The authors have no acknowledgements.

1. polyuréthane (PU) Sponge Préparation comme modèle <ol><li> Utilisez des éponges PU pour produire des modèles d&#39;hydroxyapatite contenant pores d&#39;interconnexion. Utiliser chaque éponge à fournir les trabécules primaire pour la formation des entretoises de modèle ainsi que la formation de micro-canaux à l&#39;intérieur de la trabécules. </li><li> Couper et tailler 80 ppi (pores par pouce) éponges en 2 ponts-formes avec des dimensions de 3,5 cm de hauteur x 5 cm de longueur x 1,5 cm de largeur. Remarque: Les dimensions et les formes peuvent être choisies en fonction de la taille de pore désirée primaire: 100 ppi, 80 ppi, et 60 ppi. </li><li> Ajouter 100 ml de 4% (p / v) de solution de NaOH en utilisant un bêcher de 150 ml; puis plonger et presser jusqu&#39;à ce que les éponges préparées sont complètement trempés. </li><li> Après le trempage, placer le bécher avec les éponges dans l&#39;appareil à ultrasons (42 kHz). </li><li> Ultrasons pré-traiter les éponges PU pour 15-20 min sans chaleur pour modifier les propriétés de surface. </li><li> Rincer à l&#39;eau distilléel&#39;eau pendant 5-10 min. Lors du rinçage, presser les éponges et leur permettre de développer 5 à 7 fois afin d&#39;éliminer le NaOH résiduelle à l&#39;intérieur des éponges. </li><li> Pincez les éponges avec des serviettes en papier pour éliminer l&#39;excès d&#39;eau; puis les sécher dans un four à 60-80 ° C. </li></ol> 2. hydroxyapatite (HA) lisier Préparation pour le revêtement <ol><li> Avant de procéder à la suspension HA, mesurer le poids d&#39;un bécher avec une barre d&#39;agitation magnétique. Cette mesure sera utilisé pour calculer le ratio poudre / liquide. </li><li> Mesurer 10 g de poudre de HA de taille nanométrique. </li><li> Ajouter 20 ml d&#39;eau distillée dans le bécher de 50 ml. Chaleur pour 120-140 ° C et remuer à l&#39;aide d&#39;un agitateur magnétique de la plaque chaude. </li><li> Ajouter 0,3 g (3% p / p) de l&#39;alcool de polyvinyle (PVA) (89,000-98,000 MW) par la poudre dans de l&#39;eau distillée tout en agitant à 300-400 rpm. </li><li> Remuer jusqu&#39;à ce que le PVA a complètement dissous. La solution doit être limpide après dissolution complète du PVA. </li><li> Tournez off la chaleur et ajouter 0,1 g (1% p / p) de la carboxyméthylcellulose de sodium (CMC) (ultra-faible viscosité) pour la poudre tout en agitant à 400-500 rpm. La solution doit être limpide après dissolution complète du PVA. </li><li> Remuer jusqu&#39;à ce que la CMC a complètement dissous et refroidir à la température ambiante. </li><li> Ajouter 0,3 g (3% en poids / poids) de dispersant polyacrylate d&#39;ammonium en poudre par agitation à 300 à 400 tandis que rpm. Remuer jusqu&#39;à dissolution complète. </li><li> Ajouter 0,2 g (2% en poids / poids) de glycérine par poudre tout en agitant à 300 à 400 tours par minute. Remuer jusqu&#39;à dissolution complète. </li><li> Disperser lentement la poudre HA dans la solution tout en agitant à 600-900 rpm et continuer à remuer pendant 5 min. </li><li> Soniquer pendant 5 minutes en utilisant un appareil à ultrasons pour assurer une dispersion de toute agglomération de la poudre HA. </li><li> Ajouter un supplément de 5 ml d&#39;eau distillée dans le mélange tout en agitant à 600-900 rpm et de la chaleur à 90-100 ° C. </li><li> Gardez en remuant le mélange en utilisant un agitateur magnétique à 600-800 rpm à 90-100 ° C dans order à évaporer la teneur en eau. </li><li> Mesurer le poids entier y compris le bécher de mélange et de temps en temps jusqu&#39;à ce que le rapport poudre / liquide de 1,75 à 1,8 est obtenu. </li><li> Formatage le rapport poudre / liquide, on divise le poids de la poudre par le poids total du mélange (2,14), y compris la poudre, des réactifs et de l&#39;eau, moins le poids du gobelet et d&#39;un agitateur (2.1), et diminué de la poudre HA (2.2). Remarque: Par exemple: Si A (mélange entier, y compris en poudre, des réactifs, et de l&#39;eau) est 49,05 g, B (bécher avec agitateur) est de 33,5 g, puis C (HA poudre) est de 10 g. C / (ABC) = 10 / (49.05-33.5-10) = 1,80 </li><li> Laisser la suspension refroidir à la température ambiante avant de l&#39;utiliser pour le revêtement. </li></ol> 3. HA revêtement, séchage et frittage <ol><li> Enduire les éponges préparées PU avec la bouillie de revêtement HA en utilisant une spatule jusqu&#39;à ce que la suspension inoxydable est homogène tout au long de l&#39;éponge distribués PU sur une plaque de verre. Remarque: Après avoir enlevé l&#39;excès slurry, certains des pores peuvent encore être colmatées avec du lisier en raison de la forte viscosité de la suspension. </li><li> Afin d&#39;assurer l&#39;interconnectivité, l&#39;uniformité et pores ouverts, légèrement souffler les modèles revêtus HA en utilisant un compresseur d&#39;air. Ce processus garantit que les modèles sont recouverts de manière homogène à la fois sur les surfaces intérieures et extérieures de l&#39;éponge PU. Remarque: Si un revêtement homogène est pas atteint, les modèles revêtus HA seront effondrement pendant le processus de frittage et peuvent également se fissurer lors de la manipulation raison de la faible résistance mécanique. En outre, le revêtement homogène est essentiel dans la création de micro-canaux à l&#39;intérieur de la trabécules. </li><li> Sécher les modèles revêtus HA pour un minimum de 5 heures dans des conditions de refroidissement (20-25 ° C) avec douceur la circulation d&#39;air. Cependant, prolonger le temps de séchage en fonction de la taille du modèle. Remarque: Après séchage, les modèles revêtus HA seront généralement réduire d&#39;environ 8% à 10% dans chaque dimension. </li><li> Après le processus de séchage, placer le HAmodèles couchés sur un creuset en alumine. Ensuite, placez-les dans un four à haute température et utiliser l&#39;étape 8 profil frittage suivant. <ol><li> Heat 2 ° C / min jusqu&#39;à 230 ° C. </li><li> Heat 1 ° C / min jusqu&#39;à 280 ° C. </li><li> Chauffer 0,5 ° C / min jusqu&#39;à 400 ° C. </li><li> Chauffer 3 ° C / min jusqu&#39;à 600 ° C. Gardez à 600 ° C pendant 1 heure. </li><li> Heat 5 ° C / min jusqu&#39;à 1230 ° C. Gardez 1230 ° C pendant 3 heures. </li><li> Refroidir à 5 ° C / min à la température ambiante. Remarque: Le frittage va diminuer davantage les modèles d&#39;éponges revêtues HA d&#39;environ 22% - 25% dans chaque dimension. </li></ol></li></ol> 4. Ingress et inhabitancy de cellules dans Template <ol><li> Les cellules MC3T3 pré-ostéoblastiques de la culture dans un milieu non-ostéogène consistant en α-MEM, additionné de 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% d&#39;antibiotiques (streptomycine et pénicilline) à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée contenant 5% de CO 2 . </li><li> Ajouter 10 mld&#39;une suspension de cellules à une densité cellulaire de 2 x 10 6 dans un seul puits dans une plaque à 6 puits. </li><li> Placez le gabarit en forme de pont de 3 cm x 4 cm x 1 cm verticalement dans la plaque de 6 puits. Placer une jambe de la matrice dans la plaque contenant la suspension cellulaire, et l&#39;autre jambe dans un puits vide adjacent. </li><li> Laisser le modèle d&#39;absorber la suspension de cellules pendant 10 min. </li><li> Ajouter 5 ml de milieu par la suite au puits qui a été initialement rempli avec la suspension de cellules. </li><li> Reconstituer le moyen dans les deux puits tous les 2 ou 3 jours jusqu&#39;à 7 jours se sont écoulés. </li><li> Déterminer l&#39;efficacité de la mobilité cellulaire par coloration à l&#39;hématoxyline et à l&#39;éosine 11. <ol><li> Fixer les cellules et échafaudage par immersion dans EtOH à 100% pendant 20-30 min. </li><li> Colorer à l&#39;hématoxyline pendant 1-2 min. </li><li> Rincez avec de l&#39;eau distillée pendant 1-2 min pour le double. </li><li> Déshydrater par immersion dans 70%, puis 95%, puis 100% EtOH pendant 1-2 min chacun. </li><li> Tache avec de l&#39;éosine pour 20-30 sec. </li><li> Rincez avec de l&#39;eau distillée pendant 12 minutes deux fois. </li><li> Déshydrater par immersion dans 70%, 80%, 90% et 100% de EtOH pendant 1-2 min chacun. </li><li> Incluez l&#39;échafaud dans une résine acrylique pour la coupe et de l&#39;imagerie. </li></ol></li><li> Déterminer la viabilité cellulaire avec les 3- [4,5-diméthylthiazol-2-yl] -2,5-diphényl tétrazolium bromure (MTT) de la viabilité des cellules et le dosage direct / Dead (Live cellules / morts kit de coloration MPTP) au moment des points de la journée 3 et 7 11. Remarque: Le régime de protocoles modèle fabrication os ressemblant sont représentés à la session &quot;des résultats représentatifs&quot;. </li></ol>

