The authors have no acknowledgements.

템플릿으로 1. 폴리 우레탄 (PU) 스폰지 준비 <ol><li> 상호 연결 기공을 포함하는 하이드 록시 아파타이트 템플릿을 생성하기 위해 폴리 우레탄 스폰지를 사용합니다. 템플릿 스트러트의 형성뿐만 아니라 trabeculae 내의 마이크로 채널의 형성을위한 기본을 제공하는 trabeculae 각 스폰지 사용. </li><li> 잘라 길이 폭 X 1.5 cm에 X 5cm 높이 3.5 cm의 크기로 2 브리지 모양으로 (인치 당 모공) 스폰지 80 PPI 트림. 주 : 치수 및 형상이 선택 될 수있는 원하는 기본 기공 크기에있어서 100 PPI, PPI 80 및 60을 PPI. </li><li> 4 %의 100 mL로 (w / v)의 150 ㎖의 비커를 사용하여 NaOH 용액; 다음 담그고 준비 스폰지가 완전히 젖었 때까지 짠다. </li><li> 몸을 담근 후, 초음파 (42 kHz에서)에서 스폰지와 비커를 놓습니다. </li><li> 초음파 표면 특성을 수정하는 열없이 15 ~ 20 분 동안 폴리 우레탄 스폰지를 사전 처리합니다. </li><li> 증류수로 씻어5 ~ 10 분 동안 물. 세정하는 동안, 스폰지를 압착하고가 스폰지 안에 잔여의 NaOH를 제거하기 위해 5 내지 7 배 확대 할 수있다. </li><li> 여분의 물을 제거하기 위해 종이 타월과 스폰지를 짜내; 그런 다음 60 ~ 80 ℃의 오븐에서 건조한다. </li></ol> 코팅 2. 수산화 인회석 (HA) 슬러리 준비 <ol><li> HA 슬러리를하기 전에, 자기 교반 막대가 비커의 중량을 측정한다. 이 측정은, 분말 / 액체 비율을 계산하는 데 사용된다. </li><li> 나노 크기의 HA 분말 10g을 측정한다. </li><li> 50 ㎖ 비이커에 증류수 20 ㎖를 추가합니다. 120-140 ° C 및 교반은 자기 교반 가열판을 사용하는 열. </li><li> 300-400 rpm으로 교반하면서 증류수 당 분말을 폴리 비닐 알코올 (PVA) (89,000-98,000 MW) 0.3 g (w / w 3 %)를 첨가. </li><li> PVA가 완전히 용해 될 때까지 저어. PVA 용액을 완전히 용해 후 명백하다. </li><li> O십시오400-500 rpm으로 교반하면서 FF 열 및 나트륨 카르복시 메틸 셀룰로오스 (CMC) 분말 (매우 낮은 점도) 0.1 g (w / w 1 %)를 추가한다. PVA 용액을 완전히 용해 후 명백하다. </li><li> CMC가 완전히 용해 될 때까지 저어 실온까지 냉각. </li><li> 300-400 rpm으로 교반하면서 분말 당 암모늄 폴리 아크릴 레이트 분산제 0.3 g (3 % w / w)를 첨가. 완전히 용해 될 때까지 저어. </li><li> 300 ~ 400 rpm으로 교반하면서 분말 당 글리세린 0.2 G (W 2 % / W)를 추가합니다. 완전히 용해 될 때까지 저어. </li><li> 천천히 600-900 rpm으로 교반하면서 용액에 HA 분말을 분산, 5 분 동안 계속 교반. </li><li> HA 분말의 응집 임의의 분산을 위해 초음파를 사용하여 5 분 동안 초음파 처리. </li><li> 90-100 ℃에서 600-900 rpm으로 열에서 교반하면서 혼합물에 증류수를 추가로 5 ㎖를 추가한다. </li><li> ORD에서 90-100 ℃에서 600-800 rpm으로 자기 교반기를 사용하여 교반 유지ER은 수분을 증발. </li><li> 1.75에서 1.8 사이의 분말 / 액체 비율이 얻어 질 때까지 수시로 비이커 포함한 혼​​합물 전체 중량을 측정한다. </li><li> 분말 / 액체 비율을 포맷, 분말, 시약, 물, 마이너스 비이커 및 교반기 (2.1)의 중량, 및 마이너스 HA 분말을 포함한 혼​​합물 (2.14)의 합계 중량에 의해 분말의 중량을 나누어 (2.2). 참고 : 예를 들어 : (분체, 시약, 및 물을 포함하여 전체 혼합물) 49.05 g 인 경우, B (교반기는 비커) 33.5 g, 그 후 C (HA 분말) 10g이다. C / (ABC 방송) = 10 / (49.05-33.5-10) = 1.80 </li><li> 슬러리 코팅을 위해 사용하기 전에 실온까지 냉각시킵니다. </li></ol> 3. HA 코팅, 건조, 소결 <ol><li> 코트 슬러리까지 스테인레스 주걱을 사용하여 HA 코팅 슬러리 제조 PU 스폰지 균질 유리판 상 PU 스폰지에 걸쳐 분산된다. 