Name: procedure for decellularization of rat livers in an oscillating-pressure perfusion device
Uploaded: 2015-08-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device at JoVE.com

The authors would like to gratefully thank Steffen Lippert, Khalid Aliyev, Korinna J&#246;hrens and Katharina Struecker for their help during this project.

בעלי חיים הוחזקו במתקן לרפואה ניסויית (FEM, Charité, ברלין, גרמניה), ואת כל פרוטוקולי הניסוי היו נבדקו ואושרו על ידי משרד המדינה לענייני בריאות ומקומי (LAGeSo, ברלין, גרמניה;. רג O מס &#39;0365 / 11). קציר 1. כבד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה טרום ניתוחית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בצלחת פקק לקיבעון. שים וילון רפואי על הצלחת. באמצעות ארבע מחטים, לתקן מסכת משאיפת על צלחת הפקק להרדמת משאיפת במהלך ניתוח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סידור מכוון של פורטל ורידי הצינורית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר צנתר ורידים היקפי (G-20) לברזלי שלוש-דרך. צנתר הוורידים יש לחתוך באלכסון, באורך של כ. 1.5 סנטימטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דה-אוויר למערכת באמצעות מזרק 10 מיליליטר מלא פתרון רינגר. זה מאוד חשוב לזהירות דה-האוויר כי תסחיף גז עלול להשפיע לרעה על decellularization זלוף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סידור מכווןשל צינורית העורקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש צינורית פרפר ולחתוך את המחט לאורך של 5 מ&quot;מ. להתאים צינור 5 סנטימטר (ID 0.58 מ&quot;מ; OD 0.96 מ&quot;מ) למחט 5 מ&quot;מ ולתקן את זה עם דבק מגע. הכנס צינור 2 ס&quot;מ ארוך (ID 0.28 מ&quot;מ; 0.61 מ&quot;מ OD) לתוך הצינור הגדול ולתקן את זה עם דבק מגע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחליק צינור אחר על בנייה זו כבסיס גשר ולתקן את זה עם דבק מגע. דה-אוויר צינורית העורקים עם מזרק 5 מיליליטר מלא פתרון רינגר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדמה ושיכוך כאבים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרום להרדמה של החולדה בחדר האינדוקציה ההרדמה על ידי isoflurane 3.5% בחמצן בקצב זרימה של 1.5 ליטר / דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבטיח שיכוך כאבים בטוחים במהלך המבצע, להזריק metamizol (100 מ&quot;ג / קילוגרם מסת גוף) וקטמין במינון נמוך / medetomidine (10 מ&quot;ג / 0.1 מ&quot;ג לכל קילוגרם מסת גוף) intraperitoneally. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספק isoflurane 1.5% בחמצן / דקה 1 ליטר באמצעות מסכת משאיפת לתחזוקה הבאה של הרדמה כירורגית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסדרים לפני ניתוח &lt;ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח את הבטן בנדיבות עם מכונה גז חשמלית. להרטיב את אתר החתך המגולח בבטן עם אתנול 70% לחיטוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החיה במצב שכיבה על הצלחת מוכנה, להכניס את הראש לתוך מסכת משאיפת ולתקן את הגפיים עם קלטת רפואית וסיכות. הסר אתנול ופרווה עודפים עם תחבושות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערכת הרדמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את עומק ההרדמה על ידי צפייה בקצב הנשימה. כאשר ההרדמה נראית עמוקה מספיק (40-60 נשימות / דקה), לבדוק אם כאבים די בניסיון לעורר את רפלקס קמצוץ הבוהן באמצעות מלקחיים כירורגיים לצבוט את העור בין האצבעות של שני גפיים האחוריות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גישת בטן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך החציוני בקיר בטן הזנב מעל שלפוחית ​​השתן. לחתוך מנקודה זו לשתי קשתות costal הרוחב באופן בצורת V. יש להיזהר שלא לחתוך לסרעפת. משוך את דופן הבטן לחתוך מעל החזה. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את xiphoid עם מהדק אוברהולט, למשוך אותו cranially ולתקן את זה עם גומייה. השתמש צמר גפן רטוב לפנות את המעי. לעטוף את המעי בתחבושת גזה רטובה. יתר על כן, לכסות את כל השוליים הבטן עם תחבושות רטובות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבד הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את רצועת falciform. השתמש בתחבושת גזה רטובה כדי להחזיק את האונה של הכבד המדיאלי ועזבה cranially מתחת לכיפה של הסרעפת. לחשוף את רצועת hepatoduodenal ואונת כבד omental העליונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בשני microforceps ומספריים באביב כדי לנתח בזהירות את הרצועה הצמודה לאונה העליונה omental עד האונה היא ניידת. הזז את האונה באמצעות צמר גפן רטוב מתחת לתחבושות, מחזיק אונות המדיאלי והשאירו במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הגיוס של אונת כבד omental העליונה, להעביר את הבטן בצד השמאל. תקן את הבטן עם מהדק ולנתח את omentum הקטין עם microforceps והמספריים באביב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגייס את omenta הנמוךl אונת כבד עד שהוא נייד ולאחר מכן להעביר את האונה אחורית לתוך החלל שלה. השתמש מהדק בקהאוס כדי לשמר את תריסריון. הזז את תריסריון לשמאל כדי למתוח ולחשוף את רצועת hepatoduodenal. להותיר את צינור מרה המשותף ברצועת hepatoduodenal המתוחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את צינור המרה מהשומן ורקמת לבלב. חותך את צינור המרה של 1.5 סנטימטר מהסתעפות צינור מרה. לנתח את וריד השער מרקמת השומן שמסביב. לחשוף את וריד gastroduodenal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקשור את וריד gastroduodenal פעמיים עם משי 6-0 ולחלק את הווריד בין 2 חיבורי האותיות. לנתח את תא מטען צליאק ועורק כבד הנפוץ מן הרקמה הסובבת עד שכל רמי העורקים מתגלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחרר את עורק gastroduodenal מן הרקמה הסובבת. לקשור את עורק gastroduodenal פעמיים עם משי 6-0, עם הקשרים רחוקים אחד מהשני. לנתח את עורק gastroduodenal בין 2 חיבורי האותיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחרר את עורק הטחולמהרקמה הסובבת. לקשור את עורק הטחול פעמיים עם משי 6-0, עם הקשרים רחוקים אחד מהשני. לנתח את עורק הטחול בין 2 חיבורי האותיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחרר את עורק הקיבה שמאל מהרקמה הסובבת. לקשור את עורק הקיבה שמאל פעמיים עם משי 6-0, עם