The authors have no acknowledgements.

1. Poliuretano (PU) Preparación Esponja como plantilla <ol><li> Utilice esponjas de poliuretano para producir plantillas de hidroxiapatita contienen poros interconectados. Use cada esponja para proporcionar las trabéculas primaria para la formación de los puntales de la plantilla, así como la formación de micro-canales dentro de las trabéculas. </li><li> Cortar y recortar 80 ppi (poros por pulgada) esponjas en 2 puentes formas con dimensiones de 3,5 cm de altura x 5 cm de largo x 1,5 cm de ancho. Nota: Las dimensiones y formas pueden ser elegidos de acuerdo con el tamaño de poro primario deseado: 100 ppi, 80 ppi, y 60 ppi. </li><li> Hacer una 100 ml de 4% (w / v) solución de NaOH usando un vaso de precipitados 150 ml; a continuación, sumergir y apretar hasta que las esponjas preparadas están completamente empapados. </li><li> Después de remojar, coloque el vaso con las esponjas en el ultrasonicador (42 kHz). </li><li> Ultrasonidos pre-tratamiento de las esponjas de poliuretano de 15-20 minutos sin calor para modificar las propiedades de la superficie. </li><li> Enjuague con agua destiladaagua durante 5 a 10 min. Si bien aclarado, exprimir las esponjas y les permiten expandir 5 a 7 veces con el fin de quitar el NaOH residual dentro de las esponjas. </li><li> Apriete las esponjas con toallas de papel para eliminar el exceso de agua; luego secarlos en un horno a 60-80 ° C. </li></ol> 2. La hidroxiapatita (HA) preparación de la suspensión para recubrir <ol><li> Antes de hacer la suspensión de HA, medir el peso de un vaso de precipitados con una barra agitadora magnética. Esta medición se utilizará para calcular la relación polvo / líquido. </li><li> Medir 10 g de la HA en polvo de tamaño nanométrico. </li><li> Añadir 20 ml de agua destilada en el vaso de precipitados de 50 ml. El calor de 120-140 ° C y remover con un agitador magnético plato caliente. </li><li> Añadir 0,3 g (3% w / w) de alcohol de polivinilo (PVA) (89,000-98,000 MW) por polvo en agua destilada mientras se agitaba a de 300-400 rpm. </li><li> Revuelva hasta que el PVA se haya disuelto completamente. La solución debe ser transparente después de la disolución completa del PVA. </li><li> Gire off el calor y añadir 0,1 g (1% w / w) de carboximetilcelulosa sódica (CMC) (ultra-baja viscosidad) para el polvo mientras se agita a de 400-500 rpm. La solución debe ser transparente después de la disolución completa del PVA. </li><li> Revuelva hasta que el CMC se haya disuelto por completo y enfriar a temperatura ambiente. </li><li> Añadir 0,3 g (3% w / w) de dispersante de poliacrilato de amonio por polvo mientras se agita a de 300-400 rpm. Revuelva hasta que esté completamente disuelta. </li><li> Añadir 0,2 g (2% w / w) de la glicerina por polvo mientras se agita a de 300-400 rpm. Revuelva hasta que esté completamente disuelta. </li><li> Lentamente dispersar el polvo de HA en la solución mientras se agitaba a los 600-900 rpm y se mantiene la agitación durante 5 min. </li><li> Someter a ultrasonidos durante 5 minutos usando un ultrasonicador para asegurar la dispersión de cualquier aglomeración del polvo de HA. </li><li> Añadir un extra de 5 ml de agua destilada a la mezcla con agitación a 600-900 rpm y se calienta a 90 hasta 100 ° C. </li><li> Mantener la agitación la mezcla usando un agitador magnético a 600-800 rpm a 90-100 ° C en order para evaporar el contenido de agua. </li><li> Medir el peso total incluyendo el vaso de precipitados y la mezcla de vez en cuando hasta que se obtiene una relación polvo / líquido de 1,75 a 1,8. </li><li> El formateo de la relación polvo / líquido, dividir el peso del polvo por el peso total de la mezcla de (2.14), que incluye el polvo, reactivos, y el agua, menos el peso del vaso de precipitados y un agitador (2.1), y menos el polvo de HA (2.2). Nota: Por ejemplo: Si A (mezcla entera incluyendo polvo, reactivos y agua) es 49,05 g, B (vaso de precipitados con agitador) es 33,5 g, y luego C (polvo HA) es de 10 g. C / (ABC) = 10 / (49.05-33.5-10) = 1,80 </li><li> Permitir que la suspensión se enfríe a temperatura ambiente antes de usar para el recubrimiento. </li></ol> 3. HA recubrimiento, secado y sinterización <ol><li> Escudo de las esponjas de poliuretano preparadas con la suspensión de recubrimiento de HA con una espátula de acero hasta que la suspensión se distribuye de forma homogénea en toda la esponja PU sobre una placa de vidrio. Nota: Después de retirar el exceso de insultory, algunos de los poros todavía puede que se hayan obstruido con suspensión debido a la alta viscosidad de la suspensión. </li><li> Con el fin de garantizar la interconexión, la uniformidad, y poros abiertos, ligeramente soplar las plantillas HA recubiertas utilizando un compresor de aire. Este proceso asegura que las plantillas se recubren homogéneamente tanto en las superficies interiores y exteriores de la esponja PU. Nota: Si no se logra un recubrimiento homogéneo, las plantillas recubiertas de HA colapsarán durante el proceso de sinterización y también pueden agrietarse durante la manipulación debido a la baja resistencia mecánica. Además, el recubrimiento homogéneo es crítico en la creación de los micro-canales dentro de las trabéculas. </li><li> Seque las plantillas HA recubiertas por un mínimo de 5 horas bajo condiciones de refrigeración (20-25 ° C), con una circulación de aire suave. Sin embargo, extender el tiempo de secado en función del tamaño de la plantilla. Nota: Después del secado, las plantillas HA revestidas típicamente reducir aproximadamente 8% a 10% en cada dimensión. </li><li> Después de que el proceso de secado, coloque el HAplantillas recubierto en un crisol de alúmina. Luego, colocarlos en un horno de alta temperatura y utilizar el siguiente perfil de sinterización 8 paso. <ol><li> Heat 2 ° C / min hasta 230 ° C. </li><li> Caliente 1 ° C / min hasta 280 ° C. </li><li> Calentar 0,5 ° C / min hasta 400 ° C. </li><li> Heat 3 ° C / min hasta 600 ° C. Mantenga a 600 ° C durante 1 hora. </li><li> Heat 5 ° C / min hasta 1230 ° C. Mantener 1230 ° C durante 3 horas. </li><li> ! 5 ° C / min a RT. Nota: La sinterización se reducirá aún más las plantillas de esponja HA revestidos en aproximadamente 22% - 25% en cada dimensión. </li></ol></li></ol> 4. Ingreso y inhabitancy de celdas en la plantilla <ol><li> Cultura células MC3T3 pre-osteoblásticas en un medio no osteogénico que consiste en α-MEM, suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de antibióticos (estreptomicina y penicilina) a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO 2 . </li><li> Añadir 10 mlde una suspensión celular a 2 x 10 6 densidad celular en un único bien dentro de una placa de 6 pocillos. </li><li> Coloque la plantilla en forma de puente de 3 cm x 4 cm x 1 cm verticalmente en la placa de 6 pocillos. Coloque una pata de la plantilla en la placa que contiene la suspensión de células, y la otra pierna en un pozo vacío adyacente. </li><li> Permitir que la plantilla para absorber la suspensión celular durante 10 min. </li><li> Añadir 5 ml de los medios de comunicación a partir de entonces hasta el pozo que estaba lleno originalmente con la suspensión celular. </li><li> Reponer el medio en ambos pozos cada 2 ó 3 días hasta que hayan transcurrido 7 días. </li><li> Determinar la eficacia de la movilidad celular por tinción con hematoxilina y eosina 11. <ol><li> Fijar las células y andamio por inmersión en EtOH al 100% durante 20-30 minutos. </li><li> Mancha con hematoxilina durante 1-2 minutos. </li><li> Enjuague con agua destilada durante 1-2 minutos por el doble. </li><li> Deshidratar por inmersión en 70%, entonces 95%, entonces 100% de EtOH durante 1-2 min cada uno. </li><li> Mancha con eosina durante 20-30 segundos. </li><li> Enjuague con agua destilada durante 12 minutos para dos veces. </li><li> Deshidratar por inmersión en 70%, 80%, 90% y 100% de EtOH durante 1-2 min cada uno. </li><li> Insertar el andamio en una resina acrílica para seccionar y de imagen. </li></ol></li><li> Determinar la viabilidad celular con los de 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difenil tetrazolio bromuro (MTT) ensayo de viabilidad celular y el ensayo Live / Dead (kit de tinción de células vivas / muertas MPTP) en el tiempo de puntos del día 3 y 7 11. Nota: El esquema de protocolos de fabricación plantilla de hueso como se representa en el &quot;Los resultados representativos&quot; sesión. </li></ol>