참고 : 초과 비방를 제거한 후공예, 기공의 일부는 여전히 높기 때문에 슬러리 점도의 슬러리로 막혀 할 수있다. </li><li> 약간, 상호, 균일 성, 열린 모공을 보장 공기 압축기를 사용하여 HA 코팅 된 템플릿을 타격하기 위해. 이 프로세스 템플릿 균일 PU 스폰지의 내부 및 외부 표면 모두에 코팅되는 것을 보장한다. 주 : 균질 코팅이 달성되지 않으면, HA 코팅 된 템플릿을 소결 과정 중에 붕괴되고 낮은 기계적 강도로 인해 취급시에도 균열이있다. 또한, 균일 한 코팅은 trabeculae 내에 미세 통로를 만드는데 중요하다. </li><li> 부드러운 공기 순환과 냉각 조건에서 5 시간 (20 ~ 25 ℃로)의 최소 HA 코팅 된 템플릿을 건조. 그러나 주형의 크기에 기초하여, 건조 시간을 연장한다. 참고 : 건조 후, HA 코팅 된 템플릿은 일반적으로 각 차원에 약 8 % ~ 10 %를 축소합니다. </li><li> 건조 공정 후, HA 배치알루미나 도가니에 코팅 된 템플릿. 그리고, 고온 가열로에 배치하고 다음 단계 8 소결 프로파일을 사용한다. <ol><li> 예선 2 ℃ / 분까지 230 ° C. </li><li> 예선 1 ° C / 분까지 280 ° C. </li><li> 400 ° C를 때까지 0.5 ℃ / 분 가열한다. </li><li> 열 3 ℃ / 분까지 600 ° C. 1 시간 동안 600 ℃에서 보관하십시오. </li><li> 열 5 ℃ / 분, 1230 ℃로 될 때까지. 3 시간 동안 1,230 ° C를 유지합니다. </li><li> 실온으로 냉각 5 ° C / 분. 참고 : 소결 더 약 22 % HA 코팅 스폰지 템플릿을 축소합니다 - 각 차원에서 25 %. </li></ol></li></ol> 템플릿으로 세포의 4. 수신 및 거주 <ol><li> 5 % CO 2를 함유하는 가습 분위기하에 37 ℃에서 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 1 % 항생 물질 (스트렙토 마이신 및 페니실린)이 보충 된 α-MEM으로 이루어진 비 - 골 형성 배지에서 배양 사전 골아 MC3T3 세포 . </li><li> 10 ML을 추가6- 웰 접시 내에서 단일 웰에 2 × 106 세포의 밀도로 세포 현탁액. </li><li> 6 웰 플레이트에 수직으로 3cm X 4cm X 1cm의 다리 모양의 템플릿을 놓습니다. 인접한 빈 웰에 세포 현탁액을 포함하는 플레이트에 서식하고, 다른 레그 중 하나의 다리를 놓는다. </li><li> 템플릿이 10 분 동안 세포 현탁액을 흡수 할 수 있습니다. </li><li> 그 후 원래 세포 현탁액으로 가득 차 있었다 잘 미디어의 5 ML을 추가합니다. </li><li> 칠일이 경과 할 때까지 매 2 3 일 모두 우물에서 매체를 보충. </li><li> 헤 마톡 실린 및 에오신 염색 (11)에 의해 세포 이동의 효과를 결정합니다. <ol><li> 20 ~ 30 분 동안 100 %의 EtOH에 침지하여 세포와 지지체를 수정합니다. </li><li> 1 ~ 2 분 동안 헤 마톡 실린으로 얼룩. </li><li> 두 번 1-2 분 동안 증류수로 씻어. </li><li> 다음, 70 %에 담가 95 %, 1 ~ 2 분마다 다음 100 % EtOH를 탈수. </li><li> 20 ~ 30 초 동안 에오신으로 얼룩. </li><li> 두 번 12 분 동안 증류수로 씻어. </li><li> 1-2 분마다 70 %에 침지하여 80 %, 90 % 및 100 % EtOH로 탈수. </li><li> 절편 및 이미징을위한 아크릴 수지의 발판을 포함시킵니다. </li></ol></li><li> 3- [4,5- 디메틸 티아 졸 -2- 일] -2,5- 디 페닐 테트라 졸륨 브로마이드 (MTT) 세포 생존력 분석법 및 라이브 / 죽은 분석 (생균 / 죽은 세포 염색 키트 MPTP)시 점 세포 생존을 결정 3 일, 7 (11). 주 : 뼈 형상 템플릿 제작 프로토콜 방식은 &quot;대표 결과&quot;세션에서 표현된다. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

