نضح آلة الكبد Normothermic ex-vivo في الفأر. يعد نضح الكبد المؤكسج Normothermic استراتيجية واعدة لإنقاذ الأعضاء الهامشية وقد تم تقديمه مؤخرا في الممارسة السريرية. ومع ذلك ، فإن الآليات الجزيئية الأساسية ليست مفهومة جيدا.
هناك حاجة إلى نموذج فأر لمزيد من دراسة المسارات الجزيئية ، والاستفادة من الحيوانات المعدلة وراثيا ، مثل الفئران المعدلة وراثيا ، وبالتالي انتظار إنشاء نظام نضح آلة مؤكسج طبيعي الحرارة لكبد الفئران. هنا مخطط لنظامنا بأكمله. أولا ، يتم التحكم في النظام بأكمله عند 37 درجة مئوية بواسطة وحدة تحكم ثرموستاتية من خلال دوران المياه.
يتم ضخ perfusate من الخزان بواسطة مضخة تمعجية إلى جهاز الأكسجين. هناك تدفق غاز غير منقطع بنسبة 95٪ أكسجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون في جهاز الأكسجين. ثم يمر البيرفوسات عبر مصيدة الفقاعات.
يتم ضخ perfusate مع فقاعات الهواء مرة أخرى إلى الخزان تحت الضغط. يتدفق البيروزيت المتبقي إلى غرفة العضو حيث يتم توصيل الأنبوب بالوريد البابي. يتم تصريف البيرفوسات من الكبد من خلال الأجوف فوق الكبدي إلى غرفة الأعضاء.
يتم توجيه التدفق الخارجي من غرفة العضو مرة أخرى إلى الخزان بواسطة المضخة التمعجية. يتم توصيل أنبوب تصريف الصفراء بغرفة العضو لجمع الصفراء. هذا هو جدول العمليات لدينا.
تتم جميع العمليات الجراحية تحت المجهر. نحافظ على ظروف التشغيل شبه المعقمة طوال العملية الجراحية. امسك قنية الأنبوب الفرنسي بالملقط.
اخترق جدار القنية بإبرة 30 جرام على مسافة سنتيمتر واحد من نهاية القنية. ادفع الإبرة عبر القنية حتى يصبح طرف الإبرة مرئيا. فيما يلي صورة مقارنة لقسطرة 26G وقنية ذاتية الصنع ؛ كلاهما مناسب لقنية بوابة الماوس.
تحضير 25 ملليلتر من محلول ملحي هيبارين بتركيز نهائي قدره 2،500 وحدة دولية لكل مليلتر ، ووضع حقنة في حاضنة محددة عند 40 درجة مئوية. فيما يلي المكونات الرئيسية لنظام نضح آلة الحرارة العادية خارج الجسم الحي. تشمل المكونات بشكل أساسي غرفة الجهاز ، والآلة الثرموستاتية ، ومضخة الأسطوانة ، والأكسجين ، والخزان.
هنا ، يمكنك رؤية إعداد مفصل لغرفة الأعضاء لدينا. في الأساس ، يتكون من جسم غرفة الأعضاء ، ومستشعر الضغط ، والمبادل الحراري ، ومصيدة الفقاعات. أنشأنا مدخل perfusate ، ومنفذ perfusate ، وميناء تصريف الصفراء.
هذا هو نظام مراقبة ADI الذي نستخدمه لمراقبة ضغط الوريد البابي. يتكون نظام ADI من مستشعر ضغط ووحدة تحكم مركزية وشاشات. قم بتشغيل برنامج LabChart لمراقبة الضغط.
المعايرة والتصفير مطلوبان قبل كل استخدام لمستشعر الضغط. استخدم زئبق صفر ملليمتر وزئبق 20 ملليمتر كعلامات لمعايرة مستشعر الضغط للمعايرة ذات الخطوتين. بناء على المراقبة المستمرة لضغط البوابة ، يمكننا ضبط فلوران البوابة وفقا لتغيرات الضغط.
في أحجام متساوية من perfusate إلى الخزان وغرفة الجهاز لتجهيز النظام ، يجب إيلاء اهتمام خاص للحفاظ على العقم أثناء عملية التعبئة. قم بتوصيل غرفة الحث بمقبس حائط. تحويل الأكسجين إلى 0.5 لتر في الدقيقة.
تحويل إيزوفلوران إلى 3٪ضع الحيوان في الغرفة حتى يتم الوصول إلى التخدير العميق. استخدم حقنة صغيرة لتطبيق جرعة تسكين الألم المتكيفة مع وزن الجسم. هنا ، سبعة ميكرولتر من البوبرينورفين.
الآن ، نبدأ عملية الجراحة. قم بعمل شق عرضي في منطقة البطن من الماوس. يمتد شق الجلد إلى الخط الإبطي الثنائي للحوم على كلا الجانبين.
قم بعمل شق طولي بعناية على طول خط ألبا. قطع من خلال طبقة عضلات البطن مع التخثير الكهربائي والمقص. ضع بعناية قطعة من الشاش الرطب لحماية الكبد من التخثير الكهربائي.
فضح تماما تجويف البطن من الماوس. حرك الأمعاء الدقيقة بعناية من تجويف البطن باستخدام قطعة قطن مبللة لفضح الهيلوم بالكامل. يوضح هنا رسم تخطيطي لقنية الوريد البابي وقنية القناة الصفراوية.
في الأساس ، نختار القنية المناسبة وفقا لحجم الماوس ، ونستخدم خياطة الحرير 6-0 لتثبيت القنية. حرر القناة الصفراوية المشتركة بعناية باستخدام ملقط منحني ناعم بدون أسنان. القناة الصفراوية المشتركة تتلف بسهولة وتنكسر.
بمجرد أن ينكسر ، لا يمكن تقليبه. نظرا لاتجاه الموضع التشريحي ، فإن الملقط المنحني أسهل في التشغيل. ضع حلقتين من الحرير 6-0 فوق القناة الصفراوية المشتركة استعدادا للخطوة التالية.
ثقب بعناية القناة الصفراوية بإبرة 30G. استخدم ملقط منحني مدبب لتكبير الثقوب الصغيرة ، بحيث يمكن أن يغذي قنية القناة الصفراوية. استخدم ملقط قنية الوعاء عبر قنية القناة الصفراوية وادفعه إلى القناة الصفراوية. ملاحظه.
في لحظة القنية ، ستشعر بالمقاومة التي تسببها الصفراء. إذا لم يتم التحكم في القوة بشكل جيد ، دفع القنية خارج القناة الصفراوية عن طريق ضغط تدفق الصفراء. ضبط بعناية عمق القنية.
إذا كان عميقا جدا ، فقد يؤدي إلى تلف القناة الصفراوية ، وإذا لم يكن عميقا بدرجة كافية ، فقد ينزلق. يمكن ملاحظة تدفق الصفراء في القنية بعد القنية الناجحة. قم بتثبيت الوريد البابي بالملقط المسطح وحرر النسيج الضام بعناية باستخدام ملقط منحني.
لا تسحب بقوة هنا ، حتى لا تتسبب في تمزق الوريد البابي. بمجرد تلف الوريد البابي ، من الصعب إعادة سحب الوريد البابي. ضع حلقتين من الحرير 6-0 على الوريد البابي الحر.
استخدم مشبكا شريانيا لإغلاق الوريد البابي البعيد. ثقب بعناية فائقة الوريد البابي مع واحدة من قنية الوريد البابي أعلاه. يمكن ملاحظة تدفق الدم بوضوح داخل القنية بعد ثقب ناجح.
خذ محلول ملحي من الهيبارين من الحاضنة. قم بإزالة جميع فقاعات الهواء. إصلاح حقنة مع ملحية الهيبارين مسخن مسبقا في مضخة حقنة.
قم بتوصيل أنبوب تمديد مضخة المحقنة بقنية الوريد البابي. اضبط السرعة على ملليلتر في الدقيقة وابدأ في تنظيف الكبد. زيادة الأيزوفلوران إلى 5٪والقتل الرحيم للفأر بجرعة زائدة من استنشاق الأيزوفلوران.
راقب لون الكبد في نهاية عملية التنظيف. استئص الكبد بمجرد أن يتحول اللون إلى أصفر متجانس. نقل الكبد بعناية إلى غرفة الجهاز باستخدام طبق بتري.
احتفظ بكمية صغيرة من المحلول الملحي في طبق بتري لمنع سحق الكبد. ملاحظه. يمكن بسهولة التواء الوريد البابي والقناة الصفراوية أثناء هذا الإجراء ، مما قد يؤثر على تروية الكبد وجمع الصفراء. قم بضخ محلول ملحي طبيعي ببطء في قنية الوريد البابي باستخدام حقنة لإخلاء فقاعات الهواء في القنية.
قم بتوصيل قنية الوريد البابي بأنبوب التدفق الخارجي perfusate في غرفة الجهاز. يتم توجيه قنية القناة الصفراوية للفأر من خلال صمام غرفة العضو ، وهو مغلق بغطاء مطاطي. بعد ذلك ، يتم إدخال الأنبوب الصفراوي في أنبوب صغير معد مسبقا سعة 0.5 ملليلتر مع وجود ثقب صغير في المقدمة.
بعد توصيل كل شيء ، قم بتشغيل المضخة التمعجية. تحقق من قراءة ضغط الوريد البابي لضبط معدل التدفق. الحفاظ على ضغط الوريد البابي بين سبعة إلى 10 ملليمترات من الزئبق عن طريق ضبط معدل التدفق. ملاحظه.
يمكن أن يختلف معدل التدفق الاسمي قليلا حسب عمر الأنابيب ووضعها. هذا هو اختيار وسط البيرفوسات ، وحجم البيروسات ، وضغط التروية بناء على عمل أدبي لدراسات نضح آلة كبد الفئران المؤكسجة ذات الحرارة المعيارية. هذه تجربة خطوة بخطوة لإنشاء نموذج نضح الماوس.
استغرق الأمر حوالي 14 تجربة لاختيار القسطرة الأكثر ملاءمة. في أيدينا ، يعد استخدام قسطرة مطاطية فرنسية للوريد البابي ، جنبا إلى جنب مع قسطرة مطاطية فرنسية واحدة للقناة الصفراوية ، أفضل مزيج لتحقيق نضح متجانس مع وجود جميع القسطرة في مكانها. كان مستوى الأس الهيدروجيني ومستوى البوتاسيوم مستقرين طوال فترة التروية لمدة 12 ساعة.
تراوح مستوى الأس الهيدروجيني من 7.26 إلى 7.71 ، وتراوح مستوى البوتاسيوم من 5.9 إلى 6.8 مليمول لكل لتر. يظهر تلطيخ HE أنه بعد 12 ساعة من التروية ، تم الحفاظ على سلامة الأنسجة لكبد الفأر بشكل جيد نسبيا. مجتمعة ، أثبتنا هنا الإنشاء الناجح لنظام نضح آلة مؤكسج طبيعي الحرارة لكبد الفأر.
أدى نضح كبد الفأر لمدة 12 ساعة إلى الحفاظ الجيد على مورفولوجيا الكبد ، وإن لم يكن في جميع أنحاء العضو بأكمله. هناك حاجة إلى مزيد من الجهد لتحقيق التروية المتجانسة الكاملة على مدى فترة زمنية أطول. بمجرد تحقيق ذلك ، يمكن النظر في استخدام الحيوانات المعدلة وراثيا ، مثل استخدام الفئران IL-2-knockout للتحقيق في دور الالتهاب.
