Prior work with regard to susceptibility testing of dalbavancin has been valuable in development of a standardized methods and acknowledgement for this work is given to JMI Laboratories, Robert Rennie and Beth Goldstein.

ملاحظة: يرجى الرجوع إلى وثائق CLSI M7-A10 وM100-S25 و / أو ISO / FDIS 20776-1 للحصول على التفاصيل الكاملة للطريقة مرجعية مرق microdilution لقابلية المضادة للميكروبات 2، 3، 4 طرق إشارة تسمح الخيارات في بعض. إجراءات محددة لإعداد اللقاح ولوحة MIC الإنتاج لتحقيق نفس النتيجة النهائية. طريقة مفصلة هنا يتعلق أحد مضادات الميكروبات وكيل، dalbavancin، وبعض الخطوات تمثل واحدة من يحتمل عدة طرق يمكن أن يتم الإجراء المرجعية. احتياطات السلامة المناسبة (بما يتفق مع مستوى السلامة الحيوية 2) يجب أن تستخدم 10. يظهر شكل لوحة MIC تستخدم لغرض من هذا المنشور الفيديو في الجدول 1. 1. مخزن Dalbavancin مسحوق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند استلام التشخيص مسحوق الصف dalbavancin، مخزن في -20 درجة مئوية في بيئة المجفف في الفريزر غير إزالة الجليد. قبل استخدامها، ينبغي أن تتوازن مسحوق لوصول RT قبل الافتتاح. </li></ol> 2. إعداد التخفيفات لوحة MIC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل الأسهم لا تزيد عن 1600 ميكروغرام / مل من dalbavancin في أنيق (النقي) DMSO في الزجاج أو البلاستيك أنابيب معقمة، واستخدامها في نفس اليوم من إعداد أو تخزينها في -20 إلى -60 درجة مئوية أو أقل لاستخدامها في المستقبل في الفريزر غير إزالة الجليد. تأخذ في الاعتبار قوة من dalbavancin على النحو المنصوص عليه في الوثائق الواردة مع مسحوق، عندما يزن مسحوق (انظر المعادلة 1 على سبيل المثال 800 ميكروغرام / مل إعداد الأوراق المالية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع التخفيف الأسهم مماثل لنظام كما هو مبين في العمود 1 (&quot;تركيز المصدر&quot;) في الجدول رقم 2 مع DMSO أنيق من الزجاج أو البلاستيك أنابيب معقمة. استخدام الماصة واحد لقياس مخفف والماصة آخر لإضافة الأسهم dalbavancin الأولي إلى الأنبوب الأول. لكل تركيز الأسهم dalbavancin لاحق استخدام الماصة جديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 100X النهائي تناسق لوحة MICالتخفيفات التموينية (تركيزات المتوسطة) مع DMSO أنيق. كما هو مبين في الأعمدة 2-4 من الجدول 2، والجمع بين كميات مناسبة من مصدر وDMSO لتحقيق المطلوب التركيز وسيطة (وحدات التخزين لاستخدامها سيعتمد على عدد من اللوحات MIC ليتم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 0.004٪ P80: إعداد محلول المخزون العاملة جديدة من 2٪ P80 بإضافة 0.1 مل P80 إلى 4.9 مل درهم 2 O. تعقيم عن طريق تمرير من خلال مرشح واستخدام محلول 0.22 ميكرون في نفس اليوم من التحضير. إعداد 0.004٪ P80 مخفف بجعل 1: 500 التخفيف من 2٪ P80 (على سبيل المثال، 0.3 مل من 2٪ إلى 149.7 P80 مل من CAMHB). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وعلاوة على ذلك يخفف من تركيز المتوسطة أعدت في الخطوة 2.2 1: 100 في الموجبة تعديل مولر هينتون مرق (CAMHB) تستكمل مع 0.004٪ (ت / ت) بوليسوربات-80 (P-80) P-80 و / أو LHB (لالعقديات) بإضافة في ضعف التركيز النهائي لأن إضافة اللقاح (الخطوة 4.3) يؤدي إلى 1: 2 التخفيف. رؤية أعمدة 6 و 7 في الجدول 2 </stرونغ&gt;. </li></ol> 3. إعداد لوحات هيئة التصنيع العسكري <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستغناء عن 50 ميكرولتر من كل حل dalbavancin أعدت في الخطوة 2.3 في الآبار الملائمة لوحة MIC وتشمل وسائل الاعلام فقط في بئر واحدة (مراقبة نمو جيد). A الماصة متعدد القنوات مع نصائح عقيمة يمكن أن تستخدم لهذه الخطوة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام لوحات فورا أو ختم مع فيلم من البلاستيك، مكان في أكياس بلاستيكية ووضع على الفور في الفريزر غير يذيب-في ≤ 20 درجة مئوية (ويفضل في ≤ 60 درجة مئوية) لحين الحاجة إليها. إذا تم استخدام ألواح المجمدة، وإزالة الأختام ووضع لوحات فردية على مختبر مقاعد البدلاء 15-30 دقيقة (حتى يتم إذابة محتويات أيضا) قبل الانتقال إلى لوحة التلقيح. </li></ol> 4. تلقيح لوحات هيئة التصنيع العسكري، نفذ الطهارة وإعداد مستعمرة عدد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختر العديد من المستعمرات المعزولة جيدا من أجار الدم 18-24 ساعة أو غيرها من لوحة أجار غير انتقائية. تلمس الجزء العلوي من كل مستعمرة مع حلقة عقيمة أو مسحة ونقل إلى 1-5 مل CAMHB أو الصورةألين حتى تعكر ما يعادل 0.5 مكفارلاند القياسية. تقييم العكر من خلال المقارنة البصرية إلى مكفارلاند 0.5 أو مع جهاز الضوئية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في غضون 15-30 دقيقة من التحضير، ويخفف من اللقاح 1: 100 في CAMHB (100 ميكرولتر في 10 مل CAMHB). بالنسبة لمعظم البكتيريا المختبرة ضد dalbavancin، باستثناء S. الرئوية، وهذا التخفيف توفير التركيز جيدا النهائي من 5 × 10 5 خلية / مل (النطاق المقبول هو 2-8 × 10 5 خلية / مل). لS. الرئوية، والتركيز البكتيري على أساس المقارنة التعكر إلى 0.5 مكفارلاند هو عادة أقل بكثير، وبالتالي، يخفف من اللقاح 01:25 (400 ميكرولتر في 10 مل CAMHB + 10٪ + LHB). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في غضون 15 دقيقة بعد إعداد اللقاح، ونقل 50 ميكرولتر من اللقاح النهائي لكل بئر (مع استثناء من السيطرة العقم أيضا) من لوحة هيئة التصنيع العسكري أعدت في الخطوة 3. الماصة متعدد القنوات باستخدام نصائح معقمة يمكن استخدامها لهذه الخطوة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء فحص النقاءعن طريق نقل ونشر قسامة 1-10 ميكرولتر من سيطرة نمو إيجابية جيدا باستخدام حلقة عقيمة لأجار غير الانتقائية (على سبيل المثال، trypticase أجار الصويا مع 5٪ الأغنام الدم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عدد مستعمرة الإعداد عن طريق إزالة 10 ميكرولتر من سيطرة النمو بشكل جيد مع قناة الماصة واحد وطرف العقيمة ونقل إلى 10 مل من المياه المالحة (1: 1000 تمييع). خلط ونقل 100 ميكرولتر مع الماصة قناة واحدة وطرف العقيمة لمناسبة والمتوسطة أجار غير الانتقائية (على سبيل المثال، trypticase أجار الصويا مع 5٪ الأغنام الدم) وتنتشر على سطح أجار كامل مع حلقة عقيمة، وتكرار مرتين في اتجاهات مختلفة لضمان التوزيع حتى من اللقاح (01:10 تمييع). </li></ol> 5. لوحات احتضان MIC، مستعمرة العد ومركبات الطهارة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم كل لوحة هيئة التصنيع العسكري أو كومة من لا يزيد عن 4 لوحات في كيس من البلاستيك، مع شريط من البلاستيك أو مع غطاء من البلاستيك ضيقة قبل يحتضنها. بدلا من ذلك، وضع لوحة MIC فارغة على رالمرجع من كومة من لا وحات MIC أكثر من 4، ووضع منشفة ورقية رطبة في وعاء من البلاستيك، والألواح مكان MIC في وعاء من البلاستيك وعاء آمن وثيقة مع غطاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحات هيئة التصنيع العسكري في حاضنة الهواء المحيط في 35 ° C ± 2 درجة مئوية لمدة 16-20 ساعة (المكورات العنقودية والمكورات المعوية) و20-24 ساعة (العقديات) في غضون 30 دقيقة من التلقيح. احتضان عدد مستعمرة ولوحات النقاء تحت نفس الظروف إلا العقديات احتضان في 5٪ CO 2 الحاضنة. </li></ol> 6. قراءة MIC ومستعمرة عدد لوحات. تحقق الطهارة اللوحة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قراءة MIC كما تحتوي على نسبة أقل أن يمنع تماما نمو البكتيريا في الآبار كما الكشف عنها بواسطة العين المجردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد المستعمرات على لوحة العد مستعمرة. تتضاعف كل مستعمرة من قبل عامل التخفيف (1: 10000) (على سبيل المثال، 50 المستعمرات ما يعادل 5 × 10 5 خلية / مل). نطاق مقبول هو 20-80 المستعمرات (2-8 × 10 5 خلية / مل)، ويستخدم بمثابة APPROالمبدأ التوجيهي ximate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق لوحة النقاء. وإذا كان كل المستعمرات متشابهة إلى المستعمرات المستخدمة في الخطوة 4.1، ثم اللقاح يمكن اعتبار النقي. إذا كان هناك أي مستعمرات أخرى موجودة، ثم هناك احتمال لالملوث ليكون حاضرا في لوحة MIC وينبغي تكرار الاختبار. </li></ol> 7. تحقق نتائج مراقبة الجودة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الرجوع إلى الجدول رقم 3 لنطاقات المتوقع سلالات مراقبة الجودة CLSI. فقط تقرير نتائج اختبار العزلات إذا كانت النتائج MIC dalbavancin لمراقبة الجودة الكائن (الصورة) ضمن النطاق المتوقع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا حصلت على MIC من ≥0.25 ميكروغرام / مل لأي S. السريري الذهبية عزل، كرر الاختبار dalbavancin MIC و / أو إرسالها إلى مختبر مرجعي للتحقق منها. </li></ol>