등의 세포, 성장 인자, 영양소, 포함한 멀티 컴포넌트 템플릿은 성공적인 골 재생 및 임계 크기의 큰 골 결손의 수복 작용을 위해 필요하다. 이러한 요소 내에서 해부학 적으로 순응 생물학적 특성이 필수적이다. 생물학적 기능을 달성하기 위해, 템플릿은 생체 적합성, osteoconductivity, 기계적 완전성, 충분한 표면적, 적절한 표면 질감과 산소 및 영양을위한 전송 수단을 발휘한다. 용이하게 침투 템플릿에 (활성 모집), 템플릿 (유지)에 걸쳐 균일 한 분포, 가속 증식과 높은 생존 능력 (거주) : 세포 수준에서, 다음과 같은 기능은 대규모 골 결손의 기능 회복에 특히 중요하다. 마지막으로, 실질적인 세포 외 기질의 후속 형성 및 유전자 발현의 트리거링은 급속하게 혈관 필수 생물학적 과정에서 결정적인ND 골 형성. 합성 대체품의 많은 다른 유형은 자동 /으로 할당 할 뼈 이식 조직을 대체하기 위해 제안되어왔다. 그러나, 현재의 골격 조직 마이크로 채널 및 나노 기공을 함유하는 내부 미세 환경을 나타내지 않기 때문에 적극적 깊이 10mm보다 큰 합성 대체품으로 세포 침윤, 배포 및 inhabitance을 용이하게하지 않는다. 이들은 효율적으로 신속하고 균일 뼈 템플릿 깊숙이 마이그레이션 세포 선구 물리적 단서를 제공하지 않는다. 대신, 세포의 제한된 수동 모집 발판의 외부 및 내부 영역 사이의 불평등하게 분배 세포 집단을 만듭니다. 이는 주형의 내부 코어에 도달 세포의 초기 도전 악화뿐만 아니라 합성 대용의 타단 영양소 유동 세포 통신을 방해하지 만. 셀 D의 불균형 세포 모집 및 주거 이런 형태의비계 후 조정법과 불완전한 뼈 성장은 신체 14, 15에 이식되었습니다. 따라서, 우리는 이러한 장애를 해결하기위한 기본 물리적 큐로 모세관 작용의 개념을 도입하고있다. 우리는 충분히 적극적 BMT 깊숙이 세포를 모집 책임감 차 드래그 력 차지할 모세관 현상을 유도 BMT에 마이크로 채널을 설계했다. PU 스폰지 코팅 기술은 몇 가지 독특한 특성을 제공한다. 첫째, 자신이 미리 정의 된 템플릿 구조물에 의존 잘 제어 된 다공성 구조의 골소주 쉬운 제제를 허용 (즉, 300-400 μm의 템플릿에 대한 인치 당 세공 80). 이 조골 세포 침윤 15 기공 크기를 최적화하기위한 매우 중요하다. 둘째로, 기술은 셀 재 (11)를 초기화하는 데 중요한 역할을 차지 상호 접속 된 마이크로 채널의 구성을 가능하게. 사용자 정의 모양과 템플릿의 크기를 만드는 측면에서 우레탄 스펀지를 사용하는 경우 셋째, 거의 제한이있다. 메이커는 간단한 모양이나 복잡한 형상 심지어 계산 된 레이저 절단 가위를 사용할 수 있습니다. 이 정밀하게 제어 기술을 사용하여, 우리는 BMT를 만들었습니다. HA는 때문에 생체 적합성 및 osteoconductive 용량 (17)의 출발 물질로서 선택되었다. 이 연구에서 강조해야 할 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 온도가 너무 높아서 교반 속도가 너무 낮 으면 HA 슬러리 제조시, HA 슬러리를 비이커의 바닥 가장자리 붙어되고 건조된다. 과량의 HA 슬러리를 불어 코팅 공정 후에, 공기 압력이 너무 높은 BMT의 표면에 균열을 유도 할 수있다. 제대로 HA 과잉 슬러리를 공기 만 밖으로 비교적 낮은 공기압을 유지하는 것이 중요하다. 소결 공정의 마지막으로, 두 번째 및 세 번째 단계가장 중요한 (예선 1 ° C / min으로 280 ° C 및 열 0.5 ° C / 분까지 400 ° C까지)이다. HA가 조밀하게하면서이 온도 범위에서, 우레탄 스펀지가 완전히 타 버릴 것입니다. 이 프로토콜 밀접 따르지 않으면, BMT 붕괴 또는 소결 후에 부서진한다. 이 연구에 기술 BMT은 몇 가지 장점을 제공한다. 첫째,-간 연결 매크로 기공 (300 ~ 400 μm의)는 인간의 소주 골의 사람들을 모방하고 부드러운 골수 흐름 수 있습니다. 둘째, 템플릿은 모세관 작용을 통해 골 세포의 초기 진입을 촉진하기 위해 각 격벽 섬유주 내의 미세 채널 (25-50 μm의)로 구성된다. 템플릿이 300 μm의 기공 (주 모공)없이 마이크로 채널이 있다면, 전산 시뮬레이션 (13)를 사용하여 알 수 있듯이, 모세관 작용은 골수와 템플릿의 전체 채도에 충분하다. 특히 L을 필요로 대형 결함을 성립 것ARGE 크기 템플릿. 마이크로 미터 크기의 채널을 나타낸다 매우 효과적인 유체 흡수하고, 따라서 우리는 마이크로 채널이 연구에서 모세관 작용에 주된 책임이 될 것으로 기대. 셋째, 우리의 BMTs 전략적으로 나노 기공을 배치했다. 문학의 데이터는 세포가 나노 패턴 (18, 19)을 특히 민감 것을 나타냅니다; 따라서, 우리는 세포 부착을 증가시키는 역할을하는 마이크로 채널의 벽에 나노 기공을 예상. 소주 격막의 표면에 나노 크기의 기공 (100-400 nm의)는 앵커 세포를 고정화 허용했다. 전반적으로,이 세 가지 내부 구조의 결합 된 효과는 템플릿을 통해 강화 된 세포 동원 및 접착 결과. 그러나 프로토콜의 몇 가지 제한과 완벽한 BMT를 제조 할 수있는 중요한 단계가 있습니다. 예를 들어, 코팅 동안 균질 점성을 유지의 어려움으로 인해 제조 HA 슬러리 다량 종종있다. 또한 제작에 한계가있다때문에 코팅하는 동안 시간을 작업에 볼륨에서 5cm 3보다 큰 템플릿. 코팅 두께는 머신의 기술에 따라 변화하는 중요하다. 우리의 연구 결과는 제안이 흡수하고 기존의 alloplastic (또는 합성) 발판을 통해 잠재적 인 이점을 제공 할 것입니다 세포를 유지 할 수있는 BMT. 전향 적 연구는 뼈 - 관련 성장 인자와 함께 골 형성 및 / 또는 혈관 신생에 BMT의 이점을 확인하기 위해 고려되고있다. 따라서, 우리는 우리의 고유 한 기능을 갖춘 BMT의 발판이 큰 결함의 합성 구조와 불완전 골 재생에 충분 골수 침투의 주요 장벽을 해결할 수 있다고 주장한다. 본 연구의 궁극적 인 목표는 시간 - / 노동 집약적 골수 기질에 대한 필요성을 제거하여 임계 크기 결함 경골 뼈 재구성 및 복원 기능에 생명 공학의 현재 패러다임을 단순화하는 것이다L 세포의 분리 및 확장 프로세스. 마지막으로, 우리는 뼈의 재건을 위해 빠른 세포 흡수, 균일 한 분포 및 inhabitance을 유도 마이크로 채널 및 나노 기공과 3 차원 구조를 따르는 해부학 적으로 활용하는 것을 목표로하고 있습니다.