<ol>
	<li>Petrie Aronin, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+effects+of+scaffold+pore+size,+pore+volume,+and+total+void+volume+on+cranial+bone+healing+patterns+using+microsphere-based+scaffolds.">Comparative effects of scaffold pore size, pore volume, and total void volume on cranial bone healing patterns using microsphere-based scaffolds.</a> J Biomed Mater Res A. 89 (3), 632-641 (2009).</li><li>Guzm&#225;n, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitosan+scaffolds+containing+calcium+phosphate+salts+and+rhBMP-2:+in+vitro+and+in+vivo+testing+for+bone+tissue+regeneration.">Chitosan scaffolds containing calcium phosphate salts and rhBMP-2: in vitro and in vivo testing for bone tissue regeneration.</a> PLoS One. 9 (2), e87149 (1371).</li><li>Cha, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinus+augmentation+using+BMP-2+in+a+bovine+hydroxyapatite/collagen+carrier+in+dogs.">Sinus augmentation using BMP-2 in a bovine hydroxyapatite/collagen carrier in dogs.</a> J Clin Periodontol. 41 (1), 86-93 (2014).</li><li>Karageorgiou, V., Kaplan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porosity+of+3D+biomaterial+scaffolds+and+osteogenesis.">Porosity of 3D biomaterial scaffolds and osteogenesis.</a> Biomaterials. 26 (27), 5474-5491 (2005).</li><li>Fisher, M. B., Mauck, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+and+regenerative+medicine:+recent+innovations+and+the+transition+to+translation.">Tissue engineering and regenerative medicine: recent innovations and the transition to translation.</a> Tissue Eng Part B Rev. 19 (1), 1-13 (2013).</li><li>Manassero, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+in+Sheep+Using+Acropora+Coral,+a+Natural+Resorbable+Scaffold,+and+Autologous+Mesenchymal+Stem+Cells.">Regeneration in Sheep Using Acropora Coral, a Natural Resorbable Scaffold, and Autologous Mesenchymal Stem Cells.</a> Tissue Eng Part A. 19 (13-14), 1554-1563 (2013).</li><li>Reichert, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tissue+engineering+solution+for+segmental+defect+regeneration+in+load-bearing+long+bones.">A tissue engineering solution for segmental defect regeneration in load-bearing long bones.</a> Sci Transl Med. 4 (141), 141ra93 (2012).</li><li>Sachlos, E., Czernuszka, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+Tissue+Engineering+Scaffolds+Work.+Review+on+The+Application+of+Solid+Freeform+Fabrication+Technology+to+The+Production+of+Tissue+Engineering+Scaffolds.">Making Tissue Engineering Scaffolds Work. Review on The Application of Solid Freeform Fabrication Technology to The Production of Tissue Engineering Scaffolds.</a> Eur Cell Mater. 5, 29-40 (2003).</li><li>Woodard, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanical+properties+and+osteoconductivity+of+hydroxyapatite+bone+scaffolds+with+multi-scale+porosity.">The mechanical properties and osteoconductivity of hydroxyapatite bone scaffolds with multi-scale porosity.</a> Biomaterials. 28 (1), 45-54 (2007).</li><li>Correia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Acta Biomater. 8 (7), 2483-2492 (2012).</li><li>Wang, H., Li, Y., Zuo, Y., Li, J., Ma, S., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocompatibility+and+osteogenesis+of+biomimetic+nano-hydroxyapatite/polyamide+composite+scaffolds+for+bone+tissue+engineering.">Biocompatibility and osteogenesis of biomimetic nano-hydroxyapatite/polyamide composite scaffolds for bone tissue engineering.</a> Biomaterials. 28 (22), 3338-3348 (2007).</li><li>Oh, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+absorption+and+retention+properties+of+engineered+scaffolds+with+micro-channels+and+nano-pores+for+tissue+engineering:+a+proof+of+concept.">Bone marrow absorption and retention properties of engineered scaffolds with micro-channels and nano-pores for tissue engineering: a proof of concept.</a> Ceram Int. 39 (7), 8401-8410 (2013).</li><li>Hong, M. H., Kim, Y. H., Ganbat, D., Kim, D. G., Bae, C. S., Oh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+action:+enrichment+of+retention+and+habitation+of+cells+via+micro-channeled+scaffolds+for+massive+bone+defect+regeneration.J.">Capillary action: enrichment of retention and habitation of cells via micro-channeled scaffolds for massive bone defect regeneration.J.</a> Mater Sci Mater Med. 25 (8), 1991-2001 (2014).</li><li>Volkmer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+in+static+and+dynamic+3D+culture+systems+for+tissue+engineering+of+bone.">Hypoxia in static and dynamic 3D culture systems for tissue engineering of bone.</a> Tissue Eng. Part A. 14 (8), 1331-1340 (2008).</li><li>Malda, J., Klein, T. J., Upton, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+hypoxia+in+the+in+vitro+engineering+of+tissues.">The roles of hypoxia in the in vitro engineering of tissues.</a> Tissue Eng. 13 (9), 2153-2162 (2007).</li><li>Macchetta, A., Turner, I. G., Bowen, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+HA/TCP+scaffolds+with+a+graded+and+porous+structure+using+a+camphene-based+freeze-casting+method.">Fabrication of HA/TCP scaffolds with a graded and porous structure using a camphene-based freeze-casting method.</a> Acta Biomater. 5 (4), 1319-1327 (2009).</li><li>Cox, S. C., Thornby, J. A., Gibbons, G. J., Williams, M. A., Mallick, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printing+of+porous+hydroxyapatite+scaffolds+intended+for+use+in+bone+tissue+engineering+applications.">3D printing of porous hydroxyapatite scaffolds intended for use in bone tissue engineering applications.</a> Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 47, 237-247 (2015).</li><li>Wan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+and+proliferation+of+OCT-1+osteoblast-like+cells+on+micro-+and+nano-scale+topography+structured+poly(l-lactide).">Adhesion and proliferation of OCT-1 osteoblast-like cells on micro- and nano-scale topography structured poly(l-lactide).</a> Biomaterials. 26 (21), 4453-4459 (2005).</li><li>Zhao, L., Mei, S., Chu, P. K., Zhang, Y., Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+hierarchical+hybrid+micro/nano-textured+titanium+surface+with+titania+nanotubes+on+osteoblast+functions.">The influence of hierarchical hybrid micro/nano-textured titanium surface with titania nanotubes on osteoblast functions.</a> Biomaterials. 31 (19), 5072-5082 (2010).