الكتاب أشكر العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (NSERC) لتمويل هذا العمل.

1. إعداد وسائل الإعلام والثقافات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لLB + الأمبير: إعداد 500 مل من لوريا، Bertani مرق (LB) تعقيمها باستخدام الأوتوكلاف في درجة حرارة 121 مئوية لمدة 30 دقيقة. الملحق مع الأمبيسلين لتسفر عن تركيز النهائي من 100 ميكروغرام / مل من الأمبيسلين وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى المطلوبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمكافحة السل + الأمبير: الاستعداد لكبيرة (500 مل أو أكثر) مجلدا من ministring الإنتاج. إعداد 600 مل من معقم رائع مرق (السل) تعقيمها باستخدام الأوتوكلاف في درجة حرارة 121 مئوية لمدة 30 دقيقة. الملحق مع الأمبيسلين لتسفر عن تركيز النهائي من 100 ميكروغرام / مل من الأمبيسلين وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى المطلوبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للآجار LB + الأمبير: إعداد عقيمة لوحات أجار LB من خلال إعداد LB + الأمبير تستكمل مع 15 غرام / لتر من أجار. قسامة ما يقرب من 15-20 مل في أطباق بتري معقمة وتخزين رأسا على عقب في 4 درجات مئوية حتى المطلوبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد لوحة مسحة من W3NN [PDMS] من تسليط الضوء على جو معقم و مطهر W3NN [PDMS] الخلايا على آجار LB + الأمبير. احتضان overni لوحةGHT عند 30 درجة مئوية، حتى المستعمرات واحد يمكن ملاحظتها. لا احتضان W3NN فوق هذا درجة الحرارة لتجنب derepressing التعبير protelomerase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل جو معقم و مطهر 5 مل من LB + الأمبير في أنبوب اختبار معقمة. إعداد الثقافة بين عشية وضحاها من W3NN [PDMS]، فحقن هذا الحجم مع مستعمرة واحدة من لوحة متتالية. احتضان بين عشية وضحاها الثقافة في 30 درجة مئوية في شاكر في 230-250 دورة في الدقيقة. </li></ol> 2. مرحلة النمو <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جو معقم و مطهر نقل 10 مل من LB + الأمبير إلى العقيمة 125 مل دورق مخروطي وتطعيم مع 100 ميكرولتر من ثقافة W3NN [PDMS] بين عشية وضحاها إلى استعداد LB + الأمبير، مما يجعل التخفيف 1: 100. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكميات أكبر، إضافة 500 ميكرولتر من الثقافة بين عشية وضحاها إلى 50 مل من السل + الأمبير في 250 مل دورق مخروطي، بدلا من LB + الأمبير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدلا من ذلك، كما استخدم ثقافة الثانية &quot;تمثيلية&quot; في الخطوة 2.2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان في حاضنة تهتز عند 30 درجة مئوية و 250 دورة في الدقيقة حتى طريق مسدودالبنية يصل المتوسط ​​إلى مرحلة سجل في وقت متأخر، والتي تحمل الكثافة الضوئية (OD) أو الامتصاصية: 600 = 0.8. بعد 1-2 ساعة، وينبغي أن تبدأ على المدى المتوسط ​​وتظهر عكر للعين المجردة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل جو معقم و مطهر 1 مل من ثقافة إلى كوفيت معمل نظيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس الامتصاصية خفيفة باستخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية تجاه مع الطول الموجي لتعيين 600 نانومتر. استخدام 1 مل من وسائل الاعلام التي كانت تزرع الخلايا لتعيين فارغة (LB أو السل). اختياريا، استخدم الثقافة تمثيلية من الخطوة 2.1.3 لهذه الخطوة بدلا من ذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كانت الثقافة لم تصل بعد إلى OD المناسب، والعودة إلى شاكر والتحقق مرة أخرى مرة واحدة كل نصف ساعة. تحقق من OD أكثر كثيرا ما تقترب من 600 0.8. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وبمجرد أن الثقافة قد وصلت مرحلة سجل في وقت متأخر، وأشار أ 600 = 0.8، جو معقم و مطهر نقل الثقافة إلى العقيمة 50 مل أنابيب الطرد المركزي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي الثقافة في 10000 x ج لمدة 10 دقيقة. تفقد لبيllet في الجزء السفلي من الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب طاف مسح في وعاء النفايات واقية مناسبة. لا تعكر صفو بيليه الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 2،4-2،5 حتى يتم جمع كل الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق بيليه في 100 ميكرولتر LB + الأمبير. نضح باستخدام micropipette أو استخدام خلاط دوامة. لزيادة الإنتاج ministring، وإعادة تعليق بيليه من 50 مل السل + ثقافة الأمبير إلى 1 مل من الطازجة وسائل الإعلام LB + الأمبير. </li></ol> 3. Ministring الإنتاج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جو معقم و مطهر إضافة 20 مل من LB + الأمبير في 125 مل دورق مخروطي والحرارة إلى 42 درجة مئوية. لزيادة الإنتاج ministring، وإعداد 500 مل من LB + الأمبير، مسخن الى 42 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل إعادة تعليق في المتوسط ​​مسخن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند 42 درجة مئوية و 250 دورة في الدقيقة حتى مرحلة السجل الماضية، وأشار أ 600 = 1.0. لا تترك 20 مل من ثقافة في 42 درجة مئوية الماضي 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خفض درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية، وترك الثقافة لعديtional 90 دقيقة. 500 مل، وترك الثقافة لفترة تحريض إضافية من 90-120 دقيقة ولا يقلل من درجة الحرارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خفض درجة الحرارة إلى 30 درجة مئوية، وترك الثقافة اهتزاز في 200 دورة في الدقيقة لمدة درجات الحرارة بالاستعداد إضافية من 2 ساعة. 500 مل، تمديد بالاستعداد درجة الحرارة إلى 4 ساعات أو طوال الليل. </li></ol> 4. حصاد Ministrings <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جو معقم و مطهر نقل الثقافة إلى العقيمة 50 مل أنابيب الطرد المركزي. أجهزة الطرد المركزي في 10000 x ج لمدة 10 دقيقة وتفتيش لبيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب طاف في حاوية نفايات بيولوجية المناسبة من دون إزعاج بيليه. كرر حتى تم جمع كل الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإبقاء على بيليه لاستخراج البلازميد مع أي الاستخراج التجاري والذيفان الداخلي عدة إزالة أو تجميد فلاش في النيتروجين السائل وتخزينه في -80 درجة مئوية لمدة استخراج لاحق. </li></ol>