The ultimate goal of bone tissue engineering with synthetic constructs is the incorporation of the constructs into the host bone, repopulation of the constructs with host cells, and reconstitution of gas and body fluid exchanges to restore normal bone function. Considerable research has been reported over the last decade in the use of polymeric and ceramic biomaterials for producing scaffolds1,2. However, the ideal material and fabrication technique for optimal bone tissue regeneration has yet to be identified. In addition, there is an overall lack of success in bringing these technologies to the clinic, especially for the reconstruction and restoration of large bone defects. Therefore, restoring critical sized bony defects still remains a clinical challenge1-5. 
Ideally, the scaffolds for bone tissue regeneration should exhibit biocompatibility without causing inflammatory responses or foreign body/toxic reactions, have closely matched mechanical properties when compared to those of native bone, and possess a mechanism to allow diffusion and/or transport of ions and nutrients. Strong bonding with the host bone, dynamic bone growth, vascular ingrowth, and biodegradation of the scaffolds are equally desirable. Although the use of biodegradable polymer scaffolds has exhibited progress in terms of tissue ingrowth, there are controversies over their use for bone regeneration. 
Notwithstanding these extensive efforts, the highly organized structural synthetic constructs still have limited potential in overcoming the obstacle of passive cell penetration. Most of these approaches have resulted in the in vitro tissue ingrowth with cross-sections of less than a few &#181;m to several mm from the external surface, an incomplete integration with host bone, and only partial bone regeneration in vivo6,7. The pioneering cells do not migrate deeply into the constructs because of the lack of an initial force that pulls them inside before cell colonization begins. Consequently, cell colonization strictly occurs at the scaffold periphery, becoming an obstruction from the periphery to the center of the scaffold. Thus, the diffusion of oxygen and nutrients into the inner parts of the templates becomes limited8. Therefore, it is clear that the architecture of the scaffolds (pore size, porosity, interconnectivity, and permeability) that affect the transport and diffusion of substances throughout the scaffolds is critical for achieving well-distributed cell proliferation and differentiation9,10. Although calcium phosphates have been used in the past for scaffold fabrication, different processes and procedures have often resulted in calcium phosphate scaffolds with varying architectures. Thus, the selection of the manufacturing process becomes important in dictating the scaffold architecture needed for successful bone tissue regeneration.
In conclusion, there are still two major shortcomings of bone tissue engineering that need to be addressed: the initial cell recruitment into the template prior to cell attachment and colonization and the quality of substance flow both into and out of the template.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>polyurethan sponge</td>
			<td>Plastifoam</td>
			<td>PU-3215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">167176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxyapatite Powder</td>
			<td>Ossgen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl Alcoho</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">341584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxymethyl cellulose sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">360384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium polyacrylate</td>
			<td>Vanderbilt</td>
			<td>DARVAN 821A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2289</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

