The authors have no acknowledgements.

1. مادة البولي يوريثين (PU) إعداد الإسفنج كقالب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الإسفنج PU لإنتاج قوالب هيدروكسيباتيت تحتوي على الربط بين المسام. استخدام كل إسفنجة لتوفير الترابيق الرئيسي لتشكيل الدعامات قالب فضلا عن تشكيل قنوات الصغرى داخل الترابيق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قص وتقليم 80 نقطة في البوصة (المسام في البوصة) الإسفنج إلى 2 الجسور الأشكال مع أبعاد 3.5 سم في الطول × 5 سم في الطول × 1.5 سم في العرض. ملاحظة: الأبعاد والأشكال ويمكن اختيار وفقا لحجم المسام الأساسي المطلوب: 100 نقطة في البوصة، و 80 نقطة في البوصة، و 60 نقطة في البوصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل 100 مل من 4٪ (وزن / حجم) محلول هيدروكسيد الصوديوم باستخدام كوب 150 مل. ثم تزج والضغط حتى يتم استيعابه الإسفنج مستعدة تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد النقع، ضع الكأس مع الإسفنج في ultrasonicator (42 كيلو هرتز). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بالموجات فوق الصوتية قبل علاج الإسفنج PU لمدة 15-20 دقيقة دون حرارة لتعديل خصائص السطح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف مع المقطرالماء لمدة 5-10 دقيقة. بينما الشطف، ضغط الإسفنج والسماح لهم لتوسيع 5-7 مرات من أجل إزالة هيدروكسيد الصوديوم المتبقية داخل الإسفنج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضغط الإسفنج مع مناشف ورقية لإزالة الماء الزائد. ثم تجفيفها في الفرن على 60-80 درجة مئوية. </li></ol> 2. هيدروكسيباتيت (HA) إعداد الطين لطلاء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل اتخاذ الطين HA، وقياس وزن الكأس مع شريط مغناطيسي. وسيتم استخدام هذا القياس لحساب نسبة مسحوق / السائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس 10 غرام من مسحوق HA-نانو الحجم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 20 مل من الماء المقطر في الكأس 50 مل. الحرارة لمدة 120-140 ° C ويقلب باستخدام صفيحة ساخنة مغناطيسي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.3 غرام (3٪ ث / ث) الكحول البولي فينيل (PVA) (89،000-98،000 MW) في مسحوق في الماء المقطر مع التحريك على 300-400 دورة في الدقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يحرك حتى يذوب PVA تماما. يجب أن يكون الحل واضحا بعد حل كامل للبولي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل سوما يليها الحرارة وإضافة 0.1 غرام (1٪ ث / ث) من كاربوكسيميثيل الصوديوم السليلوز (CMC) (اللزوجة منخفضة للغاية) لمسحوق مع التحريك على 400-500 دورة في الدقيقة. يجب أن يكون الحل واضحا بعد حل كامل للبولي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يحرك حتى يذوب تماما CMC وتهدئة لRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.3 غرام (3٪ ث / ث) من polyacrylate الأمونيوم مشتتة في مسحوق مع التحريك على 300-400 دورة في الدقيقة. يحرك حتى يذوب تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.2 غرام (2٪ ث / ث) من الجلسرين في مسحوق مع التحريك على 300-400 دورة في الدقيقة. يحرك حتى يذوب تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفريق ببطء مسحوق HA إلى حل مع التحريك على 600-900 دورة في الدقيقة والحفاظ على التحريك لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يصوتن لمدة 5 دقائق باستخدام ultrasonicator لضمان تشتت في أي تجمع سكاني من مسحوق HA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة اضافي 5 مل من الماء المقطر إلى الخليط مع التحريك على 600-900 دورة في الدقيقة والحرارة في 90-100 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على اثارة الخليط باستخدام محرك مغناطيسي في 600-800 دورة في الدقيقة في 90-100 ° C في أوردإيه لتتبخر محتوى الماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس الوزن كله بما في ذلك الكأس وخليط من وقت لآخر حتى يتم الحصول على نسبة مسحوق / السائل من 1،75 حتي 1،8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنسيق نسبة مسحوق / السائل، تقسيم وزن مسحوق من الوزن الكلي للخليط (2.14)، بما في ذلك مسحوق الكواشف، والمياه، وناقص الوزن من الكأس والنمام (2.1)، وناقص مسحوق HA (2،2). ملاحظة: على سبيل المثال: إذا كان A (خليط بأكمله بما في ذلك مسحوق الكواشف، والمياه) هو 49.05 غرام، B (كوب مع النمام) هو 33.5 غرام، ومن ثم C (HA مسحوق) هو 10 غرام. C / (ABC) = 10 / (49.05-33.5-10) = 1،80 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح الطين ليبرد لRT قبل استخدام لطلاء. </li></ol> 3. HA الطلاء، والتجفيف، والتكلس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معطف الإسفنج PU مستعدة مع طلاء الطين HA باستخدام ملعقة غير القابل للصدأ حتى الطين يتم توزيع متجانس في جميع أنحاء الإسفنج PU على طبق من زجاج. ملاحظة: بعد إزالة افتراء الزائدراي، بعض من المسام قد تكون لا تزال مسدودة مع الطين بسبب الطين اللزوجة العالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل ضمان الترابط والتجانس، والمسام مفتوحة، قليلا ضربة القوالب HA المغلفة باستخدام ضاغط الهواء. هذه العملية تضمن أن القوالب والمغلفة بشكل متجانس على حد سواء على الأسطح الداخلية والخارجية من الاسفنج PU. ملاحظة: إذا لم يتم التوصل إلى طلاء متجانس، والقوالب المغلفة HA ينهار خلال عملية التكلس ويمكن أن الكراك أيضا أثناء التعامل مع نظرا لانخفاض القوة الميكانيكية. بالإضافة إلى ذلك، وطلاء متجانس أمر بالغ الأهمية في خلق الصغرى القنوات داخل الترابيق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجفيف قوالب HA المغلفة مدة لا تقل عن 5 ساعة تحت ظروف التبريد (20-25 درجة مئوية) مع دوران الهواء لطيف. ومع ذلك، تمديد وقت التجفيف استنادا إلى حجم القالب. ملاحظة: بعد التجفيف، والقوالب HA المغلفة يتقلص عادة ما يقرب من 8٪ إلى 10٪ في كل البعد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد عملية التجفيف، ووضع HAقوالب المغلفة على بوتقة الألومينا. ثم، ووضعها في فرن درجة حرارة عالية واستخدم ما يلي تلبد الشخصي 8 الخطوة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحرارة 2 ° C / دقيقة حتى 230 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحرارة 1 درجة مئوية / دقيقة حتى 280 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحرارة 0.5 درجة مئوية / دقيقة حتى 400 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحرارة 3 درجات مئوية / دقيقة حتى 600 درجة مئوية. الحفاظ على 600 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحرارة 5 درجات مئوية / دقيقة حتى 1230 درجة مئوية. الحفاظ على 1230 درجة مئوية لمدة 3 ساعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بارد 5 ° C / دقيقة لRT. ملاحظة: سوف التكلس مزيد من تقليص قوالب الاسفنج HA المغلفة قبل ما يقرب من 22٪ - 25٪ في كل البعد. </li></ol></li></ol> 4. تنظيم الخروج والسكنى من الخلايا في قالب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة الخلايا MC3T3 قبل عظمية في وسائل الإعلام غير عظمي المنشأ تتألف من α-MEM، على أن تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ المضادات الحيوية (الستربتومايسين والبنسلين) عند 37 درجة مئوية في جو مرطب يحتوي على 5٪ CO 2 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 ملمن تعليق خلية في 2 × 10 6 كثافة الخلايا في بئر واحد داخل لوحة 6 جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قالب على شكل جسر 3 سم × 4 سم × 1 سم عموديا في لوحة 6 جيدا. وضع ساق واحدة من القالب إلى لوحة تحتوي على تعليق خلية، والساق الأخرى في بئر فارغة مجاورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للقالب لامتصاص تعليق خلية لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 مل من وسائل الإعلام بعد ذلك إلى البئر التي كانت مليئة أصلا مع تعليق الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجديد المتوسطة في كلا البئرين كل 2 أو 3 أيام حتى انقضت مدة 7 أيام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد مدى فعالية الحراك الخلية الهيماتوكسيلين ويوزين تلطيخ 11. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الخلايا وسقالة من تخبط في 100٪ ETOH لمدة 20-30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار مع الهيماتوكسيلين لمدة 1-2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف مع الماء المقطر لمدة 1-2 دقيقة لمرتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يذوى عن طريق الغمر في 70٪، ثم 95٪، ثم ETOH 100٪ لمدة 1-2 دقيقة لكل منهما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار مع يوزين لمدة 20-30 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف مع الماء المقطر لمدة 12 دقيقة لمرتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يذوى عن طريق الغمر في 70٪، 80٪، 90٪، و 100٪ ETOH لمدة 1-2 دقيقة لكل منهما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضمين سقالة في راتنج الأكريليك لباجتزاء والتصوير. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد بقاء الخلية مع نقاط 3- [4،5-Dimethylthiazol-2-يل] -2،5-ثنائي الفينيل نتروبلو بروميد (MTT) فحص بقاء الخلية ولايف / فحص الميت (الخلية الحية / الميت تلطيخ عدة MPTP) في وقت من يوم 3 و 7 11. ملاحظة: مخطط بروتوكولات قالب تلفيق مثل العظام تتمثل في &quot;ممثل النتائج&quot; الدورة. </li></ol>