<ol>
	<li>Klinman, D. M., Ylt, A. K., Beaucaget, S. L., Conover, J., Kriegt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CpG+motifs+present+in+bacterial+DNA+rapidly+induce+lymphocytes+to+secrete+interleukin+6,+interleukin+12,+and+interferon+&#947;.">CpG motifs present in bacterial DNA rapidly induce lymphocytes to secrete interleukin 6, interleukin 12, and interferon &#947;.</a> Proc Natl Acad Sci. 93, 2879-2883 (1996).</li><li>Hodges, B. L., Taylor, K. M., Joseph, M. F., Bourgeois, S. A., Scheule, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+transgene+expression+from+plasmid+DNA+gene+therapy+vectors+is+negatively+affected+by+CpG+dinucleotides.">Long-term transgene expression from plasmid DNA gene therapy vectors is negatively affected by CpG dinucleotides.</a> Mol Ther. 10 (2), 269-278 (2004).</li><li>Darquet, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minicircle:+an+improved+DNA+molecule+for+in+vitro+and+in+vivo+gene+transfer.">Minicircle: an improved DNA molecule for in vitro and in vivo gene transfer.</a> Gene Ther. 6 (2), 209-218 (1999).</li><li>Gracey Maniar, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minicircle+DNA+vectors+achieve+sustained+expression+reflected+by+active+chromatin+and+transcriptional+level.">Minicircle DNA vectors achieve sustained expression reflected by active chromatin and transcriptional level.</a> Mol Ther. 21 (1), 131-138 (2012).</li><li>Catanese, D. J., Fogg, J. M., Ii, D. E. S., Gilbert, B. E., Zechiedrich, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supercoiled+minivector+DNA+resists+shear+forces+associated+with+gene+therapy+delivery.">Supercoiled minivector DNA resists shear forces associated with gene therapy delivery.</a> Gene Ther. 19 (1), 94-100 (2011).</li><li>Hacein-bey-abina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+oncogenesis+in+4+patients+after+retrovirus-mediated+gene+therapy+of+SCID-X1.">Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1.</a> J Clin Invest. 118 (9), 3132-3142 (2008).</li><li>Nafissi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+ministrings:+highly+safe+and+effective+gene+delivery+vectors.">DNA ministrings: highly safe and effective gene delivery vectors.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 3 (April), (2014).</li><li>Schakowski, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+minimal-size+vector+(MIDGE)+improves+transgene+expression+in+colon+carcinoma+cells+and+avoids+transfection+of+undesired+DNA.">A novel minimal-size vector (MIDGE) improves transgene expression in colon carcinoma cells and avoids transfection of undesired DNA.</a> Mol Ther. 3 (5 Pt 1), 793-800 (2001).</li><li>Wang, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+micro-linear+vector+for+in+vitro+and+in+vivo+gene+delivery+and+its+application+for+EBV+positive+tumors.">A novel micro-linear vector for in vitro and in vivo gene delivery and its application for EBV positive tumors.</a> PLoS One. 7 (10), (2012).</li><li>L&#243;pez-Fuertes, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+vaccination+with+linear+minimalistic+(MIDGE)+vectors+confers+protection+against+Leishmania+major+infection+in+mice.">DNA vaccination with linear minimalistic (MIDGE) vectors confers protection against Leishmania major infection in mice.</a> Vaccine. 21 (3-4), 247-257 (2002).</li><li>Schakowski, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+size+MIDGE+vectors+improve+transgene+expression+in+vivo.">Minimal size MIDGE vectors improve transgene expression in vivo.</a> In Vivo. 21 (1), 17-23 (2007).</li><li>Hertwig, S., Klein, I., Lurz, R., Lanka, E., Appel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PY54,+a+linear+plasmid+prophage+of+Yersinia+enterocolitica+with+covalently+closed+ends.">PY54, a linear plasmid prophage of Yersinia enterocolitica with covalently closed ends.</a> Mol Microbiol. 48, 989-1003 (2003).</li><li>Nafissi, N., Slavcev, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+an+in-vivo+linear+covalently+closed+DNA+vector+production+system.">Construction and characterization of an in-vivo linear covalently closed DNA vector production system.</a> Microb Cell Fact. 11 (1), 154 (2012).</li><li>Xu, Z. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+transcriptional+regulatory+elements+for+constructing+plasmid+vectors.">Optimization of transcriptional regulatory elements for constructing plasmid vectors.</a> Gene. 272 (1-2), 149-156 (2001).</li><li>Hoffmann, F., Rinas, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+induced+by+recombinant+protein+production+in+Escherichia+coli.">Stress induced by recombinant protein production in Escherichia coli.</a> Adv Biochem Eng Biotechnol. 89, 73-92 (2004).</li><li>Sum, C., Chong, J. Y., Wettig, S., Slavcev, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+and+purification+of+linear+covalently+closed+deoxyribonucleic+acid+by+Q-anion+exchange+membrane+chromatography.">Separation and purification of linear covalently closed deoxyribonucleic acid by Q-anion exchange membrane chromatography.</a> J Chromatogr A. 1339, 214-218 (2014).</li><li>Hoffmann, F., Rinas, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid+amplification+in+Escherichia+coli+after+temperature+upshift+is+impaired+by+induction+of+recombinant+protein+synthesis.">Plasmid amplification in Escherichia coli after temperature upshift is impaired by induction of recombinant protein synthesis.</a> Biotechnol Lett. 23, 1819-1825 (2001).</li><li>Nafissi, N., Sum, C. H., Wettig, S., Slavcev, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+one-step+heat-inducible+in+vivo+mini+DNA+vector+production+system.">Optimization of a one-step heat-inducible in vivo mini DNA vector production system.</a> PLoS One. 9 (2), (2014).</li></ol>

الكتاب تعلن أنها لا تملك المصالح المالية المتنافسة.