<ol>
	<li>Petrie Aronin, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+effects+of+scaffold+pore+size,+pore+volume,+and+total+void+volume+on+cranial+bone+healing+patterns+using+microsphere-based+scaffolds.">Comparative effects of scaffold pore size, pore volume, and total void volume on cranial bone healing patterns using microsphere-based scaffolds.</a> J Biomed Mater Res A. 89 (3), 632-641 (2009).</li><li>Guzm&#225;n, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitosan+scaffolds+containing+calcium+phosphate+salts+and+rhBMP-2:+in+vitro+and+in+vivo+testing+for+bone+tissue+regeneration.">Chitosan scaffolds containing calcium phosphate salts and rhBMP-2: in vitro and in vivo testing for bone tissue regeneration.</a> PLoS One. 9 (2), e87149 (1371).</li><li>Cha, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinus+augmentation+using+BMP-2+in+a+bovine+hydroxyapatite/collagen+carrier+in+dogs.">Sinus augmentation using BMP-2 in a bovine hydroxyapatite/collagen carrier in dogs.</a> J Clin Periodontol. 41 (1), 86-93 (2014).</li><li>Karageorgiou, V., Kaplan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porosity+of+3D+biomaterial+scaffolds+and+osteogenesis.">Porosity of 3D biomaterial scaffolds and osteogenesis.</a> Biomaterials. 26 (27), 5474-5491 (2005).</li><li>Fisher, M. B., Mauck, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+and+regenerative+medicine:+recent+innovations+and+the+transition+to+translation.">Tissue engineering and regenerative medicine: recent innovations and the transition to translation.</a> Tissue Eng Part B Rev. 19 (1), 1-13 (2013).</li><li>Manassero, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+in+Sheep+Using+Acropora+Coral,+a+Natural+Resorbable+Scaffold,+and+Autologous+Mesenchymal+Stem+Cells.">Regeneration in Sheep Using Acropora Coral, a Natural Resorbable Scaffold, and Autologous Mesenchymal Stem Cells.</a> Tissue Eng Part A. 19 (13-14), 1554-1563 (2013).</li><li>Reichert, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tissue+engineering+solution+for+segmental+defect+regeneration+in+load-bearing+long+bones.">A tissue engineering solution for segmental defect regeneration in load-bearing long bones.</a> Sci Transl Med. 4 (141), 141ra93 (2012).</li><li>Sachlos, E., Czernuszka, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+Tissue+Engineering+Scaffolds+Work.+Review+on+The+Application+of+Solid+Freeform+Fabrication+Technology+to+The+Production+of+Tissue+Engineering+Scaffolds.">Making Tissue Engineering Scaffolds Work. Review on The Application of Solid Freeform Fabrication Technology to The Production of Tissue Engineering Scaffolds.</a> Eur Cell Mater. 5, 29-40 (2003).</li><li>Woodard, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanical+properties+and+osteoconductivity+of+hydroxyapatite+bone+scaffolds+with+multi-scale+porosity.">The mechanical properties and osteoconductivity of hydroxyapatite bone scaffolds with multi-scale porosity.</a> Biomaterials. 28 (1), 45-54 (2007).</li><li>Correia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Acta Biomater. 8 (7), 2483-2492 (2012).</li><li>Wang, H., Li, Y., Zuo, Y., Li, J., Ma, S., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocompatibility+and+osteogenesis+of+biomimetic+nano-hydroxyapatite/polyamide+composite+scaffolds+for+bone+tissue+engineering.">Biocompatibility and osteogenesis of biomimetic nano-hydroxyapatite/polyamide composite scaffolds for bone tissue engineering.</a> Biomaterials. 28 (22), 3338-3348 (2007).</li><li>Oh, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+absorption+and+retention+properties+of+engineered+scaffolds+with+micro-channels+and+nano-pores+for+tissue+engineering:+a+proof+of+concept.">Bone marrow absorption and retention properties of engineered scaffolds with micro-channels and nano-pores for tissue engineering: a proof of concept.</a> Ceram Int. 39 (7), 8401-8410 (2013).</li><li>Hong, M. H., Kim, Y. H., Ganbat, D., Kim, D. G., Bae, C. S., Oh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+action:+enrichment+of+retention+and+habitation+of+cells+via+micro-channeled+scaffolds+for+massive+bone+defect+regeneration.J.">Capillary action: enrichment of retention and habitation of cells via micro-channeled scaffolds for massive bone defect regeneration.J.</a> Mater Sci Mater Med. 25 (8), 1991-2001 (2014).</li><li>Volkmer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+in+static+and+dynamic+3D+culture+systems+for+tissue+engineering+of+bone.">Hypoxia in static and dynamic 3D culture systems for tissue engineering of bone.</a> Tissue Eng. Part A. 14 (8), 1331-1340 (2008).</li><li>Malda, J., Klein, T. J., Upton, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+hypoxia+in+the+in+vitro+engineering+of+tissues.">The roles of hypoxia in the in vitro engineering of tissues.</a> Tissue Eng. 13 (9), 2153-2162 (2007).</li><li>Macchetta, A., Turner, I. G., Bowen, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+HA/TCP+scaffolds+with+a+graded+and+porous+structure+using+a+camphene-based+freeze-casting+method.">Fabrication of HA/TCP scaffolds with a graded and porous structure using a camphene-based freeze-casting method.</a> Acta Biomater. 5 (4), 1319-1327 (2009).</li><li>Cox, S. C., Thornby, J. A., Gibbons, G. J., Williams, M. A., Mallick, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printing+of+porous+hydroxyapatite+scaffolds+intended+for+use+in+bone+tissue+engineering+applications.">3D printing of porous hydroxyapatite scaffolds intended for use in bone tissue engineering applications.</a> Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 47, 237-247 (2015).</li><li>Wan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+and+proliferation+of+OCT-1+osteoblast-like+cells+on+micro-+and+nano-scale+topography+structured+poly(l-lactide).">Adhesion and proliferation of OCT-1 osteoblast-like cells on micro- and nano-scale topography structured poly(l-lactide).</a> Biomaterials. 26 (21), 4453-4459 (2005).</li><li>Zhao, L., Mei, S., Chu, P. K., Zhang, Y., Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+hierarchical+hybrid+micro/nano-textured+titanium+surface+with+titania+nanotubes+on+osteoblast+functions.">The influence of hierarchical hybrid micro/nano-textured titanium surface with titania nanotubes on osteoblast functions.</a> Biomaterials. 31 (19), 5072-5082 (2010).