الكتاب أود أن أشكر C. Roderigo للحصول على المساعدة الفنية للخبراء. نشكر S. كولر (مركز التصوير المتقدم، هاينريش هاينه جامعة دوسلدورف) للمساعدة في إنتاج الفيديو. وقد تم تمويل البحوث في مختبر البلاغ من قبل جمعية الألمانية للبحوث (DFG: رو 2327 / 8-1 لCRR)، وهاينريش هاينه جامعة دوسلدورف (لNH) وقبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01NS032123 (لMC).

<ol>
	<li>Somjen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+regulation+in+the+brain:+implications+for+pathophysiology.">Ion regulation in the brain: implications for pathophysiology.</a> Neuroscientist. 8, 254-267 (2002).</li><li>Dietzel, I., Heinemann, U., Hofmeier, G., Lux, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulus-induced+changes+in+extracellular+Na++and+Cl-+concentration+in+relation+to+changes+in+the+size+of+the+extracellular+space.">Stimulus-induced changes in extracellular Na+ and Cl- concentration in relation to changes in the size of the extracellular space.</a> Exp Brain Res. 46, 73-84 (1982).</li><li>Nicholson, C., ten Bruggencate, G., Stockle, H., Steinberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+potassium+changes+in+extracellular+microenvironment+of+cat+cerebellar+cortex.">Calcium and potassium changes in extracellular microenvironment of cat cerebellar cortex.</a> J Neurophysiol. 41, 1026-1039 (1978).</li><li>Rice, M. E., Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate-+and+aspartate-induced+extracellular+potassium+and+calcium+shifts+and+their+relation+to+those+of+kainate,+quisqualate+and+N-methyl-D-aspartate+in+the+isolated+turtle+cerebellum.">Glutamate- and aspartate-induced extracellular potassium and calcium shifts and their relation to those of kainate, quisqualate and N-methyl-D-aspartate in the isolated turtle cerebellum.</a> Neuroscience. 38, 295-310 (1990).</li><li>Prince, D. A., Lux, H. D., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+extracellular+potassium+activity+in+cat+cortex.">Measurement of extracellular potassium activity in cat cortex.</a> Brain Res. 50, 489-495 (1973).</li><li>Deitmer, J. W., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+regulation+and+proton+signalling+by+glial+cells.">pH regulation and proton signalling by glial cells.</a> Prog Neurobiol. 48, 73-103 (1996).</li><li>Chesler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+modulation+of+pH+in+the+brain.">Regulation and modulation of pH in the brain.</a> Physiol Rev. 83, 1183-1221 (2003).</li><li>Kofuji, P., Newman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Regulation of potassium by glial cells in the central nervous system. , (2009).</li><li>Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion-selective+microelectrodes+and+diffusion+measurements+as+tools+to+explore+the+brain+cell+microenvironment.">Ion-selective microelectrodes and diffusion measurements as tools to explore the brain cell microenvironment.</a> J Neurosci Methods. 48, 199-213 (1993).</li><li>Fedirko, N., Svichar, N., Chesler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+and+use+of+high-speed,+concentric+h+-+and+Ca2+-selective+microelectrodes+suitable+for+in+vitro+extracellular+recording.">Fabrication and use of high-speed, concentric h+- and Ca2+-selective microelectrodes suitable for in vitro extracellular recording.</a> J Neurophysiol. 96, 919-924 (2006).</li><li>Stephan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kir4.1+channels+mediate+a+depolarization+of+hippocampal+astrocytes+under+hyperammonemic+conditions+in+situ.">Kir4.1 channels mediate a depolarization of hippocampal astrocytes under hyperammonemic conditions in situ.</a> Glia. 60, 965-978 (2012).</li><li>Haack, N., Rose, C. R., Lei, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+Calibration+and+Application+of+Potassium-Selective+Microelectrodes.">Preparation, Calibration and Application of Potassium-Selective Microelectrodes.</a> Microelectrodes. , 87-105 (2014).</li><li>Roos, A., Boron, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pH.">Intracellular pH.</a> Physiol Rev. 61, 296-434 (1981).</li><li>Kleinhans, C., Kafitz, K. W., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-photon+Intracellular+Sodium+Imaging+Combined+with+UV-mediated+Focal+Uncaging+of+Glutamate+in+CA1+Pyramidal+Neurons.">Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2014).</li><li>Hertz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+astrocytic+Na+,K+-ATPase+and+glycogenolysis+for+K+homeostasis+in+mammalian+brain.">Roles of astrocytic Na ,K -ATPase and glycogenolysis for K homeostasis in mammalian brain.</a> J Neurosci Res. , (2014).</li><li>Pumain, R., Heinemann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulus-+and+amino+acid-induced+calcium+and+potassium+changes+in+rat+neocortex.">Stimulus- and amino acid-induced calcium and potassium changes in rat neocortex.</a> J Neurophysiol. 53, 1-16 (1985).</li><li>Vargova, L., Jendelova, P., Chvatal, A., Sykova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate,+AMPA,+NMDA+Induced+Changes+in+Extracellular+Space+Volume+and+Tortuosity+in+the+Rat+Spinal+Cord.">Glutamate, AMPA, NMDA Induced Changes in Extracellular Space Volume and Tortuosity in the Rat Spinal Cord.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 21, 1077-1089 (2001).</li><li>Fellin, T., Gomez-Gonzalo, M., Gobbo, S., Carmignoto, G., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+glutamate+is+not+necessary+for+the+generation+of+epileptiform+neuronal+activity+in+hippocampal+slices.">Astrocytic glutamate is not necessary for the generation of epileptiform neuronal activity in hippocampal slices.</a> J Neurosci. 26, 9312-9322 (2006).</li><li>Rouach, N., Koulakoff, A., Abudara, V., Willecke, K., Giaume, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astroglial+metabolic+networks+sustain+hippocampal+synaptic+transmission.">Astroglial metabolic networks sustain hippocampal synaptic transmission.</a> Science. 322, 1551-1555 (2008).</li><li>Lux, H. D., Heinemann, U., Dietzel, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+changes+and+alterations+in+the+size+of+the+extracellular+space+during+epileptic+activity.">Ionic changes and alterations in the size of the extracellular space during epileptic activity.</a> Adv Neurol. 44, 619-639 (1986).</li><li>Zanotto, L., Heinemann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspartate+and+glutamate+induced+reductions+in+extracellular+free+calcium+and+sodium+concentration+in+area+CA1+of+'in+vitro'+hippocampal+slices+of+rats.">Aspartate and glutamate induced reductions in extracellular free calcium and sodium concentration in area CA1 of 'in vitro' hippocampal slices of rats.</a> Neurosci Lett. 35, 79-84 (1983).</li><li>Borrelli, M. J., Carlini, W. G., Dewey, W. C., Ransom, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+making+ion-selective+microelectrodes+suitable+for+intracellular+recording+in+vertebrate+cells.">A simple method for making ion-selective microelectrodes suitable for intracellular recording in vertebrate cells.</a> J Neurosci Methods. 15, 141-154 (1985).</li><li>Ammann, D., Anker, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutral+carrier+sodium+ion-selective+microelectrode+for+extracellular+studies.">Neutral carrier sodium ion-selective microelectrode for extracellular studies.</a> Neurosci Lett. 57, 267-271 (1985).</li><li>Deitmer, J. W., Schlue, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Na++and+Ca2++in+leech+Retzius+neurones+during+inhibition+of+the+Na+-K++pump.">Intracellular Na+ and Ca2+ in leech Retzius neurones during inhibition of the Na+-K+ pump.</a> Pflugers Arch. 397, 195-201 (1983).</li><li>Schwiening, C. J., Thomas, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+intracellular+calcium+and+its+muffling+measured+by+calcium+iontophoresis+in+snail+neurones.">Relationship between intracellular calcium and its muffling measured by calcium iontophoresis in snail neurones.</a> J Physiol. 491 (Pt 3), 621-633 (1996).</li><li>Chesler, M., Kraig, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pH+of+astrocytes+increases+rapidly+with+cortical+stimulation.">Intracellular pH of astrocytes increases rapidly with cortical stimulation.</a> Am J Physiol. 253, R666-R670 (1987).</li><li>Ammann, D., Chao, P. S., Simon, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Valinomycin-based+K++selective+microelectrodes+with+low+electrical+membrane+resistance.">Valinomycin-based K+ selective microelectrodes with low electrical membrane resistance.</a> Neurosci Lett. 74, 221-226 (1987).</li><li>Deitmer, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicarbonate-dependent+changes+of+intracellular+sodium+and+pH+in+identified+leech+glial+cells.">Bicarbonate-dependent changes of intracellular sodium and pH in identified leech glial cells.</a> Pflugers Arch. 420, 584-589 (1992).</li><li>Lux, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+recording+ion+specific+microelectrodes:+their+use+in+pharmacological+studies+in+the+CNS.">Fast recording ion specific microelectrodes: their use in pharmacological studies in the CNS.</a> Neuropharmacology. 13, 509-517 (1974).</li><li>Nicholson, C., Phillips, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+diffusion+modified+by+tortuosity+and+volume+fraction+in+the+extracellular+microenvironment+of+the+rat+cerebellum.">Ion diffusion modified by tortuosity and volume fraction in the extracellular microenvironment of the rat cerebellum.</a> J Physiol. 321, 225-257 (1981).</li><li>Chesler, M., Chan, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulus-induced+extracellular+pH+transients+in+the+in+vitro+turtle+cerebellum.">Stimulus-induced extracellular pH transients in the in vitro turtle cerebellum.</a> Neuroscience. 27, 941-948 (1988).</li><li>Thomas, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+sodium+activity+and+the+sodium+pump+in+snail+neurones.">Intracellular sodium activity and the sodium pump in snail neurones.</a> J Physiol. 220, 55-71 (1972).</li></ol>

The authors declare no competing interests.

استنادا السائل الناقل، وقد استخدمت أقطاب ايون انتقائية بنجاح لعقود وبالنسبة للعديد من الأيونات، هي مجسات محددة للغاية المتاحة 22-26. عندما تستخدم في الفضاء خارج الخلية (ECS) الاستعدادات المخ الفقاريات، لا بد من أن نضع في اعتبارنا، بيد أن هذا هو أسلوب الغازية تماما: ففي حين أن عرض ECS هو فقط حوالي 20-50 نانومتر، وقطر أيون انتقائي الميكروية حوالي 1 ميكرون (أقطاب مزدوجة الماسورة) أو أكبر (أقطاب متحدة المركز). سوف نصائح من الميكروية ايون انتقائية تلف وبالتالي ليس فقط الأنسجة أثناء التطويق من الأنسجة، ولكن أيضا تكبير ECS، لصالح التقليل من العابرين أيون. على الرغم من هذه المزالق، العابرين أيون الخلية ردا على نشاط الخلايا العصبية متسقة بشكل ملحوظ بين مختلف المختبرات 7،8، مما يدل على مصداقية هذا الأسلوب. أداء وملاءمة أقطاب ايون انتقائيةيعتمد على حساسيتها والانتقائية، والذي تم تعريفه من قبل كوكتيل الاستشعار (&#39;السائل حامل الأيون غشاء&#39;) المستخدمة. الكوكتيلات استشعار تحتوي على جزيء الناقل خاص، على سبيل المثال valinomycin لK + الميكروية -selective الذي يسلك الانتقائية العالية للحصول على البوتاسيوم 27. بالرغم من ذلك، يمكن أن يحدث عبر التفاعل مع أيونات أخرى، ويجب أن يتم اختبار. Valinomycin يسلك عبر التفاعل الكبير لالأمونيوم، والتي لابد من أخذها في الاعتبار عند تفسير النتائج (على سبيل المثال 11،12). وعلاوة على ذلك، لأن الجهد للاستجابة للionophores تتبع سلوك Nernstian (راجع المعادلة 1)، ونسبة الإشارة إلى الضوضاء وعتبة الكشف تعتمد على تركيز أيون المراد قياسها. وهكذا، في حين صغير [K +] س العابرين تثير التغيرات الجهد كبيرة ضد خط الأساس منخفضة [K +] س، صغيرة [نا +] س العابرين هم أكثر صعوبة للكشف ضد مرحباخط الأساس GH [نا +] س (انظر الشكل 5 و 6). يتم تحديد أداء أقطاب ايون انتقائية أيضا بقرار الزمني، الذي يخضع إلى حد كبير ثابت وقته الكهربائية. يتم تحديد هذا الأخير أساسا من قبل المقاومة المحوري من أجهزة الاستشعار، والسعة وزعت على طول ماصة، بين الحلول الداخلي والخارجي السائل. في تكوين مزدوج الماسورة، ومقاومة عالية، نظرا لعمود طويل من ردم استشعار أيون. لعازلة العازلة معين (في هذا البورسليكات الزجاج حالة)، ويخضع السعة من سمك العزل. في أقطاب مزدوجة الماسورة، وعرض عازل يصل إلى الجدار الزجاجي من ماصة. كما يخفف الزجاج بالقرب من الحافة، ويندرج عرض عازلة، وزيادة السعة. هذه العوامل تتضافر لإنتاج الأقطاب مع أوقات الاستجابة التي تتراوح من عدة مئات إلى عدة ميلي ثانيةثانية، وهذه العوامل هي متنوعة. والميزة الرئيسية لتصميم متحدة المركز هي أن كلا من المقاومة المحوري والسعة إلى الحمام تتضاءل إلى حد كبير. ويحول ماصة متحدة معظم المقاومة للمبادل أيون ردم، ولم يتبق سوى بقايا في ميكرومتر القليلة الماضية قبل طرف. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الحل ملء داخل ماصة متحدة المركز ونأى جسديا من الحمام، مفصولة سمك جدارين الزجاج، والحد بشكل كبير من السعة. كما هو مبين في وقت سابق 10، التأثير المشترك لخفض المقاومة والسعة تحسنا في القرار الزماني لاثنين من حيث الحجم. في حالة متحدة المركز الكالسيوم 2+ ودرجة الحموضة الميكروية، وكانت أوقات الاستجابة 90٪ منخفضة تصل إلى 10-20 مللي ثانية 10. وهناك ميزة ذات الصلة لتصميم متحدة المركز هي أقل مستوى الضوضاء (راجع الشكل 8). نظرا لتقلص إلى حد كبير مقاومة، العابرين الجهد من أي أمبينيتم الحد من الضوضاء ر. وعلاوة على ذلك، التعافي من هذا العابرين سريعا، بسبب الوقت ثابت سريع. هذه التحف بالتالي فهي صغيرة وسريعة، ولها تأثير أقل التخريبية على التسجيلات الفسيولوجية (راجع الشكل 8). هناك أيضا عيوب تقنية متحدة المركز. أولا، جمعيتهم هو أكثر تعقيدا، وتستغرق وقتا طويلا. والعيب الثاني هو الحاجة لوضع مسرى مكروي إشارة منفصلة مع طرفها، مما يستتبع استخدام إما micromanipulator منفصل أو مناور المزدوج المتخصصة. وأخيرا، الميكروية مزدوجة الماسورة يمكن أن تمتد إلى تصميم ثلاثي الماسورة، مما يسمح للكشف عن نوعين أيون مختلفة في نفس الوقت 28، وهو أمر غير ممكن لأقطاب متحدة المركز. المزالق الأكثر شيوعا silanization غير فعالة. أهم خطوة، والعقبة الرئيسية في تلفيق أي-السيناتور السائلأو المستندة إلى أيون انتقائية مسرى مكروي هو الإجراء silanization. عندما تفشل الأقطاب الكهربائية على الاستجابة للتغيرات في تركيز أيون معين، أو الاستجابة مع استجابة الفرعية Nernstian (أي بشكل جيد أقل من 58 فولت لكل الفرق تركيز عشرة أضعاف)، فعالية سوء silanization هي عادة السبب. في تجربتنا، ويمكن أن يحدث هذا إذا رطوبة الجو مرتفعة جدا، أو منخفضة جدا، نموذجية من الشروط في ذروة فصل الصيف، أو الشتاء، على التوالي. إذا كان من الممكن لممارسة بعض السيطرة على غرفة الرطوبة، ويمكن التغلب على هذه المشاكل. المقاومة القطب مرتفعة جدا. إذا لزم الأمر، ومقاومة للبرميل حساسة أيون يمكن تخفيضه عن طريق شطف. تحقيقا لهذه الغاية، فضح طرفها لطائرة قوية من جلخ العالقة في الماء لبضع ثوان. وهذا سوف يسبب طرف أقصى درجات لكسر وانخفاض المقاومة إلى القيمة المطلوبة. الجسور الملح. ملحالجسور بين أيون والمرجعية برميل ينتج في أقطاب سيئة أو الاستجابة لا شيء، وبالتالي يمكن أيضا خلطا بين الأداء بشكل كبير في المعايرة. كما ذكر أعلاه (انظر النقطة 1.6.)، وهذا هو أساسا قضية عند اختيار مزدوجة الماسورة الزجاج ثيتا، بل هو نادر الحدوث عند استخدام الإزاحة، تقنية برميل الملتوية هو موضح هنا. مع سهولة تلفيق في الاعتبار، وتصميم مزدوج الماسورة الأصلي لوكس 29 كثيرا ما يمكن استخدام مربح. يستخدم هذا الأسلوب قبل ملء أيون والمرجعية برميل مع حلول الملح، والتعرض السريع إلى حل سيلاني عن طريق الشفط والطرد من طرف، وبعد بواسطة إدماج ايون مبادل، أيضا عن طريق طرف (انظر 30،31) . يمكن أن تكون ملفقة هذه الأقطاب في ما يقرب من 10 دقيقة، ولكن حجم غيض من عادة 4 ميكرون أو أكثر وتكون أكثر عرضة للفشل أثناء التجربة. في المقابل، طرق silanization التي تنطوي على التعرض لبخار سيلاني والحرارةجي يمكن أن تنتج الأقطاب مع نصائح الأصغر التي تستمر يوما، وأحيانا أسابيع. معا، وهناك العديد من بروتوكولات والنهج على كيفية إعداد الميكروية ايون انتقائية. هنا، التي وصفناها إجراءين الرئيسية لتصنيع الميكروية الماسورة المزدوج وكذلك متحدة المركز الملتوية التي تعمل بشكل جيد وموثوق بها في مختبراتنا، مع معدل النجاح العام ما يقرب من 100٪. الأهم من ذلك، فإن هذه التقنيات قابلة للتحويل إلى قياس أنواع الأيونات الأخرى، بما في ذلك درجة الحموضة أو الكالسيوم، وستكون تنطبق أيضا على الاستعدادات الأخرى من الدماغ، بما في ذلك تجاويف مملوءة بسائل أو السوائل بشكل عام. وأخيرا، وليس آخرا، الميكروية ايون انتقائية تسمح تحديد تركيزات الأيونات داخل الخلايا. بسبب حجمها نسبيا حجم غيض (~ 1 ميكرون)، هذه الإرادة، ومع ذلك، لن يكون ممكنا إلا في الخلايا مع خلايا الجسم كبير، على سبيل المثال مثل الموجودة في الاستعدادات اللافقارية 28،32.

An author's middle initial was omitted from the publication, <a href="http://www.jove.com/video/53058/double-barreled-concentric-microelectrodes-for-measurement">Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue</a>. The author&#39;s name has been updated to:
Christine R. Rose
from:
Christine Rose

A correction was made to Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue.

Erratum: Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue

Electrical signaling in the brain is based on the flux of ions across plasma membranes. Major ion movements into and from the extracellular space are not only mediated by passage through voltage-gated ion channels, but also by postsynaptic ionotropic receptors as well as ion transporters. Neuronal activity is thus accompanied by complex changes in the extracellular concentration of all major ions 1. For example, influx of sodium into neurons during excitatory activity has been shown to result in a decrease in the extracellular sodium concentration ([Na+]o) 2. The same holds true for the extracellular calcium concentration because calcium ions rapidly enter both pre- and postsynaptic structures 3. At the same time, potassium moves the opposite way and this mediates an increase in the extracellular potassium concentration ([K+]o) in the low mM range 4,5. Synaptic activity also causes changes in extracellular pH that are partly mitigated by concomitant glial membrane fluxes that change intraglial pH 6,7. These activity-related changes in extracellular ion concentrations have significant functional consequences. For example, even small increases in [K+]o depolarize neurons as well as glial cells thereby altering neuronal excitability, and several mechanisms exist to remove excess potassium 8. Failure of these may result in epileptiform activity of neurons or phenomena like spreading depression 1. 
Because of their critical importance, quantitative determination of extracellular ion concentrations is often necessary and required to understand the function and dysfunction of neural networks under physiological and pathophysiological conditions. For decades, double-barreled ion-selective microelectrodes have proven to be excellent tools for such measurements in brain tissue 9. For many ions, highly specific sensors with low cross-reactivity for other ions are available. In addition to the classical double-barreled electrodes, so-called concentric electrodes were recently introduced. The latter provide a superior time resolution, but take a little more time and effort to construct 10. 
In the following, we will describe the preparation and calibration of these two types of ion-selective microelectrodes. We then show how these electrodes can be employed in brain slice preparations for measurement of changes in [K+]o or [Na+]o induced by excitatory activity following different stimulation paradigms including bath and pressure application of drugs.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Abrasive&#160;&#160;</td>
			<td>MicroPolish&#160;</td>
			<td>Buehler GmbH</td>
			<td>Dissolved in A.dest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate-glass capillaries</td>
			<td>1405059</td>
			<td>Hilgenberg</td>
			<td>Application pipette; 75 mm x 2 mm, wall thickness 0.3 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries with filament</td>
			<td>GC 150 F-15&#160;</td>
			<td>Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus</td>
			<td>For the sensor of double-barreled microelectrodes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries with filament</td>
			<td>GC100-F-15</td>
			<td>Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus</td>
			<td>For the reference of double-barreled microelectrodes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries with filament</td>
			<td>GB-200TF-15&#160;</td>
			<td>Science Products</td>
			<td>Concentric, outer channel. o.d. 2.0 mm&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries with filament</td>
			<td>GB-120TF-10</td>
			<td>Science Products</td>
			<td>Concentric, inner channel. o.d. 1.2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata</td>
			<td>1322A</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrometer amplifier with headstage</td>
			<td></td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>Rin = 10T&#937; and Ibias=50fA-1pA (commercially available&#160; alternatives: e. g. Dagan IX2-700, with headstage (10 Gig feedback resistor) or EPMS-07, NPI, Tamm, Germany)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental chamber</td>
			<td></td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>Commercially available from e.g.&#160; Warner Instruments,USA;&#160; Scientifica, UK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Furnace</td>
			<td></td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>Must stay constant at 200&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hard sticky wax / dental wax&#160;</td>
			<td>Deiberit 502&#160;</td>
			<td>Siladent Dr. Boehme &#38; Schoeps GmbH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td></td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>Must stay constant at 40&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrodes holder made of plexiglas</td>
			<td></td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>Double-barreled: o.d.&#160; capillaries 1.5 mm, concentric: o.d.&#160; capillaries 2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td></td>
			<td>Leitz</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>MD4R</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>M205C</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Plan 0.8xLWD</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>Model PP-830</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>Concentric microelectrodes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td>Sutter Instruments&#160;</td>
			<td>Sensor of concentric microelectrodes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic drug ejection system</td>
			<td>Picospritzter Type II</td>
			<td>General Valve TM Corporation</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Travel dovetail stage</td>
			<td>DT 25/M</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-component glue</td>
			<td>&#160;Araldite</td>
			<td>Huntsman advanced materials GmbH</td>
			<td>One may also use a small stripe of aluminum foil to stick the capillaries together&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silverwire</td>
			<td>99.9%&#160;</td>
			<td>Wieland Edelmetalle</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slicer / Vibratome</td>
			<td>Microm HM 650 V</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td>AxoScope 8.1&#160;</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical puller&#160;</td>
			<td>Type PE-2</td>
			<td>Narishige Scientific Instruments</td>
			<td>With a revolvable chuck for&#160; double-barreled microelectrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>x/y translational stage</td>
			<td></td>
			<td>Custom-made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name of Compound</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1(S),9(R)-(&#8722;)-Bicuculline methiodide</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>14343</td>
			<td>Competitive antagonist of GABAA receptors (light-sensitive); CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNQX</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>C-127</td>
			<td>AMPA/kainate receptor antagonist; CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>D5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-AP5</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J64210</td>
			<td>NMDA receptor antagonist; CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldisilazane (HMDS)</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>440191</td>
			<td>CAUTION: Flammable, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) and corrosive to metals and skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic acid</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>A9256</td>
			<td>Activates NMDA and non-NMDA and EAATs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid monosodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>G1626</td>
			<td>Activates NMDA-R, AMPA-R, QA-R and KA-R),&#160; mGluRs and EAATs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium ionophore I - cocktail B</td>
			<td>Fluka&#160;</td>
			<td>60403</td>
			<td>Based on valinomycin; CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium ionophore II - cocktail A</td>
			<td>Fluka&#160;&#160;</td>
			<td>71178</td>
			<td>Based on ETH 157</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TTX</td>
			<td>Ascent Scientific</td>
			<td>Asc-055</td>
			<td>Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, ultra pure</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>W3500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

double-barreled and concentric microelectrodes for measurement of extracellular ion signals in brain tissue

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular concentration of all major ions. As these ion shifts bear significant functional consequences, their quantitative determination is often required to understand the function and dysfunction of neural networks under physiological and pathophysiological conditions. In the present study, we demonstrate the fabrication and calibration of double-barreled ion-selective microelectrodes, which have proven to be excellent tools for such measurements in brain tissue. Moreover, so-called &#8220;concentric&#8221; ion-selective microelectrodes are also described, which, based on their different design, offer a far better temporal resolution of fast ion changes. We then show how these electrodes can be employed in acute brain slice preparations of the mouse hippocampus. Using double-barreled, potassium-selective microelectrodes, changes in the extracellular potassium concentration ([K+]o) in response to exogenous application of glutamate receptor agonists or during epileptiform activity are demonstrated. Furthermore, we illustrate the response characteristics of sodium-sensitive, double-barreled and concentric electrodes and compare their detection of changes in the extracellular sodium concentration ([Na+]o) evoked by bath or pressure application of drugs. These measurements show that while response amplitudes are similar, the concentric sodium microelectrodes display a superior signal-to-noise ratio and response time as compared to the double-barreled design. Generally, the demonstrated procedures will be easily transferable to measurement of other ions species, including pH or calcium, and will also be applicable to other preparations.

<html> لرصد [K +] س والتغييرات التي تطرأ عليها ردا على نشاط مثير، تم إدخال مسرى مكروي والبوتاسيوم انتقائية مزدوجة الماسورة في المشععة طبقة من المنطقة CA1. بعد بضع دقائق التطويق، وصل برميل ايون انتقائية من القطب خط أساس مستقر (الشكل 7A)، المقابلة ل[K +] س من حوالي 2.8 ملم، قيمة قريبة من [K +] من ACSF المستخدمة ( 2.5 ملم). تطبيق حمام من 0.5 ملي الصوديوم لمدة 10 ثانية التي يسببها زيادة عكسها في [K +] س بنحو 4 ملم، تليها الرمية دون خط الأساس البالغة ~ 0.7 مم (الشكل 7A). خفض تركيز الصوديوم إلى 0.4، 0.3، 0.2 مم وتسبب انخفاض مماثل في السعة لكل من زيادة عابرة والرمية في [K +] س (الشكل 7A). OAD / 53058 / 53058fig7.jpg &quot;/&gt; الرقم 7. العابرين البوتاسيوم خارج الخلية ردا على نشاط مثير. (A) [K +] يا العابرين، وتتألف من زيادة يعقبه الرمية دون خط الأساس، الناجمة عن تطبيق حمام تركيزات مختلفة من الغلوتامات لمدة 10 ثانية كما هو مبين. (B) تأثير نضح مع حاصرات مستقبلات الغلوتامات (CNQX، و 100 ميكرومتر؛ APV، و 100 ميكرومتر) وسم الأسماك الرباعية الأسنان (TTX؛ 0.5 ميكرومتر) على [K +] س العابرين الناجمة عن تطبيق حمام من 0.5 ملي الصوديوم لمدة 10 ثانية. (C) العفوي [K +] س العابرين في وجود 0Mg 2+ / BIC. وأجريت التجارب هو مبين في AC باستخدام أقطاب كهربائية مزدوجة الماسورة. لأغراض التوضيح، وتلطيف آثار مع فلتر Sawitzky-غولي (عرض 20). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53058/53058fig7large.jpg" target="_blank">يرجى CL</a>إك هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. وقد أظهرت التجارب السابقة أن هذه الغلوتامات التي يسببها [K +] س الإشارات لم تغير بشكل ملحوظ خلال تطبيق TTX، وبالتالي فهي مستقلة إلى حد كبير على فتح قنوات الصوديوم الجهد بوابات وعمل الخلايا العصبية بتولد 15،16. لدراسة الآليات الكامنة وراء احظ [K +] س التغييرات استجابة لالغلوتامات، طبقنا حاصرات مستقبلات الغلوتامات، وهي CNQX (100 ميكرومتر، مانع مستقبلات أمبا) وAPV (100 ميكرومتر؛ مانع من المستقبلات NMDA) في وجود TTX (0.5 ميكرومتر). على حمام نضح مع هذه حاصرات، كانت الغلوتامات التي يسببها [K +] س التغييرات الملغاة تقريبا، مما يؤكد اعتمادهم على افتتاح ionotropic قنوات مستقبلات الغلوتامات كما ذكرت من قبل (على سبيل المثال 17؛ الشكل 7B). ولتوضيح رانه أهمية glutamatergic الإثارة لجيل من خارج الخلية [K +] إشارات، تم perfused شرائح مع اسميا المغنيسيوم 2+ المالحة خالية تحتوي على 10 ميكرومتر bicuculline methiodide (0Mg 2+ / BIC). هذا يخفف تعتمد على الجهد المغنيسيوم 2+ بلوك مستقبلات NMDA ويخفف من حدة تثبيط عن طريق منع GABA A المستقبلات، مما تسبب عفوية النشاط صرعي المتكررة في الشبكة (على سبيل المثال 18،19). كما هو متوقع 20، عفوية، والمتكررة [K +] س العابرين والبالغة نحو 1.5 ملي تم الكشف في 0Mg 2+ / BIC المالحة (الشكل 7C). في ما بين هذه الاستجابات، أصغر [K +] س العابرين مع اتساع متوسط ​​حوالي 0.2 ملي حدث (الشكل 7C). في المجموعة الثانية من التجارب، كنا [نا +] الميكروية -sensitive لتحديد [نا +] س التغييرات التي حركها تطبيقمنبهات الغلوتامات. هنا، ونحن أيضا مقارنة خصائص استجابة الميكروية مزدوجة الماسورة ومركزية توظيف اثنين من نماذج التطبيقات المختلفة. [نا +] تم وضع الميكروية -sensitive في المشععة طبقة على عمق حوالي 50 ميكرومتر. بعد أن حصل على خط الأساس مستقرة، تم تطبيق الغلوتامات ناهض L اسبارتاتي في نضح حمام (10 ملم، 120 ثانية، وحمام نضح في 2.5 مل / دقيقة). كما لوحظ في وقت سابق 21، تسبب تطبيق اسبارتاتي انخفاضا بطيئا في [نا +] س بنحو 15 ملم، والتي استمرت حوالي 5 دقائق وبعد ذلك بدأ لاسترداد العودة إلى خط الأساس (الشكل 8A). والجدير بالذكر، في حين أن سعة الذروة وحركية إشارات [نا +] س يحدده كل من الأقطاب الكهربائية متطابقة تقريبا في ظل هذه الظروف، أظهرت أقطاب متحدة خط أساس أكثر استقرارا وأقل مستوى الضوضاء (الشكل 8A). لاختبار ص<html> esponse خصائص الأقطاب المختلفة في إطار نموذج طلب أكثر سرعة، ونحن الغلوتامات الضغط المطبق من خلال ماصة الزجاج غرامة المتمركزة في المشععة الطبقة على مسافة 20-40 ميكرومتر من غيض من مسرى مكروي ايون انتقائية. كما هو متوقع 21، تسبب تطبيق الغلوتامات (10 ملم) 200 مللي قطرة في [نا +] س (الشكل 8B). كانت سعة ذروة [نا +] س انخفاض في نفس النطاق لكلا النوعين من الأقطاب الكهربائية (الماسورة المزدوج: 4،5 حتي 13،5 ملم، ن = 14؛ متحدة المركز: 2،0 حتي 19،1 ملم، ن = 15). ومع ذلك، وعلى النقيض من النتائج التي تم الحصول عليها مع بطء نضح حمام (انظر أعلاه)، فإن نسبة لا إشارة إلى الضوضاء، ولكن أيضا مدار الساعة من [نا +] س إشارات الكشف عنها من قبل هذين النوعين من الأقطاب الكهربائية تختلف بشكل كبير. وكان متوسط ​​الوقت لذروة 3.5 ثانية ليتجاوز 1.3 ثانية مزدوجة الماسورة وللالميكروية متحدة المركز. نظرائهم ve_content &quot;&gt; وهكذا، فإن هذه النتائج تثبت وتؤكد حركية استجابة أسرع للمتحدة المركز مقابل نا + الميكروية -selective مزدوجة الماسورة، (راجع الشكل 6C و8B)، كما لوحظ أيضا ل Ca 2+ ودرجة الحموضة انتقائية 10 وعلى النقيض من الدراسة السابقة، التي تم بها تنفيذ التحفيز متشابك القصير انفجر لاستحضار العابرين أيون بسرعة بفعل synaptically، لم يكن هناك سوى ميل، ولكن لا يوجد فرق كبير في سعة الذروة متوسط ​​بين أقطاب متحدة المركز ومزدوجة الماسورة مع تطبيقنا النموذج. وكان هذا ربما يرجع ذلك إلى حقيقة أن المسافة من ماصة التطبيق من غيض من مسرى مكروي ايون انتقائية تفاوتت من قبل عامل من اثنين (20-40 ميكرون)، وبالتالي، أن تركيز الصوديوم القصوى في المنطقة المستهدفة لم يكن هو نفسه في تجارب مختلفة، وعرقلة أي الفرق الموجودة في سعة الذروة. (A) الأعلى يتتبع: تغيير في فولتاجنرال الكتريك للبرميل المرجعية (V المرجع) من القطب مزدوجة الماسورة (تتبع منقط الأسود) والقطب متحدة المركز (تتبع الرمادي) في استجابة للتغيرات في الحمام نا + تركيز ([نا +] ب) كما هو مبين. لاحظ أن استجابات الجهد من كل من الأقطاب الكهربائية متطابقة تقريبا. آثار أسفل: التغيرات في التيار الكهربائي من نا + -potential (V + نا) من القطب مزدوجة الماسورة (تتبع الأسود) والقطب متحدة المركز (تتبع الرمادي) في استجابة للتغيرات في [نا +] ب. (B) قطع نصف لوغاريتمي من [نا +] ب مقابل V + نا من كل من الأقطاب الكهربائية. قطع خطية من البيانات تكشف عن المنحدر من حوالي 48 فولت لكل من الأقطاب الكهربائية. (C) الاستجابة للV نا + ل(تتبع الأسود) مزدوجة الماسورة والقطب متحدة المركز (تتبع الرمادي) إلى تغير سريع في [نا +] ب من 152 ملم إلى 70 ملم. لاحظ أن زمن الاستجابة من القطب متحدة بشكل ملحوظ فاسثالثا. لأغراض التوضيح، وتلطيف آثار مع فلتر Sawitzky-غولي (عرض 20). <img alt="الرقم 8" src="/files/ftp_upload/53058/53058fig8.jpg" /> الرقم 8: العابرين الصوديوم خارج الخلية كما الكشف عنها بواسطة أقطاب كهربائية مزدوجة الماسورة ومتحدة المركز. (A) تغيرات عابرة في V المرجع و[نا +] س الناجمة عن حمام نضح مع 10 ملي اسبارتاتي لمدة 120 ثانية كما يتبين من شريط. تظهر آثار العليا لتسجيل يؤديها مع القطب مزدوجة الماسورة، تم تسجيل انخفاض آثار استخدام القطب متحدة المركز. (B) التغييرات عابر في المرجع V و [نا +] س الناجمة عن تطبيق ضغوط محلية مع 10 ملي الغلوتامات عن 0.2 ثانية كما يتبين من رأس السهم. تظهر آثار العليا لتسجيل يؤديها مع القطب مزدوجة الماسورة، تم تسجيل انخفاض آثار استخدام القطب متحدة المركز.خطوط حمراء منقطة تمثل نوبات خطية من الفترة ما بين بداية الإشارة إلى الحد الأقصى. لاحظ أن زمن الاستجابة من القطب متحدة المركز هو أسرع بشكل ملحوظ تحت هذا الشرط. لأغراض التوضيح، وتلطيف آثار مع فلتر Sawitzky-غولي (عرض 20). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53058/53058fig8large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue at JoVE.com

Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue

We demonstrate the fabrication, calibration and properties of two types of ion-selective microelectrodes (double-barreled and concentric) for measurement of ion concentrations in brain tissue. These are then used in the mouse hippocampal slice preparation to show that excitatory activity changes both extracellular potassium and sodium concentrations.

الميكروية مزدوجة الماسورة والمركزة لقياس خارج الخلية ايون إشارات في أنسجة المخ

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular ...

double-barreled-concentric-microelectrodes-for-measurement

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.4K Views.  Heinrich Heine University Düsseldorf. We demonstrate the fabrication, calibration and properties of two types of ion-selective microelectrodes (double-barreled and concentric) for measurement of ion concentrations in brain tissue. These are then used in the mouse hippocampal slice preparation to show that excitatory activity changes both extracellular potassium and sodium concentrations. 

Video: Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments (dendrite, dendritic spine, axon, axon terminal, perikaryon), as well as their intracellular organelles and cytoskeleton, in the central nervous system at high spatial resolution. Combined with TEM, pre-embedding immunocytochemistry allows the discrimination of cellular elements with few distinctive features and identification criteria (e.g., microglial perikarya and processes, when using an antibody against the microglia-specific marker Iba1 (ionized calcium binding adaptor molecule 1; as presented here)), identifying the neurotransmitter contents of cellular elements (e.g., serotonergic) and their ultrastructural localization of soluble or membrane-bound proteins (e.g., 5 HT1A and EphA4 receptors). Here, we describe a protocol for transcardiac perfusion of mice with acrolein fixative, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase-diaminobenzidine (DAB) staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with TEM. When rigorously performed, this technique provides an excellent compromise between optimal ultrastructural preservation and immunocytochemical detection.

We describe a protocol for transcardiac perfusion of mice, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with transmission electron microscopy.

إعداد أنسجة المخ فأرة للالميكروسكوب Immunoelectron

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron microscope (FIB/SEM). The samples are fixed with aldehydes, heavy metal stained using osmium tetroxide and uranyl acetate. They are then dehydrated with alcohol and infiltrated with resin, which is then hardened. Using a light microscope and ultramicrotome with glass knives, a small block containing the region interest close to the surface is made. The block is then placed inside the FIB/SEM, and the ion beam used to roughly mill a vertical face along one side of the block, close to this region. Using backscattered electrons to image the underlying structures, a smaller face is then milled with a finer ion beam and the surface scrutinised more closely to determine the exact area of the face to be imaged and milled. The parameters of the microscope are then set so that the face is repeatedly milled and imaged so that serial images are collected through a volume of the block. The image stack will typically contain isotropic voxels with dimenions as small a 4 nm in each direction. This image quality in any imaging plane enables the user to analyse cell ultrastructure at any viewing angle within the image stack.

This protocol describes how resin embedded brain tissue can be prepared and imaged in the three dimensions in the focussed ion beam, scanning electron microscope.

ركزت شعاع ايون طحن والمجهر الإلكتروني لأنسجة الدماغ

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator of cell excitability. Altered concentrations of extracellular K+ affect the resting membrane potential and cellular excitability by shifting the equilibria between closed, open and inactivated states for voltage-dependent ion channels that underlie action potential initiation and conduction. Hence, it is valuable to directly measure extracellular K+ dynamics in health and diseased states. Here, we describe how to make, calibrate and use monopolar K+-selective microelectrodes. We deployed them in adult hippocampal brain slices to measure electrically evoked K+ concentration dynamics. The judicious use of such electrodes is an important part of the tool-kit needed to evaluate cellular and biophysical mechanisms that control extracellular K+ concentrations in the nervous system.

Potassium ions contribute&#160;to the resting membrane potential of cells and extracellular K+ concentration is a crucial regulator of cellular excitability. We describe how to make, calibrate and use monopolar K+-selective microelectrodes. Using such electrodes enables the measurement of electrically evoked K+ concentration dynamics in adult hippocampal slices.

صنع واختبار واستخدام البوتاسيوم أيون ميكروليكتروديس انتقائية في شرائح أنسجة الدماغ الكبار

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator ...

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The coordination of two Ca2+ signal sources&#8212;&#8220;Ca2+ influx&#8221; from outside the cell and &#8220;Ca2+ release&#8221; from the intracellular Ca2+ store endoplasmic reticulum (ER)&#8212;is considered to underlie the diverse spatio-temporal patterns of Ca2+ signals that cause multiple biological functions in cells. The purpose of this protocol is to describe a new Ca2+ imaging method that enables monitoring of the very moment of &#8220;Ca2+ influx&#8221; and &#8220;Ca2+ release&#8221;. OER-GCaMP6f is a genetically encoded Ca2+ indicator (GECI) comprising GCaMP6f, which is targeted to the ER outer membrane. OER-GCaMP6f can monitor Ca2+ release at a higher temporal resolution than conventional GCaMP6f. Combined with plasma membrane-targeted GECIs, the spatio-temporal Ca2+ signal pattern can be described at a subcellular resolution. The subcellular-targeted Ca2+ indicators described here are, in principle, available for all cell types, even for the in vivo imaging of Caenorhabditis elegans neurons. In this protocol, we introduce Ca2+ imaging in cells from cell lines, neurons, and glial cells in dissociated primary cultures, and describe the preparation of frozen stock of rat cortical neurons.

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Here we present a protocol for Ca2+ imaging in neurons and glial cells, which enables the dissection of Ca2+ signals at subcellular resolution. This process is applicable to all cell types that allow the expression of genetically encoded Ca2+ indicators.

تشريح المحلية Ca2 + الإشارات في الخلايا المستزرعة بالمؤشرات المستهدفة للغشاء Ca2 +

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The ...

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and study the distribution, tropism, and abundance of pathogens inside of organ tissues provides pivotal data on disease development and progression. Using conventional microscopy methods, immunolabeling is mostly restricted to thin sections obtained from paraffin-embedded or frozen samples. However, the limited 2D image plane of these thin sections may lead to the loss of crucial information on the complex structure of an infected organ and the cellular context of the infection. Modern multicolor, immunostaining-compatible tissue clearing techniques now provide a relatively fast and inexpensive way to study high-volume 3D image stacks of virus-infected organ tissue. By exposing the tissue to organic solvents, it becomes optically transparent. This matches the sample&#8217;s refractive indices and eventually leads to a significant reduction of light scattering. Thus, in combination with long free working distance objectives, large tissue sections up to 1 mm in size can be imaged by conventional confocal laser scanning microscopy (CLSM) at high resolution. Here, we describe a protocol to apply deep-tissue imaging after tissue clearing to visualize rabies virus distribution in infected brains in order to study topics like virus pathogenesis, spread, tropism, and neuroinvasion.

Novel, immunostaining-compatible tissue clearing techniques like the ultimate 3D imaging of solvent-cleared organs allow the 3D visualization of rabies virus brain infection and its complex cellular environment. Thick, antibody-labeled brain tissue slices are made optically transparent to increase imaging depth and to enable 3D analysis by confocal laser scanning microscopy.

التصوير ثلاثي الأبعاد عالي الدقة للعدوى بفيروس داء الكلب في أنسجة الدماغ التي تم تطهيرها من المذيبات

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...

Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). Therefore, detection of the presence of A&#946; in AD brain tissue is a valuable tool for developing new treatments to prevent the progression of AD. Several classical amyloid binding dyes, fluorochrome, imaging probes, and A&#946;-specific antibodies have been used to detect A&#946; histochemically in AD brain tissue. Use of these compounds for A&#946; detection is costly and time consuming. However, because of its intense fluorescent activity, high-affinity, and specificity for A&#946;, as well as structural similarities with traditional amyloid binding dyes, curcumin (Cur) is a promising candidate for labeling and imaging of A&#946; plaques in postmortem brain tissue. It is a natural polyphenol from the herb Curcuma longa. In the present study, Cur was used to histochemically label A&#946; plaques from both a genetic mouse model of 5x familial Alzheimer&#39;s disease (5xFAD) and from human AD tissue within a minute. The labeling capability of Cur was compared to conventional amyloid binding dyes, such as thioflavin-S (Thio-S), Congo red (CR), and Fluoro-jade C (FJC), as well as A&#946;-specific antibodies (6E10 and A11). We observed that Cur is the most inexpensive and quickest way to label and image A&#946; plaques when compared to these conventional dyes and is comparable to A&#946;-specific antibodies. In addition, Cur binds with most A&#946; species, such as oligomers and fibrils. Therefore, Cur could be used as the most cost-effective, simple, and quick fluorochrome detection agent for A&#946; plaques.

Curcumin is an ideal fluorophore for labeling and imaging of amyloid beta protein plaques in brain tissue due to its preferential binding to amyloid beta protein as well as its structural similarities with other traditional amyloid binding dyes. It can be used to label and image amyloid beta protein plaques more efficiently and inexpensively than traditional methods.

وضع العلامات والتصوير من لويحات اميلويد في انسجه المخ باستخدام الكركمين البوليفينول الطبيعية

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). ...

Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as well as the manifestation of severe brain disorders, including Alzheimer&#8217;s disease and epilepsy. The hippocampus receives a high degree of intra- and inter-connectivity, securing a proper communication with internal and external brain structures. This connectivity is accomplished via different informational flows in the form of fiber pathways. Brain slices are a frequently used methodology when exploring neurophysiological functions of the hippocampus. Hippocampal brain slices can be used for several different applications, including electrophysiological recordings, light microscopic measurements as well as several molecular biological and histochemical techniques. Therefore, brain slices represent an ideal model system to assess protein functions, to investigate pathophysiological processes involved in neurological disorders as well as for drug discovery purposes.
There exist several different ways of slice preparations. Brain slice preparations with a vibratome allow a better preservation of the tissue structure and guarantee a sufficient oxygen supply during slicing, which present advantages over the traditional use of a tissue chopper. Moreover, different cutting planes can be applied for vibratome brain slice preparations. Here, a detailed protocol for a successful preparation of vibratome-cut horizontal hippocampal slices of mouse brains is provided. In contrast to other slice preparations, horizontal slicing allows to keep the fibers of the hippocampal input path (perforant path) in a fully intact state within a slice, which facilitates the investigation of entorhinal-hippocampal interactions. Here, we provide a thorough protocol for the dissection, extraction, and acute horizontal slicing of the murine brain, and discuss challenges and potential pitfalls of this technique. Finally, we will show some examples for the use of brain slices in further applications.

This article aims to describe a systematic protocol to obtain horizontal hippocampal brain slices in mice. The objective of this methodology is to preserve the integrity of hippocampal fiber pathways, such as the perforant path and the mossy fiber tract to assess dentate gyrus related neurological processes.

شرائح فرس النهر الأفقية من دماغ الفأر

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered tissue samples. Traditional immunolabeling procedures require cutting the sample into thin sections, which restricts the ability to label and examine intact structures. However, if brain tissue can remain intact during processing, structures and circuits can remain intact for the analysis. Previously established clearing methods take significant time to completely clear the tissue, and the harsh chemicals can often damage sensitive antibodies. The iDISCO method quickly and completely clears tissue, is compatible with many antibodies, and requires no special lab equipment. This technique was initially validated for the use in mice tissue, but the current protocol adapts this method to image hemispheres of control and transgenic rat brains. In addition to this, the present protocol also makes several adjustments to preexisting protocol to provide clearer images with less background staining. Antibodies for Iba-1 and tyrosine hydroxylase were validated in the HIV-1 transgenic rat and in F344/N control rats using the present hydrophobic tissue clearing method. The brain is an interwoven network, where structures work together more often than separately of one another. Analyzing the brain as a whole system as opposed to a combination of individual pieces is the greatest benefit of this whole brain clearing method.

Here we present a hydrophobic tissue clearing method that allows for the viewing of target molecules as part of intact brain structures. This technique has now been validated for F344/N control and HIV-1 transgenic rats of both sexes.

طريقة إزالة الأنسجة الكارهة للماء لأنسجة دماغ الفئران

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

A Plate-Based Assay for the Measurement of Endogenous Monoamine Release in Acute Brain Slices

Monoamine neurotransmitters are associated with numerous neurologic and psychiatric ailments. Animal models of such conditions have shown alterations in monoamine neurotransmitter release and uptake dynamics. Technically complex methods such as electrophysiology, Fast Scan Cyclic Voltammetry (FSCV), imaging, in vivo&#160;microdialysis, optogenetics, or use of radioactivity are required to study monoamine function. The method presented here is an optimized two-step approach for detecting monoamine release in acute brain slices using a 48-well plate containing tissue holders for examining monoamine release, and high-performance liquid chromatography coupled with electrochemical detection (HPLC-ECD) for monoamine release measurement. Briefly, rat brain sections containing regions of interest, including prefrontal cortex, hippocampus, and dorsal striatum were obtained using a tissue slicer or vibratome. These regions of interest were dissected from the whole brain and incubated in an oxygenated physiological buffer. Viability was examined throughout the experimental time course, by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay. The acutely dissected brain regions were incubated in varying drug conditions that are known to induce monoamine release through the transporter (amphetamine) or through the activation of exocytotic vesicular release (KCl). After incubation, the released products in the supernatant were collected and analyzed through an HPLC-ECD system. Here, basal monoamine release is detected by HPLC from acute brain slices. This data supports previous in vivo and in vitro results showing that AMPH and KCl induce monoamine release. This method is particularly useful for studying mechanisms associated with monoamine transporter-dependent release and provides an opportunity to screen compounds affecting monoamine release in a rapid and low-cost manner.

This method introduces a simple technique for the detection of endogenous monoamine release using acute brain slices. The setup uses a 48-well plate containing a tissue holder for monoamine release. Released monoamine is analyzed by HPLC coupled with electrochemical detection. Additionally, this technique provides a screening method for drug discovery.

A المقايسة المستندة إلى لوحة لقياس إطلاق مونوامين الذاتية في شرائح الدماغ الحادة

Monoamine neurotransmitters are associated with numerous neurologic and psychiatric ailments. Animal models of such conditions have shown alterations in ...

Measurement of the Directional Information Flow in fNIRS-Hyperscanning Data using the Partial Wavelet Transform Coherence Method

Social interaction is of vital importance for human beings. While the hyperscanning approach has been extensively used to study interpersonal neural synchronization (INS) during social interactions, functional near-infrared spectroscopy (fNIRS) is one of the most popular techniques for hyperscanning naturalistic social interactions because of its relatively high spatial resolution, sound anatomical localization, and exceptionally high tolerance of motion artifacts. Previous fNIRS-based hyperscanning studies usually calculate a time-lagged INS using wavelet transform coherence (WTC) to describe the direction and temporal pattern of information flow between individuals. However, the results of this method might be confounded by the autocorrelation effect of the fNIRS signal of each individual. For addressing this issue, a method termed partial wavelet transform coherence (pWTC) was introduced, which aimed to remove the autocorrelation effect and maintain the high temporal-spectrum resolution of the fNIRS signal. In this study, a simulation experiment was performed first to show the effectiveness of the pWTC in removing the impact of autocorrelation on INS. Then, step-by-step guidance was offered on the operation of the pWTC based on the fNIRS dataset from a social interaction experiment. Additionally, a comparison between the pWTC method and the traditional WTC method and that between the pWTC method and the Granger causality (GC) method was drawn. The results showed that pWTC could be used to determine the INS difference between different experimental conditions and INS's directional and temporal pattern between individuals during naturalistic social interactions. Moreover, it provides better temporal and frequency resolution than the traditional WTC and better flexibility than the GC method. Thus, pWTC is a strong candidate for inferring the direction and temporal pattern of information flow between individuals during naturalistic social interactions.

This protocol describes partial wavelet transform coherence (pWTC) for calculating the time-lagged pattern of interpersonal neural synchronization (INS) to infer the direction and temporal pattern of information flow during social interaction. The effectiveness of pWTC in removing the confounds of signal autocorrelation on INS was proved by two experiments.

قياس تدفق المعلومات الاتجاهية في بيانات fNIRS-hyperscanning باستخدام طريقة تماسك تحويل المويجات الجزئية

Social interaction is of vital importance for human beings. While the hyperscanning approach has been extensively used to study interpersonal neural ...