<ol>
	<li>Petrie Aronin, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+effects+of+scaffold+pore+size,+pore+volume,+and+total+void+volume+on+cranial+bone+healing+patterns+using+microsphere-based+scaffolds.">Comparative effects of scaffold pore size, pore volume, and total void volume on cranial bone healing patterns using microsphere-based scaffolds.</a> J Biomed Mater Res A. 89 (3), 632-641 (2009).</li><li>Guzm&#225;n, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitosan+scaffolds+containing+calcium+phosphate+salts+and+rhBMP-2:+in+vitro+and+in+vivo+testing+for+bone+tissue+regeneration.">Chitosan scaffolds containing calcium phosphate salts and rhBMP-2: in vitro and in vivo testing for bone tissue regeneration.</a> PLoS One. 9 (2), e87149 (1371).</li><li>Cha, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinus+augmentation+using+BMP-2+in+a+bovine+hydroxyapatite/collagen+carrier+in+dogs.">Sinus augmentation using BMP-2 in a bovine hydroxyapatite/collagen carrier in dogs.</a> J Clin Periodontol. 41 (1), 86-93 (2014).</li><li>Karageorgiou, V., Kaplan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porosity+of+3D+biomaterial+scaffolds+and+osteogenesis.">Porosity of 3D biomaterial scaffolds and osteogenesis.</a> Biomaterials. 26 (27), 5474-5491 (2005).</li><li>Fisher, M. B., Mauck, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+and+regenerative+medicine:+recent+innovations+and+the+transition+to+translation.">Tissue engineering and regenerative medicine: recent innovations and the transition to translation.</a> Tissue Eng Part B Rev. 19 (1), 1-13 (2013).</li><li>Manassero, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+in+Sheep+Using+Acropora+Coral,+a+Natural+Resorbable+Scaffold,+and+Autologous+Mesenchymal+Stem+Cells.">Regeneration in Sheep Using Acropora Coral, a Natural Resorbable Scaffold, and Autologous Mesenchymal Stem Cells.</a> Tissue Eng Part A. 19 (13-14), 1554-1563 (2013).</li><li>Reichert, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tissue+engineering+solution+for+segmental+defect+regeneration+in+load-bearing+long+bones.">A tissue engineering solution for segmental defect regeneration in load-bearing long bones.</a> Sci Transl Med. 4 (141), 141ra93 (2012).</li><li>Sachlos, E., Czernuszka, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+Tissue+Engineering+Scaffolds+Work.+Review+on+The+Application+of+Solid+Freeform+Fabrication+Technology+to+The+Production+of+Tissue+Engineering+Scaffolds.">Making Tissue Engineering Scaffolds Work. Review on The Application of Solid Freeform Fabrication Technology to The Production of Tissue Engineering Scaffolds.</a> Eur Cell Mater. 5, 29-40 (2003).</li><li>Woodard, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanical+properties+and+osteoconductivity+of+hydroxyapatite+bone+scaffolds+with+multi-scale+porosity.">The mechanical properties and osteoconductivity of hydroxyapatite bone scaffolds with multi-scale porosity.</a> Biomaterials. 28 (1), 45-54 (2007).</li><li>Correia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Acta Biomater. 8 (7), 2483-2492 (2012).</li><li>Wang, H., Li, Y., Zuo, Y., Li, J., Ma, S., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocompatibility+and+osteogenesis+of+biomimetic+nano-hydroxyapatite/polyamide+composite+scaffolds+for+bone+tissue+engineering.">Biocompatibility and osteogenesis of biomimetic nano-hydroxyapatite/polyamide composite scaffolds for bone tissue engineering.</a> Biomaterials. 28 (22), 3338-3348 (2007).</li><li>Oh, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+absorption+and+retention+properties+of+engineered+scaffolds+with+micro-channels+and+nano-pores+for+tissue+engineering:+a+proof+of+concept.">Bone marrow absorption and retention properties of engineered scaffolds with micro-channels and nano-pores for tissue engineering: a proof of concept.</a> Ceram Int. 39 (7), 8401-8410 (2013).</li><li>Hong, M. H., Kim, Y. H., Ganbat, D., Kim, D. G., Bae, C. S., Oh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+action:+enrichment+of+retention+and+habitation+of+cells+via+micro-channeled+scaffolds+for+massive+bone+defect+regeneration.J.">Capillary action: enrichment of retention and habitation of cells via micro-channeled scaffolds for massive bone defect regeneration.J.</a> Mater Sci Mater Med. 25 (8), 1991-2001 (2014).</li><li>Volkmer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+in+static+and+dynamic+3D+culture+systems+for+tissue+engineering+of+bone.">Hypoxia in static and dynamic 3D culture systems for tissue engineering of bone.</a> Tissue Eng. Part A. 14 (8), 1331-1340 (2008).</li><li>Malda, J., Klein, T. J., Upton, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+hypoxia+in+the+in+vitro+engineering+of+tissues.">The roles of hypoxia in the in vitro engineering of tissues.</a> Tissue Eng. 13 (9), 2153-2162 (2007).</li><li>Macchetta, A., Turner, I. G., Bowen, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+HA/TCP+scaffolds+with+a+graded+and+porous+structure+using+a+camphene-based+freeze-casting+method.">Fabrication of HA/TCP scaffolds with a graded and porous structure using a camphene-based freeze-casting method.</a> Acta Biomater. 5 (4), 1319-1327 (2009).</li><li>Cox, S. C., Thornby, J. A., Gibbons, G. J., Williams, M. A., Mallick, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printing+of+porous+hydroxyapatite+scaffolds+intended+for+use+in+bone+tissue+engineering+applications.">3D printing of porous hydroxyapatite scaffolds intended for use in bone tissue engineering applications.</a> Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 47, 237-247 (2015).</li><li>Wan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+and+proliferation+of+OCT-1+osteoblast-like+cells+on+micro-+and+nano-scale+topography+structured+poly(l-lactide).">Adhesion and proliferation of OCT-1 osteoblast-like cells on micro- and nano-scale topography structured poly(l-lactide).</a> Biomaterials. 26 (21), 4453-4459 (2005).</li><li>Zhao, L., Mei, S., Chu, P. K., Zhang, Y., Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+hierarchical+hybrid+micro/nano-textured+titanium+surface+with+titania+nanotubes+on+osteoblast+functions.">The influence of hierarchical hybrid micro/nano-textured titanium surface with titania nanotubes on osteoblast functions.</a> Biomaterials. 31 (19), 5072-5082 (2010).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

وهناك حاجة إلى قالب مكون متعددة بما في ذلك الخلايا، وعوامل النمو، والمغذيات، وغيرها من أجل نجاح تجديد وترميم العظام وظيفية من عيوب العظام الكبيرة الحرجة الحجم. ضمن هذه العوامل والخصائص البيولوجية المطابقة تشريحيا ضرورية. لإنجاز وظائف بيولوجية، يجب أن القالب يحمل توافق مع الحياة، osteoconductivity، السلامة الميكانيكية، مساحة كافية، نسيج السطح المناسب، ووسائل الأكسجين والمغذيات النقل. على المستوى الخلوي، الميزات التالية هي حاسمة خاصة بالنسبة للترميم وظيفية من عيوب العظام الضخمة: اختراق سهل في القالب (التجنيد النشط)، توزيع موحد في جميع أنحاء قالب (الاحتفاظ)، وتسارع انتشار وقابلية عالية (سكن). وأخيرا، وتشكيل لاحق من مصفوفة الخلوية اضافية كبيرة واثار التعبير الجيني حاسمة في العمليات الحيوية الأساسية مثل السريع الأوعية الدموية لتكون العظم الثانية. لقد تم اقتراح العديد من أنواع مختلفة من البدائل الاصطناعية ليحل محل لصناعة السيارات في / خيفي؛ مخايف ترقيع العظام. ومع ذلك، فإن منظمة سقالة الحالية لا يبدون المكروية الداخلية تحتوي على القنوات الدقيقة والنانو المسام، وبالتالي لا تسهل بنشاط تسلل خلية، والتوزيع، وسكان في عمق البدائل الاصطناعية التي يزيد حجمها عن 10 مم. أنها لا توفر الاشارات الجسدية لريادتها الخلايا بكفاءة، تهاجر بسرعة، وبشكل موحد عميقا في قالب العظام. بدلا من ذلك، التوظيف السلبي محدود من الخلايا يخلق السكان خلية موزعة بالتساوي بين المناطق الخارجية والداخلية للسقالة. وهذا الأمر يزيد ليس فقط التحدي الأولي من الخلايا الوصول إلى اللب الداخلي للقالب ولكن أيضا يعيق تدفق المغذيات وخلية الاتصال مع الطرف الآخر من بديل الاصطناعية. هذا النوع من التوظيف والاستيطان النتائج خلية غير المتكافئة في الخلية دوقد تم زرع eath والعظام غير مكتملة النمو بعد سقالة في الجسم 14،15. وهكذا، أدخلنا مفهوم العمل الشعري كما جديلة المادية الأولية لمعالجة هذه العقبات. لقد هندستها بدقة القنوات الدقيقة في BMT للحث على العمل الشعري من شأنها أن تشكل قوة سحب الابتدائية مسؤولة عن تجنيد بنشاط خلايا عميقة في BMT. تقدم تقنية PU الاسفنج طلاء عدة خصائص فريدة من نوعها. أولا، لأنها تتيح لإعداد السهل هياكل تربيقية مسامية تسيطر عليها بشكل جيد، والتي أنفسهم تعتمد على الهياكل قالب محددة مسبقا (أي 80 المسام في قالب بوصة ل300-400 ميكرون). هذا مهم جدا لتحسين حجم المسام لبناء العظم تسلل 15. ثانيا، هذه التقنية تتيح بناء مترابطة القنوات الدقيقة، والتي تمثل دور كبير في تهيئة الخلية نقل 11. ثالثا، هناك قيود تقريبا أي عند استخدام الإسفنج PU من حيث خلق العرف الاشكال والاحجام من القوالب. يمكن للصانع استخدام مقص لالأشكال البسيطة أو حتى محسوب القطع بالليزر لهندستها معقدة. باستخدام هذه التقنيات تسيطر على وجه التحديد، أنشأنا BMT. وقد تم اختيار HA كمادة تبدأ بسبب توافق مع الحياة وعظمي قدرتها 17. في هذه الدراسة، هناك العديد من الخطوات الهامة التي تحتاج إلى تسليط الضوء عليها. أثناء إعداد الطين HA، إذا كانت درجة الحرارة مرتفعة جدا وسرعة التحريك منخفضة جدا، فإن الطين HA أصبحت عالقة في حواف الجزء السفلي من كوب وتجف. بعد عملية طلاء عندما تطاير HA الطين الزائد، عالية جدا من ضغط الهواء يمكن أن تحدث تشققات على سطح BMT. فمن المهم للحفاظ على ضغط الهواء المنخفض نسبيا للتعبير بشكل صحيح خارج HA الطين الزائد فقط. وأخيرا، الخطوات الثانية والثالثة من عملية التكلسهي الأكثر أهمية (الحرارة 1 درجة مئوية / دقيقة حتى 280 درجة مئوية، والحرارة 0.5 درجة مئوية / دقيقة حتى 400 ° C). في هذا النطاق درجة الحرارة، والاسفنج PU حرق بالكامل في حين أن HA يصبح كثيفا. إذا لم يتم تتابع عن كثب هذا البروتوكول، وسيتم انهار BMT أو انهارت بعد تلبد. وBMT الموضحة في هذه الدراسة توفر العديد من المزايا. أولا، مترابطة المسام الماكرو (300-400 ميكرون) تحاكي تلك العظام تربيقية البشري وتسمح لتدفق سلس للنخاع العظام. الثانية، وتتألف القوالب من القنوات الدقيقة (25-50 ميكرون) في كل الحاجز التربيقي لتسريع دخول الأولي من خلايا العظام عن طريق عمل شعري. كما أظهرت المحاكاة الحاسوبية باستخدام 13، إذا كان القالب فقط 300 ميكرون المسام (المسام الأولية) وليس microchannels، فإن عمل شعري لا تكون كافية لتشبع الكامل للقالب مع نخاع العظام. وهذا من شأنه خصوصا عقد صحيح عن عيوب كبيرة الحجم التي تتطلب لقوالب حجم الدو. ، ميكرومتر الحجم القنوات المعرض امتصاص السوائل فعالة للغاية، وبالتالي فإننا نتوقع القنوات الصغيرة ليكون المسؤول الأول عن العمل الشعري في دراستنا. ثالثا، BMTs لدينا بشكل استراتيجي النانو المسام. وتشير البيانات من الأدب أن خلايا حساسة خاصة إلى أنماط نانو 18،19. لذا، كنا نتوقع نانو المسام على جدران القنوات الصغيرة أن تلعب دورا في زيادة مرفق الخلية. المسام نانو الحجم (100-400 نانومتر) على سطح الحاجز تربيقية سمح الخلايا لترسيخ يجمد. عموما، أدت الآثار المجتمعة لهذه الهياكل الداخلية ثلاثة في تعزيز تعبئة الخلية والتصاق في جميع أنحاء القالب. ومع ذلك، هناك بعض القيود المفروضة على البروتوكول والخطوات الحاسمة لافتعال BMT الكمال. على سبيل المثال، غالبا ما يكون هناك كمية كبيرة من HA الطين أعد نظرا لصعوبة الحفاظ على اللزوجة متجانسة في حين الطلاء. أيضا هناك قيود في صنعقوالب أكبر من 5 سم 3 في حجم بسبب وقت العمل في حين الطلاء. سمك الطلاء هو الحاسم الذي يختلف اعتمادا على تقنيات للصانع. وتشير نتائج دراستنا أن BMT قادرة على استيعاب والاحتفاظ الخلايا سوف نقدم المزايا المحتملة على مدى التلاؤم التغييري التقليدي (أو الاصطناعية) السقالات. ويجري النظر في دراسة استطلاعية للتحقق من فوائد BMT في تكون العظم و / أو الأوعية الدموية إلى جانب عوامل النمو المرتبطة العظام. ولذلك، ندعي أن لدينا فريدة من نوعها مميزة BMT سقالة يمكن معالجة العوائق الرئيسية لعدم كفاية نخاع العظام تسلل إلى بنيات تركيبية وغير مكتملة تجديد العظام في عيوب كبيرة. والهدف النهائي من هذه الدراسة هو تبسيط النموذج الحالي للالهندسة الحيوية في إعادة بناء العظام وترميم وظيفية في العيوب العظمية حاسمة الحجم من خلال القضاء على الحاجة إلى زمني / كثيفة العمالة نخاع العظم سدىخلايا ل العزلة وتوسيع العمليات. وأخيرا، فإننا نهدف إلى الاستفادة تشريحيا المطابقة يبني 3D مع القنوات الصغيرة ومتناهية الصغر المسام، مما يحفز امتصاص السريع الخلية، توزيع متجانس، وسكان لإعادة بناء العظام.

The ultimate goal of bone tissue engineering with synthetic constructs is the incorporation of the constructs into the host bone, repopulation of the constructs with host cells, and reconstitution of gas and body fluid exchanges to restore normal bone function. Considerable research has been reported over the last decade in the use of polymeric and ceramic biomaterials for producing scaffolds1,2. However, the ideal material and fabrication technique for optimal bone tissue regeneration has yet to be identified. In addition, there is an overall lack of success in bringing these technologies to the clinic, especially for the reconstruction and restoration of large bone defects. Therefore, restoring critical sized bony defects still remains a clinical challenge1-5. 
Ideally, the scaffolds for bone tissue regeneration should exhibit biocompatibility without causing inflammatory responses or foreign body/toxic reactions, have closely matched mechanical properties when compared to those of native bone, and possess a mechanism to allow diffusion and/or transport of ions and nutrients. Strong bonding with the host bone, dynamic bone growth, vascular ingrowth, and biodegradation of the scaffolds are equally desirable. Although the use of biodegradable polymer scaffolds has exhibited progress in terms of tissue ingrowth, there are controversies over their use for bone regeneration. 
Notwithstanding these extensive efforts, the highly organized structural synthetic constructs still have limited potential in overcoming the obstacle of passive cell penetration. Most of these approaches have resulted in the in vitro tissue ingrowth with cross-sections of less than a few &#181;m to several mm from the external surface, an incomplete integration with host bone, and only partial bone regeneration in vivo6,7. The pioneering cells do not migrate deeply into the constructs because of the lack of an initial force that pulls them inside before cell colonization begins. Consequently, cell colonization strictly occurs at the scaffold periphery, becoming an obstruction from the periphery to the center of the scaffold. Thus, the diffusion of oxygen and nutrients into the inner parts of the templates becomes limited8. Therefore, it is clear that the architecture of the scaffolds (pore size, porosity, interconnectivity, and permeability) that affect the transport and diffusion of substances throughout the scaffolds is critical for achieving well-distributed cell proliferation and differentiation9,10. Although calcium phosphates have been used in the past for scaffold fabrication, different processes and procedures have often resulted in calcium phosphate scaffolds with varying architectures. Thus, the selection of the manufacturing process becomes important in dictating the scaffold architecture needed for successful bone tissue regeneration.
In conclusion, there are still two major shortcomings of bone tissue engineering that need to be addressed: the initial cell recruitment into the template prior to cell attachment and colonization and the quality of substance flow both into and out of the template.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>polyurethan sponge</td>
			<td>Plastifoam</td>
			<td>PU-3215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">167176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxyapatite Powder</td>
			<td>Ossgen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl Alcoho</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">341584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxymethyl cellulose sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">360384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium polyacrylate</td>
			<td>Vanderbilt</td>
			<td>DARVAN 821A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2289</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

distinctive capillary action by micro-channels in bone-like templates can enhance recruitment of cells for restoration of large bony defect

بدون ومزدهرة السكان الخلية النشطة التي يتم توزيعها بشكل جيد وترتكز على قالب إدراج ثابت، لا يحدث تجديد العظام استثنائية. مع القوالب التقليدية، وغياب الداخلية النتائج القنوات الدقيقة في عدم وجود تسلل خلية، والتوزيع، وسكان في عمق القوالب. وبالتالي، قالب يسهل اختراقها للغاية ومترابط بشكل موحد تربيقية العظام مثل مع قنوات الصغرى (قالب المكروية الاحيائية، BMT) وقد وضعت لمعالجة هذه العقبات. تم إنشاء BMT الرواية التي كتبها مفاهيم مبتكرة (العمل الشعري) وملفقة مع تقنية الطلاء الاسفنج القالب. تتألف BMT من العديد من المكونات الهيكلية: مترابطة المسام الابتدائية (300-400 ميكرون) التي تحاكي المسام في العظام التربيقي، قنوات الدقيقة (25-70 ميكرون) في كل تربيق، وnanopores (100-400 نانومتر) على السطح للسماح للخلايا لارساء. وعلاوة على ذلك، تم توثيق BMT من خلال الدراسة اختبار الميكانيكية لديك سيمILAR خصائص القوة الميكانيكية لتلك العظام التربيقي البشري (~ 3.8 ميجا باسكال) 12. وBMT عرضت امتصاص عالية، والاحتفاظ، وسكن من الخلايا في جميع أنحاء (Π) قوالب على شكل جسر (الارتفاع 3 سم و 4 سم طول). الخلايا التي كانت في البداية المصنفة في نهاية واحدة من القوالب تعبئة فورا إلى الطرف الآخر (10 سم المسافة) من خلال العمل الشعري من BMT على وسائل الإعلام الخلية. بعد 4 ساعات، والخلايا احتلت متجانس وBMT كامل وعرضت السلوك الخلوي العادي. استحوذ عمل شعري للتسلل خلايا معلقة في وسائل الإعلام وتوزيع (الهجرة النشيطة) في جميع أنحاء BMT. وبعد أن لاحظ هذه القدرات من BMT، نتوقع أن BMTs سوف تمتص خلايا نخاع العظام، وعوامل النمو، والمواد المغذية من المحيط في ظل الظروف الفسيولوجية. يجوز للBMT حل القيود الحالية عبر تسلل السريع، وتوزيع متجانس وinhabitaالامتحانات التنافسية الوطنية من الخلايا في والقوالب حجمية كبيرة لإصلاح عيوب هيكلية واسعة النطاق.

الهيكل العام للBMT المعارض قالب ثلاثي الأبعاد فريدة من نوعها مع هياكل تشبه العظام التربيقية الداخلية. وBMT يحتوي على مسام الكلية، القنوات الدقيقة، والنانو المسام. وتم التحقق من تكوينات واضحة مترابطة بشكل كامل المسام الكلية (متوسط ​​حجم 320 ميكرون)، القنوات الصغيرة (متوسط ​​قطرها 50 ميكرومتر)، والنانو المسام (متوسط ​​حجم 100 نانومتر) مع المجهر الإلكتروني الماسح (EVO-40؛ ZEISS) وكذلك من خلال التصوير المقطعي الصغيرة. ويبين الشكل 1 بروتوكولات مفصلة التدريجي في خلق BMT. من خلال مراقبة دقيقة من البروتوكولات من إعداد الإسفنج PU لعملية التكلس (P1 - P7؛ الشكل 1)، والميزات التالية يمكن أن يتحقق: سطح كثيفة للغاية وعلى نحو سلس بعد HA الطلاء والتجفيف. الحجم والشكل بالضبط و3-D القالب. شبكة تربيقية مسامية مترابطة تماما مماثلة لتلك التي من العظام التربيقي. والقنوات الصغرى الطرافةهين كل تربيق التي تحاكي قنوات داخل عظمي مثل القنوات هافيرسية والقنوات فولكمان (أرقام 2 و 3). وعلاوة على ذلك، قوة ميكانيكية عالية نسبيا (~ 3.8 ميجا باسكال) مماثلة لتلك التي من العظام تربيقية البشري وقد تم قياس من خلال اختبار قوة الضغط. وأكدت المعلمات القياس النسيجي مماثلة إلى حد كبير مع تلك الفقرات القطنية البشري فقرات العظام التربيقي عن طريق تحليل CT الدقيقة 12. وقد أثبتت مقادير مختلفة من العمل الشعري من خلال أقطار الشعرية المختلفة في الشكل (4) استخدام المحاكاة الحاسوبية. من خلال هذه المحاكاة، ونحن المتوقع أن BMT سوف تظهر متفاوتة معدلات الاستيعاب داخل المسام الابتدائية (300-400 ميكرون)، والقنوات الدقيقة (25-70 ميكرون) استنادا إلى الأقطار. الشعيرات الدموية الصغيرة أظهرت قدرات امتصاص أقوى. تم التحقق من هذه الفرضية في هذه التجربة كما هو مبين في الشكل (5). وBMT عرضت فعالة للغايةامتصاص السوائل واحتباس خلال العمل الشعري من الهياكل الدقيقة القناة؛ وقد استخدم صمة عار الزرقاء stevenel باعتبارها وسيلة السائل بسهولة تتبع تدفق (الشكل 5). على أساس المحاكاة الحاسوبية، كان ينظر إلى BMT مع هذه التكوينات على استيعاب وتعليق خلية الاحتفاظ يصل إلى 8.5 سم في المسافة الإجمالية في غضون 10 ثانية. نتيجة لعمل شعري قوي الناجمة عن الهياكل الداخلية، بلغ المتوسط ​​الملون الطرف المقابل من 3 سم (الطول) × 4 سم (طول) × 1 سم (العرض) قالب على شكل جسر في حدود 1 دقيقة و 40 ثانية. وعلاوة على ذلك، لوحظ وتعبئة الخلية النشطة وإدماجها في BMT (الشكل 6). وفي وقت لاحق، أسفرت تعبئة خلية متجانسة والتعلق في تعزيز انتشار وتشكيل مصفوفة في تشكيل موزعة بالتساوي. وعلاوة على ذلك، تم التحقق من صحة مسافات طويلة (~ 10 سم) هجرة الخلايا من خلال BMT فور مشبعة BMT مع تعليق الخلية. SE<html> خلايا eded نجا في قطاع القالب الذي تعرض للهواء وليس منغمسين في ثقافة المتوسط. في هذه التجربة، وقدمت مستنبت إلى الخلايا عن طريق حصرا في الآبار لمس فقط الساقين من السقالة. عمل شعري التي أظهرتها و microchannels ثم سمح لمتوسطة جديدة للوصول إلى القمة، جزء من جسر السقالة. بعد 3 أيام من الثقافة، وأصبح القالب المحتلة مع الخلايا المتكاثرة بشكل سريع. بعد 7 أيام من الثقافة، وكانت ملفوفة كل تربيق بواسطة مصفوفات الخلوية اضافية وجزءا لا يتجزأ من بخلايا 13. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig1.jpg" /> الشكل 1. تشبه العظام عموما بروتوكول قالب تلفيق من قبل معاملة بو الإسفنج (P1) إلى المعالجة الحرارية النهائية (P7). حفظ الملف الشخصى تلبد الدقيق بعد P7 أمر بالغ الأهمية في تحقيق القوة الميكانيكية مواتية.و = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig1large.jpg&quot; الهدف = &quot;_ فارغة&quot;&gt; الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig2.jpg" /> . الرقم 2 المجهر ستيريو ممثل (AmScope، SM-2TZ-M) وصور (X4) من 80 نقطة في البوصة الحجم بو الإسفنج (يسار)، HA المغلفة وتجفيفها BMT (وسط)، ومتكلس BMT (يمين) (البعد: 3. سم في الطول × 4 سم في الطول × 1 سم في العرض). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig3.jpg" /> الشكل 3. SEM والصغرى CT صور قالب الاحيائية: (A) صورة شاملة للقالب الاحيائية، <st<html> رونغ&gt; (B، C، D) وصور للقنوات الصغرى. من أجل تسليط الضوء اضحة القنوات الدقيقة في الترابيق، وحبيبات القالب. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 4" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig4.jpg" /> . الشكل 4. حساب الحاسوبية من عمل شعري بأقطار قناة مختلفة في غضون نفس الفترة الزمنية (0.4 مللي ثانية)، في حين أن أكبر الشعرية (د = 300 ميكرون: يشير إلى الابتدائية المسام) استوعبت المتوسطة (الأزرق) تصل إلى 0.16 مم ارتفاع، أصغر الشعرية (د = 30 ميكرون: يشير إلى قناة الصغرى) استوعبت المتوسطة تصل إلى 0،415 ملم في الطول. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> الإقليم الشمالي &quot;FO: المحافظة على together.within صفحة =&quot; دائما &quot;&gt; <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig5.jpg" /> الرقم 5. وأظهرت صور الاختلاف في قدرات الاستيعاب من عمل شعري يعتمد على أحجام مختلفة من المسام الابتدائية والقنوات الصغيرة (حجم المسام الأساسي يشير إلى متوسط ​​قطرها: 60 نقطة في البوصة ≈ 470 ميكرون، و 80 نقطة في البوصة ≈ 320 ميكرون، 100 نقطة في البوصة ≈ 200 ميكرون)، والخطوط الصفراء تمثل عمل شعري الناجم عن مزيج من المسام الابتدائية والقنوات الصغرى. الخطوط الحمراء تمثل عمل شعري الناجمة عن أساسا القنوات الصغيرة عرضت في كل تربيق. كما هو مبين في (F)، القالب 100 نقطة في البوصة يسببها أقوى العمل الشعري، مما أدى إلى تشبع كامل للقالب ضمن 39 ثانية. تم اختبار القوالب 80 نقطة في البوصة و 60 نقطة في البوصة بعد ذلك. (B) 0 ثانية، (C) 0.5 ثانية، (D) 1.5 ثانية، (E) 17.0 ثانية، (F) 39،0 ثانية، (G) 50.0 ثانية، و(H) 1 دقيقة 18 ثانية بعد الغمر. (البعد قالب: 1سم × 1 سم × 4 سم في الطول مكعبي الشكل). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (6)" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig6.jpg" /> الرقم 6. الدخول والهجرة من الخلايا من الآبار المصنفة (الجزء الأول) إلى الآبار غير المصنف (الجزء الخامس) من خلال القوالب الاحيائية الناجمة عن عمل شعري، وبلغت الخلايا المصنفة في البداية نهاية الساق غير المصنف (الجزء الخامس) على الفور بعد التشبع الكامل. بعد 3 أيام، وكان التقاء الخلايا واضحا في جميع أنحاء القالب بأكمله. بعد 7 أيام، وقع الزمانية المكانية تشكيل الكولاجين مصفوفة داخل السكان الخلية (H &amp; E صمة عار). (البعد قالب: 3 سم في الطول × 4 سم في الطول × 1 سم في العرض). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig6large.jpg" target="_blank">الرجاء CL</a>إك هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Watch this Scientific Journal Video about Distinctive Capillary Action by Micro-channels in Bone-like Templates can Enhance Recruitment of Cells for Restoration of Large Bony Defect at JoVE.com

Distinctive Capillary Action by Micro-channels in Bone-like Templates can Enhance Recruitment of Cells for Restoration of Large Bony Defect

A step-by-step generic process to create a bone-like template with engineered micro-channels is presented. High absorption and retention capabilities of the template are demonstrated by capillary action via micro-channels.

يمكن قوالب مميزة شعري عمل من قبل الصغرى، قنوات في العظام مثل تعزيز تجنيد خلايا لترميم كبير بوني عيب

Without an active, thriving cell population that is well-distributed and stably anchored to the inserted template, exceptional bone regeneration does not ...

distinctive-capillary-action-micro-channels-bone-like-templates-can

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.6K Views.  Columbia University. A step-by-step generic process to create a bone-like template with engineered micro-channels is presented. High absorption and retention capabilities of the template are demonstrated by capillary action via micro-channels. 

Video: Distinctive Capillary Action by Micro-channels in Bone-like Templates can Enhance Recruitment of Cells for Restoration of Large Bony Defect

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

رسم الخرائط البصرية إمكانيات العمل والعابرون الكالسيوم في القلب ماوس

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical discoveries with the aims of developing functional tissues for cardiac regeneration as well as in vitro screening assays. However, the ability to create high-fidelity models of heart tissue has proven difficult. The heart&#8217;s extracellular matrix (ECM) is a complex structure consisting of both biochemical and biomechanical signals ranging from the micro- to the nanometer scale2. Local mechanical loading conditions and cell-ECM interactions have recently been recognized as vital components in cardiac tissue engineering3-5.
A large portion of the cardiac ECM is composed of aligned collagen fibers with nano-scale diameters that significantly influences tissue architecture and electromechanical coupling2. Unfortunately, few methods have been able to mimic the organization of ECM fibers down to the nanometer scale. Recent advancements in nanofabrication techniques, however, have enabled the design and fabrication of scalable scaffolds that mimic the in vivo structural and substrate stiffness cues of the ECM in the heart6-9.
Here we present the development of two reproducible, cost-effective, and scalable nanopatterning processes for the functional alignment of cardiac cells using the biocompatible polymer poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)8 and a polyurethane (PU) based polymer. These anisotropically nanofabricated substrata (ANFS) mimic the underlying ECM of well-organized, aligned tissues and can be used to investigate the role of nanotopography on cell morphology and function10-14.
Using a nanopatterned (NP) silicon master as a template, a polyurethane acrylate (PUA) mold is fabricated. This PUA mold is then used to pattern the PU or PLGA hydrogel via UV-assisted or solvent-mediated capillary force lithography (CFL), respectively15,16. Briefly, PU or PLGA pre-polymer is drop dispensed onto a glass coverslip and the PUA mold is placed on top. For UV-assisted CFL, the PU is then exposed to UV radiation (&#955; = 250-400 nm) for curing. For solvent-mediated CFL, the PLGA is embossed using heat (120 &#176;C) and pressure (100 kPa). After curing, the PUA mold is peeled off, leaving behind an ANFS for cell culture. Primary cells, such as neonatal rat ventricular myocytes, as well as human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, can be maintained on the ANFS2.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

الشعرية قوة الطباعة الحجرية لهندسة الأنسجة القلبية

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to evaluate new strategies that aim at improving vascularization, reliable methods are required to make the in-growth of new blood vessels into bio-artificial scaffolds visible and quantify the results. Over the past couple of years, our group has introduced a full skin defect model that enables the direct visualization of blood vessels by transillumination and provides the possibility of quantification through digital segmentation. In this model, one surgically creates full skin defects in the back of mice and replaces them with the material tested. Molecules or cells of interest can also be incorporated in such materials to study their potential effect. After an observation time of one&#8217;s own choice, materials are explanted for evaluation. Bilateral wounds provide the possibility of making internal comparisons that minimize artifacts among individuals as well as of decreasing the number of animals needed for the study. In comparison to other approaches, our method offers a simple, reliable and cost effective analysis. We have implemented this model as a routine tool to perform high-resolution screening when testing vascularization of different biomaterials and bio-activation approaches.

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Vascularization is key to approaches in successful tissue engineering. Therefore, reliable technologies are required to evaluate the development of vascular networks in tissue-constructs. Here we present a simple and cost-effective method to visualize and quantify vascularization in vivo.

جلد كامل عيب نموذج في تقييم الأوعية الدموية من الحيوية<em&gt; في فيفو</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product to demonstrate how regulating nutrient levels can improve cell yields. In previous studies, bioreactors facilitated increased culture volumes over static cultures, but no increase in cell yields were observed. Limitations in key nutrients such as glucose, which were consumed between batch feedings, can lead to limitations in cell expansion. Large fluctuations in glucose levels were observed, despite the increase in glucose concentrations in the media. The use of continuous feeding systems eliminated fluctuations in glucose levels, and improved cell growth rates when compared with batch fed static and SSB culture methods. Additional increases in growth rates were observed by adjusting the feed rate based on calculated nutrient consumption, which allowed the maintenance of physiological glucose over three weeks in culture. This method can also be adapted for other cell types.

Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.

تنظيم المغذيات عن طريق تغذية مستمرة لتوسيع نطاق واسع من خلايا الثدييات في الأجسام الشبه الكروية

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds during repair, which gives rise to a lack of sufficient blood supply and causes necrosis of the new tissues. Rapid vascularization is a vital prerequisite for new tissue survival and integration with existing host tissue. The de novo generation of vasculature in scaffolds is one of the most important steps in making bone regeneration more efficient, allowing repairing tissue to grow into a scaffold. To tackle this problem, the genetic modification of a biomaterial scaffold is used to accelerate angiogenesis and osteogenesis. However, visualizing and tracking in vivo blood vessel formation in real-time and in three-dimensional (3D) scaffolds or new bone tissue is still an obstacle for bone tissue engineering. Multiphoton microscopy (MPM) is a novel bio-imaging modality that can acquire volumetric data from biological structures in a high-resolution and minimally-invasive manner. The objective of this study was to visualize angiogenesis with multiphoton microscopy in vivo in a genetically modified 3D-PLGA/nHAp scaffold for calvarial critical bone defect repair. PLGA/nHAp scaffolds were functionalized for the sustained delivery of a growth factor pdgf-b gene carrying lentiviral vectors (LV-pdgfb) in order to facilitate angiogenesis and to enhance bone regeneration. In a scaffold-implanted calvarial critical bone defect mouse model, the blood vessel areas (BVAs) in PHp scaffolds were significantly higher than in PH scaffolds. Additionally, the expression of pdgf-b and angiogenesis-related genes, vWF and VEGFR2, increased correspondingly. MicroCT analysis indicated that the new bone formation in the PHp group dramatically improved compared to the other groups. To our knowledge, this is the first time multiphoton microscopy was used in bone tissue-engineering to investigate angiogenesis in a 3D bio-degradable scaffold in vivo and in real-time.

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Here, we present a protocol to visualize blood vessel formation in vivo and in real-time in 3D scaffolds by multiphoton microscopy. Angiogenesis in genetically modified scaffolds was studied in a murine calvarial critical bone defect model. More new blood vessels were detected in the treatment group than in controls.

تصور الأوعية بالفحص المجهري مولتيفوتون في فيفو في "الكائنات المعدلة وراثيا" سقالة 3D-بلجا/نهاب كالفاريال إصلاح العيب العظام الحرجة

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds ...

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently needed in disease diagnosis, microbial monitoring, genetically modified organism (GMO) detection, and forensic analysis. We have previously described the platform called CALM (Capillary Array-based Loop-mediated isothermal amplification for Multiplex visual detection of nucleic acids). Herein, we describe improved fabrication and performance processes for this platform. Here, we apply a small, ready-to-use cassette assembled by capillary array for multiplex visual detection of nucleic acids. The capillary array is pre-treated into a hydrophobic and hydrophilic pattern before fixing loop-mediated isothermal amplification (LAMP) primer sets in capillaries. After assembly of the loading adaptor, LAMP reaction mixture is loaded and isolated into each capillary, due to capillary force by a single pipetting step. The LAMP reactions are performed in parallel in the capillaries. The results are visually read out by illumination with a hand-held UV flashlight. Using this platform, we demonstrate monitoring of 8 frequently appearing elements and genes in GMO samples with high specificity and sensitivity. In summary, the platform described herein is intended to facilitate the detection of multiple nucleic acids. We believe it will be widely applicable in fields where high-throughput nucleic acid analysis is required.

This protocol describes the fabrication of a small, ready-to-use cassette that can be applied for visual detection of multiple nucleic acids in a single, test that is easy to operate. In this approach, a capillary array was used for multiplex and highly efficient detection of GMO targets.

الكشف عن الأحماض النووية متعددة في صفيف شعرية البصرية

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

كشف الذيفان في تركيبات النانو باستخدام فحوصات ليستي (ال) أموبوسيتي ليمولوس

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Simultaneous Electrical and Mechanical Stimulation to Enhance Cells' Cardiomyogenic Potential

Cardiovascular diseases are the leading cause of death in developed countries. Consequently, the demand for effective cardiac cell therapies has motivated researchers in the stem cell and bioengineering fields to develop in vitro high-fidelity human myocardium for both basic research and clinical applications. However, the immature phenotype of cardiac cells is a limitation on obtaining tissues that functionally mimic the adult myocardium, which is mainly characterized by mechanical and electrical signals. Thus, the purpose of this protocol is to prepare and mature the target cell population through electromechanical stimulation, recapitulating physiological parameters. Cardiac tissue engineering is evolving toward more biological approaches, and strategies based on biophysical stimuli, thus, are gaining momentum. The device developed for this purpose is unique and allows individual or simultaneous electrical and mechanical stimulation, carefully characterized and validated. In addition, although the methodology has been optimized for this stimulator and a specific cell population, it can easily be adapted to other devices and cell lines. The results here offer evidence of the increased cardiac commitment of the cell population after electromechanical stimulation. Electromechanically stimulated cells show an increased expression of main cardiac markers, including early, structural, and calcium-regulating genes. This cell conditioning could be useful for further regenerative cell therapy, disease modeling, and high-throughput drug screening.

Simultaneous Electrical and Mechanical Stimulation to Enhance Cells&#039; Cardiomyogenic Potential

Here we present a protocol for training a cell population using electrical and mechanical stimuli emulating cardiac physiology. This electromechanical stimulation enhances the cardiomyogenic potential of the treated cells and is a promising strategy for further cell therapy, disease modeling, and drug screening.

التحفيز الكهربائية والميكانيكية المتزامنة لتعزيز إمكانات كارديوميوجينيك الخلايا

Cardiovascular diseases are the leading cause of death in developed countries. Consequently, the demand for effective cardiac cell therapies has motivated ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

قياس إمكانات العمل البصري أحادي الخلية في خلايا القلب المشتقة من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Rapid, Enzymatic Methods for Amplification of Minimal, Linear Templates for Protein Prototyping using Cell-Free Systems

This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins in less than 24 h using cell-free expression. After receiving DNA from a vendor, the gene fragment is PCR-amplified, cut, circularized, and cryo-banked. A small amount of the banked DNA is then diluted and amplified significantly (up to 106x) using isothermal rolling circle amplification (RCA). RCA can yield microgram quantities of the minimal expression template from picogram levels of starting material (mg levels if all starting synthetic fragment is used). In this work, a starting amount of 20 pg resulted in 4 &#181;g of the final product. The resulting RCA product (concatemer of the minimal template) can be added directly to a cell-free reaction with no purification steps. Due to this method being entirely PCR-based, it may enable future high-throughput screening efforts when coupled with automated liquid handling systems.

The study describes a protocol for creating large (&#181;g-mg) quantities of DNA for protein screening campaigns from synthetic gene fragments without cloning or using living cells. The minimal template is enzymatically digested and circularized and then amplified using isothermal rolling circle amplification. Cell-free expression reactions could be performed with the unpurified product.

طرق سريعة انزيمية لتضخيم الحد الأدنى من القوالب الخطية لنماذج البروتين باستخدام أنظمة خالية من الخلايا

This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins ...