作者はこの仕事に資金を供給するための自​​然科学とカナダの工学研究評議会（NSERC）をお願いいたします。

メディアと文化の作製<ol><li> LB +アンプの場合：ルリア - ベルターニ培地（LB）の500mlを30分間121℃でオートクレーブを用いて滅菌準備。必要になるまで4℃でアンピシリン及び店舗を100μg/ mlの最終濃度を得るためのアンピシリンを含む栄養補助食品。 </li><li> TB +アンプの場合：生産をministringの（500ミリリットル以上）大量の準備をします。調製無菌のTerrificブロス（TB）の600mlを30分間121℃でオートクレーブを用いて滅菌しました。必要になるまで4℃でアンピシリン及び店舗を100μg/ mlの最終濃度を得るためのアンピシリンを含む栄養補助食品。 </li><li> LB寒天+アンプの場合：寒天の15グラム/ Lを補充したLB +アンプを用意することにより、滅菌LB寒天プレートを準備します。一定分量は約15 - 必要になるまで4℃で逆さまに滅菌ペトリ皿中の20ミリリットルと保存。 </li><li>無菌的W3NN [PDMS]をストリーキングW3NN [PDMS]のストリークプレートを準備し、LB寒天+アンプ上の細胞。プレートをインキュベートoverni単一のコロニーが観察されるまで、30℃、でGHT。 protelomerase式をderepressing避けるために、この温度以上にW3NNをインキュベートしないでください。 </li><li>無菌的移送無菌試験管にLB +アンプ5mlの。ストリークプレートから単一コロニーを使用してこのボリュームを接種することによりW3NN [PDMS]の一晩培養物を準備します。 230から250 rpmで振とう機で30℃で培養一晩インキュベートします。 </li></ol> 2.成長期<ol><li>無菌的に転送滅菌125ミリリットルの三角フラスコにLB +アンプの10ミリリットルと1作り、準備されたLB +アンプに一晩W3NN [PDMS]文化の100μlで接種：100希釈を。 <ol><li>大容量の場合は、代わりにLB + AMPの、250ミリリットルの三角フラスコにTB +アンプ50mlに一晩培養液500μlを追加します。 </li><li>また、ステップ2.2で第二の「代表」文化としての使用。 </li></ol></li><li> CULまで30℃、250rpmで振盪インキュベーター中でインキュベート600 = 0.8：トゥーレは、光学密度（OD）または吸光度によって示され、後期対数期半ばに達します。 1-2時間後、培地を肉眼で濁っ出現し始めるべきです。 <ol><li>無菌的に転送クリーン分光光度計のキュベットへの文化の1ミリリットル。 </li><li> 600 nmの設定波長を有するUV-VIS分光光度計を用いて吸光度を測定します。セルが空白（LBまたはTB）を設定するために成長されたメディアの1ミリリットルを使用してください。必要に応じて、代わりにこのステップについて、ステップ2.1.3からの代表的な文化を使用します。 </li><li>文化はまだ適切なODに達していない場合は、シェーカーに戻り、再び半時間ごとに確認してください。 A 600が 0.8に近づくにつれて、より頻繁にODを確認してください。 </li></ol></li><li>培養物が600 = 0.8で示される後期対数期に達した後、無菌的に滅菌した50mLの遠心管に培養物を移します。 </li><li> 10分10,000×gで文化を遠心分離して細胞を収集します。 PEのための点検チューブの底にllet。 </li><li>適切なバイオハザード廃棄物容器に透明な上清をデカント。細胞ペレットを乱さないでください。 </li><li>すべての細胞が収集されるまで繰り返して、2.4から2.5を繰り返します。 </li><li> 100μlのLB +アンプでペレットを再懸濁します。吸引物は、マイクロピペットを用いて、またはボルテックスミキサーを使用します。大きいministringの生産のために、新鮮なLB +アンプ・メディアの1ミリリットル中に50ミリリットルTB +アンプ培養物からのペレットを再懸濁します。 </li></ol> 3. Ministring生産<ol><li>無菌的に42°Cに125ミリリットルの三角フラスコや熱でLB +アンプの20ミリリットルを追加します。大きいministringの生産のために、42℃に予熱したLB +アンプの500ミリリットルを、準備します。 </li><li>予熱した培地中に再懸濁を転送します。 </li><li> 42℃で培養し、600 = 1.0で示される過去の対数期まで250rpmで、。 1時間を過ぎて42℃で培養液の20ミリリットルを放置しないでください。 </li><li> 37℃まで温度を下げるとのaddiのための文化を残します的な90分。 500ミリリットルのために、90の追加の誘導期間の文化を残す - 120分と温度を低下させません。 </li><li> 30℃まで温度を低下させ、2時間の追加の温度ダウンシフトの期間、200rpmで振とう培養を残します。 500ミリリットルのために、4時間または一晩に温度シフトダウンを拡張します。 </li></ol> 4.収穫Ministrings <ol><li>無菌的に滅菌した50ml遠心チューブに培養物を移します。 10分10,000×gで遠心分離し、ペレットを検査。 </li><li>ペレットを乱すことなく、適切なバイオハザード廃棄物容器に上清を除去。すべての細胞が収集されるまで繰り返します。 </li><li>後で抽出のために-80℃で液体窒素とストア内のすべての市販の抽出とエンドトキシン除去キットまたはフラッシュ凍結してプラスミド抽出のためのペレットを保持します。 </li></ol>

<ol>
	<li>Klinman, D. M., Ylt, A. K., Beaucaget, S. L., Conover, J., Kriegt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CpG+motifs+present+in+bacterial+DNA+rapidly+induce+lymphocytes+to+secrete+interleukin+6,+interleukin+12,+and+interferon+&#947;.">CpG motifs present in bacterial DNA rapidly induce lymphocytes to secrete interleukin 6, interleukin 12, and interferon &#947;.</a> Proc Natl Acad Sci. 93, 2879-2883 (1996).</li><li>Hodges, B. L., Taylor, K. M., Joseph, M. F., Bourgeois, S. A., Scheule, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+transgene+expression+from+plasmid+DNA+gene+therapy+vectors+is+negatively+affected+by+CpG+dinucleotides.">Long-term transgene expression from plasmid DNA gene therapy vectors is negatively affected by CpG dinucleotides.</a> Mol Ther. 10 (2), 269-278 (2004).</li><li>Darquet, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minicircle:+an+improved+DNA+molecule+for+in+vitro+and+in+vivo+gene+transfer.">Minicircle: an improved DNA molecule for in vitro and in vivo gene transfer.</a> Gene Ther. 6 (2), 209-218 (1999).</li><li>Gracey Maniar, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minicircle+DNA+vectors+achieve+sustained+expression+reflected+by+active+chromatin+and+transcriptional+level.">Minicircle DNA vectors achieve sustained expression reflected by active chromatin and transcriptional level.</a> Mol Ther. 21 (1), 131-138 (2012).</li><li>Catanese, D. J., Fogg, J. M., Ii, D. E. S., Gilbert, B. E., Zechiedrich, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supercoiled+minivector+DNA+resists+shear+forces+associated+with+gene+therapy+delivery.">Supercoiled minivector DNA resists shear forces associated with gene therapy delivery.</a> Gene Ther. 19 (1), 94-100 (2011).</li><li>Hacein-bey-abina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+oncogenesis+in+4+patients+after+retrovirus-mediated+gene+therapy+of+SCID-X1.">Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1.</a> J Clin Invest. 118 (9), 3132-3142 (2008).</li><li>Nafissi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+ministrings:+highly+safe+and+effective+gene+delivery+vectors.">DNA ministrings: highly safe and effective gene delivery vectors.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 3 (April), (2014).</li><li>Schakowski, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+minimal-size+vector+(MIDGE)+improves+transgene+expression+in+colon+carcinoma+cells+and+avoids+transfection+of+undesired+DNA.">A novel minimal-size vector (MIDGE) improves transgene expression in colon carcinoma cells and avoids transfection of undesired DNA.</a> Mol Ther. 3 (5 Pt 1), 793-800 (2001).</li><li>Wang, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+micro-linear+vector+for+in+vitro+and+in+vivo+gene+delivery+and+its+application+for+EBV+positive+tumors.">A novel micro-linear vector for in vitro and in vivo gene delivery and its application for EBV positive tumors.</a> PLoS One. 7 (10), (2012).</li><li>L&#243;pez-Fuertes, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+vaccination+with+linear+minimalistic+(MIDGE)+vectors+confers+protection+against+Leishmania+major+infection+in+mice.">DNA vaccination with linear minimalistic (MIDGE) vectors confers protection against Leishmania major infection in mice.</a> Vaccine. 21 (3-4), 247-257 (2002).</li><li>Schakowski, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+size+MIDGE+vectors+improve+transgene+expression+in+vivo.">Minimal size MIDGE vectors improve transgene expression in vivo.</a> In Vivo. 21 (1), 17-23 (2007).</li><li>Hertwig, S., Klein, I., Lurz, R., Lanka, E., Appel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PY54,+a+linear+plasmid+prophage+of+Yersinia+enterocolitica+with+covalently+closed+ends.">PY54, a linear plasmid prophage of Yersinia enterocolitica with covalently closed ends.</a> Mol Microbiol. 48, 989-1003 (2003).</li><li>Nafissi, N., Slavcev, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+an+in-vivo+linear+covalently+closed+DNA+vector+production+system.">Construction and characterization of an in-vivo linear covalently closed DNA vector production system.</a> Microb Cell Fact. 11 (1), 154 (2012).</li><li>Xu, Z. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+and+purification+of+linear+covalently+closed+deoxyribonucleic+acid+by+Q-anion+exchange+membrane+chromatography.">Separation and purification of linear covalently closed deoxyribonucleic acid by Q-anion exchange membrane chromatography.</a> J Chromatogr A. 1339, 214-218 (2014).</li><li>Hoffmann, F., Rinas, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid+amplification+in+Escherichia+coli+after+temperature+upshift+is+impaired+by+induction+of+recombinant+protein+synthesis.">Plasmid amplification in Escherichia coli after temperature upshift is impaired by induction of recombinant protein synthesis.</a> Biotechnol Lett. 23, 1819-1825 (2001).</li><li>Nafissi, N., Sum, C. H., Wettig, S., Slavcev, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+one-step+heat-inducible+in+vivo+mini+DNA+vector+production+system.">Optimization of a one-step heat-inducible in vivo mini DNA vector production system.</a> PLoS One. 9 (2), (2014).</li></ol>