הקשרים רחוקים אחד מהשני. לנתח את העורק בין 2 חיבורי האותיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להותיר את וריד caval הנחות בין הכליה הימנית ואונת כבד לרוחב הנכונה. לנתח את הווריד מהחלל retroperitoneal. לחשוף את אב העורקים על ידי הבא לתא מטען צליאק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את רקמת שומן retroperitoneal. הזרק 1,000 הפרין IE מלוחים 1 מיליליטר לווריד הנבוב הנחות. לחזור הצינורית ולסגור את החתך עם צמר גפן. חכה 1-2 דקות להשפעה המערכתית של הפרין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להותיר את אב העורקים עם מלקחיים. לנתח את אב העורקים ולגרום לדימום מחודש החולדה. יתר על כן, לנתח את נחות הווריד הנבוב distally מהכליות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פורטל הוורידים Cannulation (השתמש בצינורית מוכנה בסעיף 1.2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך דגים-פה בוריד שער דיסטלי. פתח את החתך עם מלקחיים וcannulate וריד השער. לשטוף את הכבד עם 20 מיליליטר פתרון רינגר עד decolorizes הכבד ולתקן את הצינורית עם חיבורי אותיות (משי 6-0). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העורקים Cannulation (השתמש בצינורית מוכנה בסעיף 1.3) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את אב העורקים מעל תא מטען צליאק. לשחרר את קטע אב העורקים מהחלל retroperitoneal. חותך את קטע אב העורקים longitudinally ליצור תיקון אב העורקים. הכנס את הצינורית העצמית בנויות לבעל סטטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 2 מלקחיים כדי להחליק את תיקון אב העורקים על הצינורית. ולקשור את העורק הכבד עם משי 6-0 על הצינורית ולתקן את התיקון בירכה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Explantation כבד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את הסרעפת, לעשות חתך עגול ולנתח את הכבד מהמבנים הסמוכים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סטהמחדש את הכבד במכל 500 מיליליטר סטרילי המלא 350 מיליליטר פתרון רינגר עד לשימוש. </li></ol></li></ol> 2. פתרונות דטרגנט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10% מניות פתרון Triton X-100 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו בקבוק 1,000 מיליליטר עם dest אקווה 900 מיליליטר. ולהוסיף 100 מיליליטר Triton X-100 (99,9%). השתמש בוחש לפזר את טריטון X-100. מלא את הבקבוק עם dest אקווה. עד נפח כולל של 1,000 מיליליטר הוא הגיע. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1% Triton X-100 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף את פתרון המניות 100 מיליליטר (10%) לבקבוק 1,000 מיליליטר. להוסיף 900 ​​dest אקווה מיליליטר. ולנער את הבקבוק פעמיים. סנן 1% דרך פילטר סטרילי פתרון Triton X-100. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10% SDS פתרון במלאי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו בקבוק 1,000 מיליליטר עם dest אקווה 900 מיליליטר. ולהוסיף SDS 66.99 גרם (99.9%, צפיפות 0.67). השתמש בוחש לפזר את SDS. מלא את הבקבוק עם dest אקווה. עד נפח כולל של 1,000 מיליליטר הוא הגיע. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1% SDS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף את פתרון המניות 100 מיליליטר (10%) לבוט 1,000 מיליליטרייתכנו. להוסיף 900 ​​dest אקווה מיליליטר. ולנער את הבקבוק פעמיים. סנן 1% SDS הפתרון דרך פילטר סטרילי. </li></ol></li></ol> 3. Decellularization <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרה של התקן זלוף <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig1.jpg" /></li></ol> איור 1:. תכנית של התקן זלוף לסלקטיבי עורקים וורידי הפורטל זלוף של כבדי עכברוש ארבעה תחת תנאי לחץ נדנוד (. שונה מן et al Struecker 14) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קישור לטמיון לברזלי שלוש-דרך והארכת Heidelberger להסדיר את רמת מילוי וממלא את הכור עם 500 מיליליטר 0,9% NaCl. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig2.jpg" /></li></ol> איור 2:. תכנית של הגדרת זלוף קישור תא זלוף (1,400 סנטימטר 3) (1) לקצה הדיסטלי (4) למלכודת הבועה (5) דרך גישת ורידי הפורטל (2) או באמצעות AC העורקיםסס (3). מלכודת הבועה (5) צריכה להיות מצוידת בחֲסִימָה (4) בקצה הדיסטלי ואוורור (6). חבר את מלכודת הבועה (5) להארכת Heidelberger (7). קישור הארכת Heidelberger למגזר המשאבה (8). יתר על כן, לחבר את קטע המשאבה (8) לעוד ארכה Heidelberger (9). הכנס את ההארכה האחרונה Heidelberger (9) לבקבוק של תמיסת ניקוי (10). חבר את הנשמה (11) לתא זלוף (או למפיץ הלחץ במקרה של זילופים מרובים). כדי לנקז את נוזלי הכור, לחבר את יצוא לבקבוק פסולת (12). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את קטע המשאבה למשאבה. התחל המשאבה כדי למלא את המחזור עם PBS, לסגור את הקצה הדיסטלי של מלכודת הבועה ולפתוח את פתח האוורור. כאשר החלק התחתון של הבועה מכוסה היטב עם PBS (2-3 סנטימטר), לסגור את פתח האוורור ולפתוח את הקצה הדיסטלי של מלכודת הבועה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקנה כבד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קישור הסתום המשולש של צינורית וריד שער לגישת כור בנושא. גonnect צינורית העורקים לגישת העורקים. להיות זהיר כדי להבטיח שאף אוויר נכנס למערכות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישום של תנאי לחץ נדנוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש הנשמה בתדירות של 15 פעימות לדקה ומשרעת של 26 mbar (דקות. 4 mbar, מקסימום. 30 mbar). חבר את מכשיר ההנשמה לתא לחץ ההפצה ולחבר את התא לכור. התחל יישום לחץ. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוטוקול decellularization <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את השלבים זלוף עם קצב זרימה של 5 מיליליטר / דקה. התחל decellularization עם טפטוף של הכבד עם 1% Triton X-100 למשך 90 דקות. לאפשר הזרמת שפכים באמצעות יצוא של מכשיר זלוף ולהשאיר את הנוזל בתוך מתמיד תא זלוף ומעל כבד perfused. לאחר 90 דקות, לשנות את חומר הניקוי ל1% SDS. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig3.jpg" /> <img alt="טבלת 1" src="/files/ftp_upload/53029/53029table1.jpg" /></li></ol></li></ol> &lt;p&gt; איור 3: זלוף פרוטוקול לכל קבוצות הניסוי.

<ol>
	<li>Struecker, B., Raschzok, N., Sauer, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+support+strategies:+cutting-edge+technologies.">Liver support strategies: cutting-edge technologies.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 11, 166-176 (2014).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32, 3233-3243 (2011).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+liver+scaffolds+effectively+support+the+proliferation+and+differentiation+of+mouse+fetal+hepatic+progenitors.">Decellularized liver scaffolds effectively support the proliferation and differentiation of mouse fetal hepatic progenitors.</a> J Biomed Mater Res A. , (2013).</li><li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+reengineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix.">Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nat Med. 16, 814-820 (2010).</li><li>Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+decellularization+of+intact+rat+liver.">Method for the decellularization of intact rat liver.</a> Organogenesis. 6, 134-136 (2010).</li><li>Bao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+portal+implantable+functional+tissue-engineered+liver+using+perfusion-decellularized+matrix+and+hepatocytes+in+rats.">Construction of a portal implantable functional tissue-engineered liver using perfusion-decellularized matrix and hepatocytes in rats.</a> Cell transplantation. 20, 753-766 (2011).</li><li>Baptista, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+whole+organ+decellularization+for+the+generation+of+a+vascularized+liver+organoid.">The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid.</a> Hepatology. 53, 604-617 (2011).</li><li>Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on+whole-organ+assembly:+moving+toward+transplantation+on+demand.">Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand.</a> J Clin Invest. 122, 3817-3823 (2012).</li><li>Soto-Gutierrez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+whole-organ+regenerative+medicine+approach+for+liver+replacement.">A whole-organ regenerative medicine approach for liver replacement.</a> Tissue engineering. Part C, Methods. 17, 677-686 (2011).</li><li>De Kock, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+quick+method+for+whole-liver+decellularization:+a+novel+in+vitro+three-dimensional+bioengineering+tool.">Simple and quick method for whole-liver decellularization: a novel in vitro three-dimensional bioengineering tool.</a> Archives of toxicology. 85, 607-612 (2011).</li><li>Park, K. M., Woo, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+decellularization+for+multi-organ+scaffolds+in+rats.">Systemic decellularization for multi-organ scaffolds in rats.</a> Transplantation proceedings. 44, 1151-1154 (2012).</li><li>Shirakigawa, N., Ijima, H., Takei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+liver+as+a+practical+scaffold+with+a+vascular+network+template+for+liver+tissue+engineering.">Decellularized liver as a practical scaffold with a vascular network template for liver tissue engineering.</a> J Biosci Bioeng. , (2012).</li><li>Ren, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+two+decellularization+methods+in+the+development+of+a+whole-organ+decellularized+rat+liver+scaffold.">Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold.</a> Liver Int. 33, 448-458 (2013).</li><li>Struecker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+rat+liver+decellularization+by+arterial+perfusion+under+oscillating+pressure+conditions.">Improved rat liver decellularization by arterial perfusion under oscillating pressure conditions.</a> J Tissue Eng Regen Med. , (2014).</li><li>Struecker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+Liver+Decellularization+Under+Oscillating+Pressure+Conditions:+A+Technical+Refinement+to+Improve+the+Homogeneity+of+the+Decellularization+Process.">Porcine Liver Decellularization Under Oscillating Pressure Conditions: A Technical Refinement to Improve the Homogeneity of the Decellularization Process.</a> Tissue engineering. Part C, Methods. , (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

למרות שהטכניקה שהוצגה לקציר כבד החולדה וdecellularization היא לשחזור בקלות, ישנם צעדים קריטיים מסוימים לשקול: במהלך הכנה לקציר כבד, חשוב להימנע מדימום חמור משום שהיא תפעיל קרישת דם ועלולה לגרום להיווצרות קריש דם בתוך הכבד. לדעתנו, זה יתר?...

Decellularization וrecellularization עשוי לאפשר את הדור של איברים פונקציונליים, השתלה במבחנה 1. על ידי תאי הסרת וחומר אנטיגני (למשל., DNA, epitopes אלפא-גל) מאיבר, ניתן להשיג את המטריצה ​​הלא פחות או-חיסונית תאית (ECM). מטריצה ​​זו חוסכת microanatomy תלת ממדי של איברים ויכולה לשמש כbiomatrix האידיאלי לאכלוס עם תאים ממוצא שונה, ואולי xenogeneic 2. כך, מטריצת כבד חולדה decellularized יכולה להיות אוכלס מחדש עם תאי כבד אנושיים. מיקרו-כבד אנושי זה יכול לשמש כמודל vivo לשעבר למחקר על מחלות (למשל., מחלות מטבוליות מולדות, מחלות ויראליות או ממאירות) או לבדיקת תרופות פרה 3. כמה פרוטוקולים שונים לdecellularization זלוף כבד חולדה כבר פורסמו 4-13. בכל הפרוטוקולים, decellularלמען האזרוח הושג על ידי טפטוף של חומרי ניקוי יוניים או שאינם יוניים בסיסיים דרך וריד פורטל cannulated. למיטב ידיעתנו, היינו הקבוצה הראשונה לדווח decellularization כבד חולדה על ידי זלוף סלקטיבית דרך וריד הפורטל ו / או עכברוש העורק כבד 14. מאפשר זלוף סלקטיבית של מערכות כלי דם השונות בכבד עשוי לאפשר תוצאות decellularization טובות יותר ו, יתר על כן, עשוי לשחק תפקיד חשוב באכלוס סלולארי. במחקר המפורט כאן, כבדים היו perfused במכשיר זלוף קניינית מותאם אישית, המאפשרים זלוף בתנאי לחץ נדנוד. תנאי לחץ אלה מחקים את זלוף נשימה תלויה הפיזיולוגי של הכבד: באתר, הכבד נתקע מתחת לאוגד של הסרעפת, תנועה שבנשימה יש השפעה ישירה על זלוף כבד. השראה במיוחד מובילה להורדת של הסרעפת ולסחוט של הכבד, אופטימיזציהיצוא hepato-ורידים, ואילו פקיעה מובילה להעלאה של הכבד והורדה של לחץ intraabdominal כדי לייעל יבוא פורטל-ורידים 15. המטרה שלנו הייתה להעריך אם יש להם תנאי לחץ נדנוד השפעה על ההומוגניות של decellularization זלוף כבד חולדה על ידי חיקוי תנאי intraabdominal vivo לשעבר. ההומוגניות של תהליך decellularization עשויה להיות גורם לזלזל בdecellularization זלוף. כל הסוכנים הידועים המשמשים לשינויי סיבת decellularization הכבד לECM. תאים באזורי perfused גרוע יישארו בECM, ואילו באזורים אחרים כבר decellularized לחלוטין. לפזר את התאים הנותרים, משך זלוף או לחץ חייב להיות מורם, גורם ליותר שינויים באזורי perfused היטב. לפיכך, חומרי ניקוי לdecellularization צריך להיות מופץ homogenously בתוך האיבר.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Self built arterial cannula</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Portex Non Sterile Polyethene Tubing</td><td>SIMS Portex</td><td>REF 800/110/100</td><td>0.28 mm ID 0.61 mm OD</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Portex Non Sterile Polyethene Tubing</td><td>SIMS Portex</td><td>REF 800/110/200</td><td>0.58 mm ID 0.96 mm OD</td></tr><tr><td>Venodrop Safe butterfly catheter</td><td>Fresenius Kabi</td><td>3275851</td><td>21 G</td></tr><tr><td colspan="4">portal vein cannula</td></tr><tr><td>Periphereal Venous Catheter</td><td>BD</td><td>393224</td><td>BD Venflon Pro 20G</td></tr><tr><td>Three-way stopcock</td><td>smiths medical</td><td>888-101RE</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">surgery</td></tr><tr><td>Cotton Sticks</td><td>Hecht-Assistent</td><td>4302</td><td></td></tr><tr><td>Cotton Pads&amp;nbsp;</td><td>Shaoxing Zhengde Surgical dressing</td><td>13H118-03</td><td></td></tr><tr><td>Gauze Bandage</td><td>Hubei Haige&amp;nbsp; Medical Instruments</td><td>14388</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Ringer Solution</td><td>Fresenius Kabi</td><td>13 HKP022</td><td>1000 ml</td></tr><tr><td>10 ml Syringe</td><td>Braun</td><td>4606108V</td><td>10 ml/ Luer Solo</td></tr><tr><td>5 ml Syringe</td><td>Braun</td><td>4606061V</td><td>5 ml /Luer Solo</td></tr><tr><td>Suture (Silk 6/0)</td><td>Resorba</td><td>H1F</td><td>LOT 105001.81</td></tr><tr><td>medical drape</td><td>Shaoxing Zhengde Surgical dressing</td><td>D0613011</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">surgical instruments</td></tr><tr><td>needle holder</td><td>Geuder</td><td>17570</td><td></td></tr><tr><td>micro-forceps</td><td>Inox-Electronic</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>micro-scissors</td><td>Martin</td><td>11-740-11</td><td></td></tr><tr><td>micro-forceps</td><td>S&amp;amp;T&amp;nbsp;</td><td>112314</td><td></td></tr><tr><td>Clamp</td><td>Aesculap</td><td>BH111R</td><td></td></tr><tr><td>scissors</td><td>F S T&amp;nbsp;</td><td>14501-14</td><td></td></tr><tr><td>surgical forceps</td><td>Aesculap</td><td>BD 557</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Decellularisation</td></tr><tr><td>Respirator</td><td>Resmed</td><td>14.24.11.0004</td><td>SmartAIR ST</td></tr><tr><td>Perfusion Device</td><td>Charite, medical engineering laboratory</td><td>custome-made device</td><td>decellularisation device</td></tr><tr><td>peristaltic pump ismatec reglo ICC</td><td>IDEX</td><td>ISM4408&amp;nbsp;</td><td>4-channel</td></tr><tr><td>heidelberger extension 75 cm&amp;nbsp;</td><td>Fresenius Kabi</td><td>2873</td><td>75 cm</td></tr><tr><td>MS/CA pump-segment</td><td>IDEX</td><td>IS 3510&amp;nbsp;</td><td>MS/CA/click&#039;n&#039;go/POM-C</td></tr><tr><td>CA 2-stopper tube</td><td>Pharmed</td><td>BPT NSF-51</td><td></td></tr><tr><td>bubble trap&amp;nbsp;</td><td></td><td>custome-made item</td><td></td></tr><tr><td>Luer Lock hose connector</td><td>Neolab</td><td>No. 02-1887</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Detergents</td></tr><tr><td>SDS pellets</td><td>Carl Roth&amp;nbsp;</td><td>CN30.4&amp;nbsp;</td><td>2.5 kg</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Carl Roth&amp;nbsp;</td><td>3051.1&amp;nbsp;</td><td>10 L</td></tr><tr><td>PBS&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>DPBS</td></tr><tr><td colspan="4">staining</td></tr><tr><td>Eosin 1%</td><td>Morphisto</td><td>10177</td><td></td></tr><tr><td>Mayer hematoxylin</td><td>AppliChem</td><td>A4840</td><td></td></tr><tr><td>gomori staining</td><td>Morphisto</td><td>11104</td><td></td></tr><tr><td>AlcainBlue-PAS staining</td><td>Morphisto</td><td>11388</td><td></td></tr><tr><td>Direct Red 80&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>365548</td><td></td></tr></tbody></table>

procedure for decellularization of rat livers in an oscillating-pressure perfusion device

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent liver decellularization have already been published. We aimed to improve the decellularization process by construction of a proprietary perfusion device enabling selective perfusion via the portal vein and/or the hepatic artery. Furthermore, we sought to perform perfusion under oscillating surrounding pressure conditions to improve the homogeneity of decellularization. The homogeneity of perfusion decellularization has been an underestimated factor to date. During decellularization, areas within the organ that are poorly perfused may still contain cells, whereas the extracellular matrix (ECM) in well-perfused areas may already be affected by alkaline detergents. Oscillating pressure changes can mimic the intraabdominal pressure changes that occur during respiration to optimize microperfusion inside the liver. In the study presented here, decellularized rat liver matrices were analyzed by histological staining, DNA content analysis and corrosion casting. Perfusion via the hepatic artery showed more homogenous results than portal venous perfusion did. The application of oscillating pressure conditions improved the effectiveness of perfusion decellularization. Livers perfused via the hepatic artery and under oscillating pressure conditions showed the best results. The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.

הומוגניות ובכך את האפקטיביות של פרוטוקולי decellularization שונים הוערכו על ידי התבוננות מקרוסקופית, ניתוח היסטולוגית, וניתוח של תוכן ה- DNA שנותר בתוך מטריצות כבד decellularized. יתר על כן, ליהוק קורוזיה בוצע לדמיין microanatomy שלם של כבדים לאחר decellularization. <p class="jove_content" style=";text-align:right;direc...

Watch this Scientific Journal Video about Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device at JoVE.com

Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device

The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.

נוהל Decellularization של כבדי עכברוש בהתקן זלוף נדנוד לחץ

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent ...

procedure-for-decellularization-rat-livers-an-oscillating-pressure

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.2K Views.  Charité – Universitätsmedizin Berlin. The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.

Video: Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to recreate or mimic the liver microstructure with grounds up approach using tissue engineering and microfabrication techniques have not been successful so far due to this design challenge. In addition, synthetic biomaterials used to create scaffolds for liver tissue engineering applications have been limited in inducing tissue regeneration and repair in large part due to the lack of specific cell binding motifs that would induce the proper cell functions2. Decellularized native tissues such blood vessels3and skin4on the other hand have found many applications in tissue engineering, and have provided a practical solution to some of the challenges. The advantage of decellularized native matrix is that it retains, to an extent, the original composition, and the microstructure, hence enhancing cell attachment and reorganization5.
In this work we describe the methods to perform perfusion-decellularization of the liver, such that an intact liver bioscaffold that retains the structure of major blood vessels is obtained. Further, we describe methods to recellularize these bioscaffolds with adult primary hepatocytes, creating a liver graft that is functional in vitro, and has the vessel access necessary for transplantation in vivo.

Perfusion decellularization is a novel technique to produce whole liver scaffolds that retains the organ's extracellular matrix composition and microarchitecture. Herein, the method of preparing whole organ scaffolds using perfusion decellularization and subsequent repopulation with hepatocytes is described. Functional and transplantable liver grafts can be generated using this technique.

Decellularization ו Recellularization של כבדים שלמים

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

Technique of Subnormothermic Ex Vivo Liver Perfusion for the Storage, Assessment, and Repair of Marginal Liver Grafts

The success of liver transplantation has resulted in a dramatic organ shortage. In most transplant regions 20-30% of patients on the waiting list for liver transplantation die without receiving an organ transplant or are delisted for disease progression. One strategy to increase the donor pool is the utilization of marginal grafts, such as fatty livers, grafts from older donors, or donation after cardiac death (DCD). The current preservation technique of cold static storage is only poorly tolerated by marginal livers resulting in significant organ damage. In addition, cold static organ storage does not allow graft assessment or repair prior to transplantation.
These shortcomings of cold static preservation have triggered an interest in warm perfused organ preservation to reduce cold ischemic injury, assess liver grafts during preservation, and explore the opportunity to repair marginal livers prior to transplantation. The optimal pressure and flow conditions, perfusion temperature, composition of the perfusion solution and the need for an oxygen carrier has been controversial in the past.
In spite of promising results in several animal studies, the complexity and the costs have prevented a broader clinical application so far. Recently, with enhanced technology and a better understanding of liver physiology during ex vivo perfusion the outcome of warm liver perfusion has improved and consistently good results can be achieved.
This paper will provide information about liver retrieval, storage techniques, and isolated liver perfusion in pigs. We will illustrate a) the requirements to ensure sufficient oxygen supply to the organ, b) technical considerations about the perfusion machine and the perfusion solution, and c) biochemical aspects of isolated organs.

Technique of Subnormothermic Ex Vivo Liver Perfusion for the Storage, Assessment, and Repair of Marginal Liver Grafts

Marginal grafts, such as fatty livers, grafts from older donors, or livers retrieved after cardiac death (DCD) tolerate conventional, cold static storage only poorly. We developed a novel model of subnormothermic ex vivo liver perfusion for preservation, assessment, and repair of marginal liver grafts prior to transplantation.

טכניקה של Subnormothermic<em&gt; Ex Vivo</em&gt; הכבד זלוף לאחסון, ההערכה, ותיקון שתלי כבד שולי

The success of liver transplantation has resulted in a dramatic organ shortage. In most transplant regions 20-30% of patients on the waiting list for ...

Medicine

Normothermic Ex Vivo Liver Machine Perfusion in Mouse

This protocol presents an optimized erythrocytes-free NEVLP system using mouse livers. Ex vivo preservation of mouse livers was achieved by employing modified cannulas and techniques adapted from conventional commercial ex vivo perfusion equipment. The system was utilized to evaluate the preservation outcomes following 12 h of perfusion. C57BL/6J mice served as liver donors, and the livers were explanted by cannulating the portal vein (PV) and bile duct (BD), and subsequently flushing the organ with warm (37 &#176;C) heparinized saline. Then, the explanted livers were transferred to the perfusion chamber and subjected to normothermic oxygenated machine perfusion (NEVLP). Inlet and outlet perfusate samples were collected at 3 h intervals for perfusate analysis. Upon completion of the perfusion, liver samples were obtained for histological analysis, with morphological integrity assessed using modified Suzuki-Score through Hematoxylin-Eosin (HE) staining. The optimization experiments yielded the following findings: (1) mice weighing over 30 g were deemed more suitable for the experiment due to the larger size of their bile duct (BD). (2) a 2 Fr (outer diameter = 0.66 mm) polyurethane cannula was better suited for cannulating the portal vein (PV) when compared to a polypropylene cannula. This was attributed to the polyurethane material&#39;s enhanced grip, resulting in reduced catheter slippage during the transfer from the body to the organ chamber. (3) for cannulation of the bile duct (BD), a 1 Fr (outer diameter = 0.33 mm) polyurethane cannula was found to be more effective compared to the polypropylene UT - 03 (outer diameter = 0.30 mm) cannula. With this optimized protocol, mouse livers were successfully preserved for a duration of 12 h without significant impact on the histological structure. Hematoxylin-Eosin (HE) staining revealed a well-preserved morphological architecture of the liver, characterized by predominantly viable hepatocytes with clearly visible nuclei and mild dilation of hepatic sinusoids.

Normothermic Ex Vivo Liver Machine Perfusion in Mouse

A normothermic ex vivo liver perfusion (NEVLP) system was created for mouse livers. This system requires experience in microsurgery but allows for reproducible perfusion results. The ability to utilize mouse livers facilitates the investigation of molecular pathways to identify novel perfusate additives and enables the execution of experiments focused on organ repair.

זילוח מכונת כבד Normothermic Ex Vivo בעכבר

This protocol presents an optimized erythrocytes-free NEVLP system using mouse livers. Ex vivo preservation of mouse livers was achieved by employing ...

Engineering

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver engineering, including in vivo organ decellularization followed by repopulation, has emerged as a promising approach over ex vivo liver engineering. However, postoperative survival was not achieved. The aim of this study is to develop a novel surgical technique of in vivo selective liver lobe perfusion in rats as a prerequisite for in vivo liver engineering. We generate a circuit bypass only through the left lateral lobe. Then, the left lateral lobe is perfused with heparinized saline. The experiment is performed with 4 groups (n = 3 rats per group) based on different perfusion times of 20 min, 2 h, 3 h, and 4 h. Survival, as well as the macroscopically visible change of color and the histologically determined absence of blood cells in the portal triad and the sinusoids, is taken as an indicator for a successful model establishment. After selective perfusion of the left lateral lobe, we observe that the left lateral lobe, indeed, turned from red to faint yellow. In a histological assessment, no blood cells are visible in the branch of the portal vein, the central vein, and the sinusoids. The left lateral lobe turns red after reopening the blocked vessels. 12/12 rats survived the procedure for more than one week. We are the first to report a surgical model for in vivo single liver lobe perfusion with a long survival period of more than one week. In contrast to the previously published report, the most important advantage of the technique presented here is that perfusion of 70% of the liver is maintained throughout the whole procedure. The establishment of this technique provides a foundation for in vivo partial liver engineering in rats, including decellularization and recellularization.

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

We establish a novel surgical technique for an in vivo single liver lobe perfusion model in rat as a prerequisite for further studying in vivo partial liver engineering in the future.

טכניקה כירורגית הרומן כבסיס In Vivo חלקי הכבד הנדסה בעכברוש

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Liver fibrosis is defined by the excessive deposition of extracellular matrix by activated myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic myofibroblasts, including hepatic stellate cells, portal fibroblasts and bone marrow derived fibroblasts 1. Hepatic stellate cells have been the best studied, but portal fibroblasts are increasingly recognized as important contributors to the myofibroblast pool, particularly in biliary fibrosis 2. Portal fibroblasts undergo proliferation in response to biliary epithelial injury, potentially playing a key role in the early stages of biliary scarring 3-5. A method of isolating portal fibroblasts would allow in vitro study of this cell population and lead to greater understanding of the role portal fibroblasts play in biliary fibrosis.
Portal fibroblasts have been isolated using various techniques including outgrowth 6, 7 and liver perfusion with enzymatic digestion followed by size selection 8. The advantage of the digestion and size selection technique compared to the outgrowth technique is that cells can be studied without the necessity of passage in culture. Here, we describe a modified version of the original technique described by Kruglov and Dranoff 8 for isolation of portal fibroblasts from rat liver that results in a relatively pure population of primary cells.

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

A technique for isolating portal fibroblasts from rat liver is described. Livers are perfused and digested in situ with collagenase, followed by ex vivo digestion of the liver slurry and size selection of cells. This method provides a pure population of portal fibroblasts without the need for passage in culture.

הבידוד של Fibroblasts פורטל עכברוש ידי<em&gt; באתרו</em&gt; כבד זלוף

Liver fibrosis is defined  by the excessive deposition of extracellular matrix by activated  myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic ...

Biology

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

בידוד תרבות ראשונית של תאים בכבד עכברוש

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

Patients with severe traumatic injuries and tissue loss require complex surgical reconstruction. Vascularized composite allotransplantation (VCA) is an evolving reconstructive avenue for transferring multiple tissues as a composite subunit. Despite the promising nature of VCA, the long-term immunosuppressive requirements are a significant limitation due to the increased risk of malignancies, end-organ toxicity, and opportunistic infections. Tissue engineering of acellular composite scaffolds is a potential alternative in reducing the need for immunosuppression. Herein, the procurement of a rat hindlimb and its subsequent decellularization using sodium dodecyl sulfate (SDS) is described. The procurement strategy presented is based upon the common femoral artery. A machine perfusion-based bioreactor system was constructed and used for ex vivo decellularization of the hindlimb. Successful perfusion decellularization was performed, resulting in a white translucent-like appearance of the hindlimb. An intact, perfusable, vascular network throughout the hindlimb was observed. Histological analyses showed the removal of nuclear contents and the preservation of tissue architecture across all tissue compartments.

Procurement and Decellularization of Rat Hindlimbs Using an Ex Vivo Perfusion-Based Bioreactor for Vascularized Composite Allotransplantation

We describe the surgical technique and decellularization process for composite rat hindlimbs. Decellularization is conducted using low-concentration sodium dodecyl sulfate through an ex vivo machine perfusion system.

רכש ודה-סלוליזציה של חולדות אחוריות באמצעות ביוריאקטור מבוסס ex vivo perfusion עבור allotransplantation מרוכב וסקולרי

Patients with severe traumatic injuries and tissue loss require complex surgical reconstruction. Vascularized composite allotransplantation (VCA) is an ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, normothermic ex vivo liver perfusion (NEVLP) has been introduced as a method to evaluate and modify organ function. NEVLP has many advantages in comparison to hypothermic and subnormothermic perfusion including reduced preservation injury, restoration of normal organ function under physiologic conditions, assessment of organ performance, and as a platform for organ repair, remodeling, and modification. Both murine and porcine NEVLP models have been described. We demonstrate a rat model of NEVLP and use this model to show one of its important applications &#8212; the use of a therapeutic molecule added to liver perfusate. Catalase is an endogenous reactive oxygen species (ROS) scavenger and has been demonstrated to decrease ischemia-reperfusion in the eye, brain, and lung. Pegylation has been shown to target catalase to the endothelium. Here, we added pegylated-catalase (PEG-CAT) to the base perfusate and demonstrated its ability to mitigate liver preservation injury. An advantage of our rodent NEVLP model is that it is inexpensive in comparison to larger animal models. A limitation of this study is that it does not currently include post-perfusion liver transplantation. Therefore, prediction of the function of the organ post-transplantation cannot be made with certainty. However, the rat liver transplant model is well established and certainly could be used in conjunction with this model. In conclusion, we have demonstrated an inexpensive, simple, easily replicable NEVLP model using rats. Applications of this model can include testing novel perfusates and perfusate additives, testing software designed for organ evaluation, and experiments designed to repair organs.

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

There is a significant liver donor shortage, and criteria for liver donors have been expanded. Normothermic ex vivo liver perfusion (NEVLP) has been developed to evaluate and modify organ function. This study demonstrates a rat model of NEVLP and tests the ability of pegylated-catalase, to mitigate liver preservation injury.

מודל בעלי חיים קטנים של זלוף הכבד Normothermic Vivo לשעבר

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure for primary hepatocyte isolation is technically challenging, especially in portal vein cannulation. The procedure is also prone to occasional contamination and variations in perfusion conditions due to difficulties in the assembly, optimization, or maintenance of the perfusion setup. Here, a detailed protocol for an improved two-step collagenase perfusion procedure with multiparameter perfusion control is presented. Primary rat hepatocytes were successfully and reliably isolated by taking the necessary technical precautions at critical steps of the procedure, and by reducing the operational difficulty and mitigating the variability of perfusion parameters through the adoption of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control, and real-time monitoring and alarm system. The isolated primary rat hepatocytes consistently exhibit high cell viability (85%-95%), yield (2-5 x 108 cells per 200-300 g rat) and functionality (albumin, urea and CYP activity). The procedure was complemented by an integrated perfusion system, which is compact enough to be set up in the laminar flow hood to ensure aseptic operation.

This protocol details the use of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control complemented by real-time monitoring, and an alarm system for two-step collagenase perfusion procedure to improve the consistency in the viability, yield, and functionality of isolated primary rat hepatocytes.

בידוד של הפטוציטים ראשוניים של חולדות עם בקרת זלוף רב-פרמטרית

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure ...

Evaluation of Apoptosis and Lung Injury in DCD Donor Lungs Preserved by EVLP

Establishment of a Novel Ex Vivo Lung Perfusion System for Rat Lungs After Circulatory Death

The increasing scarcity of donor lungs for transplantation has spurred significant interest in the utilization of organs procured from donors after cardiac death (DCD). However, a critical challenge remains in maximizing the number of viable lungs that meet stringent criteria for clinical use. Ex vivo lung perfusion (EVLP) emerges as a promising technology to evaluate and potentially improve the function of donated lungs. This paper describes the development of a cost-effective and reproducible small animal experimental platform specifically designed for EVLP research. This platform offers a high degree of customization, enabling researchers to tailor experimental parameters to address specific research questions within the field of EVLP. The team established a rat model to simulate DCD and implemented a two-stage preservation approach. Lungs were subjected to static cold storage using a perfusate solution at 4 &#176;C for 4 h, followed by normothermic EVLP for another 4 h. Researchers evaluated various lung function parameters, including pulmonary vascular resistance, pulmonary dynamic compliance, blood gas measurements of the perfusate, and apoptotic cell death in lung tissues. The study demonstrates that EVLP could significantly improve the functional performance of DCD lungs compared to simple cold storage at 4 &#176;C, suggesting that EVLP has the potential to mitigate ischemia-reperfusion injury and enhance graft function following circulatory death, thereby increasing the pool of transplantable lungs.

The objective is to develop a new ex vivo lung perfusion (EVLP) model in rats that can sustain consistent lung function for 4 h throughout EVLP and furnish the industry with implementation specifics that will offer a sturdy method for applying EVLP to rodent models.

The increasing scarcity of donor lungs for transplantation has spurred significant interest in the utilization of organs procured from donors after ...

נוהל Decellularization של כבדי עכברוש בהתקן זלוף נדנוד לחץ

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video