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Se necesita una plantilla de varios componentes incluyendo las células, factores de crecimiento, nutrientes, etc. para la regeneración ósea exitoso y restauración funcional de los defectos óseos grandes críticos de tamaño. Dentro de estos factores, propiedades biológicas anatómicamente conformes son esenciales. Para lograr la funcionalidad biológica, la plantilla debe exhibir biocompatibilidad, osteoconductividad, integridad mecánica, área de superficie suficiente, adecuada textura de la superficie, y los medios para el transporte de nutrientes y oxígeno. A nivel celular, las siguientes características son especialmente crucial para la restauración funcional de los defectos óseos masivos: la penetración facilitado en plantilla (reclutamiento activo), la distribución uniforme en toda la plantilla (de retención), la proliferación acelerada y alta viabilidad (morada). Por último, la subsiguiente formación de matriz extracelular sustancial y el desencadenamiento de la expresión génica son cruciales en los procesos biológicos esenciales, tales como la rápida vascularización unaosteogénesis nd. Se han propuesto muchos tipos diferentes de sustitutos sintéticos para reemplazar / asignaciones injertos óseos auto-. Sin embargo, la organización andamio actual no presenta un microambiente interno que contiene micro-canales y nano-poros, y por lo tanto no facilita la infiltración de células activamente, distribución y inhabitance profundamente en los sustitutos sintéticos que son mayores que 10 mm. No proporcionan señales físicas por ser pionero en las células de manera eficiente, migrar rápidamente y uniformemente profundamente en la plantilla de los huesos. En su lugar, el reclutamiento pasiva limitado de células crea una poblaciones de células distribuidas de manera desigual entre las zonas exteriores e interiores del andamio. Esto no sólo agrava el desafío inicial de las células alcanzan el núcleo interno de la plantilla, pero también dificulta el flujo de nutrientes y la comunicación celular con el otro extremo del sustituto sintético. Este tipo de contratación y habitar resultados celulares desproporcionada en la celda death y huesos incompletos crecimiento tras el andamio ha sido implantado en el cuerpo 14,15. Por lo tanto, hemos introducido el concepto de acción capilar como la señal física primaria para abordar estos obstáculos. Hemos diseñado minuciosamente microcanales en el trasplante de médula ósea para inducir la acción capilar que tener en cuenta la fuerza de arrastre principal responsable de reclutar activamente a las células profundas en el trasplante de médula ósea. La técnica de recubrimiento esponja PU presenta varias propiedades únicas. En primer lugar, permite una fácil preparación de las estructuras trabeculares porosas bien controlados, que a su vez dependen de las estructuras de plantilla predefinida (es decir, 80 poros por pulgada plantilla para de 300-400 micras). Esto es muy importante para la optimización de tamaño de poro para la infiltración de los osteoblastos 15. En segundo lugar, la técnica permite la construcción de micro-canales interconectados, que representan el papel importante de la inicialización de reubicación celular 11. En tercer lugar, casi no hay limitaciones cuando se utiliza la esponja PU en términos de creación de formas y tamaños de las plantillas personalizadas. El fabricante puede utilizar una tijera de formas simples o de corte por láser, incluso computarizada para geometrías complejas. El uso de estas tecnologías controladas con precisión, creamos el TMO. HA fue seleccionado como el material de partida debido a su biocompatibilidad y la capacidad osteoconductiva 17. En este estudio, hay varios pasos críticos que deben ser destacados. Durante la preparación de la suspensión HA, si la temperatura es demasiado alta y la velocidad de agitación es demasiado baja, la suspensión HA se quedarán atascados en los bordes inferiores de la vaso de precipitados y se secan. Después del proceso de revestimiento cuando se sopla hacia fuera el exceso de suspensión HA, demasiado alto de una presión de aire puede inducir grietas en la superficie del BMT. Es importante mantener la presión de aire relativamente baja para ventilar adecuadamente el exceso de lechada Sólo AH. Por último, la segunda y la tercera etapas del proceso de sinterizaciónson más crucial (Heat 1 ° C / min hasta 280 ° C y calor 0,5 ° C / min hasta 400 ° C). En este rango de temperatura, la esponja PU se quema por completo, mientras que el HA se vuelve denso. Si este protocolo no se sigue de cerca, el BMT se colapsó o se derrumbó después de la sinterización. El BMT se describe en este estudio ofrece varias ventajas. En primer lugar, los macroporos interconectados (300-400 micras) son similares a los del hueso trabecular humana y permite el flujo de la médula ósea suave. En segundo lugar, las plantillas se componen de micro-canales (25-50 micras) dentro de cada tabique trabecular para acelerar la penetración inicial de las células óseas a través de la acción capilar. Como se ha demostrado mediante simulación computacional 13, si la plantilla sólo tenía 300 micras poros (poros primarios) y no hay microcanales, la acción capilar sería insuficiente para la saturación completa de la plantilla con la médula ósea. Esto sería especialmente cierto para los defectos de gran tamaño que requieren lplantillas de tamaño arge. De tamaño micrométrico canales exhiben absorción de líquidos altamente efectivo, y por lo tanto espera que los microcanales a ser el principal responsable de la acción capilar en nuestro estudio. En tercer lugar, nuestros BMTs han colocado estratégicamente nano-poros. Los datos de la literatura indican que las células son especialmente sensibles a nano-patrones 18,19; Por lo tanto, esperábamos las nano-poros en las paredes de los microcanales para jugar un papel en el aumento de la unión celular. Poros de tamaño nanométrico (de 100-400 nm) en la superficie de los septos trabecular permitió células para anclar inmovilizado. En general, los efectos combinados de estas tres estructuras internas resultaron en una mayor movilización de células y la adhesión a lo largo de la plantilla. Sin embargo, hay algunas limitaciones del protocolo y los pasos críticos para fabricar el BMT perfecto. Por ejemplo, a menudo hay una gran cantidad de HA suspensión preparada debido a la dificultad de mantener una viscosidad homogénea mientras recubrimiento. También hay una limitación en la fabricaciónplantillas de más de 5 cm 3 de volumen debido al tiempo de trabajo, mientras recubrimiento. El espesor del recubrimiento es crítico que varía en función de las técnicas del fabricante. Los resultados de nuestro estudio sugieren que el trasplante de médula ósea capaces de absorber y retener las células ofrecen potenciales ventajas sobre aloplástica convencional (o sintético) andamios. Un estudio prospectivo se está considerando para verificar los beneficios de BMT en la osteogénesis y / o angiogénesis junto con factores de crecimiento relacionados con el hueso. Por lo tanto, afirmamos que nuestra única andamio BMT ofrecido puede abordar los principales obstáculos de la infiltración de la médula ósea insuficiente en las construcciones sintéticas y regeneración ósea incompleta en grandes defectos. El objetivo final de este estudio es el de simplificar el actual paradigma de la bioingeniería en la reconstrucción ósea y la restauración funcional en defectos óseos críticos empresas al eliminar la necesidad de estroma de la médula ósea tiempo- / mano de obra intensivaaislamiento l células y expansión procesos. Por último, nuestro objetivo es utilizar anatómicamente conforme 3D construcciones con micro-canales y nano-poros, que inducen una rápida absorción celular, distribución homogénea y habitabilidad para la reconstrucción del hueso.

The ultimate goal of bone tissue engineering with synthetic constructs is the incorporation of the constructs into the host bone, repopulation of the constructs with host cells, and reconstitution of gas and body fluid exchanges to restore normal bone function. Considerable research has been reported over the last decade in the use of polymeric and ceramic biomaterials for producing scaffolds1,2. However, the ideal material and fabrication technique for optimal bone tissue regeneration has yet to be identified. In addition, there is an overall lack of success in bringing these technologies to the clinic, especially for the reconstruction and restoration of large bone defects. Therefore, restoring critical sized bony defects still remains a clinical challenge1-5. 
Ideally, the scaffolds for bone tissue regeneration should exhibit biocompatibility without causing inflammatory responses or foreign body/toxic reactions, have closely matched mechanical properties when compared to those of native bone, and possess a mechanism to allow diffusion and/or transport of ions and nutrients. Strong bonding with the host bone, dynamic bone growth, vascular ingrowth, and biodegradation of the scaffolds are equally desirable. Although the use of biodegradable polymer scaffolds has exhibited progress in terms of tissue ingrowth, there are controversies over their use for bone regeneration. 
Notwithstanding these extensive efforts, the highly organized structural synthetic constructs still have limited potential in overcoming the obstacle of passive cell penetration. Most of these approaches have resulted in the in vitro tissue ingrowth with cross-sections of less than a few &#181;m to several mm from the external surface, an incomplete integration with host bone, and only partial bone regeneration in vivo6,7. The pioneering cells do not migrate deeply into the constructs because of the lack of an initial force that pulls them inside before cell colonization begins. Consequently, cell colonization strictly occurs at the scaffold periphery, becoming an obstruction from the periphery to the center of the scaffold. Thus, the diffusion of oxygen and nutrients into the inner parts of the templates becomes limited8. Therefore, it is clear that the architecture of the scaffolds (pore size, porosity, interconnectivity, and permeability) that affect the transport and diffusion of substances throughout the scaffolds is critical for achieving well-distributed cell proliferation and differentiation9,10. Although calcium phosphates have been used in the past for scaffold fabrication, different processes and procedures have often resulted in calcium phosphate scaffolds with varying architectures. Thus, the selection of the manufacturing process becomes important in dictating the scaffold architecture needed for successful bone tissue regeneration.
In conclusion, there are still two major shortcomings of bone tissue engineering that need to be addressed: the initial cell recruitment into the template prior to cell attachment and colonization and the quality of substance flow both into and out of the template.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>polyurethan sponge</td>
			<td>Plastifoam</td>
			<td>PU-3215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">167176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxyapatite Powder</td>
			<td>Ossgen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl Alcoho</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">341584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxymethyl cellulose sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">360384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium polyacrylate</td>
			<td>Vanderbilt</td>
			<td>DARVAN 821A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2289</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