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Un modèle de composant de plusieurs cellules, y compris les facteurs de croissance, des substances nutritives, etc. est nécessaire à la réussite de la régénération osseuse et la restauration fonctionnelle de grands défauts osseux critiques moyenne. Parmi ces facteurs, les propriétés biologiques anatomiquement conformes sont essentiels. Pour accomplir fonctionnalité biologique, le modèle doit présenter biocompatibilité, ostéoconductivité, l&#39;intégrité mécanique, une surface suffisante, la texture de surface adéquate, et les moyens pour l&#39;oxygène et le transport des nutriments. Au niveau cellulaire, les caractéristiques suivantes sont particulièrement crucial pour la restauration fonctionnelle des défauts osseux massifs: la pénétration facilité en modèle (recrutement actif), la distribution uniforme dans le modèle (rétention), la prolifération accélérée et une viabilité élevée (habitation). Enfin, la formation ultérieure de la matrice extracellulaire substantielle et le déclenchement de l&#39;expression des gènes sont essentiels dans les processus biologiques essentiels comme une vascularisation rapidee ostéogenèse. De nombreux types de substituts synthétiques différents ont été proposés pour remplacer / allo- greffes osseuses automatique. Cependant, l&#39;organisation actuelle de l&#39;échafaudage ne présente pas un microenvironnement interne contenant des micro-canaux et nano-pores, et donc ne facilite pas activement infiltration de cellules, la distribution et inhabitance profondément dans les substituts synthétiques qui sont de plus de 10 mm. Ils ne fournissent pas d&#39;indices physiques pionnier cellules efficacement, migrer rapidement et uniformément profondément dans le modèle de l&#39;os. Au lieu de cela, le recrutement passive limité de cellules crée une des populations de cellules réparties de façon inégale entre les zones extérieure et intérieure de l&#39;échafaudage. Cela permet non seulement aggrave le défi initial des cellules atteignant le noyau interne du modèle, mais entrave également l&#39;écoulement des nutriments et de la communication de la cellule à l&#39;autre extrémité de la substitut synthétique. Ce type de recrutement et de l&#39;inhabitation résultats cellulaires disproportionnée dans la cellule death et d&#39;os incomplètes croissance après l&#39;échafaud a été implanté dans le corps 14,15. Ainsi, nous avons introduit le concept de l&#39;action capillaire comme la queue physique primaire pour surmonter ces obstacles. Nous avons soigneusement conçu des micro-canaux dans le BMT à induire l&#39;action capillaire qui représenteront la force de traîner primaire responsable pour recruter activement des cellules profondes dans la BMT. La technique de revêtement PU éponge présente plusieurs propriétés uniques. Premièrement, il permet une préparation facile de structures trabéculaires poreuses bien contrôlées, qui dépendent elles-mêmes les structures modèle prédéfini (ie, 80 pores par modèle de pouces pour 300-400 um). Ceci est très important pour l&#39;optimisation de la taille des pores pour l&#39;infiltration 15 d&#39;ostéoblastes. Deuxièmement, la technique permet la construction de micro-canaux interconnectés, qui représentent le rôle important de l&#39;initialisation de la relocalisation de la cellule 11. Troisièmement, il n&#39;y a presque pas de limitations lors de l&#39;utilisation de l&#39;éponge PU en termes de création de formes et de tailles des modèles personnalisés. Le fabricant peut utiliser une paire de ciseaux pour les formes simples ou découpe laser, même calculée pour des géométries complexes. L&#39;utilisation de ces technologies contrôlées précisément, nous avons créé le BMT. HA a été choisi comme matériau de départ en raison de sa biocompatibilité et la capacité 17 ostéoconducteur. Dans cette étude, il ya plusieurs étapes critiques qui doivent être mis en évidence. Au cours de la préparation de la suspension HA, si la température est trop élevée et la vitesse d&#39;agitation est trop faible, la bouillie HA va devenir bloqué à bords inférieurs du bécher et tarir. Après le processus de revêtement lorsqu&#39;on souffle sur la suspension HA excès, trop élevé d&#39;une pression d&#39;air peut provoquer des fissures sur la surface de la BMT. Il est important de maintenir la pression relativement faible pour aérer correctement la suspension HA excès que de l&#39;air. Enfin, les deuxième et troisième étapes du procédé de frittagesont le plus important (chauffage de 1 ° C / min jusqu&#39;à 280 ° C et la chaleur de 0,5 ° C / min jusqu&#39;à 400 ° C). Dans cette gamme de température, l&#39;éponge PU complètement brûler tandis que le HA devient dense. Si ce protocole est pas suivie de près, le BMT sera effondré ou émietté après frittage. La greffe de moelle osseuse décrit dans cette étude offre plusieurs avantages. Tout d&#39;abord, les macro-pores inter-connectés (300-400 um) imitent celles de l&#39;os trabéculaire humain et permet un débit de moelle osseuse lisse. Deuxièmement, les modèles sont constitués de micro-canaux (25 à 50 um) dans chaque cloison trabéculaire à accélérer la pénétration initiale de cellules osseuses par action capillaire. Comme l&#39;a démontré en utilisant la simulation numérique 13, si le modèle avait seulement 300 um (pores pores primaires) et pas de microcanaux, l&#39;action capillaire serait insuffisante pour la saturation complète du modèle avec la moelle osseuse. Ce serait particulièrement vrai pour les grands défauts de taille qui exigeraient lmodèles de taille de ARGE. Taille micrométrique canaux exposition d&#39;absorption de fluide très efficace, et donc nous nous attendions à des micro-canaux à être principalement responsable de l&#39;action capillaire dans notre étude. Troisièmement, nos OGEC ont placé stratégiquement nano-pores. Les données de la littérature indiquent que les cellules sont particulièrement sensibles à nano-motifs 18,19; Par conséquent, nous nous attendions les nano-pores sur les parois des microcanaux de jouer un rôle dans l&#39;augmentation de la fixation des cellules. Pores de taille nanométrique (100-400 nm) sur la surface des cloisons trabéculaire acceptés cellules pour ancrer immobilisés. Dans l&#39;ensemble, les effets combinés de ces trois structures internes ont donné lieu à une meilleure mobilisation des cellules et l&#39;adhérence tout au long de la matrice. Cependant, il ya des limitations du protocole et les étapes critiques pour fabriquer la parfaite BMT. Par exemple, il y a souvent une grande quantité de HA suspension épaisse préparée en raison de la difficulté de maintenir une viscosité homogène tout revêtement. Il ya aussi une limitation à fairedes modèles de plus de 5 cm 3 de volume due à temps de travail tout revêtement. L&#39;épaisseur du revêtement est critique qui varie selon les techniques du fabricant. Les résultats de notre étude suggèrent que le BMT capable d&#39;absorber et de retenir les cellules offriront avantages potentiels par rapport alloplastiques conventionnelle (ou synthétique) échafaudages. Une étude prospective est envisagée afin de vérifier les avantages de BMT sur l&#39;ostéogenèse et / ou l&#39;angiogenèse ainsi que les facteurs de croissance liées aux os. Par conséquent, nous prétendons que notre unique, échafaudage BMT sélectionnée peut aborder les principaux obstacles de l&#39;infiltration de la moelle osseuse insuffisante dans les constructions synthétiques et incomplètes régénération osseuse dans les grands défauts. Le but ultime de cette étude est de simplifier le paradigme actuel de la bioingénierie dans la reconstruction de l&#39;os et la restauration fonctionnelle des défauts osseux critique de taille en éliminant la nécessité de stroma Durée- / main-d&#39;œuvre de la moelle osseuseprocessus cellules de l &#39;isolement et l&#39;expansion. Enfin, nous nous efforçons d&#39;utiliser anatomiquement conforme 3D constructions avec des micro-canaux et nano-pores, qui induisent une absorption rapide de la cellule, la distribution homogène et inhabitance pour la reconstruction de l&#39;os.

The ultimate goal of bone tissue engineering with synthetic constructs is the incorporation of the constructs into the host bone, repopulation of the constructs with host cells, and reconstitution of gas and body fluid exchanges to restore normal bone function. Considerable research has been reported over the last decade in the use of polymeric and ceramic biomaterials for producing scaffolds1,2. However, the ideal material and fabrication technique for optimal bone tissue regeneration has yet to be identified. In addition, there is an overall lack of success in bringing these technologies to the clinic, especially for the reconstruction and restoration of large bone defects. Therefore, restoring critical sized bony defects still remains a clinical challenge1-5. 
Ideally, the scaffolds for bone tissue regeneration should exhibit biocompatibility without causing inflammatory responses or foreign body/toxic reactions, have closely matched mechanical properties when compared to those of native bone, and possess a mechanism to allow diffusion and/or transport of ions and nutrients. Strong bonding with the host bone, dynamic bone growth, vascular ingrowth, and biodegradation of the scaffolds are equally desirable. Although the use of biodegradable polymer scaffolds has exhibited progress in terms of tissue ingrowth, there are controversies over their use for bone regeneration. 
Notwithstanding these extensive efforts, the highly organized structural synthetic constructs still have limited potential in overcoming the obstacle of passive cell penetration. Most of these approaches have resulted in the in vitro tissue ingrowth with cross-sections of less than a few &#181;m to several mm from the external surface, an incomplete integration with host bone, and only partial bone regeneration in vivo6,7. The pioneering cells do not migrate deeply into the constructs because of the lack of an initial force that pulls them inside before cell colonization begins. Consequently, cell colonization strictly occurs at the scaffold periphery, becoming an obstruction from the periphery to the center of the scaffold. Thus, the diffusion of oxygen and nutrients into the inner parts of the templates becomes limited8. Therefore, it is clear that the architecture of the scaffolds (pore size, porosity, interconnectivity, and permeability) that affect the transport and diffusion of substances throughout the scaffolds is critical for achieving well-distributed cell proliferation and differentiation9,10. Although calcium phosphates have been used in the past for scaffold fabrication, different processes and procedures have often resulted in calcium phosphate scaffolds with varying architectures. Thus, the selection of the manufacturing process becomes important in dictating the scaffold architecture needed for successful bone tissue regeneration.
In conclusion, there are still two major shortcomings of bone tissue engineering that need to be addressed: the initial cell recruitment into the template prior to cell attachment and colonization and the quality of substance flow both into and out of the template.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>polyurethan sponge</td>
			<td>Plastifoam</td>
			<td>PU-3215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">167176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydroxyapatite Powder</td>
			<td>Ossgen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl Alcoho</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">341584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxymethyl cellulose sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">360384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium polyacrylate</td>
			<td>Vanderbilt</td>
			<td>DARVAN 821A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2289</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

distinctive capillary action by micro-channels in bone-like templates can enhance recruitment of cells for restoration of large bony defect

Sans une, prospère population active de cellule qui est bien distribué et stable ancré au modèle inséré, exceptionnelle régénération osseuse ne se produit pas. Avec des modèles classiques, l&#39;absence de résultats internes des micro-canaux en l&#39;absence de l&#39;infiltration de cellules, la distribution et inhabitance profondément à l&#39;intérieur des modèles. Ainsi, un modèle très poreuse et uniformément interconnecté trabéculaire-os-like avec des micro-canaux (modèle de microenvironnement biogénique; BMT) a été développé pour répondre à ces obstacles. Le roman BMT a été créé par des concepts innovants (action capillaire) et fabriqué avec une technique de revêtement éponge modèle. Le BMT est constitué de plusieurs composants structurels: primaire-pores interconnectés (300-400 um) qui imitent pores dans l&#39;os trabéculaire, des micro-canaux (25-70 um) au sein de chaque travée, et nanopores (100-400 nm) sur la surface pour permettre aux cellules de l&#39;ancre. En outre, le BMT a été documentée par une étude d&#39;essai mécanique d&#39;avoir similaires propriétés de résistance mécanique à celles de l&#39;os trabéculaire humain (~ 3,8 MPa) 12. Le BMT a présenté une absorption élevée, la rétention et l&#39;habitation des cellules à travers les (tc) modèles en forme de pont (3 cm de hauteur et 4 cm de longueur). Les cellules ont été initialement ensemencées que dans une extrémité de modèles immédiatement mobilisés à l&#39;autre extrémité (10 cm de distance) par action capillaire de la greffe de moelle osseuse sur le support de cellule. Après 4 h, les cellules occupées de façon homogène l&#39;ensemble du BMT et ont présenté un comportement cellulaire normale. L&#39;action capillaire représentait l&#39;infiltration des cellules en suspension dans les médias et la distribution (de migration active) tout au long du BMT. Ayant observé ces capacités de la greffe de moelle osseuse, nous prévoyons que OGEC absorbera cellules de moelle osseuse, les facteurs de croissance, des substances nutritives et de la périphérie dans des conditions physiologiques. Le BMT peut résoudre les limitations actuelles via une infiltration rapide, la distribution homogène et inhabitance de cellules dans les grandes, les modèles volumétriques pour réparer les défauts squelettiques massives.

La structure globale du BMT présente un modèle unique à trois dimensions avec des structures internes de l&#39;os trabéculaire-like. Le BMT contient macro-pores, des micro-canaux, et les nano-pores. Configurations claires de macropores entièrement interconnectés (taille moyenne de 320 um), les micro-canaux (de diamètre moyen de 50 um), et les nano-pores (taille moyenne de 100 nm) ont été vérifiées avec un microscope électronique à balayage (EVO-40; ZEISS) ainsi que par le biais de micro-tomographie. La figure 1 montre des protocoles détaillés pas à pas dans la création d&#39;un BMT. Grâce à un contrôle précis des protocoles de la préparation des éponges PU au processus de frittage (P1 - P7; Figure 1), les fonctions suivantes peuvent être réalisées: une surface très dense et lisse après HA revêtement et le séchage; une forme précise et dimensionné 3-D modèle; un réseau trabéculaire poreuse totalement interconnecté similaire à celle de l&#39;os trabéculaire; et des micro-canaux d&#39;esprithin chaque travée qui imitent canaux intra-osseux tels que les canaux de Havers et les canaux (figures 2 et 3) de Volkmann. En outre, une résistance mécanique relativement élevée (~ 3,8 MPa) similaire à celle de l&#39;os trabéculaire humain a été mesurée par un test de résistance à la compression. Paramètres histomorphométriques très similaires à ceux des vertèbres lombaires humain os trabéculaire ont été confirmés par l&#39;analyse micro-CT 12. Différentes amplitudes de capillarité ont été démontrés par des diamètres de capillaires dans la figure 4 en utilisant la simulation de calcul. Grâce à ces simulations, nous avons projeté que le BMT présenterait des taux d&#39;absorption variant dans les primaires-pores (300-400 um) et des micro-canaux (25-70 um) basé sur les diamètres. Les petits capillaires présentent des capacités d&#39;absorption plus fortes. Cette hypothèse a été vérifiée dans cette expérience comme le montre la figure 5. Le BMT a exposé très efficaceabsorption et la rétention de fluide par l&#39;action capillaire des structures de micro-canal; bleuissement de Stevenel a été utilisé comme fluide de suivre facilement le flux (Figure 5). Sur la base de la simulation numérique, la greffe de moelle osseuse avec ces configurations ont été observés pour absorber et retenir des suspensions de cellules jusqu&#39;à 8,5 cm de distance totale à moins de 10 sec. En raison d&#39;une action capillaire forte induite par les structures internes, le milieu souillé atteint l&#39;extrémité opposée de 3 cm (hauteur) x 4 cm (longueur) x 1 cm (largeur) modèle en forme de pont à l&#39;intérieur de 1 min et 40 sec. En outre, la mobilisation de la cellule active et incorporation dans le BMT a été observée (figure 6). Par la suite, la mobilisation de cellules homogène et fixation entraîné une prolifération accrue et formation de la matrice dans une formation uniformément répartie. De plus, de longues distances (~ 10 cm) la migration des cellules à travers la greffe de moelle osseuse a été validé immédiatement après la greffe de moelle osseuse a été saturée avec la suspension de cellules. Se<html> EDED cellules ont survécu dans le segment du modèle qui a été exposé à l&#39;air et non immergé dans le milieu de culture. Dans cette expérience, le milieu de culture a été fournie aux cellules par puits exclusivement en touchant uniquement les jambes de l&#39;échafaudage. L&#39;action capillaire présentée par les microcanaux ensuite laissé pour un milieu frais pour atteindre la partie supérieure, le pont de l&#39;échafaud. Après 3 jours de culture, le modèle est devenu occupé avec des cellules qui se divisent rapidement. Après 7 jours de culture, chaque travée a été enveloppé par des matrices extracellulaires et intégré avec 13 cellules. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig1.jpg" /> Figure 1. Le protocole modèle de fabrication globale os comme du pré-traitement de PU éponge (P1) pour le traitement thermique final (P7). Garder le profil de frittage précise après P7 est crucial dans la réalisation de résistance mécanique favorable.f = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig1large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig2.jpg" /> . Figure 2 de microscope stéréo Représentant (AmScope; SM-2TZ-M) images (x4) d&#39;un ppi 80 dimensionné PU éponge (à gauche), HA enduit et séché BMT (au milieu), et fritté BMT (à droite) (Dimension: 3. cm de hauteur x 4 cm de longueur x 1 cm de largeur). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig3.jpg" /> 3. Figure images MEB et micro-CT d&#39;un modèle biogénique: (A) une image d&#39;ensemble d&#39;un modèle biogène, <st<html> rong&gt; (B, C, D) des images pour des micro-canaux. Afin de mettre en évidence des micro-canaux clairs dans les travées, le modèle a été granulé. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig4.jpg" /> . Figure 4. calcul informatique de l&#39;action capillaire avec différents diamètres de canal à l&#39;intérieur de la même période (0,4 ms), tandis que la plus grande capillaire (d = 300 um: désigne primaire à pores) absorbé le moyen (bleu) jusqu&#39;à 0,16 mm hauteur, le plus petit capillaire (d = 30 um: se réfère à micro-canaux) absorbé le moyen jusqu&#39;à 0.415 mm de hauteur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> nt &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig5.jpg" /> Figure 5. Les images ont montré des différences de capacités d&#39;absorption de l&#39;action capillaire à base de différentes tailles de primaires-pores et micro-canaux (taille primaire pores se réfère au diamètre moyen: 60 ppi ≈ 470 um, 80 ppi ≈ 320 um, 100 ppi ≈ 200 um). Les lignes jaunes représentent l&#39;action capillaire induite par la combinaison des primaires-pores et micro-canaux. Les lignes rouges représentent l&#39;action capillaire induite par principalement des micro-canaux exposées dans chaque travée. Comme le montre la (F), le modèle 100 ppi induit la plus forte action capillaire, ce qui entraîne la saturation complète de la matrice à l&#39;intérieur de 39 sec. Les 80 ppi et 60 ppi modèles ont été testés par la suite. (B) 0 sec, (C) 0,5 s, (D) 1.5 s, (E) 17,0 s, (F) 39,0 s, (G) 50,0 sec, et (H) 1 min 18 sec après immersion. (Dimension Template: 1cm x 1 cm x 4 cm de hauteur cubique). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig5large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig6.jpg" /> Figure 6. La pénétration et l&#39;immigration des cellules des puits ensemencées (partie I) aux puits non ensemencés (partie V) à travers les modèles biogènes induites par capillarité. Les cellules initialement ensemencées ont atteint la fin de la jambe non ensemencée (partie V) immédiatement après la saturation complète. Après 3 jours, la confluence des cellules était évident dans l&#39;ensemble du modèle. Après 7 jours, la formation spatio-temporelle de la matrice de collagène est produit dans les populations de cellules (coloration H &amp; E). (Dimension Modèle: 3 cm de hauteur x 4 cm de longueur x 1 cm de largeur). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig6large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cl</a>beurk ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Watch this Scientific Journal Video about Distinctive Capillary Action by Micro-channels in Bone-like Templates can Enhance Recruitment of Cells for Restoration of Large Bony Defect at JoVE.com

Distinctive Capillary Action by Micro-channels in Bone-like Templates can Enhance Recruitment of Cells for Restoration of Large Bony Defect

A step-by-step generic process to create a bone-like template with engineered micro-channels is presented. High absorption and retention capabilities of the template are demonstrated by capillary action via micro-channels.

Modèles distinctif action capillaire par des micro-canaux en os comme peuvent améliorer le recrutement des cellules pour la restauration de la Grande Bony Défaut

Without an active, thriving cell population that is well-distributed and stably anchored to the inserted template, exceptional bone regeneration does not ...

distinctive-capillary-action-micro-channels-bone-like-templates-can

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.6K vues.  Columbia University. A step-by-step generic process to create a bone-like template with engineered micro-channels is presented. High absorption and retention capabilities of the template are demonstrated by capillary action via micro-channels. 

Vidéo: Distinctive Capillary Action by Micro-channels in Bone-like Templates can Enhance Recruitment of Cells for Restoration of Large Bony Defect

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

Cartographie optique de potentiels d&#39;action et les transitoires de calcium dans le cœur de la souris

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Recherche

Bio-ingénierie

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical discoveries with the aims of developing functional tissues for cardiac regeneration as well as in vitro screening assays. However, the ability to create high-fidelity models of heart tissue has proven difficult. The heart&#8217;s extracellular matrix (ECM) is a complex structure consisting of both biochemical and biomechanical signals ranging from the micro- to the nanometer scale2. Local mechanical loading conditions and cell-ECM interactions have recently been recognized as vital components in cardiac tissue engineering3-5.
A large portion of the cardiac ECM is composed of aligned collagen fibers with nano-scale diameters that significantly influences tissue architecture and electromechanical coupling2. Unfortunately, few methods have been able to mimic the organization of ECM fibers down to the nanometer scale. Recent advancements in nanofabrication techniques, however, have enabled the design and fabrication of scalable scaffolds that mimic the in vivo structural and substrate stiffness cues of the ECM in the heart6-9.
Here we present the development of two reproducible, cost-effective, and scalable nanopatterning processes for the functional alignment of cardiac cells using the biocompatible polymer poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)8 and a polyurethane (PU) based polymer. These anisotropically nanofabricated substrata (ANFS) mimic the underlying ECM of well-organized, aligned tissues and can be used to investigate the role of nanotopography on cell morphology and function10-14.
Using a nanopatterned (NP) silicon master as a template, a polyurethane acrylate (PUA) mold is fabricated. This PUA mold is then used to pattern the PU or PLGA hydrogel via UV-assisted or solvent-mediated capillary force lithography (CFL), respectively15,16. Briefly, PU or PLGA pre-polymer is drop dispensed onto a glass coverslip and the PUA mold is placed on top. For UV-assisted CFL, the PU is then exposed to UV radiation (&#955; = 250-400 nm) for curing. For solvent-mediated CFL, the PLGA is embossed using heat (120 &#176;C) and pressure (100 kPa). After curing, the PUA mold is peeled off, leaving behind an ANFS for cell culture. Primary cells, such as neonatal rat ventricular myocytes, as well as human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, can be maintained on the ANFS2.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

Capillaire de travail lithographie pour l&#39;ingénierie tissulaire cardiaque

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to evaluate new strategies that aim at improving vascularization, reliable methods are required to make the in-growth of new blood vessels into bio-artificial scaffolds visible and quantify the results. Over the past couple of years, our group has introduced a full skin defect model that enables the direct visualization of blood vessels by transillumination and provides the possibility of quantification through digital segmentation. In this model, one surgically creates full skin defects in the back of mice and replaces them with the material tested. Molecules or cells of interest can also be incorporated in such materials to study their potential effect. After an observation time of one&#8217;s own choice, materials are explanted for evaluation. Bilateral wounds provide the possibility of making internal comparisons that minimize artifacts among individuals as well as of decreasing the number of animals needed for the study. In comparison to other approaches, our method offers a simple, reliable and cost effective analysis. We have implemented this model as a routine tool to perform high-resolution screening when testing vascularization of different biomaterials and bio-activation approaches.

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Vascularization is key to approaches in successful tissue engineering. Therefore, reliable technologies are required to evaluate the development of vascular networks in tissue-constructs. Here we present a simple and cost-effective method to visualize and quantify vascularization in vivo.

Une peau pleine de défauts modèle pour évaluer la vascularisation des biomatériaux<em&gt; In Vivo</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product to demonstrate how regulating nutrient levels can improve cell yields. In previous studies, bioreactors facilitated increased culture volumes over static cultures, but no increase in cell yields were observed. Limitations in key nutrients such as glucose, which were consumed between batch feedings, can lead to limitations in cell expansion. Large fluctuations in glucose levels were observed, despite the increase in glucose concentrations in the media. The use of continuous feeding systems eliminated fluctuations in glucose levels, and improved cell growth rates when compared with batch fed static and SSB culture methods. Additional increases in growth rates were observed by adjusting the feed rate based on calculated nutrient consumption, which allowed the maintenance of physiological glucose over three weeks in culture. This method can also be adapted for other cell types.

Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.

Règlement des éléments nutritifs par l&#39;alimentation continue pour l&#39;expansion à grande échelle de cellules de mammifères en Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds during repair, which gives rise to a lack of sufficient blood supply and causes necrosis of the new tissues. Rapid vascularization is a vital prerequisite for new tissue survival and integration with existing host tissue. The de novo generation of vasculature in scaffolds is one of the most important steps in making bone regeneration more efficient, allowing repairing tissue to grow into a scaffold. To tackle this problem, the genetic modification of a biomaterial scaffold is used to accelerate angiogenesis and osteogenesis. However, visualizing and tracking in vivo blood vessel formation in real-time and in three-dimensional (3D) scaffolds or new bone tissue is still an obstacle for bone tissue engineering. Multiphoton microscopy (MPM) is a novel bio-imaging modality that can acquire volumetric data from biological structures in a high-resolution and minimally-invasive manner. The objective of this study was to visualize angiogenesis with multiphoton microscopy in vivo in a genetically modified 3D-PLGA/nHAp scaffold for calvarial critical bone defect repair. PLGA/nHAp scaffolds were functionalized for the sustained delivery of a growth factor pdgf-b gene carrying lentiviral vectors (LV-pdgfb) in order to facilitate angiogenesis and to enhance bone regeneration. In a scaffold-implanted calvarial critical bone defect mouse model, the blood vessel areas (BVAs) in PHp scaffolds were significantly higher than in PH scaffolds. Additionally, the expression of pdgf-b and angiogenesis-related genes, vWF and VEGFR2, increased correspondingly. MicroCT analysis indicated that the new bone formation in the PHp group dramatically improved compared to the other groups. To our knowledge, this is the first time multiphoton microscopy was used in bone tissue-engineering to investigate angiogenesis in a 3D bio-degradable scaffold in vivo and in real-time.

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Here, we present a protocol to visualize blood vessel formation in vivo and in real-time in 3D scaffolds by multiphoton microscopy. Angiogenesis in genetically modified scaffolds was studied in a murine calvarial critical bone defect model. More new blood vessels were detected in the treatment group than in controls.

Visualisation de l’angiogenèse par microscopie Multiphoton In Vivo en échafaudage de 3D-PLGA/PNVS génétiquement modifiés pour la réparation osseuse défaut critique substance

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds ...

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently needed in disease diagnosis, microbial monitoring, genetically modified organism (GMO) detection, and forensic analysis. We have previously described the platform called CALM (Capillary Array-based Loop-mediated isothermal amplification for Multiplex visual detection of nucleic acids). Herein, we describe improved fabrication and performance processes for this platform. Here, we apply a small, ready-to-use cassette assembled by capillary array for multiplex visual detection of nucleic acids. The capillary array is pre-treated into a hydrophobic and hydrophilic pattern before fixing loop-mediated isothermal amplification (LAMP) primer sets in capillaries. After assembly of the loading adaptor, LAMP reaction mixture is loaded and isolated into each capillary, due to capillary force by a single pipetting step. The LAMP reactions are performed in parallel in the capillaries. The results are visually read out by illumination with a hand-held UV flashlight. Using this platform, we demonstrate monitoring of 8 frequently appearing elements and genes in GMO samples with high specificity and sensitivity. In summary, the platform described herein is intended to facilitate the detection of multiple nucleic acids. We believe it will be widely applicable in fields where high-throughput nucleic acid analysis is required.

This protocol describes the fabrication of a small, ready-to-use cassette that can be applied for visual detection of multiple nucleic acids in a single, test that is easy to operate. In this approach, a capillary array was used for multiplex and highly efficient detection of GMO targets.

Détection visuelle de plusieurs acides nucléiques dans une gamme capillaire

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

Détection d’endotoxines dans les Nano-formulations utilisant la Limulus Amébocytes Lysate (LAL)

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Simultaneous Electrical and Mechanical Stimulation to Enhance Cells' Cardiomyogenic Potential

Cardiovascular diseases are the leading cause of death in developed countries. Consequently, the demand for effective cardiac cell therapies has motivated researchers in the stem cell and bioengineering fields to develop in vitro high-fidelity human myocardium for both basic research and clinical applications. However, the immature phenotype of cardiac cells is a limitation on obtaining tissues that functionally mimic the adult myocardium, which is mainly characterized by mechanical and electrical signals. Thus, the purpose of this protocol is to prepare and mature the target cell population through electromechanical stimulation, recapitulating physiological parameters. Cardiac tissue engineering is evolving toward more biological approaches, and strategies based on biophysical stimuli, thus, are gaining momentum. The device developed for this purpose is unique and allows individual or simultaneous electrical and mechanical stimulation, carefully characterized and validated. In addition, although the methodology has been optimized for this stimulator and a specific cell population, it can easily be adapted to other devices and cell lines. The results here offer evidence of the increased cardiac commitment of the cell population after electromechanical stimulation. Electromechanically stimulated cells show an increased expression of main cardiac markers, including early, structural, and calcium-regulating genes. This cell conditioning could be useful for further regenerative cell therapy, disease modeling, and high-throughput drug screening.

Here we present a protocol for training a cell population using electrical and mechanical stimuli emulating cardiac physiology. This electromechanical stimulation enhances the cardiomyogenic potential of the treated cells and is a promising strategy for further cell therapy, disease modeling, and drug screening.

Stimulation électrique et mécanique simultanée pour promouvoir le potentiel de cellules Cardiomyogénique

Cardiovascular diseases are the leading cause of death in developed countries. Consequently, the demand for effective cardiac cell therapies has motivated ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Mesure du potentiel d’action optique unicellulaire dans les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Rapid, Enzymatic Methods for Amplification of Minimal, Linear Templates for Protein Prototyping using Cell-Free Systems

This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins in less than 24 h using cell-free expression. After receiving DNA from a vendor, the gene fragment is PCR-amplified, cut, circularized, and cryo-banked. A small amount of the banked DNA is then diluted and amplified significantly (up to 106x) using isothermal rolling circle amplification (RCA). RCA can yield microgram quantities of the minimal expression template from picogram levels of starting material (mg levels if all starting synthetic fragment is used). In this work, a starting amount of 20 pg resulted in 4 &#181;g of the final product. The resulting RCA product (concatemer of the minimal template) can be added directly to a cell-free reaction with no purification steps. Due to this method being entirely PCR-based, it may enable future high-throughput screening efforts when coupled with automated liquid handling systems.

The study describes a protocol for creating large (&#181;g-mg) quantities of DNA for protein screening campaigns from synthetic gene fragments without cloning or using living cells. The minimal template is enzymatically digested and circularized and then amplified using isothermal rolling circle amplification. Cell-free expression reactions could be performed with the unpurified product.

Méthodes enzymatiques rapides pour l’amplification de modèles linéaires minimaux pour le prototypage de protéines à l’aide de systèmes sans cellules

This protocol describes the design of a minimal DNA template and the steps for enzymatic amplification, enabling rapid prototyping of assayable proteins ...