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たない宣言します。

ここでは代表的な細菌の増殖および操作に使用されているものとは別に特別な設備を必要としないワンステップの熱誘導性プロトコルを使用して、LCCのDNA ministringsの生産のための簡単​​なシステムを説明します。 DNAのministringsは、原核生物の遺伝的要素を欠いねじれのない、安定した直鎖状DNA発現カセット、あります。それらは、真核生物系における導入遺伝子発現の効率に向かって遺伝子導入、レポーター遺伝子の発現、ならびににおける評価のための従来の方法の代わりに使用することができます。 DNAのministringsは、生体適合性を組み合わせて、直線状のDNAベクターの優れた安全性プロファイルと「ミニ」ベクターのトランスフェクション効率の利益を増加させました。 インビボ生産プラットフォームにおける我々の強固なワンステップは、迅速かつ容易に複数の高価なインビトロの方法を必要とすることなく、任意の遺伝子導入の適用のためのDNA ministringsを生成します。 には、いくつかの重要なステップがあります。最適なministring生産（ 図2、図 3）を確保。熱誘導は生産をministringに最も重要なステップです。生産をministringの完全な欠如は、protelomerase発現の抑制は、LCCのministringに前駆体プラスミドの変換を防止する熱誘導（30℃で保持された細胞）の欠如のために最も可能性が高いです。熱誘導プロトコールに従って、約75％の生産効率を期待します。細胞が対数期にある間、熱誘導が最適です。 （「草むし&quot; 図3）静止期の細胞を使用する場合にPEをministringにおける統計的に有意な差はないが、我々は、全体的なプラスミド収率はほぼ50％の減少を観察しました。収率は使用したプラスミド抽出プロトコルに依存します。細胞が対数期にありながら、最適なministringの生産のために、熱の誘導を誘発します。悪いministring生産は最も可能性の高い長期の温度上昇やinsufficieの結果になりますNT温度シフトダウン。これはE.を活性化させるように長時間の温度上昇は推奨されprotelomerase活性を阻害し、プラスミド安定性を妨げる可能性大腸菌熱ショック応答15。したがって、温度ダウンシフトタイミング、効率的なministring生産のためのもう一つの重要なステップです。 30℃でさらにインキュベーション時間なしで、ministring生産効率が非常に悪いことが判明した（「初期の取り外し」、 図3）。これは、電話の発現および活性のために必要な時間に起因し得ます。発信元プロファージPY54エンコードの電話番号は通常30°Cも電話の活動のためのより最適であり得ることを示している、最適の周りに28°C 12成長エルシニアを 、感染protelomerase。 DNA minivector生産システムは、高品質の細菌の配列遊離DNA minivectorsを生成するために、in vivoでのプラットフォームを利用しています。プロトコルへの変更は、5月増殖期（代わりLBのTB）中に細胞増殖を促進し、またはministring製造及び変換効率を高めるために、プラスミドおよびタンパク質産生を最適化するために、増殖培地を変化させることnclude。より大きな培養容積（200ミリリットル以上）、温度シフトダウンし、30℃でのインキュベーションのためにPEをministringに深刻な悪影響を与えることなく、一晩延長することができます。ここでは、例として、500ミリリットルの文化のための私達のプロトコルでの変更が含まれています。 DNAのministringsの精製は、原核生物の骨格のin vitroでのエンドヌクレアーゼ消化を介して迅速ことができます。原核生物の骨格のin vitroでの分解を可能にする、オープンな線形端を露出するように切 ​​断することができる前駆体プラスミド、原核生物のバックボーン上で利用可能なエンドヌクレアーゼ標的部位の数（ 例えば 、PI-SceIを、PvuIを、ScaIを）があります。他のベクター種からministringsの単離はまた、アニオン交換膜クロマトグラフィー16を介して達成することができます。 LCC DNAベクター生産システムに関連する一つの電流制限は、他のLCCとCCC製品からのDNA ministringの精製の必要性です。簡単に標準的なプラスミド単離方法を用いて精製したが、単離工程は、依然として大​​規模な設定において不利であることができます。 ministringとLCC原核バックボーンのサイズがあまりにも類似している場合ministringの分離は、AGEを使用して、時間がかかることがあります。あるいは、アニオン交換膜クロマトグラフィーCCCベクトル種16からministringsのより良好な分離を提供することができます。高温はまた、 大腸菌における熱ショック応答を活性化するような温度アップシフトは、他の潜在的な制限することができます負の組換えタンパク質に影響を与える大腸菌は 、17もたらし、その結果、変換をministringにプラスミドの速度を低下させます。我々は、生産プラットフォームの最適化は、回避および/ ​​または熱ショック18のような効果を緩和するために他の場所で報告します。我々また、現在、in vivoでの LCC原核バックボーン汚染を排除または低減するための方法を最適化しています。 LCCのDNA ministringの染色体組込みは、宿主染色体を破壊し、アポトーシスに細胞を施します。だけでなく、このような発癌と隣接する遺伝子のサイレンシング、それによってその安全性を向上させるなどの挿入突然変異誘発の潜在的な負の影響を減らすん。致死効果はまた、関連する副作用との統合の損傷なしノックインおよび遺伝子置換研究のための理想的な方法としての役割を果たすことができます。 DNAのministringベクターは、 生体内で指定されたターゲットに治療用タンパク質、RNA、抗体、または抗原に対する遺伝子の導入および発現に向けて適用されるか、または不良または非機能的対立遺伝子を交換することができます。シンプルなワンステップの熱誘導性のin vivoの産生系は、DNA ministringベクトルが容易に臨床的または工業的用途のために製造することを可能にします。

目標は、in vivoでの DNA ministring生産システムを簡単かつ高効率ワンステップの熱誘導を用いた線形共有結合した（LCC）のDNA minivectorsのスケーラブルな量を生産することです。 DNAのministringsは、DNAを送達するための安全で効果的な非ウイルス戦略を提供します。それらは、DNAミニサークルの効率でLCCベクターの安全性を兼ね備え、さらにトランスフェクション効率を損なうことなく、ウイルス由来のベクターの安全な代替手段を提供します。 成功するために、導入遺伝子送達システムのために、DNAベクターを標的宿主細胞に入ると、符号化された導入遺伝子（単数または複数）を発現しなければなりません。特に哺乳類系では、実際には克服すべきいくつかの細胞の障壁があります。細網内皮系により、血清ヌクレアーゼおよび免疫検出による分解を回避するために、DNAベクターは、バイオとターゲットシステムと免疫適合性でなければなりません。保護されていないDNAはすぐにプラズマヌクレアーゼによって消化されますDNAベクターは、急速に、標的細胞の形質膜を横切ることができなければならないので、プラスミド膜は緻密なリポタンパク質の壁で構成されています。一旦細胞では、ベクターは、細胞質を横断し、導入遺伝子発現のために核に入ること核膜を通過しなければなりません。非ウイルス遺伝子送達技術は、組織及び細胞標的の強化に焦点を当てます。しかしながら、これらの技術を有する従来のプラスミドの使用は、急速に、遺伝子発現をサイレンシング1,2免疫原性細菌配列の存在によるトランスフェクション効率を低下させます。従来のプラスミドは、通常、原核生物系における保守のための抗生物質耐性遺伝子を運びます。しかし、これらは、ヒト宿主における潜在的な有害作用を生じるか天然に水平遺伝子伝達の影響を介してホスト叢の発生に対する抵抗性を付与することができます。従来のプラスミドはまた、潜在的に、望ましくない免疫賦活応答を誘発することができるジヌクレオチドCpGモチーフ2を含み、導入遺伝子の発現を減少またはサイレンシング。 これらは単独で、真核生物の発現カセットから構成されているように、このようなDNAのミニサークル3のようなDNA minivectorsは、それらの小型化および免疫刺激性原核生物の要素が存在しないため、それらが細胞外および細胞内生物学的利用能および改善された遺伝子発現を向上呈するように遺伝子送達のためのより良い代替手段であります4。より良い標的部位5にインビボ投与に関連した剪断力に対する抵抗性に関して縮小ベクトルサイズの運賃。単位質量あたりのベクターのより高いコピー数は、従って毒性を低下させる、より少ないトランスフェクション試薬を必要とします。しかし、宿主染色体へのランダムベクター組込みの際に、円共有結合、DNAのミニサークルと従来のプラスミドの両方を含む（CCC）ベクターを、閉じた分子の連続性を付与するため、壊滅的な結果をもたらすことができ、挿入変異誘発につながる可能性があり<s&gt; 6アップ。比較的、直鎖状DNAベクターの組込みは、染色体を破壊し、それによって増殖する細胞集団から変異体細胞を除去し、挿入突然変異誘発7を防止し 、細胞死経路を開始します。最小限の免疫学的に定義された遺伝子発現（MIDGE）ベクター8マイクロ線形ベクター9（MiLV）は、インビトロで開発された LCC DNAベクターです。 MIDGEベクターは、従来のプラスミドDNAは、11ベクトルに比べて、in vivoで 17倍改善された導入遺伝子の発現を最大に発揮しており、ワクチン10および癌8遺伝子治療において有望な結果を示しました。また、原因LCCのminivectorのねじれ無構造に、より少ないトランスフェクション試薬は、このような毒性7を低減する 、CCCスーパーコイルの対応と比較して必要とされます。 当社の強化されたLCCのDNAベクターは、DNA ministringsは、優れた発現効率とbioavaiを実証しています不安定性7。さらに、DNAのministringsは、1ステップの熱誘導性のin vivoの産生系、in vitroで複数のステップを必要MIDGEとMiLV LCCベクトル、に好都合で費用対効果の高い代替で製造されています。実証するDNA ministring生産システムは、費用対効果の高い、容易にスケーラブル両方作り、in vivoで実施単純な熱誘導性のプロセスです。このシステムは、 エルシニアエンテロコリチカバクテリオファージPY54由来電話/ PALは 、原核生物プラスミド骨格から最小の真核生物発現カセットを分離するために再結合システム12を protelomerase利用します。我々は、熱誘導性バクテリオファージλプロモーターの制御下のcI [Tsの] 857 13電話のprotelomeraseを表現するために大腸菌細胞（W3NNを）設計されています。発現の際に、電話番号は、前駆体プラスミド上に配置された「スーパーシーケンス」（SS）のサイト内に存在するパル標的部位に作用をprotelomeraseDNAのministring次いで（ 図1）で精製することが可能なLCC製品を得ました。 DNAのministring前駆体プラスミド上のSSサイトも、それによって1前駆体プラスミドから同質遺伝子LCCとCCCのminivectorsの生産を促進する、Creリコンビナーゼ（LOX）、TelNのprotelomerase（telRL）とのFlpリコンビナーゼ（FRT）を含む他のリコンビナーゼのための標的部位をコードします。また、各SSの部位は、核転座14を改善するのに役立つSV40エンハンサー（融合させ、SV40e）配列によって両側に隣接しています。私たちは、融合させ、SV40eの連続添加は、次第にトランスフェクション効率7の対応する増加を与えることを他の場所で実証されています。前駆体プラスミド（pDNAをMiniStringまたはPDMS）は、緑色蛍光レポーター（GFP）との転写融合への関心の任意の所望の遺伝子の挿入を容易にするポリリンカー（ 図1）が含まれています。 DNAのminivector技術かもしれません真核生物系における導入遺伝子発現の効率に向かって遺伝子導入、レポーター遺伝子の発現、および評価するための従来の方法の代わりに使用します。 DNAのministringsは、生体適合性を組み合わせて、直線状のDNAベクターの優れた安全性プロファイルと「ミニ」ベクターのトランスフェクション効率の利益を増加させました。当社の強固なワンステップ生産プラットフォームは、迅速かつ簡単に任意の遺伝子転送アプリケーションのためのDNA ministringsを生成し、高い安全性プロファイルを提供しています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1428">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">E. coli W3NN&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Mediphage</td>
			<td style="width:268px;"></td>
			<td style="width:492px;">strain for ministring processing: Nafissi &#38; Slavcev, 2012</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">pDMS.IRES.GFP</td>
			<td style="width:295px;">Mediphage</td>
			<td style="width:268px;"></td>
			<td>parent plasmid for ministring processing: also referred to as pDNA Ministring (pDMS)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:375px;">BD&#8482; Difco&#8482; Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani)</td>
			<td style="width:295px;">Fisher Scientific</td>
			<td>244620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Fisher BioReagents&#8482; Terrific Broth</td>
			<td style="width:295px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:268px;">BP2468500</td>
			<td style="width:492px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">BD&#8482; Bacto&#8482; Dehydrated Agar</td>
			<td style="width:295px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:268px;">214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Ampicilin</td>
			<td style="width:295px;">MP Biomedicals LCC</td>
			<td style="width:268px;">2190147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Ultrapure Milipore Water</td>
			<td style="width:295px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:268px;">Z00Q0V0US</td>
			<td>Model: Mili-Q Advantage A10 Water Purification System</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:375px;">Surgical Gloves</td>
			<td style="width:295px;">VWR</td>
			<td style="width:268px;">(S) 82026-424, (M)82026-426, (L) 82026-428, (XL) 82026-430&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:375px;">Fisherbrand&#8482; Petri Dishes with Clear Lid Raised Ridge (100 x 15 mm)</td>
			<td style="width:295px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:268px;">FB0875712&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">30 mL KIMAX&#174; Test Tubes</td>
			<td style="width:295px;">VWR</td>
			<td style="width:268px;">89001-448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Spectrophotometer Cuvette</td>
			<td style="width:295px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:268px;">67.74</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Sterile 15 mL Falcon Tubes</td>
			<td style="width:295px;">&#160;BD Falcon</td>
			<td>62406-200,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">&#160;Sterile 50 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:295px;">&#160;FroggaBio</td>
			<td>2930-S0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon&#8482; Disposable Polystyrene Serological Pipets 10 mL</td>
			<td style="width:295px;">BD Falcon</td>
			<td>13-675-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon&#8482; Disposable Polystyrene Serological Pipets 25 mL</td>
			<td style="width:295px;">BD Falcon</td>
			<td>13-668-2&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Micropipettor (100-1000 &#956;L)</td>
			<td style="width:295px;">FroggaBio</td>
			<td style="width:268px;">C1000-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Micropipettor (20-200 &#956;L)</td>
			<td style="width:295px;">FroggaBio</td>
			<td style="width:268px;">C200-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Sterile Pipette Tips (100-1250 &#956;L)</td>
			<td style="width:295px;">VWR</td>
			<td style="width:268px;">89079-472&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Sterile Pipette Tips (1-200 &#956;L)</td>
			<td style="width:295px;">VWR</td>
			<td style="width:268px;">89079-460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Fisher Scientific Economy Burner</td>
			<td style="width:295px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:268px;">03-917Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Incubator Shaker</td>
			<td style="width:295px;">New Brunswick Scientific&#160;</td>
			<td style="width:268px;">M1352-00000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Sterile Erlenmeyer Flask (125 mL)</td>
			<td style="width:295px;">Pyrex (Sigma Aldrich)</td>
			<td>CLS4980125 Aldrich&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Sterile Erlenmeyer Flask (250 mL)</td>
			<td style="width:295px;">Pyrex (Sigma Aldrich)</td>
			<td>CLS4980250 Aldrich&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">&#160;Sterile Erlenmeyer Flask (500 mL)</td>
			<td style="width:295px;">Pyrex (Sigma Aldrich)</td>
			<td>CLS4980500 Aldrich&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:268px;">335901</td>
			<td>Model: Genesys 10 Vis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Floor Centrifuge</td>
			<td style="width:295px;">Beckman Coulter&#160;</td>
			<td style="width:268px;">369001</td>
			<td>Model: Avanti J-E</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Benchtop Centrifuge</td>
			<td style="width:295px;">Beckman</td>
			<td style="width:268px;">362114</td>
			<td>Model: GS-6R</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Fisher Scientific Analog Vortex Mixer&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:268px;">02-215-365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">1 kb DNA Ladder</td>
			<td style="width:295px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:268px;">N3232S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of double-stranded dna ministrings

我々は、in vivoでのシンプルなプラットフォームを介して生成非ウイルス遺伝子送達ベクターの代替として（LCC）のDNA minivectors共有結合した線形を構築した。DNAのministringsが高まり安全性プロファイルを有し、また、効率的に標的細胞へのDNAの貨物を引き渡します。従来のDNAベクターは、抗生物質耐性遺伝子を含む、望ましくない原核生物配列、CpGモチーフを担持し、細菌の複製起点、宿主の免疫学的応答の刺激につながる可能性があります。従来のDNAベクターの生物学的利用能はまた、それらのより大きな分子サイズに妥協されます。その円形の性質はまた、挿入変異誘発につながる、染色体組み込みを付与することができます。 細菌配列にのみ関心のある遺伝子（GOI）及び必要な真核生物の発現要素を残して、DNAのminivectorsから切除されます。当社のLCCのDNAのminivectors、またはDNA ministringsは、免疫原性細菌配列を欠いています。したがって番目を改善EIR生物学的利用能およびGOI表現。染色体へのベクターの統合の際には、LCCのDNAのministringは致死的に、それによって増殖する細胞集団から潜在的に危険な変異体を除去する、宿主染色体を混乱させるだろう。望ましくないベクター組込み事象の可能性を排除しつつ、DNAのministringsは「ミニサークル」DNAの利点を提供しています。従来のプラスミドおよびその同質遺伝子円形共有結合した（CCC）の対応と比較して、DNAのministringsは、優れた生物学的利用能、トランスフェクション効率、および細胞質の動態を実証する - 彼らは、このように、標的細胞の効果的なトランスフェクションのためのカチオン性界面活性剤の低い量を必要とします。 我々は、使用が簡単で迅速、かつスケーラブルである大腸菌におけるDNA ministringsの生産のためのワンステップ誘導インビボ系を構築しました。

DNA抽出後、残りの前駆体プラスミド、LCC原核バックボーン、およびDNA ministringが回復されます。全体的なプラスミド収率及び純度は分光光度計を用いて評価することができます。純度は、1.9〜2.0の比が最適である260 nmでの吸光度の比および280nm（A260 / A280）を用いて推定されます。すべてのLCCおよびCCC産物をアガロースゲル電気泳動（AGE）（ 図2）を介して分離することができます。 AGEは前ministring精製に、熱誘導後の生産をministringの結果を可視化します。 ministring生産の定性的評価は、親プラスミド（5.6 KB）（ 図2）にministring（2.4 KB）のバンド強度を比較することにより、この段階で行うことができます。 Ministring DNAはAGE以下の標準プラスミドゲル抽出プロトコルを介して回収することができる。 図3搬送中に発生する可能性が様々な条件下での生産効率をministring要約プロトコルをる。 Ministring生産効率、製造者の解析プログラムを使用して、DNAバンドの強度に基づいて決定しました。任意の類似した濃度測定プログラムは、AGEの結果を分析するために使用することができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53177/53177fig1highres.jpg" width="700" /> 図1：生産をministringの概要 （A）親ベクターは、2つのSSサイトに囲まれたレポーター遺伝子と転写融合でポリリンカーを、含まれています。バックボーンは、アンピシリン耐性のβ-ラクタマーゼをコードし、また、in vitro消化のためのバックボーンに固有のいくつかの切断部位が含まれています。 （B）主プロトコルの概要。ステップ2）成長フェーズおよび3）Ministring生産は、プロトコルのシンプルさを強調し、関連する手順の全体概略を提供するために、図に表されています。 （C）Ministring誘導。熱誘導は親プラスミド中のSSサイト上の電話活動が続くTEL発現を可能にする、温度感受性リプレッサーを不活性化する。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53177/53177fig1highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53177/53177fig2highres.jpg" width="350" /> 図2：プロトコルからの逸脱後に生産をMinistring。 1：コントロール、2：非誘導、3：生い茂る、4：Overinduced、5：早期除去。 DNAのministringはLCC骨格は3キロバイトで、pNN9親プラスミドは5.6キロバイトで、約2.4キロバイトです。 ministringとLCCバックボーンバンドのバンド強度は低いministring収量を示す、プロトコルからの逸脱でドロップします。左から右へ：New England Biolabs社から1キロバイトラダー。コントロール、プロトコルに従って、誘導されていない、ない温度シフトアップ;生い茂る、温度アップシフトドゥリングラム固定相; Overinduced、拡張温度シフトアップ。早期の除去、温度無ダウンシフト。プラスミドはオメガバイオテクEZNAプラスミドミニキットを用いて抽出した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53177/53177fig2highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53177/53177fig3highres.jpg" width="550" /> 図3：生産効率（PE）をministring上のプロトコルからの逸脱の影響結果は、3つの試験の平均です。 PEは、AGE後AlphaImager HPを使用して測定された相対バンド強度から推定されます。偏差は、以下の手順で発生します。コントロール、プロトコルに従って、非誘導、ステップ2で、温度無シフトアップ。生い茂る、温度上昇は、ステップ1.6で固定相の間に始まりました。 Overinduced、ステップ2.3で拡張温度シフトアップ。早期の除去は、細胞を除去し、抽出しましたステップ2.3での温度ダウンシフトなし。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53177/53177fig3highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

Watch this Scientific Journal Video about Production of Double-stranded DNA Ministrings at JoVE.com

Production of Double-stranded DNA Ministrings

The linear covalently closed (LCC) DNA minivector (DNA ministring) is a non-viral gene delivery vector offering high transfection efficiency and is relevant to any DNA delivery application. The production system is simple, rapid, and scalable in vivo. The following protocol provides visual step-by-step instructions for the production of DNA ministrings.

二本鎖DNA Ministringsの生産

We constructed linear covalently closed (LCC) DNA minivectors as a non-viral gene-delivery vector alternative produced via a simple platform in vivo. DNA ...

production-of-double-stranded-dna-ministrings

Research

JoVE Journal

Biology

10.3K ビュー.  University of Waterloo. The linear covalently closed (LCC) DNA minivector (DNA ministring) is a non-viral gene delivery vector offering high transfection efficiency and is relevant to any DNA delivery application. The production system is simple, rapid, and scalable in vivo. The following protocol provides visual step-by-step instructions for the production of DNA ministrings. 

ビデオ: Production of Double-stranded DNA Ministrings

Technical Demonstration of Whole Genome Array Comparative Genomic Hybridization

Array comparative genomic hybridization (array CGH) is a method for detecting gains and losses of DNA segments or gene dosage in the genome 1. Recent advances in this technology have enabled high resolution comparison of whole genomes for the identification of genetic alterations in cancer and other genetic diseases 2. The Sub-Megabase Resolution Tiling-set array (or SMRT) array is comprised of a set of approximately thirty thousand overlapping bacterial artificial chromosome (BAC) clones that span the human genome in ~100 kilobase pair (kb) segments 2. These BAC targets are individually synthesized and spotted in duplicate on a single glass slide 2-4. Array CGH is based on the principle of competitive hybridization. Sample and reference DNA are differentially labeled with Cyanine-3 and Cyanine-5 fluorescent dyes, and co-hybridized to the array. After an incubation period the unbound samples are washed from the slide and the array is imaged. A freely available custom software package called SeeGH (www.flintbox.ca) is used to process the large volume of data collected - a single experiment generates 53,892 data points. SeeGH visualizes the log2 signal intensity ratio between the 2 samples at each BAC target which is vertically aligned with chromosomal position 5,6. The SMRT array can detect alterations as small as 50 kb in size 7. The SMRT array can detect a variety of DNA rearrangement events including DNA gains, losses, amplifications and homozygous deletions. A unique advantage of the SMRT array is that one can use DNA isolated from formalin fixed paraffin embedded samples. When combined with the low input requirements of unamplified DNA (25-100ng) this allows profiling of precious samples such as those produced by microdissection 7,8. This is attributed to the large size of each BAC hybridization target that allows the binding of sufficient labeled samples to produce signals for detection. Another advantage of this platform is the tolerance of tissue heterogeneity, decreasing the need for tedious tissue microdissection 8. This video protocol is a step-by-step tutorial from labeling the input DNA through to signal acquisition for the whole genome tiling path SMRT array.

This video is a technical demonstration of the hybridization protocol for whole genome tiling path array CGH, which scans the entire human genome using only 25-100 ng of DNA that can be isolated from a variety of sources, including archival formalin fixed material.

全ゲノムアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーションの技術デモンストレーション

Array comparative genomic hybridization (array CGH) is a method for detecting gains and losses of DNA segments or gene dosage in the genome 1.  Recent ...

生物学

Methylated DNA Immunoprecipitation

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on gene expression, and is involved with normal development as well as disease 1-4. Thus, the ability to discriminate between methylated DNA and non-methylated DNA is essential for generating methylation profiles for such studies. Methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP) is an efficient technique for the extraction of methylated DNA from a sample of interest 5-7. A sample of as little as 200 ng of DNA is sufficient for the antibody, or immunoprecipitation (IP), reaction. DNA is sonicated into fragments ranging in size from 300-1000 bp, and is divided into immunoprecipitated (IP) and input (IN) portions. IP DNA is subsequently heat denatured and then incubated with anti-5'mC, allowing the monoclonal antibody to bind methylated DNA. After this, magnetic beads containing a secondary antibody with affinity for the primary antibody are added, and incubated. These bead-linked antibodies will bind the monoclonal antibody used in the first step. DNA bound to the antibody complex (methylated DNA) is separated from the rest of the DNA by using a magnet to pull the complexes out of solution. Several washes using IP buffer are then performed to remove the unbound, non-methylated DNA. The methylated DNA/antibody complexes are then digested with Proteinase K to digest the antibodies leaving only the methylated DNA intact. The enriched DNA is purified by phenol:chloroform extraction to remove the protein matter and then precipitated and resuspended in water for later use. PCR techniques can be used to validate the efficiency of the MeDIP procedure by analyzing the amplification products of IP and IN DNA for regions known to lack and known to contain methylated sequences. The purified methylated DNA can then be used for locus-specific (PCR) or genome-wide (microarray and sequencing) methylation studies, and is particularly useful when applied in conjunction with other research tools such as gene expression profiling and array comparative genome hybridization (CGH) 8. Further investigation into DNA methylation will lead to the discovery of new epigenetic targets, which in turn, may be useful in developing new therapeutic or prognostic research tools for diseases such as cancer that are characterized by aberrantly methylated DNA 2, 4, 9-11.

This video demonstrates the protocol for methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP). MeDIP is a two day procedure that selectively extracts methylated DNA fragments from a genomic DNA sample using antibodies with specificity for 5 -methylcytosine (anti-5 mC).

メチル化DNA免疫沈降

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on ...

Lentivirus Production

RNA interference (RNAi) is a system of gene silencing in living cells. In RNAi, genes homologous in sequence to short interfering RNAs (siRNA) are silenced at the post-transcriptional state. Short hairpin RNAs, precursors to siRNA, can be expressed using lentivirus, allowing for RNAi in a variety of cell types. Lentiviruses, such as the Human Immunodeficiency Virus, are capable to infecting both dividing and non-dividing cells. We will describe a procedure which to package lentiviruses. Packaging refers to the preparation of competent virus from DNA vectors. Lentiviral vector production systems are based on a 'split' system, where the natural viral genome has been split into individual helper plasmid constructs. This splitting of the different viral elements into four separate vectors diminishes the risk of creating a replication-capable virus by adventitious recombination of the lentiviral genome. Here, a vector containing the shRNA of interest and three packaging vectors (p-VSVG, pRSV, pMDL) are transiently transfected into human 293 cells. After at least a 48-hour incubation period, the virus containing supernatant is harvested and concentrated. Finally, virus titer is determined by reporter (fluorescent) expression with a flow cytometer.

To make lentiviruses, DNA vectors are transfected into human 293 cells. After harvest and concentrating the supernatant, virus titer is determined by fluorescence expression with a flow cytometer.

レンチウイルスの生産

RNA interference (RNAi) is a system of gene silencing in living cells. In RNAi, genes homologous in sequence to short interfering RNAs (siRNA) are ...

DNA Stable-Isotope Probing (DNA-SIP)

DNA stable-isotope probing (DNA-SIP) is a powerful technique for identifying active microorganisms that assimilate particular carbon substrates and nutrients into cellular biomass. As such, this cultivation-independent technique has been an important methodology for assigning metabolic function to the diverse communities inhabiting a wide range of terrestrial and aquatic environments. Following the incubation of an environmental sample with stable-isotope labelled compounds, extracted nucleic acid is subjected to density gradient ultracentrifugation and subsequent gradient fractionation to separate nucleic acids of differing densities. Purification of DNA from cesium chloride retrieves labelled and unlabelled DNA for subsequent molecular characterization (e.g. fingerprinting, microarrays, clone libraries, metagenomics). This JoVE video protocol provides visual step-by-step explanations of the protocol for density gradient ultracentrifugation, gradient fractionation and recovery of labelled DNA. The protocol also includes sample SIP data and highlights important tips and cautions that must be considered to ensure a successful DNA-SIP analysis.

DNA Stable-Isotope Probing DNA-SIP

DNA stable-isotope probing is a cultivation-independent method to identify and characterize active communities of microorganisms that are capable of utilizing specific substrates. Assimilation of substrate enriched in heavy isotope leads to incorporation of labelled atoms into microbial biomass. Density gradient ultracentrifugation retrieves labelled DNA for downstream molecular analyses.

プロービングDNA安定同位体（DNA - SIP）

DNA stable-isotope probing (DNA-SIP) is a powerful technique for identifying active microorganisms that assimilate particular carbon substrates and ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

遺伝学的およびエピジェネティクス解析のためのパラフィン包埋材料からのDNA抽出

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Iterative Optimization of DNA Duplexes for Crystallization of SeqA-DNA Complexes

Escherichia coli SeqA is a negative regulator of DNA replication that prevents premature reinitiation events by sequestering hemimethylated GATC clusters within the origin of replication1. Beyond the origin, SeqA is found at the replication forks, where it organizes newly replicated DNA into higher ordered structures2. SeqA associates only weakly with single GATC sequences, but it forms high affinity complexes with DNA duplexes containing multiple GATC sites. The minimal functional and structural unit of SeqA is a dimer, thereby explaining the requirement of at least two GATC sequences to form a high-affinity complex with hemimethylated DNA3. Additionally, the SeqA architecture, with the oligomerization and DNA-binding domains separated by a flexible linker, allows binding to GATC repeats separated by up to three helical turns. Therefore, understanding the function of SeqA at a molecular level requires the structural analysis of SeqA bound to multiple GATC sequences. In protein-DNA crystallization, DNA can have none to an exceptional effect on the packing interactions depending on the relative sizes and architecture of the protein and the DNA. If the protein is larger than the DNA or footprints most of the DNA, the crystal packing is primarily mediated by protein-protein interactions. Conversely, when the protein is the same size or smaller than the DNA or it only covers a fraction of the DNA, DNA-DNA and DNA-protein interactions dominate crystal packing. Therefore, crystallization of protein-DNA complexes requires the systematic screening of DNA length4 and DNA ends (blunt or overhang)5-7. In this report, we describe how to design, optimize, purify and crystallize hemimethylated DNA duplexes containing tandem GATC repeats in complex with a dimeric variant of SeqA (SeqA&Delta;(41-59)-A25R) to obtain crystals suitable for structure determination.

Crystal structure of protein&#x2013;DNA complexes can provide insight into protein function, mechanism, as well as, the nature of the specific interaction. Here, we report how to optimize the length, sequence and ends of duplex DNA for co-crystallization with Escherichia coli SeqA, a negative regulator of replication initiation.

SeqA-DNA複合体の結晶化のためのDNA二重鎖の反復最適化

Escherichia coli SeqA is a negative regulator of DNA replication that prevents premature reinitiation events by sequestering hemimethylated GATC clusters ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

レシオメトリック二分子ビーコンを使用して、生細胞における単エンジニアのRNA転写物のリアルタイムイメージング

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Reduced-gravity Environment Hardware Demonstrations of a Prototype Miniaturized Flow Cytometer and Companion Microfluidic Mixing Technology

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If humans are to travel beyond low Earth orbit, a transition towards space-ready, point-of-care (POC) testing is required. Such testing needs to be comprehensive, easy to perform in a reduced-gravity environment, and unaffected by the stresses of launch and spaceflight. Countless POC devices have been developed to mimic laboratory scale counterparts, but most have narrow applications and few have demonstrable use in an in-flight, reduced-gravity environment. In fact, demonstrations of biomedical diagnostics in reduced gravity are limited altogether, making component choice and certain logistical challenges difficult to approach when seeking to test new technology. To help fill the void, we are presenting a modular method for the construction and operation of a prototype blood diagnostic device and its associated parabolic flight test rig that meet the standards for flight-testing onboard a parabolic flight, reduced-gravity aircraft. The method first focuses on rig assembly for in-flight, reduced-gravity testing of a flow cytometer and a companion microfluidic mixing chip. Components are adaptable to other designs and some custom components, such as a microvolume sample loader and the micromixer may be of particular interest. The method then shifts focus to flight preparation, by offering guidelines and suggestions to prepare for a successful flight test with regard to user training, development of a standard operating procedure (SOP), and other issues. Finally, in-flight experimental procedures specific to our demonstrations are described.

Spaceflight blood diagnostics need innovation. Few demonstrations have been published illustrating in-flight, reduced-gravity health diagnostic technology. Here we present a method for construction and operation of a parabolic flight test rig for a prototype point-of-care flow-cytometry design, with components and preparation strategies adaptable to other setups.

プロトタイプ小型化フローサイトメーターおよびコンパニオンマイクロ流体混合技術の縮小重力環境ハードウェアデモンストレーション

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If ...

A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses performed. Considering that the use of new bacterial community analysis techniques (e.g., microbiomics, metagenomics) is becoming more prevalent in the agricultural and environmental sciences and many environmental samples within these disciplines can be physiochemically and microbiologically unique (e.g., fecal and litter/bedding samples from the poultry production spectrum), appropriate and effective DNA extraction methods need to be carefully chosen. Therefore, a novel semi-automated hybrid DNA extraction method was developed specifically for use with environmental poultry production samples. This method is a combination of the two major types of DNA extraction: mechanical and enzymatic. A two-step intense mechanical homogenization step (using bead-beating specifically formulated for environmental samples) was added to the beginning of the &#8220;gold standard&#8221; enzymatic DNA extraction method for fecal samples to enhance the removal of bacteria and DNA from the sample matrix and improve the recovery of Gram-positive bacterial community members. Once the enzymatic extraction portion of the hybrid method was initiated, the remaining purification process was automated using a robotic workstation to increase sample throughput and decrease sample processing error. In comparison to the strict mechanical and enzymatic DNA extraction methods, this novel hybrid method provided the best overall combined performance when considering quantitative (using 16S rRNA qPCR) and qualitative (using microbiomics) estimates of the total bacterial communities when processing poultry feces and litter samples.

A novel semi-automated hybrid DNA extraction method for use with environmental poultry production samples was developed and demonstrated improvements over a common mechanical and enzymatic extraction method in terms of the quantitative and qualitative estimates of the total bacterial communities.

家禽生産のサンプルからの細菌群集の定性的および定量的評価のためのハイブリッドDNA抽出法

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

膜タンパク質の緑色蛍光タンパク質ベースの発現スクリーニングで<em&gt;エシェリヒア·コリ</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...