<ol>
	<li>Boucher, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Once-weekly+dalbavancin+versus+daily+conventional+therapy+for+skin+infection.">Once-weekly dalbavancin versus daily conventional therapy for skin infection.</a> The New England journal of medicine. 370, 2169-2179 (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> M07-A10. Methods for Dilution Antimicrobial Tests for Bacteria that Grow Aerobically.: Approved Standard. , (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> M100-S25. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-Fifth Informational Supplement. , (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+laboratory+testing+and+in+vitro+diagnostic+test+systems+--+Susceptibility+testing+of+infectious+agents+and+evaluation+of+performance+of+antimicrobial+susceptibility+test+devices+--+Part+1:+Reference+method+for+testing+the+in+vitro+activity+of+antimicrobial+agents+against+rapidly+growing+aerobic+bacteria+involved+in+infectious+diseases.">Clinical laboratory testing and in vitro diagnostic test systems -- Susceptibility testing of infectious agents and evaluation of performance of antimicrobial susceptibility test devices -- Part 1: Reference method for testing the in vitro activity of antimicrobial agents against rapidly growing aerobic bacteria involved in infectious diseases.</a> ISO/FDIS. 20776-1, (2006).</li><li>Jones, R. N., Farrell, D. J., Flamm, R. K., Sader, H. S., Dunne, M. W., Mendes, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surrogate+analysis+of+vancomycin+to+predict+susceptible+categorization+of+dalbavancin.">Surrogate analysis of vancomycin to predict susceptible categorization of dalbavancin.</a> Diagn Microbiol Infect Dis. , (2015).</li><li>Turnidge, J., Paterson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Setting+and+revising+antibacterial+susceptibility+breakpoints.">Setting and revising antibacterial susceptibility breakpoints.</a> Clinical microbiology reviews. 20, 391-408 (2007).</li><li>Rennie, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+broth+microdilution+antimicrobial+susceptibility+test+results+for+dalbavancin,+a+new+glycopeptide+agent.">Factors influencing broth microdilution antimicrobial susceptibility test results for dalbavancin, a new glycopeptide agent.</a> Journal of clinical microbiology. 45, 3151-3154 (2007).</li><li>Arhin, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+polysorbate+80+on+oritavancin+binding+to+plastic+surfaces:+implications+for+susceptibility+testing.">Effect of polysorbate 80 on oritavancin binding to plastic surfaces: implications for susceptibility testing.</a> Antimicrobial agents and chemotherapy. 52, 1597-1603 (2008).</li><li>Farrell, D. J., Mendes, R. E., Rhomberg, P. R., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+reference+broth+microdilution+method+for+testing+telavancin:+effect+on+MIC+results+and+correlation+with+other+testing+methodologies.">Revised reference broth microdilution method for testing telavancin: effect on MIC results and correlation with other testing methodologies.</a> Antimicrobial agents and chemotherapy. 58, 5547-5551 (2014).</li><li>Ribbon Panel, B. l. u. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+Safe+Work+Practices+in+Human+and+Animal+Medical+Diagnostic+Laboratories.">Guidelines for Safe Work Practices in Human and Animal Medical Diagnostic Laboratories.</a> MMWR Supplements. 61 (01), 1-101 (2012).</li><li>Anderegg, T. R., Biedenbach, D. J., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+quality+control+evaluations+for+susceptibility+testing+of+Dalbavancin+(BI397),+an+investigational+glycopeptide+with+potent+gram-positive+activity.">Initial quality control evaluations for susceptibility testing of Dalbavancin (BI397), an investigational glycopeptide with potent gram-positive activity.</a> Journal of clinical microbiology. 41, 2795-2796 (2003).</li><li>Koeth, L. M., Windau, A. R., Goldstein, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Broth+Microdilution+and+Agar+Dilution+Dalbavancin+and+Vancomycin+MIC+Results+for+42+Aerobic+Gram-positive+Bacteria.+Poster+132.">Comparison of Broth Microdilution and Agar Dilution Dalbavancin and Vancomycin MIC Results for 42 Aerobic Gram-positive Bacteria. Poster 132.</a> ASM. , (2012).</li><li>Fritsche, T. R., Rennie, R. P., Goldstein, B. P., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+dalbavancin+MIC+values+determined+by+Etest+(AB+BIODISK)+and+reference+dilution+methods+using+gram-positive+organisms.">Comparison of dalbavancin MIC values determined by Etest (AB BIODISK) and reference dilution methods using gram-positive organisms.</a> Journal of clinical microbiology. 44, 2988-2990 (2006).</li><li>Mushtaq, S., Warner, M., Johnson, A. P., Livermore, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+dalbavancin+against+staphylococci+and+streptococci,+assessed+by+BSAC+and+NCCLS+agar+dilution+methods.">Activity of dalbavancin against staphylococci and streptococci, assessed by BSAC and NCCLS agar dilution methods.</a> The Journal of antimicrobial chemotherapy. 54, 617-620 (2004).</li><li>Jones, R. N., Flamm, R. K., Sader, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveillance+of+dalbavancin+potency+and+spectrum+in+the+United+States+(2012).">Surveillance of dalbavancin potency and spectrum in the United States (2012).</a> Diagnostic microbiology and infectious disease. 76, 122-123 (2013).</li></ol>

ساندرا مكوردي هو موظف من Durata التداوي. المتخصصين المختبرات، وشركة، صاحب العمل لورا Koeth وجينا فيشر، تم التعاقد من قبل Durata التداوي لإعداد المخطوطة. تم دفع رسوم النشر لهذه المادة من قبل اختصاصيي المختبرات، وشركة

يتم عرض تفاصيل الطريقة التالية لاعتبارات إضافية عند التحضير للاختبار dalbavancin MIC. سوف تصميم لوحة MIC يعتمد على عدد من العوامل المضادة للجراثيم لفحصها (أي.، dalbavancin وحده أو وكلاء متعددة) وأنواع من البكتيريا لفحصها. وينبغي أن تشمل تركيزات dalbavancin نقاط الإيقاف التفسيرية لجميع الأنواع البكتيرية لفحصها ومجموعة كاملة من التخفيفات المتوقع لسلالة واحدة على الأقل QC. يمكن تنظيم سلسلة تخفيف مضادات الميكروبات سواء في الصفوف أو الأعمدة اعتمادا على عدد من العوامل المضادة للجراثيم و / أو يعزل / لوحة وطريقة التلقيح. يجب أن يحسب حجم مسحوق dalbavancin والمرق للتأكد من أن كميات الأمثل ويتم إنتاج والنفايات هو الحد الأدنى. للمثال المستخدمة في هذا المنشور، وتقوم وحدات التخزين على إعداد فريقي هيئة التصنيع العسكري. وينبغي إعداد الموجبة تعديل مولر هينتون مرق وتعقيمها وفقا للإنسانالتحقق تعليمات ufacturer والعقم وسائل الإعلام. لوحات هيئة التصنيع العسكري يمكن أن تكون وتستخدم في نفس اليوم من إعداد أو أنها يمكن اختبارها مع الكائنات مراقبة الجودة المناسبة والألواح التحقق من صحة تخزينها في المجمد لاستخدامها في المستقبل. من المهم أن استخدام تقنيات معقمة في جميع أنحاء الداخلي. ليس هناك معايير صارمة للتحقق من تركيز اللقاح مع التهم مستعمرة. يمكن مراجعة التهم مستعمرة في البداية لكل أنواع اختبار و / أو دوريا للتحقق من صحة الخطوة تخفيف يؤديها في الخطوة 4.2. من المهم أن صلاحية مكفارلاند مستوى 0.5 محددا أيضا بشكل روتيني مع E. القولونية ATCC 25922 باستخدام إجراء مماثل إلى الخطوة 4.5. إذا لم تكن النتائج تعادل 1-2 × 10 8 كفو / مل، يجب الحصول على الجديد 0.5 مكفارلاند القياسية. إذا كانت التهم مستعمرة من الآبار MIC هي خارج نطاق مقبول (2-8 × 10 5 خلية / مل النتائج وهيئة التصنيع العسكري لعزل السريرية (ق) تختلف من عشريتوقع ه التوزيع الطبيعي (على سبيل المثال. 0،03-0،12 ميكروغرام / مل للبكتريا المكورة العنقودية البرتقالية) و / أو نتائج هيئة التصنيع العسكري لمراقبة الجودة عزل (ق) هي خارج النطاقات المتوقعة، اختبار التحقق من صحة ضروري ويمكن أن يكون له ما يبرره طريقة التعديل. ويقترح أن التحقق من صحة 0.5 مكفارلاند معيار يستخدم لتكرار العد مستعمرة (ق) وإذا كانت النتائج غير مرة أخرى خارج النتائج المتوقعة، وتخفيف اللقاح كما يؤديها في الخطوة 4.2 يجب أن تعدل وفقا لذلك وتكرار MIC. لاحظ أن الاختيار نقاء ضروري حتى لو يتم تنفيذ عدد مستعمرة لإجراء تعداد المستعمرة يستخدم حجم المخففة التي قد لا يكشف بالضرورة تركيزات أقل من الكائنات تلوث. لاختبار هيئة التصنيع العسكري أن تعتبر صالحة، يجب أن يحدث نمو مقبول في مراقبة النمو بشكل جيد. بالنسبة لمعظم البكتيريا التي سيتم اختبارها ضد dalbavancin (أي.، المكورات العنقودية، المكورات العقدية والمكورات المعوية، سوف ينظر النمو كزر (عادة&gt; 2 مم) وأقل الابequently، قد تظهر النمو كما التعكر في البئر. وخلافا لبعض العوامل المضادة للجراثيم التي قد تظهر زائدة اعتبارا زيادة تركيزات، تعرف النهاية dalbavancin عادة بشكل جيد. هناك العديد من أجهزة العرض يهدف إلى تسهيل اختبارات القراءة microdilution، والتي يمكن استخدامها لقراءة dalbavancin تحتوي على لوحات طالما لا يوجد حل وسط في القدرة على التمييز النمو في الآبار. ترتبط الخطوات الحاسمة ضمن بروتوكول للمراحل الإجراءات التي تتعلق ذوبان dalbavancin وإضافة P80. من المهم أن الحد الأقصى لتركيز dalbavancin المستخدم هو لا يزيد عن 1600 ميكروغرام / مل، ويستخدم هذا DMSO كمادة مذيبة وتعد أن تركيزات المتوسطة في DMSO قبل اتخاذ التخفيفات مرق بحيث التركيز النهائي من DMSO في MIC لوحة الآبار ليس أكبر من 1٪. DMSO هو بلوري ولذا، فإن استخدام الزجاجات القديمة من DMSO لconsideratايون فيما يتعلق dalbavancin الذوبان. ومع ذلك، في حين أظهرت دراسة BMD صغيرة مع سلالات مراقبة الجودة هذا لا يجب أن يكون متغير مهم (انظر القسم النتائج)، ومن الممارسات الجيدة لاستخدام زجاجات جديدة أو فتح مؤخرا من DMSO. ومن المهم أيضا أن P80 يضاف إلى المرق في الخطوة الأخيرة من الإعداد تخفيف المخدرات وغير بتركيز نهائي من 0.002٪ في MIC جيدا. الإجراء BMD المضمنة هنا يستخدم إعداد لوحات MIC باستخدام 50 ميكرولتر / جيد في dalbavancin وP-80 تركيزات مرتين على التركيز النهائي وإضافة اللقاح مع 50 ميكرولتر / جيد بحيث الحجم النهائي / هو من 100 ميكرولتر. يسمح هذا الأسلوب للتنسيق لوحة واحدة MIC إلى أن يتم إنتاجها لاختبار كلا S. الذهبية وS. الرئوية لأنه لا يمكن أن تضاف الحصان الدم هي lysed إلى اللقاح. طرق بديلة لإعداد لوحات MIC باستخدام 100 ميكرولتر / جيد مع إضافة ما يصل إلى 10 ميكرولتر / جيد موصوفة فيCLSI وISO الإجراءات. وتوقف عرضة dalbavancin لS. العنقودية الذهبية هي ≤0.12 ميكروغرام / مل (FDA حزمة إدراج). كما هو مبين في المراقبة الأخيرة، وتحول دون غالبية العزلات التي كتبها dalbavancin عند مستويات 0.06 ميكروغرام / مل 15. مع نقطة توقف عرضة بالقرب من MIC مشروط، أي الاختلاف في هيئة التصنيع العسكري نتيجة للاختلافات طريقة يمكن أن تؤثر على معدلات الحساسية. لأن الإجراء BMD لdalbavancin يتضمن بعض الخطوات فريدة من نوعها (على وجه التحديد، واستخدام DMSO في إعداد الأوراق المالية والتخفيفات المخدرات وسيطة و 0.002٪ P80 في MIC جيدا، فمن الضروري أن يتبع طريقة بالضبط. الكائن S. الذهبية QC (آي تي ​​سي سي 29213) مع واضحة جدا MIC dalbavancin مشروط من 0.06 ميكروغرام / مل، فقد كان مؤشرا جيدا على طريقة الاختلاف وينبغي أن تستخدم بشكل روتيني للتحقق من صحة طريقة BMD. إذا كانت النتائج هي هيئة التصنيع العسكري مع النطاق المتوقع من 0،03-0،12 ميكروغرام / مل، ولكن تتجه إما إلى انخفاض أو المهزومةح جانب من هذا النطاق، يوجد ما يبرر مواصلة التحقق من صحة هذه الطريقة. يوصى بإضافة 0.002٪ P80 لجميع الكائنات موجبة الجرام ذات الصلة (staphylococcci، المكورات المعوية، والمكورات العقدية). ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أنه قد ثبت أن هي lysed حصان الدم يعمل على غرار P-80 بالنسبة لسياستها المعادية ملزم القدرة وأن إضافة P-80 إلى CAMHB + LHB لا يوجد لديه تأثير إضافي على dalbavancin العقديات النتائج هيئة التصنيع العسكري. لا يوجد حاليا أي طريقة نشر القرص لاختبار dalbavancin وبسبب الارتباط الضعيف لBMD والنتائج AD، اختبار الحساسية من dalbavancin باستخدام طريقة AD لا ينصح 12، 14. طريقة BMD ينبغي أن تستخدم لتقييم المستقبل dalbavancin الحساسية وكمعيار الذهب للتنمية التجارية اختبارات الحساسية المضادة للميكروبات.

Dalbavancin هو lipoglycopeptide شبه الاصطناعية التي وافقت عليها ادارة الاغذية والعقاقير مايو 2014 لعلاج الجلد وبنية الجلد الالتهابات البكتيرية الحادة التي تسببها الكائنات إيجابية الجرام 1. الهدف الأساسي من تفاصيل هذه الطريقة في شكل شريط فيديو هو توفير توجيهات واضحة إلى المختبر والبحوث السريرية العلماء لاختبار النتائج والإبلاغ عنها dalbavancin قابلية دقيقة وقابلة للتكرار. يتم تنفيذ تقرير لعامل مضاد للميكروبات MIC بالطرق التجارية بشكل روتيني في مختبرات السريرية لتقييم النشاط في المختبر وكيلا ضد البكتيريا المسببة للأمراض. الطريقة الموصوفة هنا هو طريقة microdilution مرق على النحو الموصى به من قبل CLSI وISO 2،3،4. منذ dalbavancin طرق قابلية التجارية غير متوفرة حاليا (في ذلك الوقت من هذا المنشور) ونشر القرص وطرق التخفيف آغار لا ينصح حاليا وأو dalbavancin وطرق مرق إشارة تخفيف هي الخيارات المتاحة حاليا 12،14. وبما أن هذه الطريقة المرجعية ليست التجاري وFDA مسح الأسلوب في المختبر التشخيصي، والمختبرات السريرية في الولايات المتحدة الأمريكية أن استخدام هذا الإجراء لاختبار المريض يجب أن تلتزم بالمتطلبات التنظيمية لمختبر المتقدمة اختبار (LDT). ومن المتوقع أن كما يزيد استخدام dalbavancin، والمزيد من مختبرات سوف يكون هناك حاجة لاختبار هذا المركب. فانكومايسين اختبار كبديل لتحديد dalbavancin قابلية S. تم التحقق من صحة الذهبية 5. ومع ذلك، قد يكون dalbavancin فعال ضد فانكومايسين وسيط S. الذهبية (فيزا)، وبالتالي، الأطباء أن يطلبوا النتائج dalbavancin MIC. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يطلب النتائج MIC الأنواع البكتيرية الأخرى. وتوقف عرضة FDA لdalbavancin ضد S. وقد أنشئت الذهبية في ≤0.12 ميكروغرام / مل. ادارة الاغذية والعقاقير المخصصة فقط susceptiفئة بلي بسبب عدم وجود بيانات على العزلات مقاومة. توزيع MIC الطبيعي بين النوع البري S. الذهبية يعزل ما بين 0،03-0،12 ميكروغرام / مل، مع MIC مشروط واضح من 0.06 ميكروغرام / مل. وهناك اختلاف طفيف في نتائج MIC نتيجة لأسلوب الفرق، بالإضافة إلى الاختلاف BMD المتأصل في ± واحد التخفيف، ويحتمل أن يكون لها تأثير كبير على معدلات الحساسية. 6 مماثلة إلى وكلاء lipoglycopeptide أخرى، يمكن أن dalbavancin اختبار الحساسية تكون صعبة نتيجة ل من الذوبان وحجم كبير نسبيا من جزيء وخصائص ملزمة لها 7،8،9. طريقة إشارة BMD هو موضح هنا تضم ​​اثنين من الخطوات المحددة التي هي فريدة من نوعها لعملاء غير قابلة للذوبان و / أو وكلاء lipoglycopeptide: (1) استخدام DMSO لإعداد الحلول الأسهم و(2) إضافة-P 80 0.002٪ في لوحة MIC النهائية التخفيفات. والهدف من هذا المنشور الفيديو هو توفير الوضوح على dalbavancin طريقة BMD وspecificaالتركيز LLY على هذه الخطوات الرئيسية، لضمان النتائج MIC دقيقة وقابلة للتكرار.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dalbavancin</td>
			<td>Metrics, Inc.</td>
			<td>Greenville, NC</td>
			<td>BI-397</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vancomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>St. Louis, MO</td>
			<td>C5793</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cation Adjusted Mueller Hinton Broth</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>Sparks, MD</td>
			<td>212322</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysed horse blood</td>
			<td>Cleveland Scientific</td>
			<td>Bath, OH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dose-it peristaltic pump</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>Hudson, NH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-channel pipet (Viaflo II)</td>
			<td>Integra</td>
			<td>Hudson, NH</td>
			<td>4164</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 channel pipet (Matrix)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Waltham, MA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channelpPipets (Ovation 10 &#181;L - 100 &#181;L)</td>
			<td>VistaLab</td>
			<td>Brewster, NY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well microplate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>Monroe, NC</td>
			<td>650161</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL flat cap conical bottom centrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Waltham, MA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16x125mm disposable glass tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Waltham, MA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12x17mm snap cap, polystyrene tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Waltham, MA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 mL centrifuge tubes</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>Kaysville, UT</td>
			<td>C-3394-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent reservoirs</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td>Hudson, NH</td>
			<td>4312</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable sterilelLoops (1 uL &#38; 10 uL)</td>
			<td>Biologix</td>
			<td>Lenexa, KA</td>
			<td>65-0001,65-0010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soy agar + 5% sheep blood</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>Sparks, MD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (ambient)</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (5% CO2)</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Waltham, MA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td></td>
			<td>52817</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab coats</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a reference broth microdilution method for dalbavancin in vitro susceptibility testing of bacteria that grow aerobically

يتم إجراء اختبار الحساسية للمضادات الميكروبات (AST) لتقييم النشاط في المختبر من العوامل المضادة للجراثيم ضد البكتيريا المختلفة. وتستخدم النتائج AST، والتي يتم التعبير عنها تركيزات المثبطة الدنيا (البلدان المتوسطة الدخل) في مجال البحوث للتنمية المضادة للميكروبات ورصد تطور المقاومة والإعداد السريرية لتوجيه العلاج المضادة للميكروبات. Dalbavancin هو عامل lipoglycopeptide شبه الاصطناعية المضادة للميكروبات التي وافق مايو 2014 من قبل إدارة الغذاء والدواء (FDA) لعلاج الجلد وبنية الجلد الالتهابات البكتيرية الحادة التي تسببها الكائنات موجبة الجرام. ميزة dalbavancin على العلاجات المضادة للالعنقوديات الحالية لنصف العمر الطويل، والذي يسمح لجرعات مرة واحدة أسبوعيا. Dalbavancin ديه نشاط ضد المكورات العنقودية الذهبية (بما في ذلك مثسلين عرضة S. الذهبية [MSSA] ومقاومة للميثيسيلين S. الذهبية [MRSA])، المخثرة سلبية المكورات العنقودية، <em&gt; العقدية الرئوية، العقدية مجموعة ذبحية، β-الانحلالي العقديات المكورة المعوية وعرضة. على غرار غيرها من العوامل lipoglycopeptide مؤخرا، والتحسين من CLSI وISO مرق طرق اختبار قابلية يشمل ذلك استخدام سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO) كمذيب عند إعداد الحلول الأسهم وبوليسوربات 80 (P80) للتخفيف من حدة تمسك وكيل لمن البلاستيك. قبل الدراسات السريرية وخلال التطوير الأولي للdalbavancin، لم تجر دراسات قابلية مع استخدام P-80 و تميل النتائج MIC أن يكون تم الحصول عليها 2-4 العالي أضعاف، وبالمثل أعلى MIC النتائج مع أجار طريقة التخفيف الحساسية. وكان أول شملت Dalbavancin في CLSI مرق microdilution الجداول منهجية في عام 2005 والمعدل في عام 2006 لتوضيح استخدام DMSO وP-80. وmicrodilution مرق (BMD) الإجراء المبين هنا هو محدد لdalbavancin ويتفق مع الأساليب CLSI وISO، مع خطوة بخطوة بالتفصيل وFOCلنا على خطوات حاسمة وأضاف لوضوح.

Watch this Scientific Journal Video about A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically at JoVE.com

A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

Here, we present a protocol for determination of dalbavancin susceptibility of clinically relevant Gram-positive bacteria using a broth microdilution reference methodology.

مرجع مرق الطريقة Microdilution لDalbavancin<em&gt; في المختبر</em&gt; حساسية اختبار من البكتيريا التي تنمو هوائيا

Antimicrobial susceptibility testing (AST) is performed to assess the in vitro activity of antimicrobial agents against various bacteria. The AST results, ...

a-reference-broth-microdilution-method-for-dalbavancin-vitro

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

28.7K Views.  Laboratory Specialists, Inc. Here, we present a protocol for determination of dalbavancin susceptibility of clinically relevant Gram-positive bacteria using a broth microdilution reference methodology. 

Video: A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third most common infection in US hospitals. Different manifestations of candidiasis are associated with biofilm formation, both on host tissues and/or medical devices (i.e. catheters). Biofilm formation carries negative clinical implications, as cells within the biofilms are protected from host immune responses and from the action of antifungals. We have developed a simple, fast and robust in vitro model for the formation of C. albicans biofilms using 96 well microtiter-plates, which can also be used for biofilm antifungal susceptibility testing. The readout of this assay is colorimetric, based on the reduction of XTT (a tetrazolium salt) by metabolically active fungal biofilm cells. A typical experiment takes approximately 24 h for biofilm formation, with an additional 24 h for antifungal susceptibility testing. Because of its simplicity and the use of commonly available laboratory materials and equipment, this technique democratizes biofilm research and represents an important step towards the standardization of antifungal susceptibility testing of fungal biofilms.

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

We describe a simple, rapid and robust method for the formation of Candida albicans biofilms using 96 well microtiter plates and its utility in antifungal susceptibility testing of cells within biofilms.

96 ألف لوحة حسنا Microtiter القائم على أسلوب تشكيل لمراقبة واختبار قابلية مضاد المبيضات البيض الأغشية الحيوية

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third ...

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. Biofilms are community-associated bacteria attached to a surface and encased in a matrix. The role of the extracellular matrix is multifaceted, including facilitating nutrient acquisition, and offers significant protection against environmental stresses (e.g. host immune responses). In an effort to acquire a better understanding as to how the bacteria within a biofilm respond to environmental stresses we have used a protocol wherein we visualize bacterial biofilms which have formed in an 8-well chamber slide. The biofilms were stained with the BacLight Live/Dead stain and examined using a confocal microscope to characterize the relative biofilm size, and structure under varying incubation conditions. Z-stack images were collected via confocal microscopy and analyzed by COMSTAT. This protocol can be used to help elucidate the mechanism and kinetics by which biofilms form, as well as identify components that are important to biofilm structure and stability.

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

This article describes the procedure for the formation and visualization of a bacterial biofilm grown within an 8-well chamber slide

تشكيل بيوفيلم في المختبر في غرفة الشرائح 8 جيد

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Antimicrobial Susceptibility Testing of Mycobacterium Tuberculosis Complex for First and Second Line Drugs by Broth Dilution in a Microtiter Plate Format

The rapid detection of antimicrobial resistance is important in the effort to control the increase in resistant Mycobacterium 
tuberculosis (Mtb). Antimicrobial susceptibility testing (AST) of Mtb has traditionally been performed by the agar method of proportion or by 
macrobroth testing on an instrument such as the BACTEC (Becton Dickinson, Sparks, MD), VersaTREK (TREK Diagnostics, Cleveland, OH) or BacT/ALERT (bioM&eacute;rieux, Hazelwood, MO). The agar proportion method, while considered the &#x201C;gold&#x201D; standard of AST, is labor intensive and requires calculation of resistance by performing colony counts on drug-containing agar as compared to drug-free agar. If there is &ge;1% growth on the drug-containing medium as compared to drug-free medium, the organism is considered resistant to that drug. The macrobroth methods require instrumentation and test break point ("critical") drug concentrations for the first line drugs (isoniazid, ethambutol, rifampin, and pyrazinamide). The method described here is commercially available in a 96 well microtiter plate format [MYCOTB (TREK Diagnostics)] and contains increasing concentrations of 12 antimicrobials used for treatment of tuberculosis including both first (isoniazid, rifampin, ethambutol) and second line drugs (amikacin, cycloserine, ethionamide, kanamycin, moxifloxacin, ofloxacin, para-aminosalicylic acid, rifabutin, and streptomycin). Pyrazinamide, a first line drug, is not included in the microtiter plate due to its need for acidic test conditions. Advantages of the microtiter system include both ease of set up and faster turn around time (14 days) compared with traditional agar proportion (21 days). In addition, the plate can be set up from inoculum prepared using either broth or solid medium. Since the microtiter plate format is new and since Mtb presents unique safety challenges in the laboratory, this protocol will describe how to safely setup, incubate and read the microtiter plate.

Antimicrobial susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis is challenging but critical for patient care. This microtiter plate format offers testing of 12 antimycobacterial drugs and provides minimum inhibitory concentration (MIC) values, which will aid in appropriate treatment.

اختبار الحساسية للمضادات الميكروبات مجمع المتفطرة السل للأدوية الخط الأول والثاني عن طريق التخفيف في شكل حساء بلايت Microtiter

The rapid detection of antimicrobial resistance is important in the effort to control the increase in resistant Mycobacterium 
tuberculosis (Mtb). ...

A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in the thymus proper vasculature formation and patterning is essential for thymocyte entry into the organ and mature T-cell exit to the periphery. The spatial arrangement of blood vessels in the thymus is dependent upon signals from the local microenvironment, namely thymic epithelial cells (TEC). Several recent reports suggest that disruption of these signals results in thymus blood vessel defects 1,2. Previous studies have described techniques used to label the neonatal and adult thymus vasculature 1,2. We demonstrate here a technique for labeling blood vessels in the embryonic thymus. This method combines the use of FITC-dextran or Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I (GSL 1 - isolectin B4) facial vein injections and CD31 antibody staining to identify thymus vascular structures and PDGFR-&beta; to label thymic perivascular mesenchyme 3-5. The option of using cryosections or vibratome sections is also provided. This protocol can be used to identify thymus vascular defects, which is critical for defining the roles of TEC-derived molecules in thymus blood vessel formation. As the method labels the entire vasculature, it can also be used to analyze the vascular networks in multiple organs and tissues throughout the embryo including skin and heart 6-10.

This article describes a method for labeling embryonic skin and thymus blood vessels.

A طريقة لوصفها الأوعية الدموية في الفئران الجنينية

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional identification requires the sub-culture of signaled blood culture broth with identification available only after colonies on solid agar have matured. MALDI-TOF MS is a reliable, rapid method for identification of the majority of clinically relevant bacteria when applied to colonies on solid media. The application of MALDI-TOF MS directly to blood culture broth is an attractive approach as it has potential to accelerate species identification of bacteria and improve clinical management. However, an important problem to overcome is the pre-analysis removal of interfering resins, proteins and hemoglobin&#160;contained in blood culture specimens which, if not removed, interfere with the MS spectra and can result in insufficient or low discrimination identification scores. In addition it is necessary to concentrate bacteria to develop spectra of sufficient quality. The presented method describes the concentration, purification, and extraction of Gram negative bacteria allowing for the early identification of bacteria from a signaled blood culture broth.

The application of matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) directly to blood culture broth expedites the identification of bacteria. The presented method is a rapid and reliable method for identification of Gram negative bacteria directly from blood culture broth.

التعرف السريع على البكتيريا سالبة الجرام من ثقافة الدم في مرق عن طريق MALDI-TOF الطيف الكتلي

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a rapid identification of the infectious agent to guide optimal antibiotic treatment. The analysis of Gram stains from positive blood culture can be rapidly conducted and already significantly impact the antibiotic regimen. However, the accurate identification of the infectious agent is still required to establish the optimal targeted treatment. We present here a simple and fast bacterial pellet preparation from a positive blood culture that can be used as a sample for several essential downstream applications such as identification by MALDI-TOF MS, antibiotic susceptibility testing (AST) by disc diffusion assay or automated AST systems and by automated PCR-based diagnostic testing. The performance of these different identification and AST systems applied directly on the blood culture bacterial pellets is very similar to the performance normally obtained from isolated colonies grown on agar plates. Compared to conventional approaches, the rapid acquisition of a bacterial pellet significantly reduces the time to report both identification and AST. Thus, following blood culture positivity, identification by MALDI-TOF can be reported within less than 1 hr whereas results of AST by automated AST systems or disc diffusion assays within 8 to 18 hr, respectively. Similarly, the results of a rapid PCR-based assay can be communicated to the clinicians less than 2 hr following the report of a bacteremia. Together, these results demonstrate that the rapid preparation of a blood culture bacterial pellet has a significant impact on the identification and AST turnaround time and thus on the successful outcome of patients suffering from bloodstream infections.

A rapid bacterial pellet preparation from a positive blood culture can be used as a sample for applications such as identification by MALDI-TOF, Gram staining, antibiotic susceptibility testing and PCR-based test. The results can be rapidly communicated to clinicians to improve the outcome of patients suffering from bloodstream infections.

إعداد ثقافة بيليه الدم الجرثومي السريع لتحديد واختبار حساسية المضادات الحيوية

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

في المختبر التفكيك من الأنفلونزا من الفيروسات Capsids بواسطة الطرد المركزي التدرج

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

إنشاء إعداد إنتاجية عالية لفحص الجزيئات الصغيرة التي تعدل ج-دي-GMP في اشارة<em&gt; الزائفة الزنجارية</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in the caseous cores of cavities and lesions is especially crucial because they harbor subpopulations of drug-tolerant bacteria also commonly referred to as persisters. Existing methods for the measurement of drug penetration in tuberculosis lesions involve costly and time-consuming in vivo pharmacokinetic studies coupled to bioanalytical or imaging techniques. The in vitro measurement of drug binding to caseum macromolecules was proposed as an alternative to such techniques since this binding hinders the passive diffusion of drug molecules through caseum. Rapid equilibrium dialysis is a fast and reliable system for performing plasma protein and tissue binding studies. In this protocol, we used a rapid equilibrium dialysis (RED) device to measure drug binding to homogenates of caseum that is excised from the lesions and cavities of tuberculosis-infected rabbits. The protocol also describes how to generate a surrogate matrix from lipid loaded THP-1 macrophages to use in place of caseum. This caseum/surrogate binding assay is an important tool in tuberculosis drug discovery and can be adapted to help study drug distribution in lesions or abscesses caused by other diseases.

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Here we describe a rapid equilibrium dialysis (RED) method to measure drug binding to caseum from pulmonary tuberculosis lesions and cavities. The protocol is also used with a foamy macrophage-derived matrix that is an effective surrogate to caseum.

ل<em&gt; في المختبر</em&gt; كاسيم ملزمة الفحص الذي يتنبأ اختراق المخدرات في الآفات السل

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

مضان القائم على النورامينيداز تثبيط الفحص لتقييم مدى حساسية فيروسات الأنفلونزا إلى والنورامينيداز المانع فئة من الأدوية المضادة للفيروسات

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...