-film. Coloque a superfície de película de gel em contacto directo com o objecto desejado tocado ou superfície (Figura 2). Aplicar uma pequena quantidade de pressão para assegurar uma transferência eficiente de bio-partículas para o filme de gel. NOTA: Se muita pressão é aplicada, a lâmina de vidro pode quebrar. NOTA: Várias amostras do mesmo objecto ou superfície podem ser recolhidos para o mesmo pedaço de gel de película. </li><li> Confirmar a transferência de partículas bio-película sobre o gel (figura 3), colocando a lâmina num estereomicroscópio (trans- ou epi-iluminação pode ser utilizado). Use ampliação de 20X ~ Para uma melhor visualização áreas maiores do-filme gel, e ampliação de ~ 200X para melhor vibio-ewing partículas individuais. </li><li> Armazenar as lâminas de amostra de gel de película à temperatura ambiente numa caixa coberta de slides ou usar imediatamente para a coloração e / ou recolha de bio-partícula. </li></ol> 2. Coloração opcional de biopartículas para ajudar na visualização <ol><li> Colocar a lâmina de amostra de gel de película preparada no Passo 1 para um suporte de lâminas mancha sobre uma pia. </li><li> Usando uma pipeta de transferência descartável, cobrir a superfície do gel de película inteira com mancha azul de tripano (Figura 4A). Incubar à temperatura ambiente durante 1-2 min. </li><li> Retire o excesso de mancha inclinando a lâmina para permitir que a mancha para escorrer na pia (Figura 4B). NOTA: O slide pode ser lavado por inundações suave com água estéril usando uma pipeta de transferência descartável, se necessário (Figura 4C). </li><li> Permitir que o slide para o ar seco antes de prosseguir para o isolamento de bio-partículas. Veja o slide usando um microscópio estereoscópico (~ 20X para a visão global e ~ 200-300X para vIEW biopartículas individuais) para assegurar a coloração adequada (Figura 4D-E). NOTA: A lâmina pode ser armazenado em temperatura ambiente em uma caixa de slides coberto. </li></ol> 3. Isolamento de biopartículas de interesse para análise <ol><li> Inserir o número apropriado de 0,2 ml em tubos de PCR uma cremalheira e rotular os tubos apropriadamente. </li><li> Prepare a mistura de amplificação STR (ver lista de materiais) em uma capa designado amplificação PCR ou gabinete de biossegurança. Vortex da mistura principal bem e centrifugar brevemente em um mini-centrífuga. <ol><li> O volume de mistura de amplificação necessária por amostra é de 3,5 l; preparar um volume adequado de mistura principal para o número de amostras desejado. </li></ol></li><li> Pipet 3,5 ul de mistura de amplificação em cada tubo de 0,2 ml. Tampe cada tubo vagamente. </li><li> Coloque um pedaço de fita dupla vara em uma lâmina de vidro limpa ou diretamente em um bloco de vidro. NOTA: Este será usado para segurar oTubo de 0,2 ml no local durante a coleta de amostras. </li><li> Coloque um pedaço de fita dupla vara em uma lâmina de vidro limpo. Coloque um pedaço de fita de onda de solda solúvel em água na parte superior da fita de dupla face. NOTA: Este diapositivo pode ser armazenado num exsicador para uso futuro. </li><li> Coloque o primeiro tubo de 0,2 ml para o slide duplo tape vara ou bloco preparada no passo 3.4. Definir este tubo de lado até que a amostra é coletada. </li><li> Coloque a fita de solda por onda de slides solúvel em água sob o microscópio (baixa ampliação). Com a ponta de uma agulha de tungsténio, raspe a superfície da fita, a fim de recolher uma pequena quantidade (ou &quot;bola&quot;) de adesivo na extremidade da agulha (Figura 5A). NOTA: O tamanho da bola pode ser feita pequena ou grande, dependendo do número de biopartículas que serão recolhidos. </li><li> Cuidadosamente remover a agulha de tungsténio com adesivo sob o microscópio, sem perturbar a ponta da agulha. A agulha podeser realizada em um rack, se desejar durante a colocação da amostra. </li><li> Colocar a amostra de película de gel preparado (a partir de Passos 1 e 2) na platina do microscópio. Ajuste o foco e ampliação, até que as partículas biológicas podem ser facilmente visualizados. Identificar os bio-partículas que serão recolhidos. NOTA: Um bloco de vidro pode ser utilizado para suportar a lâmina se necessário. </li><li> Recuperar a agulha de tungstênio com bola adesivo e colocar a agulha sobre a superfície gel de filme onde os bio-partículas de interesse estão localizados. Pressionar a ponta da agulha (com adesivo) para baixo de modo que ele se encontra em contacto com o bio-partícula (Figura 5B). Levantar a agulha para cima para assegurar que a bio-partícula foi recolhido. Repita este processo até que tenha sido recolhido o número desejado de bio-partículas. </li><li> Colocar o preparado de 0,2 ml tubo de PCR na platina do microscópio. Regule a ampliação de modo que o fundo do tubo contendo a mistura de amplificação está em foco. </li><li> Com cuidado, insira o needl tungstêniode e para o tubo de PCR de 0,2 ml, até a ponta da agulha se encontra na mistura de amplificação. NOTA: Este é melhor executada durante a visualização através do microscópio. </li><li> Segurar a agulha na mistura de amplificação até dissolver o adesivo e as biopartículas são libertados em solução (Figura 5C). Retire a agulha, coloque os 0,2 ml na posição vertical e vagamente tampar o tubo. </li><li> Repita o procedimento de coleta de amostras adicionais. Limpe a agulha de tungstênio com álcool pré-umedecido (isopropanol) toalhetes entre amostras. </li></ol> 4. Combinada Microvolume Ácido Nucleico Isolation (Lise Direto) e autossômica Curto Tandem Repeat (STR) Profiling <ol><li> Prepare o tampão de lise (ver Materiais) em uma capa designado amplificação PCR ou gabinete de biossegurança. Adicionar 1,5 uL de tampão de lise a cada tubo para um volume total de reacção de 5 ul. Fechar tampas tubo bem. NOTA: Os 0,2 ml tubos já contêm 3,5 mL damix de amplificação ea coleção bio-partículas de Passo 3. </li><li> Colocar as amostras do termociclador e amplificar as amostras utilizando as seguintes condições de ciclo: 75 ° C durante 15 min; 95 ° C durante 11 min; 34 ciclos de 94 ° C durante 20 seg e 59 ° C durante 3 min; 60 ° C durante 10 min; e 4 ° C espera. <ol><li> Produtos de amplificação armazenar a 4 ° C para armazenagem de curta duração. </li></ol></li></ol> 5. Detecção de Produto - Eletroforese Capilar (CE) <ol><li> Em uma placa de 96 poços, adicione 10 ml de mistura CE running (9,7 ul formamida deionizada e tamanho 0,3 ul padrão, ver Materiais). Adicionar 1 ml de produto amplificado ou escada alélica para cada poço. CUIDADO: Formamide é um potencial mutagênico e deve ser tratado em uma capa química enquanto usava equipamentos de proteção individual adequados. </li><li> Use condições eletroforéticas especificados pelo fabricante no manual do kit de amplificação ou internally condições validado. </li><li> Analisar dados brutos com software de análise de STR. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Aqui descrevemos métodos para a recolha e análise genética melhorada do biopartículas recuperados a partir de provas de DNA touch. A abordagem desenvolvida envolve o seguinte: 1) coleta de material biológico (ou seja, biopartículas) via gel de filme a partir de objetos e superfícies tocadas, itens de vestuário usado ou pele humana direta, 2) o exame microscópico do material biológico recuperado para assegurar a cobrança do potencial de material biológico humano, e 3) micromanipulação de partículas biológicas únicas ou poucos utilizando um adesivo solúvel em água, e 4) de perfis de ADN autosomal-STR de biopartículas recolhidos utilizando um microvolume (5 ul) de um passo de lise / reacção de amplificação. A utilização de um único passo de reacção tubo fechado reduz o potencial para a contaminação da amostra e perda de manipulações adicionais ou de amostras de transferência para outros tubos de reacção. O reforçada microvolume de uma etapa (5 ul) lise / reações de amplificação STR permite a recuperação de todo ou probative STR perfis do doador de biopartículas única ou poucas. Esta abordagem foi desenvolvida para obter perfis fonte STR ​​únicos de provas de DNA toque único e multi-fonte (por exemplo, itens usados ​​de vestuário e outros artigos para o lar, tocou / objetos manipulados e superfícies, misturas pele / pele). Tem sido utilizado com sucesso para a detecção do dador macho em amostras da mistura de agressão físicos simulados. Esta abordagem poderia ser melhor avaliadas em cenários adicionais mistura fluido corporal / tecido tais como vítima risca sua / seu agressor, em que apenas alguns biopartículas do assaltante estaria presente entre uma enorme quantidade de material biológico da vítima. Além disso, uma vez que esta abordagem desenvolvida no presente estudo permite a análise ao nível biopartícula único, poderia ser usada para obter uma melhor compreensão da natureza e extensão da transferência secundário 14-19, em que um intermediário transfere um perfil de ADN sobre uma supce, objeto ou pessoa a outra superfície do objeto ou pessoa 20. Uma abordagem cega-enxugamento para a análise de transferência secundário pode não conseguir identificar pequenas quantidades de material a partir do dador secundário. A abordagem aqui desenvolvido permite a análise de partículas biológicas únicas ou poucos e, por conseguinte, os resultados não são confundidos pela presença de uma enorme quantidade de material biológico a partir do dador primário. As metodologias desenvolvidas neste trabalho também pode ter implicações para a análise de vestígios de material biológico em casos de violência sexual, como os que envolvem a penetração digital da vagina, onde identificação positiva de vestígios de células da pele do agressor pode ser crucial para estabelecer que o contato sexual ocorreu. Enquanto a coleção de biopartículas de amostra gel-filme não envolve manipulações difíceis e complexas, há passos críticos neste processo que precisam ser realizadas com muito cuidado para garantir a successful transferência de biopartículas para o vaso de reacção a jusante. A recolha de partículas biológicas com o adesivo solúvel em água tem de ser visto ao microscópio (isto é, estereomicroscópio com a ampliação elevada (~ 200-300X) para assegurar que apenas as partículas biológicas de interesse são recolhidas. Dependendo do tamanho do adesivo &quot;bola&quot; utilizada, há é o potencial para recolher o material circundante adicional que pode incluir tanto material biológico e não-biológico (por exemplo, fibras, outros detritos). A recolha de partículas biológicas adicionais indesejadas pode resultar na recuperação de perfis de ADN misturados. A recolha do material não biológico podem introduzir inibidores para a lise micro-volume / reações STR. Se vários biopartículas são coletados com o mesmo adesivo &quot;bola&quot;, há um potencial para biopartículas coletados anteriormente para se tornar desapegado do adesivo. Isso não é muito freqüente, mas pode ocorrer quando um número maior de bioparticles são coletados (por exemplo, mais de 50) com um único adesivo &quot;bola&quot;. Se um grande número de partículas biológicas são segmentados, recomenda-se que vários conjuntos de menos biopartículas são feitas, mas tudo transferido para o mesmo tubo de 0,2 ml. Uma vez biopartículas foram recolhidos, deve ser tomado cuidado durante a remoção da lâmina de película de gel a partir da fase de microscópio e o posicionamento do tubo de 0,2 ml, de modo que a ponta da agulha não é perturbado. Durante a colocação da ponta da agulha no interior da mistura de amplificação, na parte inferior do tubo de 0,2 ml, a ponta da agulha não deve entrar em contacto com os lados do tubo, a fim de evitar perda de material nos lados do tubo. Enquanto a solubilização do adesivo é tipicamente rápida (~ 30 segundos ou menos, dependendo do tamanho do adesivo &quot;bola&quot;) e pode monitorizados durante o exame microscópico, a ponta da agulha deve ser lentamente removido da mistura de amplificação para assegurar que completa solubilizaçãode o adesivo ter sido alcançada. Se o adesivo não se ter dissolvido completamente, a agulha pode ser devolvido para o líquido para permitir a dissolução completa. Os protocolos descritos aqui foram otimizados para uso com biopartículas e células humanas a partir de evidências biológicas forense. O tampão de lise seleccionado é compatível com o kit de amplificação de ADN-STR seleccionado. Embora possa haver tampões de lise alternativos adequados, a sua eficiência em termos de lise celular e de compatibilidade com a análise a jusante deve ser verificada pelo utilizador. Além disso, o número de kit de amplificação STR e ciclo de amplificação descrito neste protocolo ter sido otimizado para uso com biopartículas única ou poucas. Um estojo de amplificação de STR próxima geração, com elevada sensibilidade e robustez relatado foi seleccionado e foi demonstrado para resultar na recuperação de perfis de alta qualidade a partir de STR biopartículas únicas ou poucos. Enquanto vários outros kits STR, com variados amplifi recomendadonúmeros ciclo de cátions, estão disponíveis, eles não podem possuir sensibilidade adequada e, portanto, teria de ser devidamente avaliado antes da utilização nestes protocolos. Apesar do sucesso do uso de métodos descritos para os perfis de recuperação STR de biopartículas única ou poucas, a taxa de sucesso de recuperação de perfil não será de 100%. Portanto, para algumas amostras pode ser observado um perfil de DNA parcial limitado ou nenhum perfil. Isto não pode ser evitado, devido à incapacidade para identificar conclusivamente a maioria das biopartículas visualmente como material celular, o estado de degradação potencial do material nuclear em biopartículas ou perda de material da amostra a partir do adesivo recolhidos antes da transferência para o recipiente de reacção. Portanto, a análise de uma amostra única biopartícula para cada item de ADN toque não é recomendado. Nós freqüentemente coletar 20 conjuntos de amostras de uma amostra de gel-film individual e irá recolher conjuntos de amostras adicionais, conforme necessário, se um perfil STR adequado não é obtido. Tele única limitação para colecções é a quantidade de material biológico presente na amostra de gel de filme (e provavelmente o custo de análise, embora as reacções microvolume proporcionar a oportunidade de recolher amostras adicionais para um custo semelhante ou inferior, como um único volume de reacção padrão ( por exemplo, 25 ul). Os métodos de identificação de DNA desenvolvidos descrever aqui fornecer uma abordagem molecular para a caracterização, análise e interpretação de material biológico trace recuperado de amostras de DNA de toque. No entanto, não há informações suplementares genético que pode ser obtido a partir de biopartículas recuperados em adição à determinação do doador (isto é, o perfil de STR) do dador do material biológico. A fonte de fluido de tecido ou órgão de origem (por exemplo, a pele contra saliva) pode fornecer informações cruciais contextual a uma investigação criminal. Sem essa determinação, a ambiguidade da fonte de tecido de origem pode ser Exploitada circunstâncias como alternativas do crime (por exemplo, como o fluido corporal pode ter sido depositada) pode ser sugerido. Os biopartícula recolha e isolamento de protocolos descritos aqui pode ser utilizado para recolher partículas biológicas ou outras células (por exemplo, bucal, vaginal) para utilização num tecido de identificação de fonte (ARNm de perfilamento 21-30) estratégia que envolve micro-volume de transcrição reversa (RT) e As reacções de amplificação. Com maior otimização também pode ser possível desenvolver uma estratégia de DNA / RNA co-isolamento para permitir a identificação do tipo de célula (RNA) e STR profiling da mesma amostra, incluindo biopartículas de provas de DNA touch.

DNA O toque é uma forma de traço evidência biológica que é a transferência direta de material celular (por exemplo, lançar as células da pele) de um indivíduo a um objeto ou outro indivíduo durante o contato físico 1. A capacidade de obter perfis de ADN a partir de uma variedade de objetos tocados (documentos, roupas de cama, sapatos, armas de fogo, recipientes de bebida, canetas, pasta alças) tem sido relatado na literatura 2-9. Um fator crítico na análise das provas de DNA de toque é a recuperação bem sucedida do traço material biológico presente. Toque provas de DNA é normalmente recolhida por raspagem da área suspeita com uma mecha de algodão estéril (referido como &quot;cega-enxugamento&quot;). Usando esta abordagem, a natureza do material biológico recolhido não é conhecido e a amostragem de uma área generalizada é realizada. A presença de sulcos superficiais ou fendas podem impedir a recuperação bem-sucedida do muitas vezes já pequena quantidade de biological presente material. Além disso, uma abordagem de &quot;blind-swabbing&quot; vontade material celular necessariamente co-amostra dos diferentes indivíduos cujas células estão presentes no item, mesmo que as células dos indivíduos estão localizados em locais espacialmente distintos sobre o item. A recuperação de perfis de ADN miscigenadas, que são muitas vezes difíceis de resolver particularmente com amostras de DNA de baixo do modelo, é frequentemente observada 8,10,11 e em muitos casos será um artefato consequente do processo de enxugamento si. Se apenas uma pequena quantidade de material estava presente a partir de um dos doadores, técnicas de extracção e de análise padrão pode falhar para recuperar um perfil a partir do menor contribuidor. Além disso, o tipo de zaragatoa ou se foi utilizada a seco ou molhado (pré-humedecidos com água estéril) podem influenciar a quantidade de material biológico que é recolhida, devido a diferenças em absortividade e adsorção e a eficiência de libertação do material biológico 12. Smétodos de extração tandard pode resultar em perda de amostra adicional devido à manipulação física exigida dos passos de exemplo ou de transferência de amostra. Como descrito acima, as técnicas de esfregar simples para a recuperação de material biológico pode resultar na perda de quantidades vestigiais de amostra biológica, bem como um aumento da ocorrência de perfis misturados devido a uma falha para separar os componentes biológicos individuais. Assim, buscou-se desenvolver estratégias de recuperação mais seletivos e eficientes para a coleção de micropartículas celulares presentes em objetos tocados. A estratégia desenvolvida para a análise de material biológico a partir de provas de DNA toque (referido aqui como &quot;biopartículas&quot;, devido ao facto de um núcleo não é sempre visível uma vez que a maioria das células presentes na camada epidérmica mais externa da pele são mortos ou moribundos queratinócitos 13) envolve o seguinte: 1) recolha de material biológico (isto é, biopartículas) através de gel de fr-películaom tocou objetos e superfícies, itens de vestuário gastas ou pele humana direta, 2) o exame microscópico do material biológico recuperado para assegurar a cobrança do potencial de material biológico humano, e 3) de micromanipulação de bio-partículas única ou poucas usando um adesivo solúvel em água, e 4) autossômica perfis de ADN-STR dos bio-partículas coletadas usando um microvolume (5 mL) de uma etapa de lise / reacção de amplificação. Este procedimento oferece inúmeras vantagens sobre os métodos de análise utilizados tradicionalmente. Recuperação de partículas biológicas utilizando o filme de gel permite um exame microscópico do material biológico presente na amostra antes da análise. Embora a maioria das biopartículas recuperados a partir de provas de DNA toque pode não ser células nucleadas tornando-o mais difícil de determinar qual ou quantas bio-partículas deve ser seleccionado, o exame microscópico das amostras antes da análise proporciona a oportunidade para procurar as células nucleadas assim maximizing a probabilidade de recuperação de perfis de ADN. A coleção de biopartículas usando micromanipulação assistida-adesivo solúvel em água permite a transferência direta de biopartículas alvo em tubos de reacção. Este procedimento é visualizado sob o microscópio para garantir o sucesso da transferência de material biológico. A reação reduzida ou microvolume aumenta a sensibilidade e reduzindo o custo de análise por amostra. Isto permite a análise do aumento do número de amostras a partir de uma peça individual de provas. Devido à gama no estado genético de bio-partículas em provas de DNA toque, várias amostragens de itens individuais são recomendados. Aqui, vamos demonstrar o uso bem sucedido dos protocolos desenvolvidos para obter perfis genéticos altamente probatório dos doadores de material biológico em provas de DNA touch. A coleção biopartícula desenvolvido e métodos de criação de perfil de ADN fornecer uma abrangente &#39;inteligente&#39; (ou seja, específicos, mensuráveis, attaabordagem baseada inable, realista e oportuno) molecular para a caracterização, análise e interpretação de material biológico de rastreamento. Embora originalmente desenvolvido para aplicação para análise forense de provas de DNA de toque, as estratégias desenvolvidas aqui pode ser aplicado a outras fontes de material biológico e oferecer uma oportunidade para se obter informação de identificação pessoal ao nível da célula individual.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="998">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:147px;">Company</td>
			<td style="width:139px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:320px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:395px;">SealRite 1.5 mL natural microcentrifuge tubes, sterile</td>
			<td style="width:147px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:139px;">1615-5510</td>
			<td style="width:320px;">numerous altnerative suppliers are available, but tubes should be sterile</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">0.2 mL PCR tubes with flat cap, natural</td>
			<td style="width:147px;">Phenix Research</td>
			<td style="width:139px;">MPX-200F</td>
			<td style="width:320px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:395px;">Kimwipes</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">06-666 and/or 06-666-11C</td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:395px;">Alcohol prep pads</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">06-669-62</td>
			<td style="width:320px;">alternative is 06-665-24 (Fisher Sci); canister of larger alcohol wipes rather than individual pads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Sterile water</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:320px;">18.2 mega-ohm, autoclaved</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Glass microscope slides, frosted, 3&#34; x 1&#34;: 1mm</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">12-544-3</td>
			<td style="width:320px;">alternative brands or sizes are acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Disposable transfer pipet</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">13-711-9D</td>
			<td style="width:320px;">alternatives are acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Trypan blue solution</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">T8154</td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Pipets: 0.2-2, 2-20, 10-100, 100-1,1000 mL</td>
			<td style="width:147px;">various</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Sterile, aerosol-resistant pipet tips</td>
			<td style="width:147px;">various</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Mini-centrifuge</td>
			<td style="width:147px;">various</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:395px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:147px;">Leica</td>
			<td style="width:139px;">M205C</td>
			<td style="width:320px;">others are suitable, but must be capable of magifications up to 350X</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:395px;">GeneAmp PCR system 9700 thermal cycle (silver or gold block)</td>
			<td style="width:147px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:139px;">N8050200 or 4314878</td>
			<td style="width:320px;">other models and manufacturers can be used, but performance with the STR amplification kit must be verified</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:395px;">3130 Genetic Analyzer</td>
			<td style="width:147px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:139px;">3130-01</td>
			<td style="width:320px;">Alternatives: 310 or 3500 Genetic Aanlyzers (Life Technologies)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:395px;">GeneMapper software</td>
			<td style="width:147px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:139px;">various</td>
			<td style="width:320px;">Various versions of the software are available and can be used</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:395px;">WF Gel-Film , x8 retention level</td>
			<td style="width:147px;">Gel-Pak</td>
			<td style="width:139px;">WF-40-x8-A</td>
			<td style="width:320px;">4&#34; x 4&#34; wafer film; can be ordered in other size specifications</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Double sided tape</td>
			<td style="width:147px;">various</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:395px;">Glass block, 3&#34; x 1.5&#34; x 3/8&#34;</td>
			<td style="width:147px;">McCrone Microscopes and Accessories</td>
			<td style="width:139px;">370-2</td>
			<td style="width:320px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:395px;">Tungsten needle with holder</td>
			<td style="width:147px;">McCrone Microscopes and Accessories</td>
			<td style="width:139px;">106</td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">3M&#160; water soluble wave solder tape, 5414 transparent</td>
			<td style="width:147px;">Allied Electronics</td>
			<td style="width:139px;">70113977</td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:395px;">Lysis buffer (forensicGEM Saliva, Zygem)</td>
			<td style="width:147px;">VWR</td>
			<td style="width:139px;">95043-992</td>
			<td style="width:320px;">Lysis buffer is prepared in 10 ml portions (prepare additional master mix portions as needed to accommodate the desired number of samples). 1.5 ml is used for each sample. To prepare 10 ml of lysis buffer (sufficient for ~6 samples): 6.9 mL sterile water, 2.1 mL 10x buffer - blue, 1 mL forensicGEM.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="210">
			<td height="210" style="height:210px;width:395px;">STR Amplification kit, AmpFlSTR Identifiler Plus PCR amplification kit</td>
			<td style="width:147px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:139px;">4427368</td>
			<td style="width:320px;">Alternative STR amplification kits can be used, but performance would have to be verified by user. The amplification mix is prepared as follows (volumes per sample): 2.2 ml PCR reaction mix, 1.1 ml Primer set, 0.2 ml (1U) AmpliTaq Gold DNA polymerase. A master mix sufficient for the desired number of samples should be prepared. 3.5 ml of the prepared mix is added to the 0.2 mL tube for bio-particle collection.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">AmpliTaq Gold DNA polymerase</td>
			<td style="width:147px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:139px;">N808-0245</td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">HiDi formamide</td>
			<td style="width:147px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:139px;">4311320</td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">GeneScan 500 LIZ size standard</td>
			<td style="width:147px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:139px;">4322682</td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">96 well optical reaction plates</td>
			<td style="width:147px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:139px;">N8010560</td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Plate septa, 96 well</td>
			<td style="width:147px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:139px;">4315933</td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:395px;">Performance-optimized polymer, POP-7</td>
			<td style="width:147px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:139px;">4363785</td>
			<td style="width:320px;">Alternatives such as POP-4 are acceptable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enhanced genetic analysis of single human bioparticles recovered by simplified micromanipulation from forensic &#8216;touch dna&#8217; evidence

Perfis de ADN pode ser obtido a partir de evidências &quot;toque DNA &#39;, que compreende traços microscópicos de material biológico humano. Os métodos atuais para a recuperação de DNA trace swabs empregam algodão ou fita adesiva para provar uma área de interesse. No entanto, este tipo de abordagem &#39;blind-swabbing&#39; co-amostra do material genético de diferentes indivíduos, mesmo que as células dos indivíduos estão localizados em locais geograficamente distintos sobre o item. Assim, algumas das misturas de ADN encontradas em amostras de DNA de toque são criados artificialmente pela própria raspagem. Em alguns casos, um ADN alvo pode ser encontrado em excesso significativo de mascaramento do DNA, assim, qualquer agente potencial. A fim de contornar os desafios com métodos de recuperação e de análise padrão, temos desenvolvido um custo menor, o método &quot;análise inteligente &#39;que resulta em análise genética melhorada de provas de DNA touch. Nós descrevemos um um otimizadod estratégia de recuperação eficiente a micromanipulação para a recolha de bio-partículas presentes em amostras de ADN de toque, bem como uma estratégia de amplificação aumentada envolvendo um passo de amplificação 5 ul microvolume lise / STR para permitir a recuperação de perfis STR a partir do dador de bio-partícula (s). A utilização de alguns ou indivíduo (isto é, &quot;blocos&quot;) biopartículas resulta na capacidade de obtenção de perfis de uma única fonte. Estes procedimentos são as técnicas avançadas alternativas para o isolamento e análise de partículas biológicas individuais de provas de DNA forense toque. Embora não seja necessário em todas as investigações forenses, o método pode ser altamente benéfica para a recuperação de um único perfil de ADN da fonte agente em casos que envolvem agressão física (por exemplo, o estrangulamento) que pode não ser possível, utilizando técnicas de análise normalizadas. Além disso, as estratégias desenvolvidas aqui oferecem uma oportunidade de obter informação genética ao nível de uma única célula a partir de uma variedade de other traço não-forense material biológico.

Imagens representativas de biopartículas individuais e aglutinados que foram recuperados a partir de um colarinho de camisa (100% poliéster) usado por um dador macho são mostradas na Figura 6 (biopartículas individuais) e Figura 7 (biopartículas aglutinados). Os biopartículas foram recuperados do colarinho da camisa usando o protocolo descrito aqui: transferência de biopartículas do colarinho da camisa de gel de filme através do contato direto, a coloração dos biopartículas recuperados com azul de tripan, coleta de amostras biopartícula usando uma agulha de tungstênio e adesivo solúvel em água STR e análise utilizando a amplificação de micro-5 ul volume de lise / STR. As Figuras 6 e 7 representam uma amostra típica de biopartículas que iria ser analisados ​​a partir de um produto de ADN toque individual (20 individuais biopartículas individuais e 20 / biopartículas aglutinado). O biopartícula (s) coletados em cada imagem são rotulados com comprimento e largura medidas (em microns). O percentuais de alelos STR recuperados a partir de cada um dos biopartícula recolhido (s) é fornecida em cada imagem individual para demonstrar os graus variáveis ​​de sucesso que se pode esperar para ser obtida a partir biopartículas com este tipo de provas. As biopartículas recuperados a partir de amostras de DNA de toque são em grande parte os queratinócitos mortos ou moribundos e, por conseguinte, um perfil STR de prova não é obtida a partir de cada biopartícula recolhidos, como pode ser visto nas Figuras 6 e 7. Para esta camisa amostra gola, perfis STR foram obtidos a partir de 14/20 (70%) das partículas biológicas individuais e 15/20 (75%) aglutinados biopartículas. No entanto, cada um dos perfis recuperados varia em valor de prova: 3-97% de recuperação do alelo para perfis individuais biopartículas e 3-100% de recuperação de alelo para os perfis biopartícula aglutinados. Devido à variabilidade nas taxas de sucesso, é recomendada a coleta de numerosas partículas biológicas de cada item DNA touch. Isso garante uma melhor chance de obter um altamente probative perfil STR. O perfil STR obtido a partir de uma das amostras individuais biopartícula do colarinho de camisa é mostrada na Figura 8 (a biopartícula a partir do qual se originou o perfil é mostrado à esquerda). Quase um perfil STR completa (28 de 30 alelos, um locus de cair para fora, a precisão do perfil obtido verificada por comparação com um perfil de referência) foi obtido a partir deste biopartícula indivíduo. O perfil obtido é de alta qualidade, com alturas de pico inter-locos razoavelmente equilibradas e não alélicas cair fora. Allelic desistem e desequilibradas artefatos altura de pico são ambos muito observada em amostras de DNA de baixo do modelo. O perfil STR obtido a partir de uma das amostras biopartícula aglutinados do colarinho é mostrado na Figura 9. Um perfil completo STR (30/30 alelos, a precisão do perfil obtido verificada por comparação com um perfil de referência) foi obtido. Como mencionado anteriormente, um perfil de STR que não é recuperada a partir de cada vezy biopartícula recolhidos. Um exemplo do perfil de ADN de uma única vencida biopartícula (3% de recuperação do alelo, 1/30 alelos) é mostrado na Figura 10 (biopartícula indivíduo). Enquanto isto biopartícula indivíduo não foi bem sucedida, perfis STR altamente probatório dos doadores dos biopartículas nesta amostra foram obtidas de outras partículas biológicas recuperados a partir da mesma amostra. Isso ilustra a necessidade de realizar várias amostragens única célula / moita do mesmo objeto. Os métodos de análise desenvolvidos &quot;inteligentes&quot; descritos aqui para provas de DNA toque têm sido utilizados com sucesso para recuperar perfis de origem única probatórios de solteiro e &quot;agregadas&quot; biopartículas de vários tocou objetos e itens de vestuário (por exemplo, apoios de braços da cadeira, volantes de automóveis, telefones celulares, copos de café, cigarros, canetas, camisas, shorts, e blusas). No entanto, mais importante, esta abordagem tem também sido utilizada para a detecção e caracterização de d machoonor DNA (fonte única) em amostras da mistura de contato / agressão física simulados (por exemplo, autor agarrando uma vítima de pulso, no pescoço ou na roupa, ou entre em contato com roupa de cama da vítima como em agressões sexuais). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52612/52612fig1.jpg" /> Figura 1: Preparação de gel de lâminas de película para a recolha biopartícula. (A) A capa protetora para trás branco é retirado com uma pinça estéreis a partir do pedaço de gel-filme para expor o adesivo. O filme-gel é então feita aderir sobre uma lâmina de microscópio de vidro com uma pressão firme. (B) Quando a amostra de gel de película está pronta para ser utilizada para a recolha de biopartícula, o filme protector de topo é removida utilizando pinças estéreis. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52612/52612fig2.jpg" /> Figura 2: coleção biopartícula usando gel-film a partir de vários substratos. As lâminas de película de gel pode ser utilizado para recolher partículas biológicas a partir de uma variedade de superfícies. O gel de película é colocada em contacto directo com o objecto ou superfície de interesse. Suave pressão é aplicada, a fim de transferir biopartículas sobre a superfície de gel de película. Coleção de biopartículas de (a) itens usados ​​vestuário (gola do casaco), (B) tocou objetos (viagem xícara de café), e (C) a pele humana direta (pulso masculino) são mostrados. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52612/52612fig3.jpg" /> Figura 3:. Biopartículas em um item de vestuário usado (dentro da calça leg) biopartículas são transferidos para gel de filme através do contato direto com a superfície do objeto. Biopartículas pode ser encontrado como &quot;blocos&quot; ou biopartículas single / individuais (indicadas com setas vermelhas). <img<html> alt = &quot;Figura 4&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52612 / 52612fig4.jpg&quot; /&gt; Figura 4:. Coloração opcional de biopartículas em lâminas de gel-filme para uma melhor visualização do biopartículas, as amostras de gel de película pode ser manchado com trypan mancha azul. A totalidade da superfície de gel de película é coberta por azul de tripano (A). Depois de 1-2 minutos da coloração, a corrediça é suavemente inclinada para permitir que o excesso de corante para executar fora da corrediça (B). Inundação suave com água estéril (C) pode ser usado para remover o excesso de corante. Depois, a lâmina é seca ao ar, a lâmina pode ser visto ao microscópio para assegurar coloração adequada (D, E). Nota:. Nem todos os biopartículas aparecerá com detalhes (ou seja, de cor azul) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52612/52612fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> oad / 52612 / 52612fig5.jpg &quot;/&gt; Figura 5: coleta e análise biopartícula. (A) Uma pequena quantidade (ou &quot;bola&quot;) de fita de onda de solda solúvel em água (&quot;adesivo&quot;) é recolhida para a ponta de uma agulha de tungsténio por raspagem suave. (B) O adesivo é então pressionada para a distribuição do gel superfície do filme, a fim de recolher os biopartículas de interesse. Biopartículas individuais ou múltiplas podem ser recolhidas com uma única bola adesiva. (C) Uma vez que as partículas biológicas desejadas foram recolhidas, a ponta da agulha é colocada na mistura de amplificação de PCR num tubo de 0,2 ml. A agulha é realizada no líquido até que se dissolva e a liberação de partículas biológicas em solução é observado. Todas as etapas do processo de coleta são realizados e vistos sob o microscópio para assegurar a recolha biopartícula sucesso e de transferência. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52612/52612fig5large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver um lar</a>ger versão desta figura. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52612/52612fig6.jpg" /> Figura 6:. Biopartículas individuais de uma amostra de colarinho de camisa biopartículas foram recuperados utilizando gel de película a partir do interior de um colarinho de camisa vestida por um dador macho. Os biopartículas foram coradas utilizando azul de tripan e imagens de vinte diferentes biopartículas individuais identificados na amostra são mostrados. Em cada imagem, a biopartícula que foi recolhido está circulado (círculos vermelhos indicando biopartículas em que um perfil foi recuperado; círculos pretos indicam biopartículas em que um perfil não foi recuperado). A percentagem de recuperação alelo (número de alelos observados de um total possível de 30) é mostrado acima da imagem de biopartícula a partir do qual um perfil foi recuperado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52612/52612fig6large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a><img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52612/52612fig7.jpg" /> Figura 7: clumped biopartículas em uma amostra colarinho biopartículas foram recuperados utilizando gel de película a partir do interior de um colarinho de camisa vestida por um dador masculino.. Os biopartículas foram coradas utilizando azul de tripan e imagens de vinte biopartículas clumped diferentes identificados na amostra são mostrados. Em cada imagem, a biopartícula que foi recolhido está circulado (círculos vermelhos indicando biopartículas em que um perfil foi recuperado; círculos pretos indicam biopartículas em que um perfil não foi recuperado O percentual de recuperação alelo (número de alelos observados de um total possível de 30). é mostrado para cada biopartícula a partir do qual um perfil foi recuperado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52612/52612fig7large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Figura 8: autossómica STR perfil obtido a partir de um único biopartícula de um colarinho de camisa macho Um perfil autossómica STR foi obtido a partir de um único biopartícula (mostrada à esquerda), utilizando as cinco ul de lise directa / reacção de amplificação.. A precisão deste perfil foi determinada por comparação com uma amostra de referência dador. Quinze autossómica STR loci e amelogenina (determinação do sexo) são co-amplificadas numa única reacção e separados por electroforese capilar. Os resultados são mostrados aqui como um electroferograma. Números de alelos estão designação abaixo de cada pico em cada locus. O eixo x representa o tamanho do fragmento (pares de bases, pb) e eixo y representa intensidade de sinal (RFU unidades de fluorescência relativa, desde cada número do alelo correspondente). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52612/52612fig8highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior</a><html> esta figura. <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/52612/52612fig9.jpg" /> Figura 9: autossómica STR perfil obtido a partir de um biopartícula agregada a partir de um colarinho de camisa macho Um perfil autossómica STR foi obtido a partir de um biopartícula agregada (mostrada à esquerda), utilizando as cinco ul de lise directa / reacção de amplificação.. A precisão deste perfil foi determinada por comparação com uma amostra de referência dador. Quinze autossómica STR loci e amelogenina (determinação do sexo) são co-amplificadas numa única reacção e separados por electroforese capilar. Os resultados são mostrados aqui como um electroferograma. Números de alelos estão designação abaixo de cada pico em cada locus. O eixo x representa o tamanho do fragmento (pares de bases, pb) e ao eixo dos y representa a intensidade do sinal (RFU unidades de fluorescência relativa; fornecida sob cada número correspondente alelo).pg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/52612/52612fig10.jpg" /> Figura 10:. Exemplo de uma falha para obter um perfil autossômica STR obtido a partir de um biopartícula coletadas O biopartícula indivíduo mostrado na esquerda foi coletado de uma camisa de colarinho amostra gel-film. Como pode ser visto a partir do perfil resultante STR (mostrado à direita), apenas um alelo (de 30 possíveis) obteve-se. Números de alelos estão designação abaixo de cada pico em cada locus. O eixo x representa o tamanho do fragmento (pares de bases, pb) e eixo y representa a intensidade do sinal (RFU unidades de fluorescência relativa, desde cada número do alelo correspondente). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52612/52612fig10highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Enhanced Genetic Analysis of Single Human Bioparticles Recovered by Simplified Micromanipulation from Forensic &amp;#8216;Touch DNA&amp;#8217; Evidence

Aqui nós descrevemos uma estratégia de remoção otimizada e eficiente para a recolha de bio-partículas presentes em &#39;toque de DNA&#39; amostras, juntamente com um protocolo de amplificação reforçada envolvendo um de uma etapa 5 jul micro-volume de lise / amplificação STR, para permitir a recuperação de repeat short tandem (STR) perfis do doador (s) bio-partícula.

Reforçada Análise Genética de solteiro biopartículas Humanos recuperado por Simplificado micromanipulação de Forensic Evidence &#39;Toque DNA&#39;

DNA profiles can be obtained from &#8216;touch DNA&#8217; evidence, which comprises microscopic traces of human biological material. Current methods for ...

enhanced-genetic-analysis-single-human-bioparticles-recovered

Research

JoVE Journal

Biology

Enhanced Genetic Analysis of Single Human Bioparticles Recovered by Simplified Micromanipulation from Forensic &#8216;Touch DNA&#8217; Evidence

15.4K visualizações.  University of Central Florida.  Aqui nós descrevemos uma estratégia de remoção otimizada e eficiente para a recolha de bio-partículas presentes em 'toque de DNA' amostras, juntamente com um protocolo de amplificação reforçada envolvendo um de uma etapa 5 jul micro-volume de lise / amplificação STR, para permitir a recuperação de repeat short tandem (STR) perfis do doador (s) bio-partícula. 

Vídeo: Enhanced Genetic Analysis of Single Human Bioparticles Recovered by Simplified Micromanipulation from Forensic &#8216;Touch DNA&#8217; Evidence

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its remarkable neuronal cell plasticity, and its involvement in epilepsy, neurodegenerative diseases, and psychiatric disorders. The hippocampus is composed of distinct regions; the dentate gyrus, which comprises mainly granule neurons, and Ammon's horn, which comprises mainly pyramidal neurons, and the two regions are connected by both anatomic and functional circuits. Many different mRNAs and proteins are selectively expressed in the dentate gyrus, and the dentate gyrus is a site of adult neurogenesis; that is, new neurons are continually generated in the adult dentate gyrus. To investigate mRNA and protein expression specific to the dentate gyrus, laser capture microdissection is often used. This method has some limitations, however, such as the need for special apparatuses and complicated handling procedures. In this video-recorded protocol, we demonstrate a dissection technique for removing the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope. Dentate gyrus samples prepared using this technique are suitable for any assay, including transcriptomic, proteomic, and cell biology analyses. We confirmed that the dissected tissue is dentate gyrus by conducting real-time PCR of dentate gyrus-specific genes, tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO2) and desmoplakin (Dsp), and Ammon's horn enriched genes, Meis-related gene 1b (Mrg1b) and TYRO3 protein tyrosine kinase 3 (Tyro3). The mRNA expressions of TDO2 and Dsp in the dentate gyrus samples were detected at obviously higher levels, whereas Mrg1b and Tyro3 were lower levels, than those in the Ammon's horn samples. To demonstrate the advantage of this method, we performed DNA microarray analysis using samples of whole hippocampus and dentate gyrus. The mRNA expression of TDO2 and Dsp, which are expressed selectively in the dentate gyrus, in the whole hippocampus of alpha-CaMKII+/- mice, exhibited 0.037 and 0.10-fold changes compared to that of wild-type mice, respectively. In the isolated dentate gyrus, however, these expressions exhibited 0.011 and 0.021-fold changes compared to that of wild-type mice, demonstrating that gene expression changes in dentate gyrus can be detected with greater sensitivity. Taken together, this convenient and accurate dissection technique can be reliably used for studies focused on the dentate gyrus.

A dissection technique for removal of the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope was demonstrated in this video-recorded protocol.

Dissecção do giro denteado do hipocampo de rato adulto

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

Biologia

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell types exhibit heterogeneous biochemical makeup depending on their physiological conditions and interactions with the environment. Conventional methods of mass spectrometry (MS) used for the analysis of biomolecules in single cells rely on extensive sample preparation. Removing the cells from their natural environment and extensive sample processing could lead to changes in the cellular composition. Ambient ionization methods enable the analysis of samples in their native environment and without extensive sample preparation.1 The techniques based on the mid infrared (mid-IR) laser ablation of biological materials at 2.94 &mu;m wavelength utilize the sudden excitation of water that results in phase explosion.2 Ambient ionization techniques based on mid-IR laser radiation, such as laser ablation electrospray ionization (LAESI) and atmospheric pressure infrared matrix-assisted laser desorption ionization (AP IR-MALDI), have successfully demonstrated the ability to directly analyze water-rich tissues and biofluids at atmospheric pressure.3-11 In LAESI the mid-IR laser ablation plume that mostly consists of neutral particulate matter from the sample coalesces with highly charged electrospray droplets to produce ions. Recently, mid-IR ablation of single cells was performed by delivering the mid-IR radiation through an etched fiber. The plume generated from this ablation was postionized by an electrospray enabling the analysis of diverse metabolites in single cells by LAESI-MS.12 This article describes the detailed protocol for single cell analysis using LAESI-MS. The presented video demonstrates the analysis of a single epidermal cell from the skin of an Allium cepa bulb. The schematic of the system is shown in Figure 1. A representative example of single cell ablation and a LAESI mass spectrum from the cell are provided in Figure 2.

Single cell analysis is performed by mass spectrometry on plant and animal cells at atmospheric pressure by using a sharpened optical fiber to sample the cells for laser ablation electrospray ionization (LAESI) mass spectrometry.

Análise direta de células individuais por Espectrometria de Massa à pressão atmosférica

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been understood at molecular level. One of the mechanisms mediating the effect of DNA variants on phenotypes is gene expression, which has been shown to be particularly relevant for complex traits1.
This method tests in a cellular context the effect of specific DNA sequences on gene expression. The principle is to measure the relative abundance of transcripts arising from the two alleles of a gene, analysing cells which carry one copy of the DNA sequences associated with disease (the risk variants)2,3. Therefore, the cells used for this method should meet two fundamental genotypic requirements: they have to be heterozygous both for DNA risk variants and for DNA markers, typically coding polymorphisms, which can distinguish transcripts based on their chromosomal origin (Figure 1). DNA risk variants and DNA markers do not need to have the same allele frequency but the phase (haplotypic) relationship of the genetic markers needs to be understood. It is also important to choose cell types which express the gene of interest. This protocol refers specifically to the procedure adopted to extract nucleic acids from fibroblasts but the method is equally applicable to other cells types including primary cells.
DNA and RNA are extracted from the selected cell lines and cDNA is generated. DNA and cDNA are analysed with a primer extension assay, designed to target the coding DNA markers4. The primer extension assay is carried out using the MassARRAY (Sequenom)5 platform according to the manufacturer's specifications. Primer extension products are then analysed by matrix-assisted laser desorption/ionization time of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS). Because the selected markers are heterozygous they will generate two peaks on the MS profiles. The area of each peak is proportional to the transcript abundance and can be measured with a function of the MassARRAY Typer software to generate an allelic ratio (allele 1: allele 2) calculation. The allelic ratio obtained for cDNA is normalized using that measured from genomic DNA, where the allelic ratio is expected to be 1:1 to correct for technical artifacts. Markers with a normalised allelic ratio significantly different to 1 indicate that the amount of transcript generated from the two chromosomes in the same cell is different, suggesting that the DNA variants associated with the phenotype have an effect on gene expression. Experimental controls should be used to confirm the results.

Genetic associations often remain unexplained at a functional level. This method aims to assess the effect of phenotype-associated genetic markers on gene expression by analyzing cells heterozygous for transcribed SNPs. The technology allows accurate measurement by MALDI-TOF mass spectrometry to quantify allele-specific primer extension products.

Um alelo-específico do ensaio Expressão Gênica para testar as bases funcionais das Associações de Genética

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

Transduction of Human Cells with Polymer-complexed Ecotropic Lentivirus for Enhanced Biosafety

Stem and tumor cell biology studies often require viral transduction of human cells with known or suspected oncogenes, raising major safety issues for laboratory personnel. Pantropic lentiviruses, such as the commonly used VSV-G pseudotype, are a valuable tool for studying gene function because they can transduce many cell types, including non-dividing cells. However, researchers may wish to avoid production and centrifugation of pantropic viruses encoding oncogenes due to higher biosafety level handling requirements and safety issues. Several potent oncogenes, including c-Myc and SV40 large T antigen, are known to enhance production of induced pluripotent stem cells (iPSC). All other known iPSC-inducing genetic changes (OCT4, SOX2, KLF4, NANOG, LIN28, and p53 loss of function) also have links to cancer, making them of relatively high safety concern as well. 
While these cancer-related viruses are useful in studying cellular reprogramming and pluripotency, they must be used safely. To address these biosafety issues, we demonstrate a method for transduction of human cells with ecotropic lentivirus, with additional emphasis on reduced cost and convenient handling. We have produced ecotropic lentivirus with sufficiently high titer to transduce greater than 90% of receptor-expressing human cells exposed to the virus, validating the efficacy of this approach. 
Lentivirus is often concentrated by ultracentrifugation; however, this process takes several hours and can produce aerosols infectious to human biomedical researchers. As an alternative, viral particles can be more safely sedimented onto cells by complexation with chondroitin sulfate and polybrene (CS/PB). This technique increases the functional viral titer up to 3-fold in cells stably expressing murine retrovirus receptor, with negligible added time and cost. Transduction of human dermal fibroblasts (HDFs) is maximally enhanced using CS/PB concentrations approximately 4-fold lower than the optimal value previously reported for cancer cell lines, suggesting that polymer concentration should be titrated for the target cell type of interest. We therefore describe the use of methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT) to assay for polymer toxicity in a new cell type. We observe equivalent viability of HDFs after viral transduction using either polymer complexation or the standard dose of polybrene (PB, 6 &mu;g/ml), indicating minimal acute toxicity.
In this protocol, we describe the use of ecotropic lentivirus for overexpression of oncogenes in human cells, reducing biosafety risks and increasing the transduction rate. We also demonstrate the use of polymer complexation to enhance transduction while avoiding aerosol-forming centrifugation of viral particles.

Lentiviruses are a valuable research tool for exploring gene function; however, researchers may wish to avoid production of pantropic lentivirus encoding known or suspected oncogenes. As an alternative, we present a safer protocol for use of ecotropic lentivirus on human cells modified to express the ecotropic receptor mSlc7a1.

Transdução de células humanas com Polymer-complexado Lentivirus Ecotropic para reforço de Biossegurança

Stem and tumor cell biology studies often require viral transduction of human cells with known or suspected oncogenes, raising major safety issues for ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

Bioquímica e Alto Rendimento Avaliação microscópica de massa gorda em<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is essential first to generate functional human cardiomyocytes (CMs). The use of these cells in drug discovery and toxicology studies would also be highly beneficial, allowing new pharmacological molecules for the treatment of cardiac disorders to be validated pre-clinically on cells of human origin. Of the possible sources of CMs, induced pluripotent stem (iPS) cells are among the most promising, as they can be derived directly from readily accessible patient tissue and possess an intrinsic capacity to give rise to all cell types of the body 1. Several methods have been proposed for differentiating iPS cells into CMs, ranging from the classical embryoid bodies (EBs) aggregation approach to chemically defined protocols 2,3. In this article we propose an EBs-based protocol and show how this method can be employed to efficiently generate functional CM-like cells from feeder-free iPS cells.

Pluripotent stem cells, either embryonic or induced pluripotent stem (iPS) cells, constitute a valuable source of human differentiated cells, including cardiomyocytes. Here, we will focus on cardiac induction of iPS cells, showing how to use them to obtain functional human cardiomyocytes through an embryoid bodies-based protocol.

Geração de cardiomiócitos Humanos: Um Protocolo de Diferenciação de Feeder livres Humanos células-tronco pluripotentes induzidas

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Detecting Somatic Genetic Alterations in Tumor Specimens by Exon Capture and Massively Parallel Sequencing

Efforts to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The establishment of high-throughput, massively parallel "next-generation" sequencing has aided the discovery of many such mutations. To enhance the clinical and translational utility of this technology, platforms must be high-throughput, cost-effective, and compatible with formalin-fixed paraffin embedded (FFPE) tissue samples that may yield small amounts of degraded or damaged DNA. Here, we describe the preparation of barcoded and multiplexed DNA libraries followed by hybridization-based capture of targeted exons for the detection of cancer-associated mutations in fresh frozen and FFPE tumors by massively parallel sequencing. This method enables the identification of sequence mutations, copy number alterations, and select structural rearrangements involving all targeted genes. Targeted exon sequencing offers the benefits of high throughput, low cost, and deep sequence coverage, thus conferring high sensitivity for detecting low frequency mutations.

We describe the preparation of barcoded DNA libraries and subsequent hybridization-based exon capture for detection of key cancer-associated mutations in clinical tumor specimens by massively parallel "next generation" sequencing. Targeted exon sequencing offers the benefits of high throughput, low cost, and deep sequence coverage, thus yielding high sensitivity for detecting low frequency mutations.

Detectando somáticas Genéticos Alterações em amostras de tumor por Exon Captura e Seqüenciamento Massively Parallel

Efforts  to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to  facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

Culturas alternativas para pluripotentes estaminais humanas produção de células, Manutenção e Análise Genética

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Fecal Análise de glicocorticóides: Non-invasive Monitoring Adrenal em eqüídeos

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the invasion of non-indigenous species. However, an exact identification of field predator-prey interactions is difficult in many cases. These analyses are often based on a visual evaluation of gut content or the analysis of stable isotope ratios (&#948;15N and &#948;13C). Such methods require comprehensive knowledge about, respectively, morphologic diversity or isotopic signature from individual prey organisms, leading to obstacles in the exact identification of prey organisms. Visual gut content analyses especially underestimate soft bodied prey organisms, because maceration, ingestion and digestion of prey organisms make identification of specific species difficult. Hence, polymerase chain reaction (PCR) based strategies, for example the use of group-specific primer sets, provide a powerful tool for the investigation of food web interactions. Here, we describe detailed protocols to investigate the gut contents of macroinvertebrate consumers from the field using group-specific primer sets for nuclear ribosomal deoxyribonucleic acid (rDNA). DNA can be extracted either from whole specimens (in the case of small taxa) or out of gut contents of specimens collected in the field. Presence and functional efficiency of the DNA templates need to be confirmed directly from the tested individual using universal primer sets targeting the respective subunit of DNA. We also demonstrate that consumed prey can be determined further down to species level via PCR with unmodified group-specific primers combined with subsequent single strand conformation polymorphism (SSCP) analyses using polyacrylamide gels. Furthermore, we show that the use of different fluorescent dyes as labels enables parallel screening for DNA fragments of different prey groups from multiple gut content samples via automated fragment analysis.

Most common gut content analyses of macroinvertebrates are visual. Requiring intense knowledge about morphological diversity of prey organisms, they miss soft bodied prey and, due to strong comminution of prey, are nearly impossible for some organisms, including amphipods. We provide detailed, novel genetic approaches for macroinvertebrate prey identification in the diet of amphipods.

Protocolo do laboratório para análises genéticas de conteúdo intestino de rDNA usando de macroinvertebrados aquáticos grupo-específicos Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...