distinctive capillary action by micro-channels in bone-like templates can enhance recruitment of cells for restoration of large bony defect

잘 분산 안정적으로 삽입 된 템플릿에 고정하는 활성, 번성하는 세포 집단이 없으면, 뛰어난 골 재생가 발생하지 않습니다. 종래 템플릿 깊은 템플릿 내부 세포 침윤, 배포 및 inhabitance 부족 내부 마이크로 채널 결과의 부재. 따라서, 마이크로 채널 다공성 및 균일 상호 소주 뼈 같은 템플릿 (생물 미세 템플릿, BMT)이 장애물을 해결하기 위해 개발되었다. 신규 BMT 혁신적인 개념 (모세관)에 의해 생성 및 스폰지 템플릿 코팅 기술로 제조 하였다. 간 연결 차 공극 (300 ~ 400 μm의)에 소주 뼈에 구멍, 각 trabecula 내에서 마이크로 채널 (25-70 μm의), 및 나노 기공 (100-400 nm의) 모방 : BMT는 몇 가지 구조적인 구성 요소로 이루어져 있습니다 세포를 고정 할 수 있도록 표면. 또한, BMT는 시뮬레이션이 기계적 시험 연구에 의해보고되었다인간의 소주 골 (~ 3.8 MPa의) (12)의 것과 ILAR 기계적 강도 특성. BMT는 다리 모양 (Π) 템플릿 (3cm 높이 4cm 길이)에 걸쳐 높은 흡수, 보유, 세포의 거주를 보였다. 처음이었다 세포는 즉시 셀 미디어 BMT의 모세관 작용에 의해 타 단부 ​​(10 × 거리) 동원 템플릿의 일단에 시드. 4 시간 후, 세포를 균일하게 전체 BMT를 점유하고 정상 세포의 거동을 나타냈다. 모세관 작용은 미디어 및 BMT 걸쳐 분포 (활성 마이그레이션)에 현탁 세포의 침투를 차지했다. BMT의 이러한 기능을 관찰하는 데, 우리는 BMTs 생리적 조건 하에서 외주로부터 골수 세포, 성장 인자, 영양소 흡수 것으로 예상된다. BMT는 빠른 침투, 균일 한 분포와 inhabita를 통해 현재의 한계를 해결할 수 있습니다큰 부피 템플릿에서 세포의 후부는 거대한 골격 결함을 복구합니다.

BMT의 전체 구조는 뼈 골소주 같은 내부 구조와 고유 입체 템플릿을 나타낸다. BMT는 매크로 기공, 마이크로 채널, 나노 기공을 포함하고 있습니다. 맑은 완전히 상호 연결된 매크로 기공의 구성 (320 μm의 평균 크기), 마이크로 채널들 (50 ㎛의 평균 직경), 및 나노 기공 (100 nm의 평균 크기)를 주 사형 전자 현미경으로 확인 하였다 (EVO-40; ZEISS)뿐만 아니라 마이크로 단층 촬영을 통해. 그림 1은 BMT를 만드는 단계적으로 상세한 프로토콜을 보여줍니다. 소결 공정에 PU 스폰지 (P1 - P7;도 1)의 제조에서의 정확한 제어 프로토콜을 통해, 다음의 기능은 달성 될 수있다 : 매우 치밀하고 매끄러운 표면 HA 코팅 및 건조 후, 정확하게 모양과 3-D 템플릿을 크기; 소주 골 유사한 완전히 상호 연결된 기공 섬유주 네트워크; 마이크로 채널의 지혜힌 같은 Haversian 운하와 Volkmann의 운하 (그림 2 &amp; 3)로 내 뼈의 채널을 모방 각 trabecula. 또한, 상대적으로 높은 기계적 강도 (~ 3.8 MPa의) 인간 뼈 골소주 유사한는 압축 강도 시험에 의해 측정 하였다. 소주 뼈 척추 인간의 척추의 것과 매우 유사한 조직 형태 학적 매개 변수는 마이크로 CT 분석 (12)에 의해 확인되었다. 모세관 작용의 다른 크기는 시뮬레이션 연산을 이용하여도 4에 상이한 모세관 직경을 통해 입증되었다. 이러한 시뮬레이션을 통해, 우리는 BMT 차 공극 (300-400 μm의) 및 직경에 기초하여 마이크로 채널 (25-70 μm의) 내의 다양한 흡수 속도를 나타낼 것으로 예상. 작은 모세 혈관을 강하게 흡수 능력을 보였다. 도 5에 도시 된 바와 같이,이 가정은이 실험에서 확인되었다. 골수 이식은 매우 효과적인 전시미세 채널 구조의 모세관 작용을 통해 유체를 흡수 및 보유; stevenel의 청색 염색 용이 플로우 (도 5)를 추적하는 유체 매체로서 사용 하였다. 계산 시뮬레이션에 기초하여, 이러한 구성으로 BMT 흡수하고 10 초 이내의 거리에서 총 8.5 cm에 세포 현탁액을 유지하는 것으로 하였다. 때문에 내부 구조에 의한 강한 모세관, 염색 배지 3cm (높이)의 대향 단부에 도달 4cm (길이)이 1 분 40 초 이내에 1cm (폭) 브리지 형상 템플릿 X X. 또한, BMT에 활성 셀 동원과 통합 (그림 6)이 관찰되었다. 그 후, 균일 한 세포의 동원과 첨부 파일이 고르게 분포 형성에 향상된 증식과 매트릭스 형성의 결과. BMT이 세포 현탁액으로 포화 된 후 또한 BMT 통해 세포의 장거리 (~ 10cm) 이동은 즉시 검증 하였다. 괜찮다<html> eded 세포를 공기에 노출하고 배양 배지에 침지되지 않은 템플릿 세그먼트 살아 남았다. 이 실험에서는, 배양 배지는 지지체의 다리를 만지고 웰에 의해 독점적으로 세포에 제공 하였다. 마이크로 의해 나타나는 모세관 작용은 지지체의 상부 다리 부에 도달하는 새로운 배지에 허용. 문화 3 일 후, 템플릿은 빠르게 증식 세포를 점령되었다. 문화 7 일 후, 각 trabecula는 세포 외 매트릭스 래핑 된 세포 (13)와 임베디드. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig1.jpg" /> 도 1 P7은 양호한 기계적 강도를 달성하는데 중요하다 후에 정확한 소결 프로파일을 유지하는 최종 열처리 (P7)에 PU 스폰지 (P1)의 전처리에서 전체적인 뼈 형상 템플릿 제작 프로토콜..F = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig1large.jpg&quot;대상 = &quot;_ 빈&quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig2.jpg" /> . 그림 2 대표 스테레오 현미경, 80 PPI의 (AmScope SM-2TZ-M) 이미지 (4 개)는 폴리 우레탄 스폰지 (왼쪽), HA 코팅 및 BMT (가운데), 소결 BMT (오른쪽) 건조 크기 (크기 : 3. 길이 x 폭 1cm)에 높이 x 4cm의 CM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig3.jpg" /> 생물 서식 그림 3. SEM 마이크로 CT 영상 (A) 생물 서식의 전체 이미지, <st<html> 룽&gt; 마이크로 채널 (B, C, D) 이미지. trabeculae 분명 마이크로 채널을 강조하기 위해, 템플릿은 입자 화했다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig4.jpg" /> .도 상이한 채널 직경 모세관 4. 전산 계산 같은 기간 (0.4 MS), 큰 모세관 동안 이내에서 0.16 mm까지 매체 (블루)를 흡수 (D = 300 μm의 기본 기공을 지칭) 높이가 가장 작은 모세관 : 높이 0.415 mm까지 매체를 흡수 (D = 30 μm의 마이크로 채널을 의미한다). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> NT &quot;FO : 유지 - together.within 페이지 =&quot;항상 &quot;&gt; <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig5.jpg" /> 470 μm의 80 PPI ≈ 320 μm의 100 PPI의 ≈ ≈ 60 PPI :도 5 이미지는 기본 기공 및 마이크로 채널 (차 공극 크기가 평균 직경을 지칭의 다른 크기에 기초하여 모세관 작용의 흡수 능력의 차이를 보여 주었다 )이 200㎛이. 황색 라인 프라이 기공 및 마이크로 채널의 조합에 의해 유도 된 모세관 작용을 나타낸다. 적색 선은 각 trabecula 전시 주로 미세 채널에 의해 유도 된 모세관 작용을 나타낸다. (F)에 도시 된 바와 같이, 템플릿 (100) PPI는 39 초 이내에 템플릿의 완전한 포화 결과 강한 모세관 작용을 유도. 80 PPI 60 PPI 템플릿은 후 시험 하였다. (B) 0 초, (C) 0.5 초, (D) 1.5 초, (E) 17.0 초, (F) 39.0 초, (G) 50.0 초, 및 (H) 1 분 침지 후 18 초. (템플릿 차원 : 1CM X 1cm X 높이 입방에 4cm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig6.jpg" /> 그림 6. 초기 시드 세포가 시드 화 다리의 끝에 도달 시드 우물 모세관 작용에 의해 유도 된 생물 서식을 통해 시드 화 우물 (부품 V)에 (1 부).에서 수신 및 세포의 이민 (부품 V) 직후 전체 채도. 3일 후, 세포의 합류는 템플릿 전체에 걸쳐 분명했다. 후 7 일, 시공간 콜라겐 매트릭스 형성은 세포 집단 (H &amp; E 염색) 내에서 발생 하였다. (템플릿 치수 : 높이 길이 폭 X 1cm의 X 4cm에서 3cm가). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig6large.jpg" target="_blank">카스티하세요</a>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 ICK.

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Distinctive Capillary Action by Micro-channels in Bone-like Templates can Enhance Recruitment of Cells for Restoration of Large Bony Defect

A step-by-step generic process to create a bone-like template with engineered micro-channels is presented. High absorption and retention capabilities of the template are demonstrated by capillary action via micro-channels.

마이크로 채널로 독특한 모세관 액션 뼈 같은 템플릿 대형 나폴레옹 결함의 복원에 대한 세포의 모집을 향상시킬 수 있습니다

Without an active, thriving cell population that is well-distributed and stably anchored to the inserted template, exceptional bone regeneration does not ...

distinctive-capillary-action-micro-channels-bone-like-templates-can

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.7K 조회수.  Columbia University. A step-by-step generic process to create a bone-like template with engineered micro-channels is presented. High absorption and retention capabilities of the template are demonstrated by capillary action via micro-channels. 