distinctive capillary action by micro-channels in bone-like templates can enhance recruitment of cells for restoration of large bony defect

Sin una próspera población activa, célula que está bien distribuido y estable anclada a la plantilla insertada, no se produce la regeneración ósea excepcional. Con las plantillas convencionales, la ausencia de micro-canales internos resultado en la falta de infiltración de células, la distribución y inhabitance profundamente dentro de las plantillas. Por lo tanto, una plantilla altamente poroso y uniformemente interconectado trabecular-similar al hueso con micro-canales (plantilla microambiente biogénico; BMT) ha sido desarrollado para hacer frente a estos obstáculos. La novela BMT fue creado por conceptos innovadores (acción capilar) y fabricado con una técnica de recubrimiento de esponja plantilla. El trasplante de médula ósea consiste en varios componentes estructurales:-poros primarios interconectadas (300-400 micras) que imitan poros en hueso trabecular, micro-canales (25-70 micras) dentro de cada trabécula y nanoporos (100-400 nm) en el la superficie para permitir que las células para anclar. Por otra parte, el trasplante de médula ósea ha sido documentada por el estudio prueba mecánica para tener simILAR propiedades de resistencia mecánica a las del hueso trabecular humana (~ 3,8 MPa) 12. El BMT exhibió alta absorción, retención y morada de las células a través de las plantillas (pi) en forma de puente (3 cm de altura y 4 cm de longitud). Las células que estaban inicialmente sembradas en un extremo de las plantillas inmediatamente movilizados al otro extremo (10 cm de distancia) por acción capilar del BMT en el medio celular. Después de 4 horas, las células homogéneamente ocuparon todo el BMT y exhiben comportamiento celular normal. La acción capilar representó la infiltración de las células suspendidas en los medios de comunicación y la distribución (migración activa) en todo el TMO. Habiendo observado estas capacidades del BMT, proyectamos que BMTs absorberá células de médula ósea, factores de crecimiento y nutrientes desde la periferia en condiciones fisiológicas. El trasplante de médula ósea puede resolver las limitaciones actuales a través de la infiltración rápida, la distribución homogénea y inhabitana de las células en las plantillas grandes y volumétricos para reparar defectos óseos masivos.

La estructura general del BMT exhibe una plantilla tridimensional único con estructuras internas de hueso trabecular-similares. El trasplante de médula ósea contiene macroporos, micro-canales, y nano-poros. Configuraciones claras de totalmente interconectadas macro-poros (tamaño medio de 320 micras), micro-canales (diámetro medio de 50 micras), y nano-poros (tamaño promedio de 100 nm) se verificaron con un microscopio electrónico de barrido (EVO-40; ZEISS), así como a través de micro-tomografía. La figura 1 muestra los protocolos detallados paso a paso en la creación de un trasplante de médula ósea. A través de un control preciso de los protocolos de la preparación de las esponjas de poliuretano en el proceso de sinterización (P1 - P7; Figura 1), las siguientes funciones se pueden lograr: una superficie muy densa y suave después del recubrimiento de HA y secado; una precisión de forma y tamaño de plantilla 3-D; una red trabecular porosa totalmente interconectada similar a la del hueso trabecular; y micro-canales ingeniohin cada trabécula que imitan los canales intra-óseas tales como canales de Havers y canales de Volkmann (Figuras 2 y 3). Además, resistencia mecánica relativamente alta (~ 3,8 MPa) similar a la del hueso trabecular humano se midió mediante una prueba de resistencia a la compresión. Parámetros histomorfométricos altamente similares con las de las vértebras lumbar humana hueso trabecular se confirmaron mediante análisis micro-CT 12. Diferentes magnitudes de la acción capilar se demostraron a través de diferentes diámetros capilares en la Figura 4 mediante simulación computacional. A través de estas simulaciones, proyectamos que el trasplante de médula ósea podría exhibir tasas de absorción variables dentro de los poros-primarios (300-400 micras) y micro-canales (25 a 70 micras) en base a los diámetros. Capilares más pequeños mostraron capacidades de absorción más fuertes. Esta suposición se verificó en este experimento como se muestra en la Figura 5. El BMT mostró altamente eficazla absorción y retención de fluidos a través de la acción capilar de las estructuras micro-canal; mancha azul de Stevenel se usó como el medio fluido a seguir fácilmente el flujo (Figura 5). Sobre la base de la simulación computacional, el BMT con estas configuraciones se observaron para absorber y retener las suspensiones de células de hasta 8,5 cm en la distancia total dentro de 10 seg. Debido a una fuerte acción capilar inducida por las estructuras internas, el medio manchado alcanzó el extremo opuesto de un 3 cm (altura) x 4 cm (longitud) x 1 cm (anchura) de plantilla en forma de puente dentro de 1 min y 40 seg. Además, se observó la movilización de células activo y la incorporación en el BMT (Figura 6). Posteriormente, la movilización de células homogénea y el apego resultaron en una mayor proliferación y formación de la matriz en una formación distribuida de manera uniforme. Por otra parte, de larga distancia (~ 10 cm) migración de las células a través del trasplante de médula ósea fue validada inmediatamente después del trasplante de médula ósea se saturó con la suspensión de células. Se<html> EDED células sobrevivieron en el segmento de plantilla que se expone al aire y no sumergido en el medio de cultivo. En este experimento, se proporcionó el medio de cultivo para las células por exclusivamente en los pocillos que tocan sólo las patas de la andamio. La acción capilar mostrada por los microcanales después se dejó para el medio fresco para llegar a la, parte de puente superior del andamio. Después de 3 días de cultivo, la plantilla se hizo ocupado con células que proliferan rápidamente. Después de 7 días de cultivo, cada trabécula fue envuelto por las matrices extracelulares y embebidos con células 13. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig1.jpg" /> Figura 1. El protocolo de fabricación plantilla similar al hueso en general desde el pre-tratamiento de la PU esponja (P1) para el tratamiento térmico final (P7). Manteniendo el perfil preciso de sinterización después de P7 es crucial en la consecución de una resistencia mecánica favorable.f = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig1large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig2.jpg" /> . Figura 2 microscopio estereoscópico Representante (AmScope; SM-2TZ-M) imágenes (x4) de un ppi 80 dimensionada PU esponja (izquierda), HA revestido y se seca BMT (centro) y BMT sinterizado (derecha) (Dimensión: 3. cm de altura x 4 cm de largo x 1 cm de ancho). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig3.jpg" /> Figura 3. SEM y micro-CT imágenes de una plantilla de biogénica: (A) una imagen global de una plantilla biogénico, <st<html> rong&gt; (B, C, D) imágenes por microcanales. Con el fin de resaltar los micro-canales claros en las trabéculas, la plantilla fue granulada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig3large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig4.jpg" /> . Figura 4. cálculo computacional de la acción capilar con diferentes diámetros de canal En el mismo período de tiempo (0,4 ms), mientras que el más grande capilar (d = 300 m: se refiere a poro primaria) absorbe el medio (azul) hasta 0,16 mm la altura, el capilar más pequeño (d = 30 m: se refiere a las micro-canales) absorbe el medio hasta 0,415 mm de altura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig4large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> nt &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig5.jpg" /> Figura 5. Imágenes mostraron diferencias de capacidades de absorción de la acción capilar a base de diferentes tamaños de poros-primarios y micro-canales (tamaño de poro primaria se refiere al diámetro medio: 60 ppp ≈ 470 m, 80 ppi ≈ 320 m, ≈ 100 ppi 200 micras). Las líneas amarillas representan la acción capilar inducida por la combinación de los poros primarios y micro-canales. Las líneas rojas representan la acción capilar inducida por principalmente micro-canales exhibidos en cada trabécula. Como se muestra en (F), la plantilla 100 ppi indujo la acción capilar más fuerte, dando lugar a la saturación completa de la plantilla dentro de 39 seg. Las plantillas de 80 ppi y 60 ppi fueron probados a partir de entonces. (B) 0 seg, (C) 0,5 seg, (D) 1,5 seg, (E) 17,0 seg, (F) 39,0 seg, (G) 50,0 seg, y (H) 1 min 18 seg después de la inmersión. (Dimensión Plantilla: 1cm x 1 cm x 4 cm de altura cúbico). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig6.jpg" /> Figura 6. La entrada y la inmigración de las células de los pozos sin semillas (parte I) a los pozos no cabezas de serie (parte V) a través de las plantillas biogénicas inducidos por la acción capilar. Las células sembradas inicialmente llegaron al final de la pierna no cabeza de serie (parte V) inmediatamente después la saturación completa. Después de 3 días, la confluencia de las células era evidente a lo largo de toda la plantilla. Después de 7 días, la formación de la matriz de colágeno espacio-temporal se produjo dentro de las poblaciones de células (H &amp; E stain). (Dimensión Plantilla: 3 cm de alto x 4 cm de largo x 1 cm de ancho). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig6large.jpg" target="_blank">Por favor, cl</a>ick aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Watch this Scientific Journal Video about Distinctive Capillary Action by Micro-channels in Bone-like Templates can Enhance Recruitment of Cells for Restoration of Large Bony Defect at JoVE.com

Distinctive Capillary Action by Micro-channels in Bone-like Templates can Enhance Recruitment of Cells for Restoration of Large Bony Defect

A step-by-step generic process to create a bone-like template with engineered micro-channels is presented. High absorption and retention capabilities of the template are demonstrated by capillary action via micro-channels.

Plantillas distintivo acción capilar por micro-canales en hueso como puede mejorar el reclutamiento de células para la Restauración del Gran Bony Defecto

Without an active, thriving cell population that is well-distributed and stably anchored to the inserted template, exceptional bone regeneration does not ...

distinctive-capillary-action-micro-channels-bone-like-templates-can

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.6K vistas.  Columbia University. A step-by-step generic process to create a bone-like template with engineered micro-channels is presented. High absorption and retention capabilities of the template are demonstrated by capillary action via micro-channels. 

Video: Distinctive Capillary Action by Micro-channels in Bone-like Templates can Enhance Recruitment of Cells for Restoration of Large Bony Defect

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

Mapeo óptico de potenciales de acción y transitorios de calcio en el corazón de ratón

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Investigación

Bioingeniería

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical discoveries with the aims of developing functional tissues for cardiac regeneration as well as in vitro screening assays. However, the ability to create high-fidelity models of heart tissue has proven difficult. The heart&#8217;s extracellular matrix (ECM) is a complex structure consisting of both biochemical and biomechanical signals ranging from the micro- to the nanometer scale2. Local mechanical loading conditions and cell-ECM interactions have recently been recognized as vital components in cardiac tissue engineering3-5.
A large portion of the cardiac ECM is composed of aligned collagen fibers with nano-scale diameters that significantly influences tissue architecture and electromechanical coupling2. Unfortunately, few methods have been able to mimic the organization of ECM fibers down to the nanometer scale. Recent advancements in nanofabrication techniques, however, have enabled the design and fabrication of scalable scaffolds that mimic the in vivo structural and substrate stiffness cues of the ECM in the heart6-9.
Here we present the development of two reproducible, cost-effective, and scalable nanopatterning processes for the functional alignment of cardiac cells using the biocompatible polymer poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)8 and a polyurethane (PU) based polymer. These anisotropically nanofabricated substrata (ANFS) mimic the underlying ECM of well-organized, aligned tissues and can be used to investigate the role of nanotopography on cell morphology and function10-14.
Using a nanopatterned (NP) silicon master as a template, a polyurethane acrylate (PUA) mold is fabricated. This PUA mold is then used to pattern the PU or PLGA hydrogel via UV-assisted or solvent-mediated capillary force lithography (CFL), respectively15,16. Briefly, PU or PLGA pre-polymer is drop dispensed onto a glass coverslip and the PUA mold is placed on top. For UV-assisted CFL, the PU is then exposed to UV radiation (&#955; = 250-400 nm) for curing. For solvent-mediated CFL, the PLGA is embossed using heat (120 &#176;C) and pressure (100 kPa). After curing, the PUA mold is peeled off, leaving behind an ANFS for cell culture. Primary cells, such as neonatal rat ventricular myocytes, as well as human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, can be maintained on the ANFS2.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

Capilar Fuerza Litografía Cardiaca de Ingeniería de Tejidos

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to evaluate new strategies that aim at improving vascularization, reliable methods are required to make the in-growth of new blood vessels into bio-artificial scaffolds visible and quantify the results. Over the past couple of years, our group has introduced a full skin defect model that enables the direct visualization of blood vessels by transillumination and provides the possibility of quantification through digital segmentation. In this model, one surgically creates full skin defects in the back of mice and replaces them with the material tested. Molecules or cells of interest can also be incorporated in such materials to study their potential effect. After an observation time of one&#8217;s own choice, materials are explanted for evaluation. Bilateral wounds provide the possibility of making internal comparisons that minimize artifacts among individuals as well as of decreasing the number of animals needed for the study. In comparison to other approaches, our method offers a simple, reliable and cost effective analysis. We have implemented this model as a routine tool to perform high-resolution screening when testing vascularization of different biomaterials and bio-activation approaches.

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Vascularization is key to approaches in successful tissue engineering. Therefore, reliable technologies are required to evaluate the development of vascular networks in tissue-constructs. Here we present a simple and cost-effective method to visualize and quantify vascularization in vivo.

Una piel llena de defectos modelo para evaluar la vascularización de Biomateriales<em&gt; En Vivo</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product to demonstrate how regulating nutrient levels can improve cell yields. In previous studies, bioreactors facilitated increased culture volumes over static cultures, but no increase in cell yields were observed. Limitations in key nutrients such as glucose, which were consumed between batch feedings, can lead to limitations in cell expansion. Large fluctuations in glucose levels were observed, despite the increase in glucose concentrations in the media. The use of continuous feeding systems eliminated fluctuations in glucose levels, and improved cell growth rates when compared with batch fed static and SSB culture methods. Additional increases in growth rates were observed by adjusting the feed rate based on calculated nutrient consumption, which allowed the maintenance of physiological glucose over three weeks in culture. This method can also be adapted for other cell types.

Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.

Nutriente Reglamento mediante la alimentación continua de expansión a gran escala de células de mamífero en esferoides

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds during repair, which gives rise to a lack of sufficient blood supply and causes necrosis of the new tissues. Rapid vascularization is a vital prerequisite for new tissue survival and integration with existing host tissue. The de novo generation of vasculature in scaffolds is one of the most important steps in making bone regeneration more efficient, allowing repairing tissue to grow into a scaffold. To tackle this problem, the genetic modification of a biomaterial scaffold is used to accelerate angiogenesis and osteogenesis. However, visualizing and tracking in vivo blood vessel formation in real-time and in three-dimensional (3D) scaffolds or new bone tissue is still an obstacle for bone tissue engineering. Multiphoton microscopy (MPM) is a novel bio-imaging modality that can acquire volumetric data from biological structures in a high-resolution and minimally-invasive manner. The objective of this study was to visualize angiogenesis with multiphoton microscopy in vivo in a genetically modified 3D-PLGA/nHAp scaffold for calvarial critical bone defect repair. PLGA/nHAp scaffolds were functionalized for the sustained delivery of a growth factor pdgf-b gene carrying lentiviral vectors (LV-pdgfb) in order to facilitate angiogenesis and to enhance bone regeneration. In a scaffold-implanted calvarial critical bone defect mouse model, the blood vessel areas (BVAs) in PHp scaffolds were significantly higher than in PH scaffolds. Additionally, the expression of pdgf-b and angiogenesis-related genes, vWF and VEGFR2, increased correspondingly. MicroCT analysis indicated that the new bone formation in the PHp group dramatically improved compared to the other groups. To our knowledge, this is the first time multiphoton microscopy was used in bone tissue-engineering to investigate angiogenesis in a 3D bio-degradable scaffold in vivo and in real-time.

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Here, we present a protocol to visualize blood vessel formation in vivo and in real-time in 3D scaffolds by multiphoton microscopy. Angiogenesis in genetically modified scaffolds was studied in a murine calvarial critical bone defect model. More new blood vessels were detected in the treatment group than in controls.

Visualización de angiogénesis por microscopía multifotón En Vivo en modificados genéticamente 3D-PLGA/nHAp andamio para Calvarial críticos de la reparación del defecto óseo

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds ...

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently needed in disease diagnosis, microbial monitoring, genetically modified organism (GMO) detection, and forensic analysis. We have previously described the platform called CALM (Capillary Array-based Loop-mediated isothermal amplification for Multiplex visual detection of nucleic acids). Herein, we describe improved fabrication and performance processes for this platform. Here, we apply a small, ready-to-use cassette assembled by capillary array for multiplex visual detection of nucleic acids. The capillary array is pre-treated into a hydrophobic and hydrophilic pattern before fixing loop-mediated isothermal amplification (LAMP) primer sets in capillaries. After assembly of the loading adaptor, LAMP reaction mixture is loaded and isolated into each capillary, due to capillary force by a single pipetting step. The LAMP reactions are performed in parallel in the capillaries. The results are visually read out by illumination with a hand-held UV flashlight. Using this platform, we demonstrate monitoring of 8 frequently appearing elements and genes in GMO samples with high specificity and sensitivity. In summary, the platform described herein is intended to facilitate the detection of multiple nucleic acids. We believe it will be widely applicable in fields where high-throughput nucleic acid analysis is required.

This protocol describes the fabrication of a small, ready-to-use cassette that can be applied for visual detection of multiple nucleic acids in a single, test that is easy to operate. In this approach, a capillary array was used for multiplex and highly efficient detection of GMO targets.

Detección visual de los ácidos nucleicos múltiples en un arreglo de capilares

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

Detección de endotoxinas en las formulaciones Nano mediante ensayos de Limulus Amoebocyte Lysate (LAL)

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Simultaneous Electrical and Mechanical Stimulation to Enhance Cells' Cardiomyogenic Potential

Cardiovascular diseases are the leading cause of death in developed countries. Consequently, the demand for effective cardiac cell therapies has motivated researchers in the stem cell and bioengineering fields to develop in vitro high-fidelity human myocardium for both basic research and clinical applications. However, the immature phenotype of cardiac cells is a limitation on obtaining tissues that functionally mimic the adult myocardium, which is mainly characterized by mechanical and electrical signals. Thus, the purpose of this protocol is to prepare and mature the target cell population through electromechanical stimulation, recapitulating physiological parameters. Cardiac tissue engineering is evolving toward more biological approaches, and strategies based on biophysical stimuli, thus, are gaining momentum. The device developed for this purpose is unique and allows individual or simultaneous electrical and mechanical stimulation, carefully characterized and validated. In addition, although the methodology has been optimized for this stimulator and a specific cell population, it can easily be adapted to other devices and cell lines. The results here offer evidence of the increased cardiac commitment of the cell population after electromechanical stimulation. Electromechanically stimulated cells show an increased expression of main cardiac markers, including early, structural, and calcium-regulating genes. This cell conditioning could be useful for further regenerative cell therapy, disease modeling, and high-throughput drug screening.

Simultaneous Electrical and Mechanical Stimulation to Enhance Cells&#039; Cardiomyogenic Potential

Here we present a protocol for training a cell population using electrical and mechanical stimuli emulating cardiac physiology. This electromechanical stimulation enhances the cardiomyogenic potential of the treated cells and is a promising strategy for further cell therapy, disease modeling, and drug screening.

Simultánea estimulación eléctrica y mecánica para mejorar el potencial de las células cardiomiogenético

Cardiovascular diseases are the leading cause of death in developed countries. Consequently, the demand for effective cardiac cell therapies has motivated ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Medición del potencial de acción óptica unicelular en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Rapid, Enzymatic Methods for Amplification of Minimal, Linear Templates for Protein Prototyping using Cell-Free Systems

This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins in less than 24 h using cell-free expression. After receiving DNA from a vendor, the gene fragment is PCR-amplified, cut, circularized, and cryo-banked. A small amount of the banked DNA is then diluted and amplified significantly (up to 106x) using isothermal rolling circle amplification (RCA). RCA can yield microgram quantities of the minimal expression template from picogram levels of starting material (mg levels if all starting synthetic fragment is used). In this work, a starting amount of 20 pg resulted in 4 &#181;g of the final product. The resulting RCA product (concatemer of the minimal template) can be added directly to a cell-free reaction with no purification steps. Due to this method being entirely PCR-based, it may enable future high-throughput screening efforts when coupled with automated liquid handling systems.

The study describes a protocol for creating large (&#181;g-mg) quantities of DNA for protein screening campaigns from synthetic gene fragments without cloning or using living cells. The minimal template is enzymatically digested and circularized and then amplified using isothermal rolling circle amplification. Cell-free expression reactions could be performed with the unpurified product.

Métodos rápidos y enzimáticos para la amplificación de plantillas mínimas y lineales para la creación de prototipos de proteínas utilizando sistemas libres de células

This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins ...