Los autores agradecen W. Sol y K. Jansen para los debates críticos, y reconocen el apoyo de la Nano Biomecánica Lab de la Universidad Nacional de Singapur. NAK reconoce el apoyo de una Beca Marie Curie IIF.

Cosecha 1. celular <ol><li> Obtener MD-MBA-231 desde la 37 ° C, 5% de CO2. Separe las células de la placa de cultivo de tejidos utilizando la solución de tripsina-EDTA 0,5%. Usar 1 ml de solución de tripsina-EDTA para células cultivadas en un matraz T25. </li><li> Precipitar las células en un tubo cónico de 15 ml mediante centrifugación a 200 × g durante 4 min, aspirar el sobrenadante, y Resuspender las células en 5 ml de medio de cultivo. </li><li> Contar la densidad celular, ρ, usando un hemocitómetro. Nota: Para preparar el gel interior sembrado de células, la suspensión de células después se diluyó 10 × para llegar a la densidad final de la siembra de células. Por lo tanto, se requiere 10 × suspensión celular concentrada. </li><li> Calcular el volumen de medio requerido para alcanzar una concentración de 10 × celular: <img alt="Ecuación 1" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/52735/52735eq1.jpg" width="175" /> Nota: Una densidad final siembra de células, c final, en torno al 215; 10 6 células / ml se recomienda para MD-MBA-231 y se utiliza en este protocolo. Otros densidades de siembra también se pueden explorar para otros tipos de células. </li><li> Precipitar las células una vez más en un tubo cónico de 15 ml mediante centrifugación a 200 × g durante 4 min, y aspirar el sobrenadante. </li><li> Resuspender las células en la cantidad requerida (medio V calculados en el paso 1.3) de medio de cultivo celular libre de suero a fondo para minimizar la aglutinación de células. Nota: El fenol rojo es auto-fluorescente, y puede interferir con imágenes de fluorescencia / reflectancia. Uso de medio libre de rojo de fenol puede ser considerado para lograr mejor calidad de imagen. </li></ol> 2. Preparación de las soluciones de colágeno <ol><li> Obtener la solución de colágeno de valores, 10 × tampón PBS, Milli-Q H 2 O, 0,1 M NaOH, y varios tubos de microcentrífuga. Mantenga todo en hielo para evitar la polimerización prematura de colágeno, y mantener condiciones de esterilidad. </li><li> Equilibrar un vidrio estérilplato inferior por pre-calentamiento en el 37 ° C incubadora. Nota: Todos los volúmenes en este protocolo se han optimizado para un plato de fondo de vidrio con 12 mm así. Si se utiliza otro tipo de plato, ajustar los volúmenes correspondientemente. </li><li> Calcular el volumen requerido necesario para preparar 50 l de solución de colágeno 2,4 mg / ml para el gel interior (solución I) basado en la concentración de colágeno de valores. Nota: Otros concentraciones de colágeno para el gel interior también se pueden utilizar. </li><li> En un ambiente estéril (típicamente una campana de bioseguridad), añadir lentamente 5 l de 10 x tampón de PBS a la cantidad requerida de solución de colágeno de stock (calculado en el paso 2.3) con agitación suave. Tenga cuidado para evitar la formación de burbujas de aire. </li><li> Ajustar el pH de la mezcla a 7,4 utilizando NaOH 0,1 M usando calibrado pH-metro. Como regla general, utilice unos 5 l para llevar el pH cercano a 7,4 (la cantidad varía dependiendo de la acción concentración y pH). Nota: Tenga en cuenta que los volúmenes involucrados en estepaso es demasiado pequeño para el uso de medidor de pH estándar. Utilice uno de los siguientes trucos: <ol><li> Preparar soluciones de colágeno de múltiples muestras. Ajustar el pH a granel utilizando medidor de pH estándar y distribuir las soluciones de colágeno a través de las muestras. </li><li> Alternativamente, ajustar el pH de una solución de colágeno en el volumen más grande (i. E., Volumen que permite el uso de medidor de pH estándar). Tenga en cuenta la cantidad de NaOH necesaria para llevar el pH al pH final. De bajar el volumen y utilizar la cantidad apropiada de NaOH para el experimento. Confirme el valor del pH con papel tornasol. </li><li> De lo contrario, utilice un micro electrodo de pH para ajustar con mayor precisión el pH de pequeñas cantidades. </li></ol></li><li> Poner la solución en un volumen de 45 l usando H 2 O. Realice todos los pasos en el hielo para evitar la polimerización prematura de colágeno. </li></ol> 3. Formación de Gel Concentric Cultura <ol><li> Tome el plato de fondo de vidrio precalentado (véase el paso 2.2) de The incubadora. </li><li> Añadir 5 l de la suspensión celular concentrada 10 × (preparado en el paso 1.5) a la solución I. Resuspender a fondo. Tenga cuidado para evitar la formación de burbujas de aire. La mezcla ahora tiene un volumen de 50 l y contiene la concentración final de colágeno (2,4 mg / ml) y la densidad celular (c final = 2 × 10 6 células / ml). </li><li> Añadir 20 l de la solución que contiene la célula-I lentamente hacia el centro del pozo, de manera que forme una gotita (Figura 1A) en forma de cúpula. Tenga cuidado para evitar la formación de burbujas en este paso. Si se forma una burbuja, con cuidado pero rápidamente se trate de cualquiera de romperse o aspirar a cabo utilizando una punta de pipeta. Con cuidado, coloque el plato de nuevo en la incubadora para que el gel interior polimeriza durante 45 minutos. </li><li> Preparar la solución de O (para la, gel de colágeno acelular exterior) aproximadamente 15 minutos antes del final de esta etapa de incubación. Nota: La condición exterior de gel se puede variar en términos de concentración de colágeno y pH de polimerización aobtener redes con diferentes microestructuras 10. En este protocolo, se centran en un 1,5 - / gel de colágeno ml 4.0 mg polimerizado a un pH de 7,4. <ol><li> Sobre la base de la concentración de colágeno de valores, calcular el volumen requerido necesario para preparar 200 l de solución de colágeno O a la concentración final. </li></ol></li><li> Añadir 20 l de 10 × tampón PBS lentamente a la cantidad necesaria de solución de colágeno de valores (calculado en el paso 3.4) con agitación suave. Ajustar el pH de la mezcla al pH final utilizando 0,1 M NaOH con el uso de calibrado pH-metro. Ver nota al paso 2.5 en relación con el ajuste del pH. </li><li> Poner la solución en un volumen final de 200 l usando H 2 O. Realice todos los pasos en el hielo para evitar la polimerización prematura de colágeno. </li><li> Sacar la fuente de la incubadora después de 45 min de polimerización del gel interior (véase el paso 3.3). Añadir suavemente 180 l de solución de O en la parte superior del gel interno, de manera que la solución cubra completamente el interiorgel y se llena el pozo (Figura 1B). <ol><li> Realice este paso con cuidado, sin agitar la solución, que puede conducir a orientaciones de las fibras no uniformes en el exterior de gel. Tenga cuidado de no tocar el gel interior con una punta de pipeta, y para evitar la formación de burbujas o bolsas de aire. Si se forma una burbuja, con cuidado pero rápidamente se trate de cualquiera de romperse o aspirar a cabo utilizando una punta de pipeta. Con cuidado, coloque el plato de nuevo en la incubadora para que el polimerizan exterior de gel. </li></ol></li><li> Sacar la fuente de la incubadora después de 45 min de polimerización. El gel debe estar ya bastante solidificó en este punto, a pesar de que todavía se puede separar de la superficie inferior si se maneja más o menos. <ol><li> Verter suavemente 2 ml de medio de cultivo celular se calentó hasta el plato (Figura 1C). Asegúrese de que el gel está completamente sumergido en el medio. Actualizar el medio cada 2 - 3 días a lo largo de la duración de la cultura. </li></ol></li></ol> 4. Células vivas imágenes <ol><li> Realizar las imágenes utilizando un microscopio confocal invertido equipado con capacidad de imágenes de células vivas a largo plazo. Incluir un incorporado en la cámara de incubación con una temperatura (37 ° C) y control de CO 2 (5%). Encienda el microscopio y calentar el escenario por lo menos 1 hora antes de comenzar el experimento. Nota: El uso de lente de objetivo con distancia de trabajo larga para optimizar la observación y la localización de las células en los geles 3D. </li><li> Incubar el gel en medio que contiene 5 l de colorante de seguimiento de células fluorescentes durante 30 min para permitir una localización precisa de las células en el sistema 3D. Posteriormente, retirar colorante no unido por lavado tres veces con 1 × PBS. Después, se añade medio de cultivo celular para el plato. </li><li> Sacar la fuente de la incubadora y colóquelo sobre la platina del microscopio (Figura 1D). Nota: imágenes de células vivas puede comenzar en principio justo después de la polimerización del gel exterior. Sin embargo en este punto, las células in el gel interior aún no han diseminado. Para examinar la migración de las primeras células que han invadido el exterior de gel, imágenes de células vivas puede iniciar 24 hr (dependiendo del tipo de célula) después de la iniciación del cultivo. Como una guía general, alrededor de 12 - se necesitan 14 días de cultivo para la mayoría de las células en el gel interior para entrar en el exterior de gel. </li><li> Seleccione Volúmenes de Vista (VoV de) en las regiones en el gel exterior que rodea el gel interior. Después de 24 horas de incubación, la población de células se han propagado, cruzó la interfaz entre los geles de interior y exterior, y comenzó a invadir el exterior de gel. <ol><li> Para el VoV de, incluir las regiones de gel inmediatamente al lado de la interfaz de gel, regiones intermedias, y las regiones cerca de las afueras de la exterior de gel 7. Excluir regiones más cerca de 50 micras, de las superficies inferiores y laterales, así como de la parte superior del gel, para evitar posibles efectos de borde. Cada VoV típicamente mide 647 × 647 × 100 m 3 (en x, Y, y Z, respectivamente), con un intervalo de 5 micras en el -stack z. </li></ol></li><li> Asegurar los modos de imagen, canales / filtros, tiempos de exposición, y las resoluciones de imagen se seleccionan correctamente. Para imágenes sin etiqueta de la red de colágeno, utilice la microscopía confocal de reflectancia simultáneamente durante la obtención de imágenes de células vivas de lapso de tiempo. </li><li> Tomar imágenes de muestra, trazar los histogramas de intensidad, y ajustar las ganancias y las compensaciones para observar la señal sea suficiente y evitar la saturación, asegurando que el histograma se encuentra entre cero y la máxima intensidad. No cambie estos ajustes más largo de la duración del experimento. </li><li> Tomar imágenes con lapso de tiempo de la década de VOV seleccionados, con un intervalo de tiempo, Δ t, de 10 min durante 8 horas (o más si es necesario). </li></ol> 5. Seguimiento de la célula y Análisis de Datos <ol><li> Realizar imagen cuantitativa de post-procesamiento de las imágenes -stack z utilizando apropiación<html> software de procesamiento de imágenes TE. <ol><li> Segmento de las imágenes con lapso de tiempo para seleccionar automáticamente las posiciones celulares 3D en (x, y, z, t). </li><li> Para cada cuadro, comprobar manualmente la precisión de localización y eliminar falsos positivos debido a los desechos celulares y protuberancias celulares que pueden haber sido confundido con células. Eliminar las células proliferativas de los análisis y las células se superponen o conectados divididas en objetos distintos. </li></ol></li><li> Generar pistas de células de lapso de tiempo 3D a partir de las coordenadas de células (x, y, z, t) obtenidos en el paso anterior mediante la vinculación de la ubicación de cada célula en la secuencia de tiempo. </li><li> Eliminar el ruido aleatorio y sistema mediante la eliminación de las pistas más cortas que una longitud umbral de pista (típicamente 20 min). </li><li> Corrija para la muestra deriva restando los desplazamientos netos globales de las pistas si es necesario. </li><li> Calcular el desplazamiento celular,iles / ftp_upload / 52735 / 52735eq2.jpg &quot;width =&quot; 80 &quot;/&gt;, y la distancia de la migración celular, <img alt="Ecuación 3" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52735/52735eq3.jpg" width="100" /> , A partir de las trayectorias de células observadas, donde es un vector que representa la ubicación 3D de una célula en el momento y es el número total de puntos de tiempo. <ol><li> Calcular la velocidad de célula como S = d / (n • Δ t), donde Δ t es el intervalo de tiempo entre tramas. Calcular direccionalidad migración celular (o persistencia) utilizando P = Dd / d. Esta simple medida de la persistencia implica que para P = 0, el desplazamiento neto es cero y para p = 1 la trayectoria es una línea recta direccional. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Horwitz, R., Webb, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration.">Cell migration.</a> Curr Biol. 13 (19), R756-R759 (2003).</li><li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+scratch+assay:+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro.">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nat. Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).</li><li>Provenzano, P. P., Eliceiri, K. W., Inman, D. R., Keely, P. 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H., Rajagopalan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+stiffening+and+softening+of+collagen:+interplay+of+deformation+mechanisms+in+biopolymer+networks.">Early stiffening and softening of collagen: interplay of deformation mechanisms in biopolymer networks.</a> Biomacromolecules. 13 (3), 691-698 (2012).</li><li>Sun, W., Lim, C. T., Kurniawan, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+adaptability+of+cancer+cells+strongly+affects+anti-migratory+drug+efficacy.">Mechanistic adaptability of cancer cells strongly affects anti-migratory drug efficacy.</a> J. R. Soc. Interface. 11 (99), 20140638 (2014).</li><li>Guzman, A., Ziperstein, M. J., Kaufman, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+fibrillar+matrix+architecture+on+tumor+cell+invasion+of+physically+challenging+environments.">The effect of fibrillar matrix architecture on tumor cell invasion of physically challenging environments.</a> Biomaterials. 35 (25), 6954-6963 (2014).</li><li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+limits+of+cell+migration:+control+by+ECM+space+and+nuclear+deformation+and+tuning+by+proteolysis+and+traction+force.">Physical limits of cell migration: control by ECM space and nuclear deformation and tuning by proteolysis and traction force.</a> J. Cell Biol. 201 (7), 1069-1084 (2013).</li><li>Friedl, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+migration+in+morphogenesis,+regeneration+and+cancer.">Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (7), 445-457 (2009).</li><li>Vedula, S. R. K., Ravasio, A., Lim, C. T., Ladoux, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+migration:+a+mechanistic+perspective.">Collective cell migration: a mechanistic perspective.</a> Physiology. 28 (6), 370-379 (2013).</li><li>Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+mechanics+modulate+microRNA-dependent+PTEN+expression+to+regulate+malignant+progression.">Tissue mechanics modulate microRNA-dependent PTEN expression to regulate malignant progression.</a> Nat. Med. 20 (4), 360-367 (2014).</li><li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen-based+cell+migration+models+in+vitro+and+in+vivo.">Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 20 (8), 931-941 (2009).</li><li>Wong, L. H., Kurniawan, N. A., Too, H. -. P., Rajagopalan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+resolved+microrheology+of+heterogeneous+biopolymer+hydrogels+using+covalently+bound+microspheres.">Spatially resolved microrheology of heterogeneous biopolymer hydrogels using covalently bound microspheres.</a> Biomech. Model. Mechanobiol. 13 (4), 839-849 (2014).</li><li>Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+feedback+between+actomyosin+and+focal-adhesion+systems+optimizes+rapid+cell+migration.">Spatiotemporal feedback between actomyosin and focal-adhesion systems optimizes rapid cell migration.</a> Cell. 125 (7), 1361-1374 (2006).</li><li>Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Trier, S. M., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact+guidance+mediated+three-dimensional+cell+migration+is+regulated+by+Rho/ROCK-dependent+matrix+reorganization.">Contact guidance mediated three-dimensional cell migration is regulated by Rho/ROCK-dependent matrix reorganization.</a> Biophys. J. 95 (11), 5374-5384 (2008).</li><li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-step+pericellular+proteolysis+controls+the+transition+from+individual+to+collective+cancer+cell+invasion.">Multi-step pericellular proteolysis controls the transition from individual to collective cancer cell invasion.</a> Nat. Cell Biol. 9 (8), 893-904 (2007).</li><li>Jansen, K. A., Bacabac, R. G., Piechocka, I. K., Koenderink, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+actively+stiffen+fibrin+networks+by+generating+contractile+stress.">Cells actively stiffen fibrin networks by generating contractile stress.</a> Biophys. J. 105 (10), 2240-2251 (2013).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

In this protocol we describe an in vitro assay to study the 3D migrational behavior of cells in matrix environments that topologically resemble ECMs encountered in vivo. There are three main strengths of this assay as compared to other currently available methods. First, this assay allows one to simultaneously examine the cell migration mechanisms at both population level and individual cell level. This opens up possibilities of studying collective cell migration13, which has to date been lar...

La migración de las células juega un papel clave en diversas respuestas fisiológicas, tales como el desarrollo embrionario, la hemostasia, y la respuesta inmune, así como en procesos patológicos tales como enfermedades vasculares, la inflamación y el cáncer 1. La disección de los factores bioquímicos y biofísicos subyacentes migración celular es, por tanto, fundamentalmente importante no sólo para entender los principios básicos de las funciones celulares, sino también para avanzar diversas aplicaciones biomédicas, tales como en la ingeniería de tejidos, anti-metástasis y el desarrollo de fármacos antiinflamatorios. Dado que la observación in vivo es técnicamente difícil, una gran cantidad de esfuerzos se ha centrado en la recapitulación in vitro de la migración celular. Los métodos in vitro para estudiar la migración celular en gran medida han sido diseñados para los ensayos en dos superficies dimensionales (2D), en particular el cero o cicatrización de la herida ensayo 2. Dichos ensayos ofrecen configuración experimental simple, fácil ganadoimágenes de células, y proporcionar información útil sobre diversos mecanismos bioquímicos que subyacen a la migración celular. Sin embargo, estos ensayos no dan cuenta de la matriz (ECM), la arquitectura y la remodelación extracelular, que son aspectos críticos en la comprensión de la migración vivo. Recientemente, se ha apreciado cada vez que un modelo de cultivo 3D, a menudo en matrices a base de colágeno-3, proporciona una plataforma que mejor se asemeja a la situación in vivo. De hecho, las células presentan dinámicas migratorios que son distintos de los de las superficies en 2D, especialmente debido a la diferente dimensionalidad del medio ambiente 4. Por otra parte, las propiedades biofísicas y mecánicas de la matriz afectan sensiblemente la migración celular 5, incluso en el contexto de la invasión de células tumorales 6. A continuación, presentamos un método para estudiar el comportamiento de la migración celular 3D en ECM con propiedades biofísicas que pueden ser fácilmente variado, con condiciones de preparación. Las células sonsembradas en un &quot;gel interior&quot; y se les permite escapar hacia e invadir el &quot;exterior de gel&quot; inicialmente acelular. El método se basa en la capacidad de la célula para reconocer la presencia de, y la propensión a migrar a regiones libres de células en el exterior de gel, que está estrechamente vinculado a la celda mechanosensing 7. En este estudio, utilizamos redes de colágeno como las ECMs invadidos por las células del cáncer de mama altamente invasivos, MD-MBA-231. Las propiedades mecánicas y la microestructura tanto de los geles de interior y exterior se pueden sintonizar 8 y 9 caracterizan para lograr condiciones fisiológicamente relevantes. Reconstrucción y el análisis de las vías celulares permiten examen cuantitativo detallado del comportamiento de la migración espacio-temporal, tanto a nivel de población y nivel de células individuales. Es importante destacar que la configuración del sistema de gel concéntrica imita el tejido vivo topología en enfrentado mediante la migración de las células, especialmente las células invasoras de cáncer, ofreciendo así importantes conocimientos ena los mecanismos físicos de la migración celular y la metástasis.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Fisher Scientific Pte Ltd</td>
			<td>Model: 371, S/No 318854-6055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Nikon A1R</td>
			<td></td>
			<td>Inverted confocal laser scanning microscope equipped with incubator chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10082-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent CellTracker dye CMTMR</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C2927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottom dish</td>
			<td>IWAKI Cell Biology</td>
			<td>3931-035</td>
			<td>35 mm diameter dish with 12 mm diameter glass-bottom well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>iN CYTO</td>
			<td>DHC-N01 (Neubauer Improved)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microprocessor pH meter</td>
			<td>Hanna Instruments</td>
			<td>pH 211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutragen Collagen</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>#5010-D</td>
			<td>Acid-solubilized bovine collagen type I (stock pH ~ 2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>CFI Super Plan Fluor ELWD ADM 20XC, W.D. 8.2-6.9mm, NA 0.45.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>S/No 29153352</td>
			<td>Basic pH Meter PB-11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

concentric gel system to study the biophysical role of matrix microenvironment on 3d cell migration

La capacidad de las células para migrar es crucial en una amplia variedad de funciones celulares durante toda la vida desde el desarrollo embrionario y la curación de heridas de tumor y la metástasis del cáncer. A pesar de intensos esfuerzos de investigación, los principios básicos bioquímicos y biofísicos de la migración de las células aún no se entienden completamente, especialmente en los microambientes (3D) tridimensionales fisiológicamente relevantes. Aquí se describe un ensayo in vitro diseñado para permitir el examen cuantitativo de los comportamientos de migración celular en 3D. El método explota la capacidad mechanosensing de la célula y la propensión a migrar en la matriz extracelular previamente desocupada (ECM). Usamos la invasión de células de cáncer de mama altamente invasivas, MDA-MB-231, en geles de colágeno como un sistema modelo. La difusión de la población de células y la dinámica de migración de las células individuales durante semanas de cultivo pueden ser monitoreados utilizando imágenes de células vivas y se analizan para extraer datos espaciotemporalmente resueltas. Además, El método es fácilmente adaptable para diversas matrices extracelulares, lo que ofrece una manera simple pero potente para investigar el papel de los factores biofísicos en el microambiente sobre la migración celular.

El ensayo de gel concéntrica que aquí se presenta se realizó utilizando células de cáncer de mama altamente invasivas, MDA-MB-231, con 2,4 mg / ml de gel de colágeno interior y una densidad de siembra de células de = 2 × 10 6 células / ml, como un ejemplo. Como se muestra en la Figura 2, por lo general después de unos días de cultivo, las células incumplieron la interfaz gel interior-exterior y comenzaron a invadir el exterior de gel. La población de células propaga predominante...

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Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

Las propiedades mecánicas y la microestructura de la matriz extracelular afectan fuertemente a la migración de las células 3D. Un método in vitro para estudiar el comportamiento de la migración celular espaciotemporal en entornos biofísico variables, tanto a la población y los niveles de células individuales, se describe.

Gel System Concentric para estudiar el papel de Biofísica de Matrix Microambiente en la migración de células en 3D

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.5K vistas.  FOM Institute AMOLF.  Las propiedades mecánicas y la microestructura de la matriz extracelular afectan fuertemente a la migración de las células 3D. Un método in vitro para estudiar el comportamiento de la migración celular espaciotemporal en entornos biofísico variables, tanto a la población y los niveles de células individuales, se describe. 

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Study of Cell Migration in Microfabricated Channels

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which impose a polarized phenotype to cells by physical constraints. Once inside channels, cells have only two possibilities: move forward or backward. This simplified migration in which directionality is restricted facilitates the automatic tracking of cells and the extraction of quantitative parameters to describe cell movement. These parameters include cell velocity, changes in direction, and pauses during motion. Microchannels are also compatible with the use of fluorescent markers and are therefore suitable to study localization of intracellular organelles and structures during cell migration at high resolution. Finally, the surface of the channels can be functionalized with different substrates, allowing the control of the adhesive properties of the channels or the study of haptotaxis. In summary, the system here described is intended to analyze the migration of large cell numbers in conditions in which both the geometry and the biochemical nature of the environment are controlled, facilitating the normalization and reproducibility of independent experiments.

A quantitative method to study spontaneous migration of cells in a one-dimensional confined microenvironment is described. This method takes advantage of microfabricated channels and can be used to study migration of large number of cells under different conditions in single experiments.

Estudio de la Migración celular en Canales Microfabricated

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which ...

Investigación

Bioingeniería

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

Análisis de la migración de células dentro de una matriz de colágeno tridimensional

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

Planar Sistema de Difusión de degradado para Investigar quimiotaxis en una matriz de colágeno 3D

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

Preparación de geles de colágeno en 3D y microcanales para el estudio de las interacciones 3D<em&gt; En Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

Los hidrogeles sintonizable de la matriz extracelular pulmonar por la 3D de Cultivos Celulares

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of cellular function. The ECM plays a particularly important role in adipose tissue function in obesity, and alterations in adipose tissue ECM deposition and composition are associated with metabolic disease in mice and humans. Tractable in vitro models that permit dissection of the roles of the ECM and cells in contributing to global tissue phenotype are sparse. We describe a novel 3D in vitro model of human ECM-adipocyte culture that permits study of the specific roles of the ECM and adipocytes in regulating adipose tissue metabolic phenotype. Human adipose tissue is decellularized to isolate ECM, which is subsequently repopulated with preadipocytes that are then differentiated within the ECM into mature adipocytes. This method creates ECM-adipocyte constructs that are metabolically active and retain characteristics of the tissues and patients from which they are derived. We have used this system to demonstrate disease-specific ECM-adipocyte crosstalk in human adipose tissue. This culture model provides a tool for dissecting the roles of the ECM and adipocytes in contributing to global adipose tissue metabolic phenotype and permits study of the role of the ECM in regulating adipose tissue homeostasis.

We describe a 3D human extracellular matrix-adipocyte in vitro culture system that permits dissection of the roles of the matrix and adipocytes in contributing to adipose tissue metabolic phenotype.

Un modelo de cultivo de matriz-adipocitos extracelulares 3D humano para el estudio de la conversación cruzada metabólica Matrix-Cell

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their cellular source, such as platelet lysate (PL). When used as treatment, EVs are expected to enter the target cells and effect a response from these. In this research, PL-derived EVs have been studied as a cell-free treatment for osteoarthritis (OA). Thus, a method was set up to label EVs and test their uptake on cartilage explants. PL-derived EVs are labeled with the lipophilic dye PKH26, washed twice through a column, and then tested in an in vitro inflammation-driven&#160;OA model for 5 h after particle quantification by nanoparticle tracking analysis (NTA). Hourly, cartilage explants are fixed, paraffined, cut into 6 &#181;m sections to mount on slides, and observed under a confocal microscope. This allows verification of whether EVs enter the target cells (chondrocytes) during this period and analyze their direct effect.

Here, we present a protocol to label platelet lysate-derived extracellular vesicles to monitor their migration and uptake in cartilage explants used as a model for osteoarthritis.

Etiquetado de vesículas extracelulares para monitorear la migración y absorción en explantes de cartílago

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their ...

Microgel-Extracellular Matrix Composite Support for the Embedded 3D Printing of Human Neural Constructs

The embedded 3D printing of cells inside a granular support medium has emerged in the past decade as a powerful approach for the freeform biofabrication of soft tissue constructs. However, granular gel formulations have been restricted to a limited number of biomaterials that allow for the cost-effective generation of large amounts of hydrogel microparticles. Therefore, granular gel support media have generally lacked the cell-adhesive and cell-instructive functions found in the native extracellular matrix (ECM).
To address this, a methodology has been developed for the generation of self-healing annealable particle-extracellular matrix (SHAPE) composites. SHAPE composites consist of a granular phase (microgels) and a continuous phase (viscous ECM solution) that, together, allow for both programmable high-fidelity printing and an adjustable biofunctional extracellular environment. This work describes how the developed methodology can be utilized for the precise biofabrication of human neural constructs.
First, alginate microparticles, which serve as the granular component in the SHAPE composites, are fabricated and combined with a collagen-based continuous component. Then, human neural stem cells are printed inside the support material, followed by the annealing of the support. The printed constructs can be maintained for weeks to allow the differentiation of the printed cells into neurons. Simultaneously, the collagen continuous phase allows for axonal outgrowth and the interconnection of regions. Finally, this works provides information on how to perform live-cell fluorescence imaging and immunocytochemistry to characterize the 3D-printed human neural constructs.

This work describes a protocol for the freeform embedded 3D printing of neural stem cells inside self-healing annealable particle-extracellular matrix composites. The protocol enables the programmable patterning of interconnected human neural tissue constructs with high fidelity.

Soporte compuesto de matriz extracelular de microgel para la impresión 3D integrada de construcciones neuronales humanas

The embedded 3D printing of cells inside a granular support medium has emerged in the past decade as a powerful approach for the freeform biofabrication ...

Uso de matrices de nanofibras de carbono para la entrega eficiente de biomoléculas y colorantes a las plantas

Using Vertically Aligned Carbon Nanofiber Arrays on Rigid or Flexible Substrates for Delivery of Biomolecules and Dyes to Plants

The delivery of biomolecules and impermeable dyes to intact plants is a major challenge. Nanomaterials are up-and-coming tools for the delivery of DNA to plants. As exciting as these new tools are, they have yet to be widely applied. Nanomaterials fabricated on rigid substrate (backing) are particularly difficult to successfully apply to curved plant structures. This study describes the process for microfabricating vertically aligned carbon nanofiber arrays and transferring them from a rigid to a flexible substrate. We detail and demonstrate how these fibers (on either rigid or flexible substrates) can be used for transient transformation or dye (e.g., fluorescein) delivery to plants. We show how VACNFs can be transferred from rigid silicon substrate to a flexible SU-8 epoxy substrate to form flexible VACNF arrays. To overcome the hydrophobic nature of SU-8, fibers in the flexible film were coated with a thin silicon oxide layer (2-3 nm). To use these fibers for delivery to curved plant organs, we deposit a 1 &#181;L droplet of dye or DNA solution on the fiber side of VACNF films, wait 10 min, place the films on the plant organ and employ a swab with a rolling motion to drive fibers into plant cells. With this method, we have achieved dye and DNA delivery in plant organs with curved surfaces.

Autor destacado: Desbloqueando la transformación de las plantas mediante la innovación con matrices de nanofibras de carbono 

Here we describe methods for microfabricating vertically aligned carbon nanofibers (VACNFs), transferring VACNFs to flexible substrates, and applying VACNFs on both rigid and flexible substrates to plants for biomolecule and dye delivery.

Uso de matrices de nanofibras de carbono alineadas verticalmente sobre sustratos rígidos o flexibles para la entrega de biomoléculas y colorantes a las plantas

The delivery of biomolecules and impermeable dyes to intact plants is a major challenge. Nanomaterials are up-and-coming tools for the delivery of DNA to ...