The authors would like to acknowledge our colleagues at H3 Biomedicine for their feedback during the manuscript preparation.

1. הערכה במערכת העיכול 50 למגרש (ים) של ריבית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור עקומת צמיחה (ים) לשורות תאים של עניין על מנת להעריך את צפיפות הזריעה המתאימה. עלילה מספר התאים בנקודות זמן שונות הבאים זריעה (ימים 2, 4, 6 ו -8) ביחס ליום 0. זה יספק שיעור צמיחה יחסי של הקו הסלולרי של עניין ויש להשתמש כדי להעריך את צפיפות הזריעה הראשונית כך ש מפגש הוא לא הגיע ב96-גם צלחות תוך 7 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שעקומות גדילה נקבעו, מספר המתאים של תאי זרע בלוחות שאינם שקופים, ברורים תחתון 96-גם בתקשורת של תא 100 μl להעריך GI 50. זרע מספר התאים המבוססים על קו התא המשמש ונקבע ב1.1. בדרך כלל, זרע 3x10 3 תאים לשורות תאים בצמיחה מהירות עם הכפלה זמן של ~ 24 שעות, למשל., HCT116. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צלחת assay (יום 1). לצלחת assay, תאי זרע בצפיפות רצויה בתקשורת והתרבות שלי 100 μln בארות המוצלים בכחול (איור 1). ולס מודגש בלבן מכיל רק תקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צלחת שליטה (יום 1). לצלחת השליטה, זרע אותה הצפיפות של תאים כמו בשלב 1.2.1 בשל תקשורת בתרבות 100 μl בצלחת נפרדת 96-היטב. קריאה זו &quot;יום 0 &#39;תעזור בפרשנות הטבע ציטוטוקסיות / cytostatic של התרכובות שנתחה (איור 2). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת (היום 0), לקרוא את צלחת השליטה. לאזן מגיב כדאיות תא זורח (מצע cellTiter-Glo מעורב עם חיץ לפי הוראות יצרן) לRT ומערבבים בעדינות על ידי היפוך תוכן כדי להשיג פתרון הומוגני. להוסיף 80 μl של מגיב לשל תא / תערובת תקשורת 100 μl ולנער תוכן למשך 30 דקות כדי לגרום תמוגה תא. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיא הארה עם luminometer מוגדר חשיפה של .1-1.0 גל שניות וזיהוי של 560 ננומטר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף תרכובות מבחן (תרכובותשל ריבית) לassay צלחות (יום 0). הפוך דילול 1: 4 סדרתי של תרכובות בDMSO ב200x ריכוז סופי עבור הסכום כולל של 10 ריכוזים (9 דילולים המכילים תרכובת וDMSO אחד בלבד, צלחת מתחם). כנקודת התחלה ראשונית, לשאוף למינון הנמוך ביותר של 0.03 200x מיקרומטר ומנה עליונה של 2,000 מיקרומטר (μl נפח 200 סופי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף תרכובות בדילול סדרתי עד בינוני להפוך תערובת מתחם-בינוני ב10x ריכוז סופי (נפח 100 μl הסופי, צלחת ביניים). אחסן את צלחת המתחם ב -20 ° C לשימוש ביום 3 של assay. הוסף 10 μl של תערובת מתחם-בינוני לתאים בtriplicates כך שהמינון הגבוה ביותר הוא 10 מיקרומטר (למשל., שורות B, C ו- D, יום 0) (איור 1). דגירה צלחות assay במשך 3 ימים ב 37 מעלות צלזיוס. בטל צלחת ביניים (ים) לאחר שימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 3, להכין תערובת מתחם בינוני 1x 400 μl באמצעות צלחות המתחם ערוכים 1.4. הפוך צלחות assay כדי להסיר תקשורת וללטף יבשים ברכבמגבות נייר claved 2-3x כדי להסיר תקשורת שיורית. להוסיף מתחם / תקשורת (100 μl / טוב) לבארות מוצלות בכחול ולהוסיף מדיה 100 μl להיקף בארות כדי למנוע אידוי (איור 1). Re-דגירה צלחות assay על 37 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים נוספים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 6, להעריך מספר יחסי של תאי קיימא על ידי ביצוע קריאת הארה כמתואר בשלב 1.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בקריאת יום 0 להעריך את טבע סטטי / הרעיל של תרכובות. סוכנים רעילים לגרום אפופטוזיס ואילו סוכני cytostatic לגרום עצירת מחזור התא. אם המתחם הוא רעיל (יום 6 קריאה מתחת יום 0 קריאה), לשקול בחירת GI 50, וGI 50 x 5 ריכוזים עבור מבחני עמידות. עם זאת, אם המתחם גורם קיפאון (שווה או גבוה מקריאת D0), לשקול GI 100 ועבור מבחני עמידות GI X5 100 (איור 2). </li></ol> 2. הגדרת מבחני עמידות לתרופות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם שנינות עובדתחה סוכן cytostatic, תאי זרע במפגש של 30-40% ב150 מ&quot;מ 2 מנות בתרבית רקמה (נפח = 30 מיליליטר) עבור assay ההתנגדות. אם עובד עם סוכן רעיל, זרע במפגש 70-80%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשורות תאים שנמל מנגנון תיקון אי התאמה (MMR) ללא פגע, דגירה תאים מצעד 2.1 O / N ב 37 מעלות צלזיוס עם סרטן N-אתיל-N-nitrosourea (ENU). פנק את התאים עם 30 μl של פתרון מניות של 50 מ&quot;ג / מיליליטר ENU (50 מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז סופי) כדי לשפר את חוסר יציבות גנומית. לתא קווים שיש לי פגום MMR (לוחות 2 ו -3), הטיפול בENU או חומרים מסרטנים אחרים ייתכן שיהיה צורך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשורות תאים אחרות, לקבוע MMR-מחסור בקריטריוני NCI באמצעות חוסר יציבות microsatellite 12, או המבוסס על האפיון שפורסם באמצעות מבחני חוסר יציבות microsatellite או פרופיל הגנומי / epigenomic של גני MMR 13-15. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי פינוק עם מתחם המבחן (ים) שלריבית בריכוז שנקבעה בשלב 1.8. לתרכובות רעילות ביותר הגורמים למוות של תאים בכדאיות assay שלושה ימים טיפוסי 10, להתחיל עם טיפול במינון נמוך (כלומר, במערכת העיכול 50) ואופן הדרגתי להגדיל את הריכוז (כפולות של GI 50) של מתחם כל 2-3 שבועות עד חזק התנגדות הוא ציין. לחדש תקשורת ומתחם כל 3 ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהבחירה כבר יזמה, תקשורת / מתחם שינוי לערבב כל 3-4 ימים עד שיבוטים עמידים לצוץ. התנגדות על ידי הגדרה עולה כאשר תאים שטופלו להראות גדולה יותר צמיחה / כדאיות בטיפול תרופתי בהשוואה לטיפול אקוטי של תאי שליטה טופל DMSO. </li></ol> 3. בידוד שיבוטים תא בודדים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק צלחת תרבות באמצעות מיקרוסקופ שלב בניגוד (הגדלה 40x) לאשכולות קיימא של תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיבוטים משביע רצון מארק בתחתית הצלחת עם עט סימון. בחר שיבוטים שהם בגודל ממוצע (מושבות גדולות יותר עשוימקורן תאים מרובים) ומבודד היטב ממושבות אחרות. בחר שיבוטים באמצעות אחת משתי גישות שתוארו בשלב 3.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גישת 1: באמצעות pipettor (איור 3) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר תקשורת צמיחה ולשטוף עם PBS 1x כדי להסיר את כל תאים צפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש בסימנים שחורים כמדריך לשיבוטים &quot;לקטוף&quot; עם קצה pipet (מצורף לpipettor, p200 רצוי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת שיבוטים לתוך צלחות 48-היטב עם תקשורת טרי 200 μl (עם ריכוז מתחם המחצית לאפשר התאוששות אופטימלית של תאים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר לתאים להתאושש במשך 2-3 ימים לפני הוספת 200 μl תקשורת טרי / ריכוז מתחם אידיאלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמשיך להשתנות תקשורת / מתחם כל 3-4 ימים וימשיך להרחיב את השיבוטים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גישה 2: שימוש בשיבוט דיסקים (איור 3) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן שיבוטים כמתואר בשלב 3.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 3 דיסקי מ&quot;מ שיבוט בצלחת תרבית רקמת 10 סנטימטרים המכילה לא 5 מיליליטר של 0.25%rypsin-EDTA למשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת לשאוב מצלחת המכילה שיבוטים עמידים וכיסוי שיבוטים עם דיסקי שיבוט טריפסין ספוגים באמצעות מלקחיים חד פעמי סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר במשך 1-2 דקות, תלוי כמה בקלות שיבוטים להרים את הצלחות, בחממה 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרים דיסקי שיבוט באמצעות מלקחיים סטרילי ולהעביר לתוך צלחות 48-היטב עם תקשורת 200 μl טרי וחצי ריכוז של מתחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה מעלה ומטה בעדינות כדי לסלק את התאים מדיסקי שיבוט דגירה O / N ב 37 ° C (להשאיר שיבוט דיסקים בבארות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר, להסיר את דיסקי שיבוט מצלחות 48-היטב ולחדש בארות עם 200 μl תקשורת / מתחם טרי (ריכוז מתחם מחצית אידיאלי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלושה ימים לאחר מכן, לחדש תקשורת עם הריכוז האידיאלי של מתחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמשיך לשנות את התקשורת / המתחם כל 3-4 ימים וימשיכו להרחיב את השיבוטים. </li></ol></li></ol> 4. הערכת התואר של Resistance של שיבוטים מבודדים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע 10-20 מושבות מורחבות, ליצור GI 50 עקומות כמתואר בשלב 1 כדי להעריך את מידת ההתנגדות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמיד כולל אוכלוסיות שליטה טופלו בDMSO בתהליך הבחירה. סביר מאוד להניח שהספקטרום של התנגדות הולך להיות גדול (כמה מראים חלקי ואילו אחרים מראים התנגדות מלאה). לאסוף כמה שיבוטים מכל אחד מהשיעורים האלה כמנגנון של התנגדות עשויה להשתנות בין שתי הקבוצות. </li></ol> רצף 5. הדור הבא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה 2 מיליון תאים (שליטה ושיבוטים עמידים) (XG 500 במשך 5 דקות) בבקבוקוני 15 מיליליטר חרוטי עבור שני gDNA ואוסף RNA (ולכן 2 x 2 מ&#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פעמיים עם 1x PBS ולהקפיא כדורים ב-80 ° C עד מוכן לבידוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בערכת חילוץ מסחרית לבודד RNA או gDNA פי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלח דגימות עבור סידור הדור הבאתוך שימוש בפרוטוקול של הספק 10. </li></ol> 6. ביואינפורמטיקה ניתוח של דגימות (רצף כל-exome) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Preprocess רצף נתונים לפי DNA-seq צינור תרגול הטוב ביותר 16. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מפה כל קורא להתייחסות GRCh37 הגנום האנושי באמצעות BWA 17. המרת יישור SAM מעוצב דחוס לפורמט BAM הדחוס עם Samtools 18. יישור מיין לפי לתאם עם Samtools. להוסיף קבוצות קריאה באמצעות פיקארד. (לBWA הספציפי, Samtools ופיקארד פקודות, ראה טקסט משלים 1, קווי 1-4) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן את כל הכפילויות קורא באמצעות MarkDuplicates פקודה מכלי פיקארד להגדיר 19. מדד בקובץ זה עם Samtools. (טקסט משלים 1, קווי 5-6) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למזער את הבסיסים תואמים בכל קורא, ליישר מחדש קוראים באופן מקומי באזורי מחסה הוספות או מחיקות קטנות באמצעות realigner indel 20. (טקסט משלים 1, קווי 7-8) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשפר את accurac נוסףy של קורא גרסה, ציוני איכות בסיס אמפירי לכייל מחדש באמצעות כלי כיול ציון איכות בסיס. כלי כיול איכות הבסיס צריך לא רק ציון איכות ראשונית נכון, אלא גם לקחת בחשבון השתנות המשותף של מספר תכונות, כוללים קבוצה לקרוא, מחזור מכונה, עמדת בסיס, והקשר dinucleotide (בסיסים הנוכחיים קודמים +). צור BAM recalibrated עם PrintReads פיקארד. (לפקודות ספציפיות לצעד זה, ראה טקסט משלים 1, קווי 9-10) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזרו על שלבים 6.1.1 באמצעות 6.1.4 (טקסט משלים 1, קווים 1-10) עבור כל דגימת רצף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות וריאציה אחת נוקלאוטיד (SNV) בכל שיבוט באמצעות גרסה לזווג קוראת tool19, 21-23. לכל שיבוט רצף, לרוץ גרסה לזווג קוראת באמצעות שיבוט ההורים כמתאים &quot;נורמלי&quot;. (טקסט משלים 1, קו 11) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן חוזרות, גרסאות באיכות גבוהה ולהתכונן לביאור עם כלי ביאור גרסה 24. Deprioritize variants לא משותף לכל השיבוטים העמידים. (ראה תסריט R בטקסט משלים 2) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תסמן גרסאות עם כלי ביאור 25, 26. יש לי כלים ביאור גרסה רבים יישום אינטרנט נלווה המאפשר לנתונים יועלו ועובדו על שרת מרוחק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכלי חיזוי השפעה תפקודית 27-29 לתעדף אלה גרסאות חזו שיש השפעה תפקודית גבוהה. כמו ביאור גרסה, מספר כלים זמינים לחיזוי השפעה תפקודי באמצעות ממשק אינטרנט. </li></ol>

