الهدف العام من الفيديو التالي هو إظهار استخدام مكتبة shRNA اللاجينية المجمعة لإجراء فحص اختيار سلبي. يمكن هذا الفحص من تحديد أهداف جينية محددة من خلال التسلسل. يمكن أن يساعد هذا الإجراء في تحديد العوامل اللاجينية المسؤولة عن التوسط في مقاومة السيتارابين المكتسبة في AML الخطوات هي كما يلي.
اختيار المروج الأكثر فعالية للحصول على تعبير مستمر وطويل الأمد عن shRNAs. يركز البروتوكول الحالي على فحص الحمض النووي الريبي باستخدام مكتبة الحمض النووي الريبوزي المرسال للعامل اللاجيني في خط الخلايا MV4-11 المقاوم للسيتارابين. المروجون المستخدمون لهذا الغرض هم EF-1 alpha البشري و CMV البشري و SFFV ، المروجون الذين يعبرون عن بروتين التألق الأخضر.
خذ عدد الخلايا باستخدام طريقة استبعاد التربان الأزرق. تعليق الخلايا في 10٪ RPMI المتوسطة التي تحتوي على 8 ميكروغرام لكل مل بوليبرين. البذور 1 مليون خلية في 1.5 مل من الوسط لكل بئر من صفيحة من ستة آبار في ثلاثة أضعاف.
أضف كميات مختلفة من فيروسات lentivirus المركزة. على سبيل المثال ، lentiviruses ، على سبيل المثال ، 10 و 20 و 40 ميكرولتر ، اعتمادا على عيار فيروسات lentiviruses لكل بئر. قم بتدوير الطبق بلطف لخلط المحتويات.
قم بإجراء التصويب عن طريق الطرد المركزي عند 920 جم عند 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. احتضان الألواح على الفور في حاضنة ثاني أكسيد الكربون. راقب GFP في نهاية 48 ساعة وحدد كميا في نهاية 72 ساعة.
بعد ذلك، اتبع الخطوات الموضحة في المخطط الانسيابي لاختيار المروج الذي يعرض تعبيرا متسقا عن GFP في جميع أنحاء الثقافة. إعداد مكتبة الحمض النووي الريبوزي المشبع بالفيروس الوراثي البشري المجمعة shRNA. زراعة الخلايا التائية 293T في عدد مرور منخفض مع معدل انتشار جيد في ثلاثة أطباق زراعة الخلايا 10 سم مع 8 مل من 10٪ DMFM المتوسطة في كل طبق.
بمجرد أن تصل الخلايا إلى 60٪ من الالتقاء ، استبدلها بوسط طازج تماما. تحضير مزيج النقل كما هو موضح الذي يحتوي على وسط خال من المصل ، بلازميد تغليف lentiviral PAX2 ، غلاف بلازميد pMD2. G ، بلازميدات المكتبة المجمعة ، وأخيرا كاشف النقل.
اضغط على الخليط لمزجه جيدا واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. أضف خليط النقل إلى خلايا 293T واخلطه بلطف عن طريق تدوير الأطباق. احتضان الألواح في حاضنة ثاني أكسيد الكربون.
تغيير الوسط بعد 24 ساعة. بعد 48 ساعة، تحقق من تعبير GFP تحت المجهر الفلوري لضمان كفاءة نقل عالية إلى خلايا 293T. جمع الخارقين للفيروس بعد 48 و 60 و 72 ساعة وتخزينها عند 4 درجات ، وإضافة وسط جديد ، 8 مل ، في كل نقطة زمنية بعد جمع الفيروس.
قم بتصفية الفيروسات المجمعة باستخدام مرشح 0.4 ميكرون. للحصول على عيار عال من الفيروسات ، ركز الفيروسات المجمعة عن طريق الطرد المركزي الفائق. انقل المواد الفائقة للفيروسات المصفاة إلى 70 أنبوب Ti ، وأجهزة الطرد المركزي عند 18،000 غرام لمدة 2 ساعة.
استخدم الدوار المبرد مسبقا وأجهزة الطرد المركزي عند 4 درجات. أخرج الأنابيب من جهاز الطرد المركزي بعناية وقم بإزالة supernatant تماما. أعد تعليق الكريات بلطف في 400 ميكرولتر من DMEM بدون FBS والمضادات الحيوية باستخدام ماصة دقيقة ، احتضنها على الجليد لمدة 1 ساعة.
Aliquot الفيروسات وتجميدها عند درجة سالب 80. احسب تركيز الفيروس كما هو موضح. تقدير كفاءة نقل فيروسات lentivirus.
قم بتحويل الخلايا التائية 293T مع فيروس مركز بأحجام مختلفة ، 2 و 4 و 8 ، لتأكيد التحضير الناجح للفيروس lentivirus. القيمة للفيروس المركز إلى 100X لإجراء تجربة معايرة بالتحليل الحجمي في خط الخلية الهدف. البذور 1 مليون خط خلية مستهدفة في 1.5 مل من 10٪ RPMI المتوسطة تحتوي على 8 ميكروغرام لكل مل من البولي برين في بئر واحد من صفيحة من ستة آبار.
أضف أربعة وحدات تخزين مختلفة ، 1 ، 1.5 ، 2 ، 2.5 ميكرولتر من فيروسات 100X. قم بإجراء التطهير عن طريق الطرد المركزي للصفيحة عند 920 جم لمدة 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد 72 ساعة ، قم بقياس النسبة المئوية للخلايا الإيجابية GFP عن طريق قياس التدفق الخلوي.
تحديد حجم الفيروسات للحصول على كفاءة نقل 30٪. هذه الكفاءة المنخفضة في النقل هي ضمان تكامل shRNA واحد لكل خلية. نقل مكتبة shRNA اللاجينية المجمعة في خط الخلايا المقاومة للأدوية.
احسب عدد الخلايا التي سيتم أخذها للتجربة على النحو التالي بناء على عدد التكاملات الفيروسية. إعادة تعليق 11 مليون خلية في 16 مل من 10٪ RPMI المتوسطة. أضف البوليبرين ، ثمانية ميكروغرام لكل مل واخلطه جيدا ، ثم أضف الحجم المطلوب من الفيروسات للحصول على كفاءة نقل 30٪ كما تم حسابها من قبل.
زرع جميع الخلايا على صفيحة من ستة آبار بكثافة مليون خلية لكل 1.5 مل لكل بئر. الطرد المركزي للصفيحة لمدة 90 دقيقة عند 920 جم عند 37 درجة مئوية. احتضان اللوحة بين عشية وضحاها في حاضنة ثاني أكسيد الكربون.
بعد 24 ساعة ، قم بتغيير الوسط ونقل الخلايا المحولة إلى قارورة T-75. بعد 48 ساعة ، تحقق من GFP تحت المجهر الفلوري لضمان النقل الناجح. بعد 72 ساعة ، قم بقياس GFP كميا عن طريق قياس التدفق الخلوي.
إثراء الخلايا الإيجابية GFP. قم بتوسيع الخلايا المحولة عن طريق زراعتها بكثافة 0.5 مليون لكل مل لمدة 5 إلى 7 أيام ، وقم بإجراء فرز التدفق مع إعداد فرز التدفق المحدد على أنه نقاء عال وعائد منخفض. استزرع الخلايا التي تم فرزها في وسط RPMI بنسبة 10٪.
بعد 72 ساعة ، قم بإجراء تقدير ما بعد الفرز للنسبة المئوية للخلايا الإيجابية GFP لضمان كفاءة فرز أكثر من 95٪. فحص التسرب لتحديد العوامل اللاجينية التي تتوسط في مقاومة الأدوية. قم بزراعة الخلايا المحولة إلى مكتبة shRNA في 10٪ RPMI لمدة تصل إلى 5 أيام.
جهاز الطرد المركزي 10 ملايين خلية في نسختين مكررتين. تخلص من السوبرناتانت وخزن الكريات عند درجة حرارة 80 تحت الصفر. وستكون هذه العينات بمثابة مرجع أساسي لمكتبة الحمض النووي الريبوزي المرسال اللاجيني.
قم بزراعة الخلايا المحولة المتبقية كتكرارات ، R1 و R2 ، يتم الاحتفاظ بكل منها في عدد الخلايا الذي يوفر تمثيلا 500X للمكتبة. علاج واحد من التكرارات مع المخدرات ، 10 سيتارابين ميكرومولار ، والآخر دون علاج بالعقاقير. تغيير الوسط للقوارير مع ، وبدون الدواء ، كل 72 ساعة.
كرر التغيير المتوسط ثلاث مرات للتعرض التراكمي للدواء لمدة 9 أيام. بعد اليوم 9 من العلاج من تعاطي المخدرات ، تحقق من جدوى الخلايا عن طريق طريقة استبعاد تريبان الأزرق. قم بتدوير الخلايا المتبقية القابلة للحياة ، واغسلها باستخدام PBS المعقمة وأجهزة الطرد المركزي عند 280 جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
تخلص من السوبرناتانت وخزن الكريات عند ناقص 80 لاستخراج الحمض النووي. تضخيم shRNAs المتكاملة بواسطة PCR. استخراج الحمض النووي من خلايا خط الأساس المحولة ، والخلايا المعالجة وغير المعالجة ، تليها التحقق من التركيز باستخدام مقياس الفلورومتر ، وحساب كمية الحمض النووي المطلوبة كما هو موضح وإخضاع العينات للجولة الأولى من PCR.
ويبين الجدول 2 خليط تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) مع ظروف التدوير الحراري. قم بإعداد تفاعلات متعددة تحتوي على 850 نانوغرام من الحمض النووي لكل أنبوب لما مجموعه 43 تفاعلا. تجميع منتجات PCR وتنقيتها.
قم بالتخلص من المنتجات في مخزن مؤقت سعة 50 ميكرولتر وقم بتحديدها كميا ، وأخيرا قم بتخزينها عند 20 ميكرولتر. بالنسبة للجولة الثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل ، استخدم الاشعال للفهرس العكسي ويتم جدولة الكواشف في الجدول 4. قم بإعداد أربعة تفاعلات مع 500 نانوغرام من منتج PCR الأساسي في حجم تفاعل إجمالي قدره 50 ميكرولتر لكل عينة إلى جانب التحكم السلبي.
قم بتحميل المنتج بالكامل للرحلان الكهربائي باستخدام 2٪ TBE agarose gel وتأكد من حجم النطاق باستخدام سلم جزيء KB واحد. تصور منتجات PCR على نظام توثيق الهلام. قم بقص الشريط المحدد وتنقيته باستخدام مجموعة تنقية الهلام.
وترد في الجدول 3 حسابات للتنقية باستخدام المجموعة. Elute في حجم نهائي من 30 ميكرولتر من المخزن المؤقت elution مع التركيز التقريبي لكل eluent حوالي 80 إلى 90 نانوجرام لكل ميكرولتر. تسلسل الجيل التالي وتحليل البيانات.
تخضع المنتجات المنقاة بالهلام لتسلسل الجيل التالي للحصول على عدد القراءة لاحتياجات shRNA المستنفدة. قم بقص تسلسلات المحول ، ومحاذاة القراءات المصفاة مع التسلسلات المرجعية ، وتحميل الملفات باستخدام SAMtools للحصول على ملخص المحاذاة. قم بتحميل ملفات fastQ المقتطعة في CRISPRCloud2 وقم بإجراء التحليل وفقا للتعليمات.
انقر على الرابط المتوفر لجهاز CRISPRCloud2. حدد نوع الشاشة كشاشتي البقاء على قيد الحياة والتسرب. قم بتعيين عدد المجموعات واكتب اسم كل مجموعة.
قم بتحميل المكتبة المرجعية بتنسيق ملف FASTA. تتم معالجة البيانات التي تم تحميلها وتتوفر النتائج في عنوان URL المحدد. البيانات التمثيلية.
يوضح هذا الشكل MV4-11 الخلايا الأبوية والمقاومة المعالجة بزيادة تركيز السيتارابين ، و 0.1 ميكرومولار إلى 1000 ميكرومولار ، وتقييم الجدوى بواسطة فحص MTT. يوضح هذا الشكل مخططات التدفق التمثيلية ل GFP التي تم تحديدها كميا بواسطة قياس التدفق الخلوي في نهاية 72 ساعة لمروجي EF-1 alpha البشري و CMV البشري و SFFV. يظهر CMV البشري ذروتنا غير المتجانسة بينما يظهر EF-1 alpha و SFFV البشري ذروة واحدة متجانسة.
يوضح هذا الشكل الرسم البياني الشريطي لكفاءات المروج الثلاثة المختلفة في MV4-11. أظهر GFP الذي يحركه SFFV إسكات GFP في الثقافة الطويلة. أظهرت خلايا GFP المدفوعة بألفا hEF-1 تعبيرا مستداما بعد فرز هذه الخلايا.
تظهر اللوحة اليسرى كفاءة النقل لمكتبة shRNA المجمعة التي تم نقلها في 293T في نهاية 48 ساعة تحت المجهر الفلوري. تظهر اللوحة اليمنى كفاءة نقل فيروس المسبح في الخلايا التائية 293T مع أحجام فيروسات مختلفة ، 2 و 4 و 8 ميكرولتر. يمثل هذا الرقم كفاءة النقل في خط الخلايا المقاومة MV4-11 مع أحجام مختلفة من الفيروسات ، مثل 1 و 1.5 و 2 و 2.5 ميكرولتر لتحقيق كفاءة نقل 30٪.
يوضح هذا الشكل فرز الخلايا الإيجابية GFP بكفاءة نقل 30٪ مع إعداد فرز عالي النقاء ومنخفض الغلة. يوضح الشكل توضيحا تخطيطيا للعلاج الدوائي للخلايا المصنفة إيجابية GFP للتعرض المطول للسيتارابين لمدة 9 أيام ، يليه التحقق من الجدوى وجمع الخلايا بحثا عن الحمض النووي. يوضح هذا الشكل مناطق ربط التمهيدي المستخدمة في الجولة الأولى والثانية من PCR.
يوضح هذا الشكل حجم النطاق لمنتج PCR في نهاية الجولة الأولى من PCR ، وزوج قاعدة 397 ، وزوج قاعدة منتج PCR 399 في الجولة الثانية ، والذي تم التخلص منه وتنقيته وإعطاؤه ل NGS. يوضح هذا الشكل تمثيل الحمض النووي الريبوزي المرسال المخصب أو المستنفد الذي يستهدف العوامل اللاجينية التي يمكن أن تتوسط في مقاومة السيتارابين في AML. استنتاج. يسلط هذا البروتوكول الضوء على أهمية الفحص المستهدف بالضربة القاضية لاستجواب كل من الجينات الأساسية وغير الأساسية بشكل منهجي ويوضح استخدام هذا النهج كمنصة وظيفية ، مما يسمح بتحديد الأهداف المسؤولة عن مقاومة الأدوية.