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Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

마우스 중심에 액션 후보와 칼슘 과도의 광학 매핑

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

연구

생체공학

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical discoveries with the aims of developing functional tissues for cardiac regeneration as well as in vitro screening assays. However, the ability to create high-fidelity models of heart tissue has proven difficult. The heart&#8217;s extracellular matrix (ECM) is a complex structure consisting of both biochemical and biomechanical signals ranging from the micro- to the nanometer scale2. Local mechanical loading conditions and cell-ECM interactions have recently been recognized as vital components in cardiac tissue engineering3-5.
A large portion of the cardiac ECM is composed of aligned collagen fibers with nano-scale diameters that significantly influences tissue architecture and electromechanical coupling2. Unfortunately, few methods have been able to mimic the organization of ECM fibers down to the nanometer scale. Recent advancements in nanofabrication techniques, however, have enabled the design and fabrication of scalable scaffolds that mimic the in vivo structural and substrate stiffness cues of the ECM in the heart6-9.
Here we present the development of two reproducible, cost-effective, and scalable nanopatterning processes for the functional alignment of cardiac cells using the biocompatible polymer poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)8 and a polyurethane (PU) based polymer. These anisotropically nanofabricated substrata (ANFS) mimic the underlying ECM of well-organized, aligned tissues and can be used to investigate the role of nanotopography on cell morphology and function10-14.
Using a nanopatterned (NP) silicon master as a template, a polyurethane acrylate (PUA) mold is fabricated. This PUA mold is then used to pattern the PU or PLGA hydrogel via UV-assisted or solvent-mediated capillary force lithography (CFL), respectively15,16. Briefly, PU or PLGA pre-polymer is drop dispensed onto a glass coverslip and the PUA mold is placed on top. For UV-assisted CFL, the PU is then exposed to UV radiation (&#955; = 250-400 nm) for curing. For solvent-mediated CFL, the PLGA is embossed using heat (120 &#176;C) and pressure (100 kPa). After curing, the PUA mold is peeled off, leaving behind an ANFS for cell culture. Primary cells, such as neonatal rat ventricular myocytes, as well as human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, can be maintained on the ANFS2.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

심장 조직 공학을위한 모세관 력 리소그래피

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to evaluate new strategies that aim at improving vascularization, reliable methods are required to make the in-growth of new blood vessels into bio-artificial scaffolds visible and quantify the results. Over the past couple of years, our group has introduced a full skin defect model that enables the direct visualization of blood vessels by transillumination and provides the possibility of quantification through digital segmentation. In this model, one surgically creates full skin defects in the back of mice and replaces them with the material tested. Molecules or cells of interest can also be incorporated in such materials to study their potential effect. After an observation time of one&#8217;s own choice, materials are explanted for evaluation. Bilateral wounds provide the possibility of making internal comparisons that minimize artifacts among individuals as well as of decreasing the number of animals needed for the study. In comparison to other approaches, our method offers a simple, reliable and cost effective analysis. We have implemented this model as a routine tool to perform high-resolution screening when testing vascularization of different biomaterials and bio-activation approaches.

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Vascularization is key to approaches in successful tissue engineering. Therefore, reliable technologies are required to evaluate the development of vascular networks in tissue-constructs. Here we present a simple and cost-effective method to visualize and quantify vascularization in vivo.

전체 피부 결함 모델은 생체의 혈관 신생을 평가하기<em&gt; 생체</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product to demonstrate how regulating nutrient levels can improve cell yields. In previous studies, bioreactors facilitated increased culture volumes over static cultures, but no increase in cell yields were observed. Limitations in key nutrients such as glucose, which were consumed between batch feedings, can lead to limitations in cell expansion. Large fluctuations in glucose levels were observed, despite the increase in glucose concentrations in the media. The use of continuous feeding systems eliminated fluctuations in glucose levels, and improved cell growth rates when compared with batch fed static and SSB culture methods. Additional increases in growth rates were observed by adjusting the feed rate based on calculated nutrient consumption, which allowed the maintenance of physiological glucose over three weeks in culture. This method can also be adapted for other cell types.

Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.

회전 타원체의 포유 동물 세포의 대규모 확장을위한 지속적인 공급함으로써 영양 규정

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds during repair, which gives rise to a lack of sufficient blood supply and causes necrosis of the new tissues. Rapid vascularization is a vital prerequisite for new tissue survival and integration with existing host tissue. The de novo generation of vasculature in scaffolds is one of the most important steps in making bone regeneration more efficient, allowing repairing tissue to grow into a scaffold. To tackle this problem, the genetic modification of a biomaterial scaffold is used to accelerate angiogenesis and osteogenesis. However, visualizing and tracking in vivo blood vessel formation in real-time and in three-dimensional (3D) scaffolds or new bone tissue is still an obstacle for bone tissue engineering. Multiphoton microscopy (MPM) is a novel bio-imaging modality that can acquire volumetric data from biological structures in a high-resolution and minimally-invasive manner. The objective of this study was to visualize angiogenesis with multiphoton microscopy in vivo in a genetically modified 3D-PLGA/nHAp scaffold for calvarial critical bone defect repair. PLGA/nHAp scaffolds were functionalized for the sustained delivery of a growth factor pdgf-b gene carrying lentiviral vectors (LV-pdgfb) in order to facilitate angiogenesis and to enhance bone regeneration. In a scaffold-implanted calvarial critical bone defect mouse model, the blood vessel areas (BVAs) in PHp scaffolds were significantly higher than in PH scaffolds. Additionally, the expression of pdgf-b and angiogenesis-related genes, vWF and VEGFR2, increased correspondingly. MicroCT analysis indicated that the new bone formation in the PHp group dramatically improved compared to the other groups. To our knowledge, this is the first time multiphoton microscopy was used in bone tissue-engineering to investigate angiogenesis in a 3D bio-degradable scaffold in vivo and in real-time.