<ol>
	<li>Sellers, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+blueprint+for+advancing+genetics-based+cancer+therapy.">A blueprint for advancing genetics-based cancer therapy.</a> Cell. 147 (1), 26-31 (2011).</li><li>Housman, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+resistance+in+cancer:+an+overview.">Drug resistance in cancer: an overview.</a> Cancers (Basel). 6 (3), 1769-1792 (2014).</li><li>Balbas, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+mutation-based+resistance+to+antiandrogens+with+rational+drug+design.">Overcoming mutation-based resistance to antiandrogens with rational drug design.</a> Elife. 2, e00499 (2013).</li><li>Joseph, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clinically+relevant+androgen+receptor+mutation+confers+resistance+to+second-generation+antiandrogens+enzalutamide+and+ARN-509.">A clinically relevant androgen receptor mutation confers resistance to second-generation antiandrogens enzalutamide and ARN-509.</a> Cancer Discov. 3 (9), 1020-1029 (2013).</li><li>Korpal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+F876L+mutation+in+androgen+receptor+confers+genetic+and+phenotypic+resistance+to+MDV3100+(enzalutamide).">An F876L mutation in androgen receptor confers genetic and phenotypic resistance to MDV3100 (enzalutamide).</a> Cancer Discov. 3 (9), 1030-1043 (2013).</li><li>Lawrence, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+heterogeneity+in+cancer+and+the+search+for+new+cancer-associated+genes.">Mutational heterogeneity in cancer and the search for new cancer-associated genes.</a> Nature. 499 (7457), 214-218 (2013).</li><li>Gerlinger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumor+heterogeneity+and+branched+evolution+revealed+by+multiregion+sequencing.">Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.</a> N Engl J Med. 366 (10), 883-892 (2012).</li><li>Whittaker, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-scale+RNA+interference+screen+implicates+NF1+loss+in+resistance+to+RAF+inhibition.">A genome-scale RNA interference screen implicates NF1 loss in resistance to RAF inhibition.</a> Cancer Discov. 3 (3), 350-362 (2013).</li><li>Wacker, S. A., Houghtaling, B. R., Elemento, O., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+transcriptome+sequencing+to+identify+mechanisms+of+drug+action+and+resistance.">Using transcriptome sequencing to identify mechanisms of drug action and resistance.</a> Nat Chem Biol. 8 (3), 235-237 (2012).</li><li>Adams, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NAMPT+Is+the+Cellular+Target+of+STF-31-Like+Small-Molecule+Probes.">NAMPT Is the Cellular Target of STF-31-Like Small-Molecule Probes.</a> ACS Chem Biol. 9 (10), 2247-2254 (2014).</li><li>Bhang, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+clonal+dynamics+in+response+to+cancer+therapy+using+high-complexity+barcoding.">Studying clonal dynamics in response to cancer therapy using high-complexity barcoding.</a> Nat Med. 21 (5), 440-448 (2015).</li><li>Boland, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+National+Cancer+Institute+Workshop+on+Microsatellite+Instability+for+cancer+detection+and+familial+predisposition:+development+of+international+criteria+for+the+determination+of+microsatellite+instability+in+colorectal+cancer.">A National Cancer Institute Workshop on Microsatellite Instability for cancer detection and familial predisposition: development of international criteria for the determination of microsatellite instability in colorectal cancer.</a> Cancer Res. 58 (22), 5248-5257 (1998).</li><li>Heinen, C. D., Richardson, D., White, R., Groden, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsatellite+instability+in+colorectal+adenocarcinoma+cell+lines+that+have+full-length+adenomatous+polyposis+coli+protein.">Microsatellite instability in colorectal adenocarcinoma cell lines that have full-length adenomatous polyposis coli protein.</a> Cancer Res. 55 (21), 4797-4799 (1995).</li><li>Yamada, N. A., Castro, A., Farber, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+the+extent+of+microsatellite+instability+in+human+cell+lines+with+defects+in+different+mismatch+repair+genes.">Variation in the extent of microsatellite instability in human cell lines with defects in different mismatch repair genes.</a> Mutagenesis. 18 (3), 277-282 (2003).</li><li>Ahmed, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+and+genetic+features+of+24+colon+cancer+cell+lines.">Epigenetic and genetic features of 24 colon cancer cell lines.</a> Oncogenesis. 2, e71 (2013).</li><li>. GATK Available from: <a target="_blank" href="https://www.broadinstitute.org/gatk/guide">https://www.broadinstitute.org/gatk/guide</a> (2015)</li><li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+accurate+long-read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform.">Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>McKenna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genome+Analysis+Toolkit:+a+MapReduce+framework+for+analyzing+next-generation+DNA+sequencing+data.">The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data.</a> Genome Res. 20 (9), 1297-1303 (2010).</li><li>Cibulskis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+detection+of+somatic+point+mutations+in+impure+and+heterogeneous+cancer+samples.">Sensitive detection of somatic point mutations in impure and heterogeneous cancer samples.</a> Nat Biotechnol. 31 (3), 213-219 (2013).</li><li>Larson, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SomaticSniper:+identification+of+somatic+point+mutations+in+whole+genome+sequencing+data.">SomaticSniper: identification of somatic point mutations in whole genome sequencing data.</a> Bioinformatics. 28 (3), 311-317 (2012).</li><li>Koboldt, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VarScan+2:+somatic+mutation+and+copy+number+alteration+discovery+in+cancer+by+exome+sequencing.">VarScan 2: somatic mutation and copy number alteration discovery in cancer by exome sequencing.</a> Genome Res. 22 (3), 568-576 (2012).</li><li>. Oncotator Available from: <a target="_blank" href="https://www.broadinstitute.org/oncotator">https://www.broadinstitute.org/oncotator</a> (2015)</li><li>Wang, K., Li, M., Hakonarson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ANNOVAR:+functional+annotation+of+genetic+variants+from+high-throughput+sequencing+data.">ANNOVAR: functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data.</a> Nucleic Acids Res. 38 (16), e164 (2010).</li><li>Cingolani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+program+for+annotating+and+predicting+the+effects+of+single+nucleotide+polymorphisms,+SnpEff:+SNPs+in+the+genome+of+Drosophila+melanogaster+strain+w1118;+iso-2;+iso-3.">A program for annotating and predicting the effects of single nucleotide polymorphisms, SnpEff: SNPs in the genome of Drosophila melanogaster strain w1118; iso-2; iso-3.</a> Fly. 6 (2), 80-92 (2012).</li><li>Reva, B., Antipin, Y., Sander, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+the+functional+impact+of+protein+mutations:+application+to+cancer+genomics.">Predicting the functional impact of protein mutations: application to cancer genomics.</a> Nucleic Acids Res. 39 (17), (2011).</li><li>Ng, P. C., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIFT:+Predicting+amino+acid+changes+that+affect+protein+function.">SIFT: Predicting amino acid changes that affect protein function.</a> Nucleic Acids Res. 31 (13), 3812-3814 (2003).</li><li>Adzhubei, I., Jordan, D. M., Sunyaev, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+functional+effect+of+human+missense+mutations+using+PolyPhen-2.">Predicting functional effect of human missense mutations using PolyPhen-2.</a> Curr Protoc Hum Genet. Chapter 7, Unit 7.20 (2013).</li><li>Barretina, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cancer+Cell+Line+Encyclopedia+enables+predictive+modelling+of+anticancer+drug+sensitivity.">The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity.</a> Nature. 483 (7391), 603-607 (2012).</li><li>Abaan, O. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exomes+of+the+NCI-60+panel:+a+genomic+resource+for+cancer+biology+and+systems+pharmacology.">The exomes of the NCI-60 panel: a genomic resource for cancer biology and systems pharmacology.</a> Cancer Res. 73 (14), 4372-4382 (2013).</li><li>Forbes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cosmic+2005.">Cosmic 2005.</a> Br J Cancer. 94 (2), 318-322 (2006).</li><li>Shah, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clonal+and+mutational+evolution+spectrum+of+primary+triple-negative+breast+cancers.">The clonal and mutational evolution spectrum of primary triple-negative breast cancers.</a> Nature. 486 (7403), 395-399 (2012).</li><li>Behjati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+PTPRB+and+PLCG1+mutations+in+angiosarcoma.">Recurrent PTPRB and PLCG1 mutations in angiosarcoma.</a> Nat Genet. 46 (4), 376-379 (2014).</li><li>de las Alas, M. M., Aebi, S., Fink, D., Howell, S. B., Los, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+DNA+mismatch+repair:+effects+on+the+rate+of+mutation+to+drug+resistance.">Loss of DNA mismatch repair: effects on the rate of mutation to drug resistance.</a> J Natl Cancer Inst. 89 (20), 1537-1541 (1997).</li><li>Kotani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mutation+in+the+miR-128b+gene+reduces+miRNA+processing+and+leads+to+glucocorticoid+resistance+of+MLL-AF4+acute+lymphocytic+leukemia+cells.">A novel mutation in the miR-128b gene reduces miRNA processing and leads to glucocorticoid resistance of MLL-AF4 acute lymphocytic leukemia cells.</a> Cell Cycle. 9 (6), 1037-1042 (2010).</li><li>Straussman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+micro-environment+elicits+innate+resistance+to+RAF+inhibitors+through+HGF+secretion.">Tumour micro-environment elicits innate resistance to RAF inhibitors through HGF secretion.</a> Nature. 487 (7408), 500-504 (2012).</li><li>Yang, X., Sexauer, A., Levis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+stroma-mediated+resistance+to+FLT3+inhibitors+in+FLT3-ITD+AML+is+mediated+by+persistent+activation+of+extracellular+regulated+kinase.">Bone marrow stroma-mediated resistance to FLT3 inhibitors in FLT3-ITD AML is mediated by persistent activation of extracellular regulated kinase.</a> Br J Haematol. 164 (1), 61-72 (2014).</li><li>Arora, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid+receptor+confers+resistance+to+antiandrogens+by+bypassing+androgen+receptor+blockade.">Glucocorticoid receptor confers resistance to antiandrogens by bypassing androgen receptor blockade.</a> Cell. 155 (6), 1309-1322 (2013).</li><li>Schenone, M., Dancik, V., Wagner, B. K., Clemons, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+identification+and+mechanism+of+action+in+chemical+biology+and+drug+discovery.">Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery.</a> Nat Chem Biol. 9 (4), 232-240 (2013).</li></ol>

עמלות פרסום לכתבה זו משולמות על ידי H3 ביו-רפואה.

<html> בחירה של קו תא (ים): אפיון של מדינה גנטית וחוסר יציבות גנומית אין ספק, הגורם היחיד הקריטי ביותר בחשיפה בהצלחה קלינית מנגנוני התנגדות רלוונטיים היא בחירת קו התא הראשונית. שני גורמים צריכים להיחשב. ראשית, מטרה לבחור קו תא (ים) של אותו השושלת / תת סוג חסת התכונות גנטיות ההגדרה של המחלה (למשל., BRAF V600E מלנומה). חקירה של נתונים transcriptomic ומוטציה זמינים בפומבי לשתי שורות תאי 30-32 וגידולים ראשוניים / גרורות למגוון אינדיקציות 33,34 תקל על תהליך הבחירה. למרות זיהוי של שורות תאים עם שינויים גנטיים רלוונטיים מבחינה קלינית הוא אידיאלי, במקרים מסוימים זה עשוי להיות לא אפשרי בגלל חוסר שורות תאים זמינים או אפשרי בשל גורמים כמו קושי ואורכו של תהליך המיון. &gt; בנוגע לנקודה האמורה, גורם שני הוא לשקול לאחר מכן במהלך בחירת שורת תאים הוא הקלות או הכדאיות של התנגדות הקרנה באמצעות הקו הרצוי. לדוגמא, גורמים כגון הפצה ושיעורי מוטציה פנימיות יכולים להשפיע במידה רבה על המהירות של גילוי. לשם כך, יכולות להיות מנוצלת שורות תאים עם קינטיקה מהירה צמיחה וחסרה מנגנוני DNA MMR בתקווה שהופעתה של התנגדות ספונטנית יכולה להיות מואצת 35. בהתבסס על המאגר קוסמי, כמה שורות תאי מועמד קיימות עם מחסור באחד משני הגנים שעברו מוטציה לעתים קרובות MMR, MSH2 או MLH1 (לוחות 2 ו -3). לחלופין, אם שורות תאים של עניין לא קיימות פגמים נושאים בMMR, טיפול אקוטי עם מוטציות כימיות פיזיות או DNA תגובתי כגון סוכן אלקילציה -nitrosourea N -ethyl- N (ENU) יכול לשמש כדי לשפר חוסר יציבות גנומית. למרות ששני הגישות רשאית זה באופן משמעותיHorten הזמן להשיג שיבוטים עמידים ומעקב רצף, בדיקות פונקציונליות מחמירות צריכה להתבצע על גני מועמדים כמספר גדול יותר של אי-פונקציונלי, מוטציות נוסעים צפויות לצאת. SNVs יכול להיות דרגת הורה למקסם את הסיכויים לזיהוי מוטציות רלוונטיות מבחינה תפקודית. ראשית, בחירה אלה מוטציות שחוזרות על עצמם בשיבוטים עצמאיים תגדיל את סבירות מוטציות אלה הן נהגים של התנגדות. במקרה מוטציות חוזרות ונשנות אינן מזוהות, תוך התמקדות בSNVs שמתאים את מנגנון פעולה של התרופה (לדוגמא, יעד הסמים או מפעיל במורד הזרם ידוע של יעד התרופה) עשוי להיות משמעותי. סופו של דבר, את תקן הזהב הוא תמיד הערכה ניסיונית של פעילות התנגדות-הענקת SNVs המועמד על ידי ביטוי cDNA חוץ רחמי בתאי הורים תרופה רגישה. ה- DNA לעומת רצף RNA שיבוטים פעם עמידים כבר נוצרו, DNA ו / או RNAיכול להיות רצף בהתאם לצורך. רצפי DNA, או exome או רצף הגנום, יאפשר זיהוי של גרסאות germline וגופניים, כגון SNPs, indels ולהעתיק מספר הגרסאות. בעוד רצף exome עלות ידידותית יותר מתמקד ביצירת קוראת מאזורי קידוד ידועים, רצף הגנום יפיק נתונים רצף לכל הגנום אשר עשוי להקל על זיהוי של מוטציות באלמנטי קידוד שאינו כגון משפרי או miRNAs 36. עם זאת, מאז נתונים ביטוי גנים לא תעיד ברצפי DNA, שקשה לחזות שמוטציה (ים) עשוי להיות נהג פונקציונלי. בהקשר זה, הרצף של RNA, אם כי יקר יותר, מציע את היתרון הזה. העובדה שייעוד המוטציה מתבצע רק על מיני RNA מתבטאים משפרת את הסיכוי שהמוטציה של עניין עשויה להיות נהג פונקציונלי. בנוסף מאפשר סקר ממוקד יותר של מוטציות לבדיקה פונקציונלית מעקב, רצף RNA גםמציע יתרון הנוסף של להיות מסוגל לזהות שינויים גנטיים ביטוי, שחבור חלופי ומיני RNA chimeric רומן, כולל שילובי גן שעשוי לשמש גם נהגים חזקים כמו של התנגדות. צינור ביואינפורמטיקה פקודות דוגמא מסופקות להמחשה, אבל תיעוד והדרכות מפורטים יותר זמינים מהרחב מכון 16 ויש לקרוא ביסודיות לפני תחילת ניתוח NGS. הפקודות הבאות מיועדות לסביבת UNIX פגז במערכת שבה כל הכלים ומידע התייחסות הותקנו מראש. פקודות אלה גם להניח קבצי FASTQ רצף לזווג-הסוף המכיל קורא משתי דגימות, בשם &quot;הורים&quot; ו- &quot;עמיד&quot;, כבר קיבל מהספק והניח בספרייה &quot;נתונים&quot;. ברוב המקרים צריכים להיות מותאמות בפקודות אלה או מותאמים ליישום ספציפי באמצעות arg נוסף של שורת הפקודהuments (למשל, הוספה &quot;-t 8&quot; לפקודת BWA מאפשרת פעולה מרובה על פני 8 ליבות מעבד). קבוצות קראו (שלהקצות מערכים לדגימות ביולוגיות), חייבות לעתים קרובות ניתן להוסיף לקבצי BAM גם אם יש דגימה אחת בלבד לכל קובץ BAM, על מנת לעמוד בדרישות פורמט קובץ לכלים מסוימים. קראו פרמטרים קבוצת RGID, RGSM, RGPL, RGPU, וRGLB יכול להיות מחרוזות שרירותיות המתארות את שם המדגם, פלטפורמת רצף, ואסטרטגיה ספרייה. במבחנה לעומת מבחני in vivo למרות שכמה מנגנוני התנגדות זוהו על ידי בחירה במבחנה אומתו להיות רלוונטי מבחינה קלינית, קיים אפשרות שהמנגנונים לא יכולים לשמש מנגנונים רלוונטיים או דומיננטיים כמו של התנגדות קלינית. אחת סיבות לכך עשויות לכלול תפקיד חיוני למייקרו-הסביבה בנהיגת התנגדות לטיפול, רכיב שהוא נטול בניסוי הפרוטוקול / ההתקנה דiscussed עד כה. ואכן, מספר מחקרים הראו כי חומרים אנטי-סרטניים שמסוגלים להרוג תאי גידול כבלתי יעילים כאשר התאים הסרטניים בתרבית בנוכחות של תאי סטרומה רומזים מנגנונים מולדים של התנגדות שמעניק סטרומה 37,38. לזהות מנגנונים מושרה סטרומה כגון רכשו התנגדות, ניתן לשקול ביצוע שיתוף תרבות במבחנה או במבחני עמידות גידול vivo. מאז assay לשעבר הוא די מורכב, רבים נקטו יצירת xenografts גידול עמידה לתרופות לטיפול בתפקיד הפוטנציאלי של סטרומה בנהיגת התנגדות. מחקרים כאלה חשפו 5 וייחודיים 39 שני מנגנונים הזהים של התנגדות ביחס לבחירה במבחנה, רומזים כי סטרומה אכן עשויה לשחק תפקיד באחרון. עם זאת, יש להיות מודע לאורכו של זמן זה עלול לקחת כדי ליצור גידולים עמידים כגון ואת המורכבות של הניתוח-complexitie הגנומי המעקבים בשל ההטרוגניות המולקולרית ותאית תוך ממאירות. זיהוי יעד בנוסף לחשיפת מנגנוני עמידות לתרופה, גישת פרופיל הגנומי מבוסס NGS זה יכול להיות מיושמת גם כדי לזהות מטרות סלולריות של בדיקות כימיות. מבחינה הסטורית, שיטות משוחדת מרובות כבר משמשות לזיהוי המנגנונים התאיים של פעולה ומטרות של כימיקלים במשקל מולקולריים נמוכים עם פעילות ביולוגית, כוללים טיהור זיקה בשילוב עם פרוטאומיקה כמותית, שיטות הגנומי שמרים, הקרנת RNAi, ומסקנה חישובית גישות 40. כהרחבה להבהרת מנגנוני סמים התנגדות באמצעות פרופיל הגנומי או transcriptomic מבוסס NGS של אוכלוסיות תאי phenotypically עמידות, זיהוי של וריאציות ייחודיות חוזרות אחת נוקלאוטיד (SNVs) או שינויי ביטוי המאפשרים התנגדות יכולה להציע תובנות יעדים סלולריים פונקציונליים של תרכובות. Tשלו מבוסס על הרעיון שקבוצת משנה של מנגנוני התנגדות נצפו עשויה להיות כרוך מוטציות חוזרות ונשנות בגנים המקודדים את חלבון היעדים הישירים של המולקולה הקטנה. לאחרונה, כמה דיווחי תוקף השירות של הגישה, במיוחד על ידי שילוב עם גישות אחרות, כוללים פרופיל רגישות שורת תאי הסרטן בקנה מידה גדולה, לחשיפת היעדים הסלולריים של מולקולה קטנה בוחן 9,10.

אפיון מולקולרי מפורט של הגנום גידול על ידי טכנולוגיות רצף חזקות וכלים אנליטיים נתונים משופרים הוביל לגילוי של שינויים גנטיים מרכזיים בסוגי הסרטן ספציפיים 1,2. פיתוח של טיפולים ממוקדים במטרה הנגעים הגנטיים הללו, כגון HER2, BCR-ABL, EGFR וALK, השתפר באופן משמעותי באיכות חיים של חולי 1,2. עם זאת, למרות ייחודה של גישה זו, התגובה הקלינית לטיפולים בודדים ביותר הייתה תת-אופטימלית כהתנגדות סופו של דבר מתגלה. לאחרונה, התקדמות משמעותית נעשתה בהבנת היסודות המולקולריים של התנגדות לתרופות ממוקדות. מעניין לציין, שזה הופך להיות ברור כי מנגנון בולט של התנגדות כרוכה פעילות היעד / מסלול מתמשך. כדוגמה לכך, קולטן האנדרוגן (AR) -directed טיפול enzalutamide של סרטן הערמונית גורם להעשרת הפעלת מוטציות בAR עצמו, שמירה על outp איתות-ARut בנוכחות המעכב 3-5. ידע זה הוביל לקמפיין אגרסיווי ל1) לפתח יריבים דור שלישיים שיכול להמשיך לדכא שני WT ותפקוד המוטציה-AR בenzalutamide עמיד PCA 3 ו -2) לזהות צמתים במורד הזרם פוטנציאליים של איתות AR שעשוי להיות ממוקד להתערבות טיפולית . באופן דומה, התנגדות לסוגים אחרים של מעכבים כגון אלה מיקוד EGFR, BRAF וABL לעתים קרובות להוביל למוטציות שמחדש את מסלול קינאז ממכר המקורי 1. בידיעה שההתנגדות עולה באופן בלתי נמנע ברוב החולים, פיתוח גישות להביא זריזות מנגנונים אלה לאור יאפשר פיתוח של טיפולי מעקב יעילים. גישה אחת שנמצא בשימוש נרחב היא לנתח את הגנומיקה של גידולים עקשן קליניים ביחס לגידולי טיפול-נאיבי או -sensitive לזהות מוספים / depletions בנגעים גנטיים שעשויה להיות נוח לדגילוי שטיח. למרות הבטחתה, יש שתי התחייבויות עיקריות של גישה זו שתפגענה בגילוי מהיר. ראשית, לקבל גישה לחומר בזמן גידול לחקירה הגנומי עשויה לשמש כמכשול משמעותי במעבר מטיפול כדי לרפא. שנית, deconvolution של מספר עצום של נגעים גנטיים בהגדרה עמידה עשוי להיות מאתגר מאז גידולים יכולים להציג ההטרוגניות התוך ממאירות משמעותית 6,7. לאור אתגרים אלה, יש כבר עלה הסתמכות על גילוי פרה-קליני של מנגנוני התנגדות. גישה זו עשויה לאפשר זיהוי של מנגנוני התנגדות בולטים לפני הניסויים הקליניים שעשויות להנחות 1 אסטרטגיות חלופיות לניהול קליני בחולים שנושאים מנגנונים אלה גם לפני טיפול או בעקבות תחילתה של התנגדות. כלי אחד כזה פרה-קליני גילוי שנמצא בשימוש נרחב הוא להחיל מסכי RNAi פונקציונליים משוחד. לבחינהple, ויטאקר ועמיתים מיושמים מסך RNAi הגנום בקנה מידה לזהות כי אובדן NF1 מתווך התנגדות למעכבי RAF וMEK באמצעות הפעלת מסלול MAPK ספג 8. ממצאים אלה נמצאו להיות רלוונטיים מבחינה קלינית כמוטציות פסד של הפונקציה בNF1 נצפו בתאי גידול -mutant BRAF שמהותו עמידים לעיכוב חיל האוויר המלכותי ובגידולים מלנומה עמידים לvemurafenib הפעלה 8. עם זאת, למרות הצלחתה של גישה זו, מטרות רלוונטיות מבחינה קלינית רבות לעתים קרובות אינה מזוהות, ככל הנראה בשל ההטיה הפסד של פונקציה של גישה זו. לעומת זאת, כלי פחות מוטה לגילוי פרה-קליני של מנגנוני התנגדות כרוך הדור של שורות תאים עמידות בחשיפה ממושכת למתחם של עניין בשילוב עם פרופיל הגנומי או transcriptomic מבוסס NGS. גישה זו יושמה בהצלחה על ידי מספר קבוצות לזהות ספונטנישינויים חוזרים ונשנים אחת גרסאות נוקלאוטיד או ביטוי שיאפשר התנגדות 5,9,10. לדוגמא, מוטציה F876L חוזרת בAR התגלתה לאחרונה בשיבוטים עמידים במבחנה 3-5 ובגידולי xenograft in vivo 5 לפני זיהוי מוטציה זו במרפאת 4. ממש לאחרונה, באנג ועמיתיו (2015) 11 משמשים ClonTracer בשני דגמים רלוונטיים קליני להראות כי רוב השיבוטים עמידים המתעוררים במהלך חשיפה לסמים ממושכת היו חלק מתת-אוכלוסייה מראש קיימים מצביעה על כך שרוב רלוונטי תפקודי מוטציות הם כנראה כבר קיים מראש שהופך נבחר לבמהלך בחירה 11. בניגוד לפרופיל הגנטי של גידולים שנאמרו קודם לכן, יתרונות גישה זו מפחות ההטרוגניות כשיבוטים &quot;הומוגנית&quot; עמידים המשמשים לניתוח להקל נתיחה גנטית מדויקת יותר של פוטנציאל נהגים. Furthermבצר, מרגש, בנוסף לפוטנציאל לחשיפת מנגנונים של התנגדות, שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם כדי לזהות את המנגנונים התאיים של פעולה ומטרות של מולקולות קטנות ביו שמידע זה הוא 10 לא ידוע. בהתחשב ביתרונות ברורים ושימושים רבים של גישה זו, כאן אנו מציגים פרוטוקול המפרט את היישום מוצלח של מסך כזה פרה-קליני למקסם את הפוטנציאל לתגליות משמעותיות קליני.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>48-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-86&#160;</td>
			<td>Expanding clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-588</td>
			<td>Generating GI50 curves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7572</td>
			<td>Viability testing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cloning discs (3 mm)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z374431</td>
			<td>Picking clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile forceps</td>
			<td>Unomedical</td>
			<td>DF8088S</td>
			<td>Picking clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus RNA extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td>Isolating RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood and Tissue DNeasy extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69581</td>
			<td>Isolating gDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GATK</td>
			<td>The Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>Indel realigner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MuTect</td>
			<td>The Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>Paired variant calling tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oncotator</td>
			<td>The Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>Variant annotation tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MutationAccessor</td>
			<td>The Broad Institute</td>
			<td></td>
			<td>Functional impact prediction tool</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implementation of in vitro drug resistance assays: maximizing the potential for uncovering clinically relevant resistance mechanisms

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical specimens, have been applied to uncover these resistance mechanisms to facilitate follow-up care. Although these approaches have led to clinically relevant discoveries, difficulties in attaining the relevant patient material or in deconvoluting the genomic data collected from these specimens have severely hampered the path towards a cure. To this end, we here describe a tool for expeditious discovery that may guide improvement in first-line therapies and alternative clinical management strategies. By coupling preclinical in vitro or in vivo drug selection with next-generation sequencing, it is possible to identify genomic structural variations and/or gene expression alterations that may serve as functional drivers of resistance. This approach facilitates the spontaneous emergence of alterations, enhancing the probability that these mechanisms may be observed in the patients. In this protocol we provide guidelines to maximize the potential for uncovering single nucleotide variants that drive resistance using adherent lines.

למקסם את הפוטנציאל לגילוי נהגים פונקציונליים מפתח של התנגדות, בחר שיבוטים תא בודדים להרחבה, בדיקה פנוטיפי ורצף. כפי שמודגם באיור 4 א, ​​תאי HCT116 טופלו במשך תקופה ממושכת עם המתחם ציטוטוקסיות # 1 הוביל להופעה הספונטנית של שיבוטים עמידים שהמשיכה לגדול במהלך הטיפול (עיגולים שחורים מקווקוים). שיבוטים אלה נאספו באמצעות # גישת 1 מודגש באיור 3 ולאחר מכן התרחב לניתוח פנוטיפי. כפי שניתן לראות באיור 4, שיבוטים עמידים 1-3 כל הראו התנגדות משמעותית למתחם המס &#39;1 ו# מתחם אנלוגי קרוב 2 (הכדאיות / צמיחה גדולה יותר) שלה, ואילו כל השיבוטים הראו רגישות להוולקייד מתחם ציטוטוקסיות שאינו קשור. בעקבות אישור של התנגדות פנוטיפי, gDNA היה מבודד והוגש לניתוח רצפים כל-exome. הכלים ביואינפורמטיקה יושמו כדי לצמצם בגרסות המבניות אלה שהם) חוזרים 1 ו -2) יש פוטנציאל להשפעה תפקודית (איור 5 א). גרסאות מבניות שפגשו שני קריטריונים אלה אושרו על ידי כלי רצף עצמאי. כפי שמודגם באיור 5, מוטציה missense הטרוזיגוטיים שזוהתה באמצעות רצף כל-exome אושר בשיטת סנגר הרצף (פנל עליון, רצף WT; פנל תחתון, רצף מוטציה). בעקבות אישור רצף, קו תא ההורים שימש במקור עבור assay ההתנגדות היה מהונדס גנטי לבטא cDNA המוטציה כדי לאשר את התפקיד של המוטציה תפקודית. כפי שמודגם באיור 6, ואילו ביטוי יתר של cDNA WT לא הצליח להקנות עמידות, נאלץ ביטוי של התנגדות פנוטיפי העניק באופן משמעותי את cDNA המוטציה למתחם מס &#39;1, המאשר את התפקיד הפונקציונלי של וריאציה מבנית זו כנהג של התנגדות. כל חומרים כימיים המשמשים לצורך הניסוי הזה מפורטים בטבלה 1 </s<html> טרונג&gt;. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52879/52879fig1.jpg" /> איור 1. פריסה של צלחות assay ושליטה. צל כחול, בארות טיפול מתחם. צל לבן, בינוני בלבד. תרכובות בדילול סדרתי 1: 4 ומנוהלות בtriplicates (BD או EG). 2 תרכובות יכולות להיות מיושמות לכל צלחת. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52879/52879fig2.jpg" /> איור 2. עקומות כדאיות נציג. קו מקווקו אדום מייצג את היום 0 קריאה. ציר X מציין הגדלת מינון של מתחם לימין וציר y מייצג כדאיות היחסית לבארות שליטת DMSO. GI 100 = מינון שניתן להשגה 100% עיכוב צמיחה; GI 50 = מנה משמשת להפחתת כדאיות 50% משליטת DMSO. <html> _upload / 52,879 / 52879fig3.jpg &quot;/&gt; איור 3. שתי גישות לקטיף שיבוטים עמידים להרחבה. גישת pipettor 1 השימוש להרים ולהעביר שיבוטים מוגדרים היטב לצלחות 48-היטב. 2 שימוש בגישה טריפסין ספוג דיסקי שיבוט להרים שיבוטים ולהעביר לצלחות 48-היטב. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52879/52879fig4.jpg" /> אישור איור 4. ההתנגדות השיגה עבור שיבוטים HCT116 למתחם המס &#39;1 במבחנה. # מתחם () השיבוטים HCT116 1 עמיד יצאו בעקבות בחירתה של שלושת שבועות רצופים. הכדאיות (B) של שיבוטים שליטה ועמידים נבדקה לאחר טיפול 72 שעות בתרכובות שונות. מתחם המס &#39;2 הוא אנלוגי קרובה של מתחם מס&#39; 1. הוולקייד שימש כסוכן ציטוטוקסיות שליטה. הנתונים מוצגים כסטיית תקן הממוצע של שלושה + משכפל ביולוגי. EP-together.within עמודים = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52879/52879fig5.jpg" /> זיהוי איור 5. של מוטציה ייחודית, חוזרת ונשנית (גרסאות נוקלאוטיד הבודד, SNVs) בגן בשיבוטי HCT116 1 עמידים # מתחם. זרימת עבודה () לזהות SNVs נוכח בכל השיבוטים העמידים וצפויה להיות השפעה תפקודית גבוהה על ידי MutationAssessor. אישור (ב) למוטציה בגן על ידי סנגר רצף. <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/52879/52879fig6.jpg" /> איור 6. מחדש ביטוי של התנגדות מוטציה העניקה גן למתחם מס &#39;1 במבחנה. הכדאיות של שורות תאים המהונדסים HCT116 נבדקה לאחר טיפול 72 שעות במתחם המס&#39; 1. HCT116-WT או שורות תאי מוטציה ביציבות להביע WT או cDNAs מוטציה של גן, בהתאמה. הנתונים מוצגים כo סטייה ממוצעת + סטנדרטיתו שלושה משכפל ביולוגי. <table style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם לדוגמא </td><td> חומצת אמינו </td><td colspan="2"> רקמות עיקריות </td><td> זיגוסיות </td></tr><tr><td> C-33- </td><td> p.E768fs * 44 </td><td colspan="2"> צוואר רחם </td><td> הטרוזיגוטיים </td></tr><tr><td> C-33- </td><td> p.S860 * </td><td colspan="2"> צוואר רחם </td><td> הטרוזיגוטיים </td></tr><tr><td> CML-T1 </td><td> עמ &#39;.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> הומוזיגוטים </td></tr><tr><td> CP66-MEL </td><td> p.C822F </td><td colspan="2"> עוֹר </td><td> הטרוזיגוטיים </td></tr><tr><td> CTV-1 </td><td> p.0? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> הומוזיגוטים </td></tr><tr><td> EFO-27 </td><td> p.Q130fs * 2 </td><td colspan="2"> שַׁחֲלָה </td><td> הטרוזיגוטיים </td></tr><tr><td> EFO-27 </td><td> עמ &#39;.? </td><td colspan="2"> שַׁחֲלָה </td><td> הטרוזיגוטיים </td></tr><tr> &lt;td&gt; HCC2218 </td><td> p.E467K </td><td colspan="2"> חָזֶה </td><td> הטרוזיגוטיים </td></tr><tr><td> J-RT3-T3-5 </td><td> p.R711 * </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> הומוזיגוטים </td></tr><tr><td> LNCaP </td><td> עמ &#39;.? </td><td colspan="2"> בלוטת הערמונית </td><td> הומוזיגוטים </td></tr><tr><td> LoVo </td><td> עמ &#39;.? </td><td colspan="2"> המעי הגס </td><td> הומוזיגוטים </td></tr><tr><td> נשירה-13 </td><td> p.R711 * </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> הומוזיגוטים </td></tr><tr><td> NALM-6 </td><td> עמ &#39;.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> הומוזיגוטים </td></tr><tr><td> NCI-H630 </td><td> p.R680 * </td><td colspan="2"> המעי הגס </td><td> הטרוזיגוטיים </td></tr><tr><td> SKUT-1 </td><td> p.L787fs * 11 </td><td colspan="2"> רירית הרחם </td><td> הומוזיגוטים </td></tr><tr><td> SKUT-1B </td><td> PL787fs * 11 </td><td colspan="2"> רירית הרחם </td><td> הומוזיגוטים </td></tr><tr><td> SUP-T1 </td><td> עמ &#39;.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> הומוזיגוטים </td></tr></tbody></table> שורות תאי -mutated הטבלה 1. MSH2. שורת תאים (שם דוגמא), החלפת חומצת אמינו, שושלת היוחסין של מוצא וזיגוסיות מצוינות. <table style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם לדוגמא </td><td> חומצת אמינו </td><td colspan="2"> רקמות עיקריות </td><td> זיגוסיות </td></tr><tr><td> CCRF-CEM </td><td> p.R100 * </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> הטרוזיגוטיים </td></tr><tr><td> CCRF-CEM </td><td> עמ &#39;.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> הטרוזיגוטיים </td></tr><tr><td> CW-2 </td><td> p.Y130fs * 6 </td><td colspan="2"> המעי הגס </td><td> הומוזיגוטים </td></tr><tr><td> DU-145 </td><td> עמ &#39;.? </td&gt; <td colspan="2"> בלוטת הערמונית </td><td> הומוזיגוטים </td></tr><tr><td> GR-ST </td><td> עמ &#39;.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> הומוזיגוטים </td></tr><tr><td> HCT-116 </td><td> p.S252 * </td><td colspan="2"> המעי הגס </td><td> הומוזיגוטים </td></tr><tr><td> IGROV-1 </td><td> p.S505fs * 3 </td><td colspan="2"> שַׁחֲלָה </td><td> הומוזיגוטים </td></tr><tr><td> MN-60 </td><td> עמ &#39;.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> הומוזיגוטים </td></tr><tr><td> NCI-SNU-1 </td><td> p.R226 * </td><td colspan="2"> בֶּטֶן </td><td> הומוזיגוטים </td></tr><tr><td> P30-OHK </td><td> עמ &#39;.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> הומוזיגוטים </td></tr><tr><td> PR-מל </td><td> עמ &#39;.? </td><td colspan="2"> עוֹר </td><td> הומוזיגוטים </td></tr><tr><td> ר&#39; </td><td> עמ &#39;.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td&gt; <td> הומוזיגוטים </td></tr><tr><td> SK-OV-3 </td><td> p.0? </td><td colspan="2"> שַׁחֲלָה </td><td> הומוזיגוטים </td></tr><tr><td> SNU-1,544 </td><td> p.S2L </td><td colspan="2"> המעי הגס </td><td> הטרוזיגוטיים </td></tr><tr><td> SNU-1,746 </td><td> p.E523K </td><td colspan="2"> המעי הגס </td><td> הומוזיגוטים </td></tr><tr><td> SNU-324 </td><td> p.C233R </td><td colspan="2"> לַבלָב </td><td> הטרוזיגוטיים </td></tr><tr><td> SNU-324 </td><td> p.V384D </td><td colspan="2"> לַבלָב </td><td> הטרוזיגוטיים </td></tr><tr><td> SNU-478 </td><td> p.V384D </td><td colspan="2"> לַבלָב </td><td> הטרוזיגוטיים </td></tr></tbody></table> שורות תאי -mutated הטבלה 2. MLH1. שורת תאים (שם דוגמא), החלפת חומצת אמינו, שושלת היוחסין של מוצא וזיגוסיות מצוינות.

Watch this Scientific Journal Video about Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms at JoVE.com

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

עמידות לתרופות לטיפולים ממוקדים היא נרחבת והצורך לזהות מנגנונים של התנגדות - לפני או אחרי הופעה קלינית - היא קריטי להדרכת אסטרטגיות ניהול קליניות חלופיות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לגזירה כמה קווים עמידים לתרופות במבחנה עם רצף לזרז גילוי המנגנונים אלה.

הטמעה של<em&gt; במבחנה</em&gt; תרופות מבחני התנגדות: למקסם את הפוטנציאל לחשיפת מנגנוני התנגדות קלינית רלוונטיים

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical ...

implementation-vitro-drug-resistance-assays-maximizing-potential-for

Research

JoVE Journal

Medicine

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

10.5K Views.  H3 Biomedicine.  עמידות לתרופות לטיפולים ממוקדים היא נרחבת והצורך לזהות מנגנונים של התנגדות - לפני או אחרי הופעה קלינית - היא קריטי להדרכת אסטרטגיות ניהול קליניות חלופיות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לגזירה כמה קווים עמידים לתרופות במבחנה עם רצף לזרז גיל...

Video: Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Assessing Myogenic Response and Vasoactivity In Resistance Mesenteric Arteries Using Pressure Myography

Small resistance arteries constrict and dilate respectively in response to increased or decreased intraluminal pressure; this phenomenon known as myogenic response is a key regulator of local blood flow. In isobaric conditions small resistance arteries develop sustained constriction known as myogenic tone (MT), which is a major determinant of systemic vascular resistance (SVR). Hence, ex vivo&#160;pressurized preparations of small resistance arteries are major tools to study microvascular function in near-physiological states. To achieve this, a freshly isolated intact segment of a small resistance artery (diameter ~260 &#956;m) is mounted onto two small glass cannulas and pressurized. These arterial preparations retain most in vivo characteristics and permit assessment of vascular tone in real-time. Here we provide a detailed protocol for assessing vasoactivity in pressurized small resistance mesenteric arteries from rats; these arteries develop sustained vasoconstriction - approximately 25% of maximal diameter - when pressurized at 70 mmHg. These arterial preparations may be used to study the effect of investigational compounds on relationship between intra-arterial pressure and vasoactivity and determine changes in microvascular function in animal models of various diseases.

Pressure myography is used to assess vasoactivity of small arteries that develop sustained constriction when pressurized. This manuscript provides a detailed protocol to assess in isolated segments of small mesenteric arteries from rats, vasoactivity and the effect of intraluminal pressure on vascular diameter.

הערכת myogenic תגובה וVasoactivity בעורקי ההתנגדות mesenteric שימוש Myography לחץ

Small resistance arteries constrict and dilate respectively in response to increased or decreased intraluminal pressure; this phenomenon known as myogenic ...

Optimization of High Grade Glioma Cell Culture from Surgical Specimens for Use in  Clinically Relevant Animal Models and 3D Immunochemistry

Glioblastomas, the most common and aggressive form of astrocytoma, are refractory to therapy, and molecularly heterogeneous. The ability to establish cell cultures that preserve the genomic profile of the parental tumors, for use in patient specific in vitro and in vivo models, has the potential to revolutionize the preclinical development of new treatments for glioblastoma tailored to the molecular characteristics of each tumor.
Starting with fresh high grade astrocytoma tumors dissociated into single cells, we use the neurosphere assay as an enrichment method for cells presenting cancer stem cell phenotype, including expression of neural stem cell markers, long term self-renewal in vitro, and the ability to form orthotopic xenograft tumors. This method has been previously proposed, and is now in use by several investigators. Based on our experience of dissociating and culturing 125 glioblastoma specimens, we arrived at the detailed protocol we present here, suitable for routine neurosphere culturing of high grade astrocytomas and large scale expansion of tumorigenic cells for preclinical studies. We report on the efficiency of successful long term cultures using this protocol&#160;and suggest affordable alternatives for culturing dissociated glioblastoma cells that fail to grow as neurospheres. We also describe in detail a protocol for preserving the neurospheres 3D architecture for immunohistochemistry. Cell cultures enriched in CSCs, capable of generating orthotopic xenograft models that preserve the molecular signatures and heterogeneity of GBMs, are becoming increasingly popular for the study of the biology of GBMs and for the improved design of preclinical testing of potential therapies.

Protocol for propagation of dissociated high grade glioma surgical specimens in serum-free neurosphere medium to select for cells with cancer stem cell phenotype. For specimens that fail to grow as neurospheres, an alternative protocol is suggested. A paraffin embedding technique for maintaining the 3D neurosphere architecture for immunocytochemistry is described.

אופטימיזציה של תרבית תאי גליומה בדרגה גבוהה מדגימות כירורגיות לשימוש במודלים קליניים רלוונטיים לבעלי חיים ואימונוכימיה תלת-ממדית

Glioblastomas, the most common and aggressive form of astrocytoma, are refractory to therapy, and molecularly heterogeneous. The ability to establish cell ...

An Affordable HIV-1 Drug Resistance Monitoring Method for Resource Limited Settings

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in sub-Saharan Africa continue to expand, individuals on ART should be closely monitored for the emergence of drug resistance. Surveillance of transmitted drug resistance to track transmission of viral strains already resistant to ART is also critical. Unfortunately, drug resistance testing is still not readily accessible in resource limited settings, because genotyping is expensive and requires sophisticated laboratory and data management infrastructure. An open access genotypic drug resistance monitoring method to manage individuals and assess transmitted drug resistance is described. The method uses free open source software for the interpretation of drug resistance patterns and the generation of individual patient reports. The genotyping protocol has an amplification rate of greater than 95% for plasma samples with a viral load &#62;1,000 HIV-1 RNA copies/ml. The sensitivity decreases significantly for viral loads &#60;1,000 HIV-1 RNA copies/ml. The method described here was validated against a method of HIV-1 drug resistance testing approved by the United States Food and Drug Administration (FDA), the Viroseq genotyping method. Limitations of the method described here include the fact that it is not automated and that it also failed to amplify the circulating recombinant form CRF02_AG from a validation panel of samples, although it amplified subtypes A and B from the same panel.

Drug resistance testing for HIV-1 infected individuals failing antiretroviral therapy (ART) can guide future therapies and improve treatment outcomes. Optimizing individual and population health outcomes in high HIV prevalence but resource-limited settings will ultimately require affordable and accessible drug resistance genotyping and interpretation methods.

שיטת ניטור משתלמת HIV-1 תרופות התנגדות להגדרות משאב מוגבלת

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in ...

Slow-release Drug Delivery through Elvax 40W to the Rat Retina: Implications for the Treatment of Chronic Conditions

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these diseases. Chronic retinal diseases such as retinal oedema or neovascularization usually require multiple intraocular injections to effectively treat the condition. However, the risks associated with these injections increase with repeated delivery of the drug. Therefore, alternative delivery methods need to be established in order to minimize the risks of reinjection. Several other investigations have developed methods to deliver drugs over extended time, through materials capable of releasing chemicals slowly into the eye. In this investigation, we outline the use of Elvax 40W, a copolymer resin, to act as a vehicle for drug delivery to the adult rat retina. The resin is made and loaded with the drug. The drug-resin complex is then implanted into the vitreous cavity, where it will slowly release the drug over time. This method was tested using 2-amino-4-phosphonobutyrate (APB), a glutamate analogue that blocks the light response of the retina. It was demonstrated that the APB was slowly released from the resin, and was able to block the retinal response by 7 days after implantation. This indicates that slow-release drug delivery using this copolymer resin is effective for treating the retina, and could be used therapeutically with further testing.

This paper details how Elvax 40W can be used as a slow-release method for drug delivery to the adult rat retina. The protocol for preparing, loading, and delivering the drug-resin complex to the eye is described.

משלוח שחרור איטי תרופות דרך Elvax 40W לרשתית העכברוש: ​​השלכות לטיפול במצבים כרוניים

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these ...

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone resorption. Osteoclasts can be generated in vitro from monocyte/macrophage precursor cells in the presence of certain cytokines, which promote survival and differentiation. Here, both in vivo and in vitro techniques are demonstrated, which allow scientists to study different cytokine contributions towards osteoclast differentiation, signaling, and activation. The minicircle DNA delivery gene transfer system provides an alternative method to establish an osteoporosis-related model is particularly useful to study the efficacy of various pharmacological inhibitors in vivo. Similarly, in vitro culturing protocols for producing osteoclasts from human precursor cells in the presence of specific cytokines enables scientists to study osteoclastogenesis in human cells for translational applications. Combined, these techniques have the potential to accelerate drug discovery efforts for osteoclast-specific targeted therapeutics, which may benefit millions of osteoporosis and arthritis patients worldwide.

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Differentiation of precursor cells into osteoclasts is regulated by cytokines and growth factors. Here, a novel gene transfer technique for differentiation of osteoclasts in vivo and cell culture protocols for differentiating precursor cells into osteoclasts in vitro as a method to study the effects of cytokines on osteoclastogenesis are described.

רומן<em&gt; In vivo</em&gt; טכניקה וין העברה<em&gt; במבחנה</emמבחני תא בהתבסס&gt; לחקר אובדן עצם בפרעות השלד והשרירים

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone ...

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same pathway, are likely to fail. Emphasis must be placed upon the inhibition of pathways that are responsible for intrinsic and/or adaptive resistance to therapy. An active field of investigation is the development and testing of DNA repair inhibitors that promote the action of, and prevent resistance to, commonly used chemotherapy and radiotherapy. We used a novel protocol to evaluate the effectiveness of BRCA2 inhibition as a means to sensitize tumor cells to the DNA damaging drug cisplatin. Tumor cell metabolism (acidification and respiration) was monitored in real-time for a period of 72 hr to delineate treatment effectiveness on a minute by minute basis. In combination, we performed an assessment of metastatic frequency using a chicken embryo chorioallantoic membrane (CAM) model of extravasation and invasion. This protocol addresses some of the weaknesses of commonly used in vitro and in vivo methods to evaluate novel cancer therapy regimens. It can be used in addition to common methods such as cell proliferation assays, cell death assays, and in vivo murine xenograft studies, to more closely discriminate amongst candidate targets and agents, and select only the most promising candidates for further development.

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Here, real-time monitoring of tumor cell metabolism, combined with an in vivo chicken embryo chorio-allantoic membrane (CAM) model of metastasis, are used to evaluate novel anti-cancer targets/agents for their ability to sensitize tumor cells to DNA damaging chemotherapeutics.

הערכת היעילות של תרופות למלחמה בסרטן רגישות<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same ...

Adapted Resistance Training Improves Strength in Eight Weeks in Individuals with Multiple Sclerosis

Hip weakness is a common symptom affecting walking ability in people with multiple sclerosis (MS). It is known that resistance strength training (RST) can improve strength in individuals with MS, however; it remains unclear the duration of RST that is needed to make strength gains and how to adapt hip strengthening exercises for individuals of varying strength using only resistance bands. This paper describes the methodology to set up and implement an adapted resistance strength training program, using resistance bands, for individuals with MS. Directions for pre- and post-strength tests to evaluate efficacy of the strength-training program are included. Safety features and detailed instructions outline the weekly program content and progression. Current evidence is presented showing that significant strength gains can be made within 8 weeks of starting a RST program. Evidence is also presented showing that resistance strength training can be successfully adapted for individuals with MS of varying strength with little equipment.

Hip weakness is a common symptom affecting walking ability in people with multiple sclerosis. Isolated muscle strengthening is a useful method to target specific weaknesses. This protocol describes a progressive resistance-training program using exercise bands to increase hip muscle strength.

התנגדות מותאמת הדרכה משפרת את החוזק בשמונה שבועות באנשים עם טרשת נפוצה

Hip weakness is a common symptom affecting walking ability in people with multiple sclerosis (MS). It is known that resistance strength training (RST) can ...

A Model to Simulate Clinically Relevant Hypoxia in Humans

In case of apnea, arterial partial pressure of oxygen (pO2) decreases, while partial pressure of carbon dioxide (pCO2) increases. To avoid damage to hypoxia sensitive organs such as the brain, compensatory circulatory mechanisms help to maintain an adequate oxygen supply. This is mainly achieved by increased cerebral blood flow. Intermittent hypoxia is a commonly seen phenomenon in patients with obstructive sleep apnea. Acute airway obstruction can also result in hypoxia and hypercapnia. Until now, no adequate model has been established to simulate these dynamics in humans. Previous investigations focusing on human hypoxia used inhaled hypoxic gas mixtures. However, the resulting hypoxia was combined with hyperventilation and is therefore more representative of high altitude environments than of apnea. Furthermore, the transferability of previously performed animal experiments to humans is limited and the pathophysiological background of apnea induced physiological changes is poorly understood. In this study, healthy human apneic divers were utilized to mimic clinically relevant hypoxia and hypercapnia during apnea. Additionally, pulse-oximetry and Near Infrared Spectroscopy (NIRS) were used to evaluate changes in cerebral and peripheral oxygen saturation before, during, and after apnea.

Hypoxia simulation in humans has usually been performed by inhaling hypoxic gas mixtures. For this study, apneic divers were used to simulate dynamic hypoxia in humans. Additionally, physiological changes in desaturation and re-saturation kinetics were evaluated with non-invasive tools such as Near-Infrared-Spectroscopy (NIRS) and peripheral oxygenation saturation (SpO2).

מודל כדי לדמות היפוקסיה משמעות קלינית בבני אדם

In case of apnea, arterial partial pressure of oxygen (pO2) decreases, while partial pressure of carbon dioxide (pCO2) increases. To avoid damage to ...

A Cell Culture Model of Resistance Arteries

The myoendothelial junction (MEJ), a unique signaling microdomain in small diameter resistance arteries, exhibits localization of specific proteins and signaling processes that can control vascular tone and blood pressure. As it is a projection from either the endothelial or smooth muscle cell, and due to its small size (on average, an area of ~1 &#181;m2), the MEJ is difficult to study in isolation. However, we have developed a cell culture model called the vascular cell co-culture (VCCC) that allows for in vitro MEJ formation, endothelial cell polarization, and dissection of signaling proteins and processes in the vascular wall of resistance arteries. The VCCC has a multitude of applications and can be adapted to suit different cell types. The model consists of two cell types grown on opposite sides of a filter with 0.4 &#181;m pores in which the in vitro MEJs can form. Here we describe how to create the VCCC via plating of cells and isolation of endothelial, MEJ, and smooth muscle fractions, which can then be used for protein isolation or activity assays. The filter with intact cell layers can be fixed, embedded, and sectioned for immunofluorescent analysis. Importantly, many of the discoveries from this model have been confirmed using intact resistance arteries, underscoring its physiological relevance.

A cell culture model of resistance arteries is described, allowing for the dissection of signaling pathways in endothelium, smooth muscle, or between endothelium and smooth muscle (the myoendothelial junction). The selective application of agonists or protein isolation, electron microscopy, or immunofluorescence can be utilized using this cell culture model.

מודל התרבות התא של התנגדות העורקים

The myoendothelial junction (MEJ), a unique signaling microdomain in small diameter resistance arteries, exhibits localization of specific proteins and ...

Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other vessels), and describes techniques for evaluating tissue perfusion using Laser Doppler Flowmetry (LDF) and microvessel density utilizing fluorescently labeled Griffonia simplicifolia (GS1) lectin. Current methods for studying isolated resistance arteries at transmural pressures encountered in vivo and in the absence of parenchymal cell influences provide a critical link between in vivo studies and information gained from molecular reductionist approaches that provide limited insight into integrative responses at the whole animal level. LDF and techniques to selectively identify arterioles and capillaries with fluorescently-labeled GS1 lectin provide practical solutions to enable investigators to extend the knowledge gained from studies of isolated resistance arteries. This paper describes the application of these techniques to gain fundamental knowledge of vascular physiology and pathology in the rat as a general experimental model, and in a variety of specialized genetically engineered &#34;designer&#34; rat strains that can provide important insight into the influence of specific genes on important vascular phenotypes. Utilizing these valuable experimental approaches in rat strains developed by selective breeding strategies and new technologies for producing gene knockout models in the rat, will expand the rigor of scientific premises developed in knockout mouse models and extend that knowledge to a more relevant animal model, with a well understood physiological background and suitability for physiological studies because of its larger size.

This manuscript describes in vitro video microscopy protocols for evaluating vascular function in rat cerebral resistance arteries. The manuscript also describes techniques for evaluating microvessel density with fluorescently labeled lectin and tissue perfusion using Laser Doppler Flowmetry.

הערכה של מנגנוני הבקרה וסקולרית ניצול מיקרוסקופ וידאו מבודד התנגדות העורקים של חולדות

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other ...