نحن هنا وصف نظام بسيط لإنتاج ministrings LCC الحمض النووي باستخدام بروتوكول للحرارة محرض خطوة واحدة، والذي لا يتطلب أي معدات خاصة ما عدا ذلك الذي يستخدم في نمو البكتيريا نموذجي والتلاعب. ministrings الحمض النووي هي خالية من التواء، مستقرة خطية أشرطة التعبير الحمض النووي، وتخلو من العناصر الوراثية بدائية النواة. أنها يمكن أن تستخدم بدلا من الطرق التقليدية لنقل الجين، التعبير عن الجينات المراسل، وكذلك في تقييم نحو كفاءة التعبير التحوير في أنظمة حقيقية النواة. ministrings الحمض النووي الجمع بين توافق مع الحياة وزيادة الفوائد كفاءة ترنسفكأيشن ناقلات &quot;مصغرة&quot; مع الشخصية سلامة متفوقة من ناقلات الحمض النووي الخطية. لدينا قوية خطوة واحدة في منصة إنتاج الجسم الحي بسرعة وسهولة تنتج ministrings الحمض النووي لتطبيق أي نقل الجينات من دون الحاجة إلى عمليات مكلفة متعددة في المختبر. هناك العديد من الخطوات الهامة لضمان أفضل إنتاج ministring (الشكلان 2 و 3). الحث الحراري هو الخطوة الأكثر أهمية لministring الإنتاج. انعدام تام للministring الإنتاج على الأرجح بسبب عدم وجود تحريض الحرارة (خلايا الاحتفاظ بدرجة حرارة 30 درجة مئوية)، حيث قمع التعبير protelomerase يمنع تحويل البلازميد تمهيدا لministring LCC. بعد بروتوكول تحريض الحرارة، ونتوقع كفاءة إنتاج ما يقرب من 75٪. الحث الحراري هو الأمثل في حين أن الخلايا هي في مرحلة السجل. على الرغم من عدم وجود فروق ذات دلالة إحصائية في ministring PE عند استخدام الخلايا في مرحلة ثابتة ( &quot;شديد النمو&quot;، الشكل 3)، ونحن لم نلاحظ تقريبا انخفاضا بنسبة 50٪ في العائد البلازميد بشكل عام. سيعتمد العائد على بروتوكول استخراج البلازميد المستخدمة. لإنتاج ministring الأمثل، وتحريك الاستقراء الحرارة في حين أن الخلايا هي في مرحلة السجل. سوف إنتاج ministring الفقراء من المرجح أن تكون نتيجة لupshift درجات الحرارة لفترات طويلة أو insufficieالإقليم الشمالي درجة الحرارة بالاستعداد. وتثبيط لفترات طويلة upshift درجة الحرارة لأن ذلك ينشط E. القولونية استجابة الصدمة الحرارية 15، والتي قد تمنع النشاط protelomerase وتتداخل مع استقرار البلازميد. لذلك، توقيت بالاستعداد درجة الحرارة هو خطوة حاسمة أخرى لإنتاج ministring كفاءة. بدون فترة حضانة إضافية عند 30 درجة مئوية، ووجد ministring كفاءة الإنتاج لتكون فقيرة جدا ( &quot;إزالة المبكرة&quot;، الشكل 3). ويمكن أن يعزى ذلك إلى مقدار الوقت اللازم للتعبير أبيب والنشاط. وتنشأ طليعة العاثية ترميز PY54 أبيب protelomerase يصيب عادة يرسينيا، التي تنمو على النحو الأمثل حوالي 28 درجة مئوية 12، مشيرا إلى أن 30 ° C قد يكون أيضا أكثر الأمثل للنشاط أبيب. نظام الإنتاج الحمض النووي minivector يستخدم منصة في الجسم الحي لتوليد عالية الجودة بكتيريا minivectors الحمض النووي خالية من التسلسل. تعديلات على البروتوكول واسمحوا ليNCLUDE تغيير وسائط النمو لتحسين البلازميد وإنتاج البروتين من أجل تعزيز نمو الخلايا خلال مرحلة النمو (السل بدلا من LB)، أو زيادة ministring إنتاج وتحويل الكفاءة. لكميات أكبر ثقافة (200 مل وأكبر)، بالاستعداد درجة الحرارة والحضانة عند 30 درجة مئوية ويجوز تمديدها ليلة وضحاها دون تأثير سلبي شديد على ministring PE. لقد قمنا بإدراج التعديلات في بروتوكول لدينا 500 مل الثقافات كمثال على ذلك. تنقية ministrings الحمض النووي يمكن التعجيل من خلال المختبر في نوكلياز داخلية الهضم من العمود الفقري في بدائيات النواة. وهناك عدد من المواقع المستهدفة نوكلياز داخلية (على سبيل المثال، PI-SCEI، PvuI، SCAI) متاح في العمود الفقري في بدائيات النواة من البلازميد السلائف، والتي يمكن أن تقطع لفضح خطية مفتوحة تنتهي، والسماح لفي المختبر تدهور العمود الفقري في بدائيات النواة. عزل ministrings من الأنواع ناقلات أخرى يمكن أيضا أن يتحقق من خلال تبادل أنيون غشاء اللوني 16. واحد الحد الحالي يرتبط مع نظام الإنتاج ناقلات LCC الحمض النووي هو الحاجة إلى تنقية ministring الحمض النووي من غيرها LCC ومجلس التعاون الجمركي المنتجات. على الرغم من أن تنقية بسهولة باستخدام أساليب البلازميد العزلة القياسية، يمكن للخطوة العزلة لا يزال وضع غير مؤات في إعداد نطاق واسع. فصل ministring يمكن أن يكون استخدام AGE إذا كان ministring والعمود الفقري في بدائيات النواة LCC متشابهة جدا في حجم تستغرق وقتا طويلا. بدلا من ذلك، يمكن أن توفر أنيون تبادل غشاء اللوني الفصل أفضل من ministrings من الأنواع ناقلات CCC 16. درجة الحرارة upshift يمكن أن يكون الحد محتمل آخر، لأن درجات الحرارة العالية أيضا تفعيل استجابة الصدمة الحرارية في E. القولونية، مما يؤثر سلبا على البروتين المؤتلف ينتج 17 وبالتالي خفض معدلات البلازميد إلى ministring التحويل. نفيدكم مكان آخر أمثل من منصة الإنتاج للتحايل و / أو تخفيف هذه الآثار من الصدمة الحرارية 18. نحنكما الأمثل حاليا طرق للقضاء أو الحد من التلوث LCC العمود الفقري في بدائيات النواة في الجسم الحي. التكامل الكروموسومات من ministring LCC الحمض النووي يعطل كروموسوم المضيفة ويخضع الخلية إلى موت الخلايا المبرمج. وهذا لا يقلل الآثار السلبية المحتملة من الطفرات إقحامي مثل تكون الورم وإسكات الجينات المجاورة، وبالتالي تحسين سلامتها. تأثير مميت ويمكن أيضا أن تكون بمثابة وسيلة مثالية للطرق في ودراسات استبدال الجينات من دون آثار جانبية مصاحبة والضرر من التكامل. ويمكن تطبيق ناقلات الحمض النووي ministring من أجل نقل والتعبير عن جينات البروتينات العلاجية، RNA، والأجسام المضادة، أو المستضدات إلى هدف معين في الجسم الحي أو محل الأليل وظيفية شر أو غير. يسمح للخطوة واحدة للحرارة محرض في الجسم الحي نظام الإنتاج بسيط ناقلات الحمض النووي ministring إلى أن تنتج بسهولة لتطبيقات سريرية أو الصناعية.

والهدف هو انتاج كميات قابلة للخطية مغلقة تساهمي minivectors (LCC) الحمض النووي باستخدام كفاءة بسيطة وعالية من خطوة واحدة في الجسم الحي DNA نظام الإنتاج ministring للحرارة محرض. توفير ministrings DNA استراتيجية آمنة وفعالة غير الفيروسية لإيصال الحمض النووي. فهي تجمع بين سلامة ناقلات LCC مع كفاءة minicircles الحمض النووي، وأيضا توفر بديلا آمنا للناقلات المشتقة من الفيروس دون المساس كفاءة ترنسفكأيشن. من أجل نظام تسليم التحوير لتكون ناجحة، يجب على ناقلات الحمض النووي يدخل الخلية المضيفة الهدف والتعبير عن التحوير المشفرة (ق). وهناك العديد من الحواجز الخلوية التي يجب التغلب عليها في الممارسة العملية، لا سيما في أنظمة الثدييات. من أجل تجنب تدهور التي كتبها nucleases المصل وكشف المناعي عن طريق الجهاز الشبكي البطاني، يجب أن يكون ناقلات الحمض النووي الحيوية والمناعة متوافق مع النظام المستهدف. يتم هضم الحمض النووي دون وقاية بسرعة nucleases البلازماويتكون الغشاء البلازميد الحواجز البروتين الدهني كثيفة جدا ناقلات الحمض النووي يجب أن تكون قادرة على عبور بسرعة غشاء البلازما من الخلايا المستهدفة. مرة واحدة في الخلية، ويجب أن ناقلات اجتياز السيتوبلازم وتمر عبر الغشاء النووي لدخول نواة للتعبير عن التحوير. وتركز تقنيات توصيل الجينات غير الفيروسية على تعزيز نسيجيا وخلية استهداف. ومع ذلك، فإن استخدام البلازميدات التقليدية مع هذه التقنيات يقلل من كفاءة ترنسفكأيشن بسبب وجود تسلسل البكتيرية المناعية، التي تسكت بسرعة التعبير الجيني 1،2. البلازميدات التقليدية عادة ما تحمل الجينات المقاومة للمضادات الحيوية للصيانة في أنظمة بدائية النواة. ومع ذلك، هذه قد تنتج الآثار الضارة المحتملة في المضيف البشري أو نقلها مقاومة طبيعيا النباتات المضيفة عن طريق اثار نقل الجينات الأفقي. تحتوي على البلازميدات التقليدية أيضا ثنائي النوكليوتيد الدليل السياسي الشامل الزخارف 2، والتي يمكن أن تؤدي إلى استجابة يمونوستيمولاتوري غير المرغوب فيها، ويحتملخفض أو إسكات التعبير التحوير. كما تتألف بشكل حصري من الكاسيت التعبير حقيقية النواة، minivectors الحمض النووي، مثل minicircles الحمض النووي 3، هي البديل الأفضل لتوصيل الجينات كما أنها تظهر تحسين التوافر البيولوجي خارج الخلية والخلايا وتحسين التعبير الجيني نظرا لانخفاض حجمها وغياب عناصر بدائية يمونوستيمولاتوري 4. انخفاض حجم فارس متجه نحو أفضل فيما يتعلق مقاومة قوى القص المرتبطة في إدارة الجسم الحي إلى موقع الهدف 5. عدد نسخة أعلى من ناقلات لكل وحدة كتلة يتطلب أقل ترنسفكأيشن الكاشف، وبالتالي تقليل سمية. ومع ذلك، في حالة من التكامل ناقلات عشوائي في الكروموسوم المضيف، دائري تساهميا مغلقة (CCC) ناقلات، بما في ذلك minicircles الحمض النووي والبلازميدات التقليدية ونقلها استمرارية الجزيئية، وبالتالي قد تؤدي إلى الطفرات إقحامي، والتي يمكن أن يكون لها عواقب وخيمة <sتصل&gt; 6. نسبيا، والتكامل من ناقلات الحمض النووي الخطي يعطل كروموسوم ويبدأ مسارات موت الخلايا، مما يزيل خلايا متحولة من السكان الخلايا المتكاثرة ومنع الطفرات إقحامي 7. أضيق الحدود ناقلات الجينات المحددة مناعيا (ذبابة) 8 وناقلات الصغيرة الخطي 9 (MiLV) هي ناقلات LCC الحمض النووي وضعت في المختبر. وقد عرضت ناقلات ذبابة تصل إلى 17 أضعاف تحسن التعبير التحوير في الجسم الحي مقارنة ب DNA البلازميد التقليدية ناقلات 11، وأظهرت نتائج واعدة في لقاح 10 و السرطان 8 العلاج الجيني. وبالإضافة إلى ذلك، نظرا لهيكل خالية من التواء من minivector LCC، مطلوب أقل كاشف ترنسفكأيشن بالمقارنة مع CCC supercoiled نظيره، وبالتالي تقليل سمية 7. وقد أثبتت لنا تعزيز ناقلات LCC الحمض النووي، ministrings الحمض النووي، والكفاءة العالية والتعبير bioavaiتقلقل 7. وعلاوة على ذلك، يتم إنتاج ministrings الحمض النووي على المجراة نظام الإنتاج للحرارة محرض خطوة واحدة، وهو البديل المناسب وفعالة من حيث التكلفة لذبابة وMiLV LCC ناقلات، والتي تتطلب خطوات متعددة في المختبر. نظام الإنتاج ministring الحمض النووي ليكون أظهر هو عملية للحرارة محرض بسيطة أجريت في الجسم الحي، مما يجعلها على حد سواء فعالة من حيث التكلفة وقابلة للتطوير بسهولة. يستغل هذا النظام يرسينيا القولون عاثية المستمدة PY54 أبيب / بال protelomerase نظام إعادة التركيب 12 لفصل الحد الأدنى من حقيقيات النوى كاسيت التعبير من العمود الفقري البلازميد في بدائيات النواة. لقد المهندسة الإشريكية القولونية الخلايا (W3NN) للتعبير عن أبيب protelomerase تحت سيطرة للحرارة محرض الجراثيم λ المروج، CI [تس] 857 13. على التعبير، تل protelomerase يعمل على مواقع بال الهدف موجودة داخل مواقع تقع على البلازميد السلائف &quot;سوبر تسلسل&quot; (SS)لانتاج منتجات LCC، والتي من ministring الحمض النووي يمكن بعد ذلك تنقيته (الشكل 1). مواقع SS على DNA البلازميد ministring السلائف أيضا تشفير المواقع المستهدفة لrecombinases الأخرى بما في ذلك لجنة المساواة العرقية recombinase (السلمون المدخن)، TelN protelomerase (telRL) وFLP recombinase (FRT)، مما يسهل إنتاج LCC إسوي وminivectors CCC من البلازميد السلائف واحدة. وبالإضافة إلى ذلك، ويحيط كل موقع SS على كلا الجانبين من SV40 محسن (SV40e) متواليات، التي تعمل على تحسين النبات النووي 14. لقد أثبتنا في أماكن أخرى أن إضافة المتعاقبة من SV40e يمنح تدريجيا الزيادة المقابلة في كفاءة ترنسفكأيشن 7. البلازميد السلائف (PDNA MiniString أو PDMS) يحتوي على polylinker (الشكل 1) لتسهيل إدخال أي الجين المطلوب من الاهتمام في الانصهار النسخي مع مراسل الفلورية الخضراء (GFP). تكنولوجيا الحمض النووي minivector قدأن تستخدم بدلا من الطرق التقليدية لنقل الجين، التعبير عن الجينات المراسل، والتقييمات نحو كفاءة التعبير التحوير في أنظمة حقيقية النواة. ministrings الحمض النووي الجمع بين توافق مع الحياة وزيادة الفوائد كفاءة ترنسفكأيشن ناقلات &quot;مصغرة&quot; مع الشخصية سلامة متفوقة من ناقلات الحمض النووي الخطية. لدينا قوية منصة الإنتاج خطوة واحدة بسرعة وسهولة تنتج ministrings الحمض النووي لتطبيق أي نقل الجينات، ويقدم صورة الأمان العالي.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; W3NN</td><td>Mediphage</td><td></td><td>strain for ministring processing: Nafissi &amp;amp; Slavcev, 2012</td></tr><tr><td>pDMS.IRES.GFP</td><td>Mediphage</td><td></td><td>parent plasmid for ministring processing: also referred to as pDNA Ministring (pDMS)</td></tr><tr><td>BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani)</td><td>Fisher Scientific</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents Terrific Broth</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2468500</td><td></td></tr><tr><td>BD Bacto Dehydrated Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilin</td><td>MP Biomedicals LCC</td><td>2190147</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure Milipore Water</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>Z00Q0V0US</td><td>Model: Mili-Q Advantage A10 Water Purification System</td></tr><tr><td>Surgical Gloves</td><td>VWR</td><td>(S) 82026-424, (M)82026-426, (L) 82026-428, (XL) 82026-430&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid Raised Ridge (100&amp;nbsp;x&amp;nbsp;15&amp;nbsp;mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>30 ml KIMAX Test Tubes</td><td>VWR</td><td>89001-448</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer Cuvette</td><td>Sarstedt</td><td>67.74</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 15 ml Falcon Tubes</td><td>&amp;nbsp;BD Falcon</td><td>62406-200,</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 50 ml Centrifuge Tubes</td><td>&amp;nbsp;FroggaBio</td><td>2930-S0</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Disposable Polystyrene Serological Pipets 10 ml</td><td>BD Falcon</td><td>13-675-20</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Disposable Polystyrene Serological Pipets 25 ml</td><td>BD Falcon</td><td>13-668-2&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Micropipettor (100-1,000&amp;nbsp;&amp;mu;l)</td><td>FroggaBio</td><td>C1000-1</td><td></td></tr><tr><td>Micropipettor (20-200&amp;nbsp;&amp;mu;l)</td><td>FroggaBio</td><td>C200-1</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Pipette Tips (100-1,250&amp;nbsp;&amp;mu;l)</td><td>VWR</td><td>89079-472&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Pipette Tips (1-200&amp;nbsp;&amp;mu;l)</td><td>VWR</td><td>89079-460</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific Economy Burner</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-917Q</td><td></td></tr><tr><td>Incubator Shaker</td><td>New Brunswick Scientific&amp;nbsp;</td><td>M1352-00000</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Erlenmeyer Flask (125 ml)</td><td>Pyrex (Sigma Aldrich)</td><td>CLS4980125 Aldrich&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Erlenmeyer Flask (250 ml)</td><td>Pyrex (Sigma Aldrich)</td><td>CLS4980250 Aldrich&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Erlenmeyer Flask (500 ml)</td><td>Pyrex (Sigma Aldrich)</td><td>CLS4980500 Aldrich&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>335901</td><td>Model: Genesys 10 Vis</td></tr><tr><td>Floor Centrifuge</td><td>Beckman Coulter&amp;nbsp;</td><td>369001</td><td>Model: Avanti J-E</td></tr><tr><td>Benchtop Centrifuge</td><td>Beckman</td><td>362114</td><td>Model: GS-6R</td></tr><tr><td>Fisher Scientific Analog Vortex Mixer&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>02-215-365</td><td></td></tr><tr><td>1 kb DNA Ladder</td><td>New England BioLabs</td><td>N3232S</td><td></td></tr></tbody></table>

production of double-stranded dna ministrings

بنينا الخطية مغلقة تساهمي minivectors (LCC) DNA باسم الجينات التسليم بديل ناقلات غير الفيروسية المنتجة عبر منصة بسيطة في الجسم الحي. ministrings الحمض النووي تمتلك محة سلامة مشددة وأيضا كفاءة تسليم البضائع الحمض النووي للخلايا المستهدفة. ناقلات الحمض النووي التقليدية تحمل تسلسل الكائنات الحية بدائية غير مرغوب فيها، بما في ذلك الجينات للمضادات الحيوية المقاومة، زخارف الدليل السياسي الشامل، وأصول البكتيرية النسخ المتماثل، مما قد يؤدي إلى تحفيز استجابات المناعية المضيف. ويؤثر سلبا على التوافر الحيوي للناقلات الحمض النووي التقليدية أيضا نظرا للحجم الجزيئي. قد طبيعة دائرية لها أيضا نقلها التكامل الكروموسومات، مما يؤدي إلى الطفرات إقحامي. يتم استئصال تسلسل البكتيرية من minivectors الحمض النووي، ولم يتبق سوى الجينات في المصالح (الحكومة الإسرائيلية) وعناصر التعبير حقيقية النواة الضرورية. لدينا minivectors LCC الحمض النووي، أو ministrings الحمض النووي، وتخلو من متواليات البكتيرية المناعية. وبالتالي تحسين عشرالتوافر البيولوجي الاستخراجية والتعبير الحكومة الإسرائيلية. في حال والتكامل ناقلات في كروموسوم، فإن ministring LCC الحمض النووي يعطل قاتل الكروموسوم المضيفة، مما يزيل متحولة يحتمل أن تكون خطرة من السكان الخلايا المتكاثرة. ونتيجة لذلك، ministrings DNA تقديم فوائد الحمض النووي &quot;minicircle&quot; حين القضاء على إمكانية أحداث التكامل ناقلات غير مرغوب فيها. بالمقارنة مع البلازميدات التقليدية والتي إسوي مغلقة تساهمي (CCC) نظرائهم دائرية، ministrings الحمض النووي تثبت التوافر البيولوجي المتفوق والكفاءة ترنسفكأيشن، وحركية هيولي - وبالتالي فإنها تتطلب كميات أقل من السطحي الموجبة لترنسفكأيشن فعالة من الخلايا المستهدفة. لقد شيدت على بعد خطوة واحدة محرض في نظام الجسم الحي لإنتاج ministrings الحمض النووي في القولونية التي هي سهلة الاستخدام وسريعة، وقابلة للتطوير.

بعد استخراج الحمض النووي، والمتبقي البلازميد السلائف، LCC العمود الفقري في بدائيات النواة، وministring الحمض النووي سيتم استردادها. العائد البلازميد العام ونقاء يمكن تقييم باستخدام مقياس الطيف الضوئي. ويقدر النقاء باستخدام نسبة الامتصاصية في 260 نانومتر و 280 نانومتر (A260 / A280) حيث نسبة 1،9-2،0 هو الأمثل. جميع منتجات شركة الطيران الاقتصادي ومجلس التعاون الجمركي يمكن فصلها عن طريق الكهربائي للهلام الاغاروز (AGE) (الشكل 2). AGE يتصور نتائج ministring الإنتاج بعد تحريض الحرارة، قبل ministring تنقية. ويمكن إجراء تقييم نوعي لإنتاج ministring في هذه المرحلة من خلال مقارنة كثافة الفرقة من ministring (2.4 كيلوبايت) إلى البلازميد الأم (5.6 كيلوبايت) (الشكل 2). Ministring الحمض النووي يمكن استردادها عبر بروتوكولات استخراج الهلام البلازميد القياسية التالية AGE الشكل 3 يلخص ministring كفاءة الإنتاج في ظل ظروف مختلفة من المرجح أن تحدث أثناء الحملجي من البروتوكول. تم تحديد Ministring كفاءة الإنتاج على أساس كثافة الفرقة الحمض النووي باستخدام برنامج التحليل الخاص بالشركة المصنعة. أي برنامج كثافة مماثلة يمكن استخدامها لتحليل نتائج العمر. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/53177/53177fig1highres.jpg" width="700" /> الشكل 1: لمحة عامة عن ministring إنتاج (A) وناقلات الأم يحتوي على polylinker في الانصهار النسخي مع جين مراسل، تحكمه في مواقع SS اثنين. العمود الفقري بترميز بيتا لاكتاماز المقاومة الأمبيسلين ويحتوي أيضا على العديد من المواقع قطع فريدة من نوعها في العمود الفقري للفي المختبر الهضم. (ب) نظرة عامة على بروتوكول الرئيسي. الخطوات 2) مرحلة النمو و3) Ministring الإنتاج تتمثل في رسم تخطيطي لتوفير التخطيطي الشامل للخطوات المعنية، وتسليط الضوء على البساطة من البروتوكول. (C) Ministring الحث. الحث الحراري من تعطيل كاظمة حساس درجة الحرارة، مما يسمح للتعبير الهاتف تليها النشاط أبيب على مواقع قوات الأمن الخاصة في البلازميدات الأم. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53177/53177fig1highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/53177/53177fig2highres.jpg" width="350" /> الشكل 2: Ministring الإنتاج بعد الانحرافات من البروتوكول. 1: التحكم 2: Uninduced، 3: متضخمة، 4: Overinduced، 5: إزالة المبكرة. ministring الحمض النووي هو حوالي 2.4 كيلوبايت، LCC العمود الفقري هو 3 كيلوبايت، وpNN9 البلازميد الأصل هو 5.6 كيلوبايت. كثافة عصابة من ministring والعمود الفقري LCC العصابات مع انخفاض الانحرافات من البروتوكول، مشيرا إلى انخفاض العائد ministring. من اليسار إلى اليمين: 1 كيلوبايت سلم من إنجلاند Biolabs الجديدة؛ السيطرة، بعد بروتوكول. Uninduced، لا upshift درجة الحرارة؛ متضخمة، ودرجة الحرارة upshift الزيتوز مرحلة ثابتة. Overinduced، تمديد درجة الحرارة upshift. إزالة في وقت مبكر، أي بالاستعداد درجة الحرارة. تم استخراج البلازميدات باستخدام أدوات أوميغا BIOTEK EZNA البلازميد البسيطة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53177/53177fig2highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/53177/53177fig3highres.jpg" width="550" /> الرقم 3: آثار الانحراف عن بروتوكول بشأن ministring كفاءة الإنتاج (PE) نتائج هي متوسط ​​3 محاكمات. ويقدر PE من شدة الفرقة النسبية تقاس باستخدام AlphaImager HP بعد عمر. تحدث انحرافات في الخطوات التالية: مراقبة، بعد بروتوكول. Uninduced، لا upshift درجة الحرارة في الخطوة 2. بدأ متضخمة، ودرجة الحرارة upshift خلال مرحلة ثابتة في خطوة 1.6. Overinduced، مدد upshift درجة الحرارة في خطوة 2.3. إزالة وقت مبكر، وخلايا إزالة واستخراجدون بالاستعداد درجة الحرارة في خطوة 2.3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53177/53177fig3highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Production of Double-stranded DNA Ministrings at JoVE.com

Production of Double-stranded DNA Ministrings

The linear covalently closed (LCC) DNA minivector (DNA ministring) is a non-viral gene delivery vector offering high transfection efficiency and is relevant to any DNA delivery application. The production system is simple, rapid, and scalable in vivo. The following protocol provides visual step-by-step instructions for the production of DNA ministrings.

إنتاج المزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي Ministrings

We constructed linear covalently closed (LCC) DNA minivectors as a non-viral gene-delivery vector alternative produced via a simple platform in vivo. DNA ...

production-of-double-stranded-dna-ministrings

Research

JoVE Journal

Biology

10.3K Views.  University of Waterloo. The linear covalently closed (LCC) DNA minivector (DNA ministring) is a non-viral gene delivery vector offering high transfection efficiency and is relevant to any DNA delivery application. The production system is simple, rapid, and scalable in vivo. The following protocol provides visual step-by-step instructions for the production of DNA ministrings. 

Video: Production of Double-stranded DNA Ministrings

DNA Curtains Shed Light on Complex Molecular Systems During Homologous Recombination

Homologous recombination (HR) is important for the repair of double-stranded DNA breaks (DSBs) and stalled replication forks in all organisms. Defects in HR are closely associated with a loss of genome integrity and oncogenic transformation in human cells. HR involves coordinated actions of a complex set of proteins, many of which remain poorly understood. The key aspect of the research described here is a technology called "DNA curtains", a technique which allows for the assembly of aligned DNA molecules on the surface of a microfluidic sample chamber. They can then be visualized by total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). DNA curtains was pioneered by our laboratory and allows for direct access to spatiotemporal information at millisecond time scales and nanometer scale resolution, which cannot be easily revealed through other methodologies. A major advantage of DNA curtains is that it simplifies the collection of statistically relevant data from single molecule experiments. This research continues to yield new insights into how cells regulate and preserve genome integrity.

<meta charset="utf8"></head><body>ستائر الحمض النووي تلقي الضوء على الأنظمة الجزيئية المعقدة أثناء إعادة التركيب المتماثل

DNA curtains present a novel method for visualizing hundreds or even thousands of DNA-binding proteins in real-time as they interact with DNA molecules aligned on the surface of a microfluidic sample chamber.

ستائر الحمض النووي تلقي الضوء على الأنظمة الجزيئية المعقدة أثناء إعادة التركيب المتماثل

Homologous recombination (HR) is important for the repair of double-stranded DNA breaks (DSBs) and stalled replication forks in all organisms. Defects in ...

Genetics

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. Linearized &lambda; DNA is modified to have a biotin on the end of one strand, and a digoxigenin moiety on the other end of the same strand. The biotinylated end is attached to a functionalized glass coverslip and the digoxigeninated end to a small bead. The assembly of these DNA-bead tethers on the surface of a flow cell allows a laminar flow to be applied to exert a drag force on the bead. As a result, the DNA is stretched close to and parallel to the surface of the coverslip at a force that is determined by the flow rate (Figure 1). The length of the DNA is measured by monitoring the position of the bead. Length differences between single- and double-stranded DNA are utilized to obtain real-time information on the activity of the replication proteins at the fork. Measuring the position of the bead allows precise determination of the rates and processivities of DNA unwinding and polymerization (Figure 2).

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system.

الملاحظة المباشرة من الحمض النووي الانزيمات تكرار استخدام الحمض النووي جزيء واحدة تمتد الفحص

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

<meta charset="utf8"></head><body>لوحظ فك الحمض النووي بوساطة CMG بواسطة نمو جهاز ssDNA-RPA

Single-Molecule Real-Time Visualization of DNA Unwinding by CMG Helicase

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a dynamic complex of proteins termed the replisome. At the heart of the replisome is the&#160;CDC45-MCM2-7-GINS (CMG) helicase, which separates the two strands of the DNA double helix such that DNA polymerases can copy each strand. During genome duplication, replisomes must overcome a plethora of obstacles and challenges. Each of these threatens genome stability, as failure to replicate DNA completely and accurately can lead to mutations, diseases, or cell death. Therefore, it is of great interest to understand how CMG functions in the replisome during both normal replication and replication stress. Here, we describe a total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy assay using recombinant purified proteins, which allows for real-time visualization of surface-tethered stretched DNA molecules by individual CMG complexes. This assay provides a powerful platform to investigate CMG behavior at the single-molecule level, allowing helicase dynamics to be directly observed with real-time control over reaction conditions.

<meta charset="utf8"></head><body>أضواء الكاتب: كشف ديناميكيات تكرار الحمض النووي حقيقيات النواة من خلال تصور الجزيء الفردي

This protocol demonstrates performing a single-molecule assay for live visualization of DNA unwinding by CMG helicase. It describes (1) preparing a DNA substrate, (2) purifying fluorescently labeled Drosophila melanogaster CMG helicase, (3) preparing a microfluidic flow cell for total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, and (4) the single-molecule DNA unwinding assay.

تصور أحادي الجزيء في الوقت الحقيقي لفك الحمض النووي بواسطة CMG Helicase

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a ...

Biochemistry

Strand-Specific Analysis of Proteins at Replicating DNA Strands by Enrichment and Sequencing of Protein-Associated Nascent DNA Method

Genome duplication is orchestrated by replisome proteins, including helicases, which unwind double-stranded DNA into individual antiparallel single strands, each requiring distinct modes of replication: continuous (leading) and discontinuous (lagging). Understanding the interactions of chromatin-associated proteins with replicating DNA strands in vivo is crucial for elucidating the mechanisms of chromatin assembly and DNA repair coupled to DNA replication. This protocol presents the enrichment and sequencing of protein-associated nascent DNA (eSPAN) method, designed to quantify relative protein levels on nascent leading and lagging DNA strands at replication forks. The eSPAN procedure starts with chromatin immunoprecipitation (ChIP, in yeast) or cleavage under targets and tagmentation (CUT&amp;Tag; in mammalian cells) of a protein of interest, followed by enrichment of the protein-associated nascent DNA by bromodeoxyuridine (BrdU) immunoprecipitation. Strand-specific next-generation sequencing is applied to isolated ssDNA. This technique can be used to determine whether a protein is enriched at leading or lagging replication forks. The eSPAN provides genome-wide strand-preference of chromatin-associated proteins, including histones at replication forks.

Enrichment and sequencing of protein-associated nascent DNA (eSPAN) was developed to detect the relative abundance of a chromatin-associated protein on two replicating DNA strands, thereby revealing molecular insight into chromatin replication and its coupled processes. This protocol describes eSPAN procedures in yeast and mouse embryonic stem (ES) cells.

Genome duplication is orchestrated by replisome proteins, including helicases, which unwind double-stranded DNA into individual antiparallel single ...

The DNA Replication Fork

An organism&#8217;s genome needs to be duplicated in an efficient and error-free manner for its growth and survival. The replication fork is a Y-shaped active region where two strands of DNA are separated and replicated continuously. The coupling of DNA unzipping and complementary strand synthesis is a characteristic feature of a replication fork.&#160;&#160; Organisms with small circular DNA, such as E. coli, often have a single origin of replication; therefore, they have only two replication forks, one in each direction leading away from the location of the initial opening.&#160; In organisms with large genomes, the replication of DNA is not done from a single point of origin but in many distinct, localized replication forks.&#160;
The unhindered progression of the replication fork is necessary for complete DNA replication and genome stability; however, the replication fork is often stalled by internal or external factors that can slow or stop its progression, resulting in replication stress. Replication stress causes genomic instability, which is a hallmark of diseases like cancer. Genomic instability is characterized by genomic alterations and increased frequency of harmful mutations. The movement of the replication fork can stop due to several reasons. For example, the drug hydroxyurea depletes the pool of nucleotides available for incorporation into the daughter strand, stalling the replication fork. Other problems that may hinder the progression of the replication fork include DNA lesions, a collision between a replication fork and a transcription complex, and defects in the enzymes involved in DNA replication.
The cell has a variety of repair mechanisms to reinitiate the stalled replication fork.&#160; S-phase checkpoints do not allow cells to begin mitosis until DNA repair is complete. Additionally, fork repriming can restart DNA synthesis by bypassing a DNA lesion or block. Despite these robust mechanisms, sometimes stalled forks cannot be reinitiated, which leads to the collapse of a fork, halting DNA replication.

شوكة التضاعف فى الحمض النووى الريبوزى منزوع الاكسجين

An organism&#8217;s genome needs to be duplicated in an efficient and error-free manner for its growth and survival. The replication fork is a Y-shaped ...

Education

JoVE Core

Molecular Biology

Unit 1

DNA Replication

KEY TERMS AND CONCEPTS

Fixing Double-strand Breaks

The double-stranded structure of DNA has two major advantages. First, it serves as a safe repository of genetic information where one strand serves as the back-up in case the other strand is damaged. Second, the double-helical structure can be wrapped around proteins called histones to form nucleosomes, which can then be tightly wound to form chromosomes. This way, DNA chains up to 2 inches long can be contained within microscopic structures in a cell. A double-stranded break not only damages both copies of genetic information but also disrupts the continuity of DNA, making the chromosome fragile.
In a cell, there are an estimated ten double-strand breaks (DSBs) per day. The primary source of damage is metabolic by-products such as Reactive Oxygen Species and environmental factors such as ionizing radiations. Although less common, malfunctioning nuclear enzymes can also cause DSBs. Failure of enzymes like type II topoisomerases, which cut both strands of DNA and rejoin them while disentangling chromosomes, can inadvertently result in DSBs. Mechanical stress on the DNA duplex can also lead to DSBs. In prokaryotes, prolonged desiccation strains DNA, causing DSBs.
Of the two mechanisms for DNA repair, homologous recombination depends on a sister chromatid being nearby, which happens during the S and G2 phases. Due to this restriction, in the absence of a homology donor, cells have to resort to Nonhomologous end joining (NHEJ), even though it is much less accurate. It has been hypothesized that the reason higher eukaryotes can afford to preferentially utilize NHEJ for DSB repairs is that they have abundant non-coding DNA, which permits nucleotide substitutions, deletions or additions without grievous consequences.

Double-strand Breaks DSB &amp; Nonhomologous End Joining NHEJ

اصلاح التلف مزدوج الشريط

The double-stranded structure of DNA has two major advantages. First, it serves as a safe repository of genetic information where one strand serves as the ...

DNA Repair and Recombination

Replication in Prokaryotes

DNA replication has three main steps: initiation, elongation, and termination. Replication in prokaryotes begins when initiator proteins bind to the single origin of replication (ori) on the cell&#39;s circular chromosome. Replication then proceeds around the entire circle of the chromosome in each direction from the two replication forks, resulting in two DNA molecules.
Many Proteins Work Together to Replicate the Chromosome
Replication is coordinated and carried out by a host of specialized proteins. Topoisomerase breaks one side of the double-stranded DNA phosphate-sugar backbone, allowing the DNA helix to unwind more rapidly, while helicase breaks the bonds between base pairs at the fork, separating the DNA into two template strands. Proteins that bind single-stranded DNA molecules stabilize the strands as the replication fork travels along the chromosome. DNA can only be synthesized in the 5&#39; to 3&#39; direction, so one strand of the template&#8212;the leading strand&#8212;is elongated continuously, while the other strand&#8212;the lagging strand&#8212;is synthesized in shorter pieces of 1,000&#8211;2,000 base pairs called Okazaki fragments.
Multiple Polymerases Take Part in Elongation
Much of the research to understand prokaryotic DNA replication has been performed in the bacterium Escherichia coli, a commonly-used model organism. E. coli has five DNA polymerases: Pol I, II, III, IV, and V. Pol III is responsible for the majority of DNA replication. It can polymerize about 1,000 base pairs per second. This astonishing pace allows the machinery present at the two replication forks to duplicate the E. coli chromosome&#8212;4.6 million base pairs&#8212;in roughly 40 minutes. DNA polymerase I is also well-characterized. Its primary role is to process the RNA primers on the lagging strand.
When Division Outpaces Duplication
Under favorable growth conditions, E. coli can divide every 20 minutes, about half the amount of time that it takes to replicate the genome. But how is this possible when both daughter cells must have their own DNA? Scientists found that the bacteria can begin another round of DNA replication from the origin of replication before the first round is complete; this means that daughter cells receive a chromosome that is already in the process of being copied and are prepared to divide again very quickly.

النسخ المتماثل في بدائيات النوى

DNA replication has three main steps: initiation, elongation, and termination. Replication in prokaryotes begins when initiator proteins bind to the ...

إنتاج المزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي Ministrings

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

ستائر الحمض النووي تلقي الضوء على الأنظمة الجزيئية المعقدة أثناء إعادة التركيب المتماثل

ستائر الحمض النووي تلقي الضوء على الأنظمة الجزيئية المعقدة أثناء إعادة التركيب المتماثل

الملاحظة المباشرة من الحمض النووي الانزيمات تكرار استخدام الحمض النووي جزيء واحدة تمتد الفحص

تصور أحادي الجزيء في الوقت الحقيقي لفك الحمض النووي بواسطة CMG Helicase

تصور أحادي الجزيء في الوقت الحقيقي لفك الحمض النووي بواسطة CMG Helicase

تصور أحادي الجزيء في الوقت الحقيقي لفك الحمض النووي بواسطة CMG Helicase

Strand-Specific Analysis of Proteins at Replicating DNA Strands by Enrichment and Sequencing of Protein-Associated Nascent DNA Method

شوكة التضاعف فى الحمض النووى الريبوزى منزوع الاكسجين

اصلاح التلف مزدوج الشريط

النسخ المتماثل في بدائيات النوى