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Here, we present a protocol to visualize blood vessel formation in vivo and in real-time in 3D scaffolds by multiphoton microscopy. Angiogenesis in genetically modified scaffolds was studied in a murine calvarial critical bone defect model. More new blood vessels were detected in the treatment group than in controls.

Calvarial 중요 한 뼈 결함 수리 다 현미경 Vivo에서 유전자 변형 3D-PLGA/nHAp 비 계에 의해 신생 시각화

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds ...

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently needed in disease diagnosis, microbial monitoring, genetically modified organism (GMO) detection, and forensic analysis. We have previously described the platform called CALM (Capillary Array-based Loop-mediated isothermal amplification for Multiplex visual detection of nucleic acids). Herein, we describe improved fabrication and performance processes for this platform. Here, we apply a small, ready-to-use cassette assembled by capillary array for multiplex visual detection of nucleic acids. The capillary array is pre-treated into a hydrophobic and hydrophilic pattern before fixing loop-mediated isothermal amplification (LAMP) primer sets in capillaries. After assembly of the loading adaptor, LAMP reaction mixture is loaded and isolated into each capillary, due to capillary force by a single pipetting step. The LAMP reactions are performed in parallel in the capillaries. The results are visually read out by illumination with a hand-held UV flashlight. Using this platform, we demonstrate monitoring of 8 frequently appearing elements and genes in GMO samples with high specificity and sensitivity. In summary, the platform described herein is intended to facilitate the detection of multiple nucleic acids. We believe it will be widely applicable in fields where high-throughput nucleic acid analysis is required.

This protocol describes the fabrication of a small, ready-to-use cassette that can be applied for visual detection of multiple nucleic acids in a single, test that is easy to operate. In this approach, a capillary array was used for multiplex and highly efficient detection of GMO targets.

모 세관 배열에 여러 개의 핵 산의 비주얼 검색

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

나노 제형에도 Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) 분석 실험을 사용 하 여

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Simultaneous Electrical and Mechanical Stimulation to Enhance Cells' Cardiomyogenic Potential

Cardiovascular diseases are the leading cause of death in developed countries. Consequently, the demand for effective cardiac cell therapies has motivated researchers in the stem cell and bioengineering fields to develop in vitro high-fidelity human myocardium for both basic research and clinical applications. However, the immature phenotype of cardiac cells is a limitation on obtaining tissues that functionally mimic the adult myocardium, which is mainly characterized by mechanical and electrical signals. Thus, the purpose of this protocol is to prepare and mature the target cell population through electromechanical stimulation, recapitulating physiological parameters. Cardiac tissue engineering is evolving toward more biological approaches, and strategies based on biophysical stimuli, thus, are gaining momentum. The device developed for this purpose is unique and allows individual or simultaneous electrical and mechanical stimulation, carefully characterized and validated. In addition, although the methodology has been optimized for this stimulator and a specific cell population, it can easily be adapted to other devices and cell lines. The results here offer evidence of the increased cardiac commitment of the cell population after electromechanical stimulation. Electromechanically stimulated cells show an increased expression of main cardiac markers, including early, structural, and calcium-regulating genes. This cell conditioning could be useful for further regenerative cell therapy, disease modeling, and high-throughput drug screening.

Here we present a protocol for training a cell population using electrical and mechanical stimuli emulating cardiac physiology. This electromechanical stimulation enhances the cardiomyogenic potential of the treated cells and is a promising strategy for further cell therapy, disease modeling, and drug screening.

Cardiovascular diseases are the leading cause of death in developed countries. Consequently, the demand for effective cardiac cell therapies has motivated ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에서 단세포 광학 작용 잠재적 측정

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Rapid, Enzymatic Methods for Amplification of Minimal, Linear Templates for Protein Prototyping using Cell-Free Systems

This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins in less than 24 h using cell-free expression. After receiving DNA from a vendor, the gene fragment is PCR-amplified, cut, circularized, and cryo-banked. A small amount of the banked DNA is then diluted and amplified significantly (up to 106x) using isothermal rolling circle amplification (RCA). RCA can yield microgram quantities of the minimal expression template from picogram levels of starting material (mg levels if all starting synthetic fragment is used). In this work, a starting amount of 20 pg resulted in 4 &#181;g of the final product. The resulting RCA product (concatemer of the minimal template) can be added directly to a cell-free reaction with no purification steps. Due to this method being entirely PCR-based, it may enable future high-throughput screening efforts when coupled with automated liquid handling systems.

The study describes a protocol for creating large (&#181;g-mg) quantities of DNA for protein screening campaigns from synthetic gene fragments without cloning or using living cells. The minimal template is enzymatically digested and circularized and then amplified using isothermal rolling circle amplification. Cell-free expression reactions could be performed with the unpurified product.

세포 없는 시스템을 사용하여 단백질 프로토타이핑을 위한 최소선형 템플릿의 증폭을 위한 신속하고 효소적인 방법

This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins ...