Die Autoren danken den Naturwissenschaften und Engineering Research Council of Canada (NSERC) für die Förderung dieser Arbeit.

1. Herstellung von Medien und Kulturen <ol><li> Für LB + Amp: Bereiten 500 ml Luria-Bertani-Brühe (LB) sterilisiert für 30 min einem Autoklaven bei 121 ° C verwendet wird. Supplement mit Ampicillin in einer Endkonzentration von 100 ug / ml Ampicillin und lagern bei 4 ° C zu erhalten, bis sie benötigt. </li><li> Für TB + Amp: Bereiten Sie sich auf große (500 ml oder mehr) Produktionsvolumina MiniString-. Bereiten 600 ml steriler Terrific Broth (TB) sterilisiert unter Verwendung eines Autoklaven bei 121 ° C für 30 min. Supplement mit Ampicillin in einer Endkonzentration von 100 ug / ml Ampicillin und lagern bei 4 ° C zu erhalten, bis sie benötigt. </li><li> Für LB-Agar + Amp: Bereiten sterile LB-Agarplatten mit LB + Amp mit 15 g / l Agar ergänzt vorbereitet. Aliquotieren ca. 15, - 20 ml in sterile Petrischalen und speichern den Kopf bei 4 ° C, bis sie benötigt. </li><li> Bereiten Sie eine Ausstrichplatte von W3NN [PDMS] von aseptisch Ausstreichen W3NN [PDMS] Zellen auf LB-Agar + Amp. Die Platte overnight bei 30 ° C, bis einzelne Kolonien beobachtet werden können. Sie brüten nicht W3NN oberhalb dieser Temperatur dereprimieren protelomerase Ausdruck zu vermeiden. </li><li> Aseptisch Transfer 5 ml LB + Amp in ein steriles Reagenzglas. Bereiten Sie eine Nacht-Kultur von W3NN [PDMS] durch dieses Volumen mit einer einzelnen Kolonie von der Ausstrichplatte Inokulation. Inkubieren der Kultur über Nacht bei 30 ° C in einem Schüttler bei 230-250 Umdrehungen pro Minute. </li></ol> 2. Wachstum Phase <ol><li> Aseptisch Transfer 10 ml LB + Amp in einen sterilen 125 ml Erlenmeyerkolben und impfen mit 100 &amp; mgr; l der über Nacht W3NN [PDMS] Kultur in die vorbereitete LB + Amp, so dass eine 1: 100-Verdünnung. <ol><li> Für größere Volumina, 500 &amp; mgr; l über Nacht Kultur in 50 ml TB + Amp in einem 250-ml-Erlenmeyerkolben, anstelle von LB + Amp. </li><li> Alternativ können Sie als zweite &quot;repräsentativ&quot; Kultur in Schritt 2.2. </li></ol></li><li> Inkubieren in einem Schüttelinkubator bei 30 ° C und 250 rpm bis zum culture erreicht durch eine optische Dichte (OD) oder Absorption bis zur späten logarithmischen Phase, angegeben mid: A 600 = 0,8. Nach 1-2 Stunden sollte das Medium beginnen mit dem bloßen Auge trüb erscheinen. <ol><li> Aseptisch 1 ml der Kultur auf eine saubere Spektrophotometerküvette. </li><li> Messen Sie die Lichtabsorption eines UV-VIS-Spektralphotometer mit der Wellenlänge auf 600 nm verwendet wird. Verwenden Sie 1 ml der Medien, in denen Zellen, die den Rohling (LB oder TB) zu setzen angebaut wurden. Optional können Sie die repräsentative Kultur aus Schritt statt 2.1.3 für diesen Schritt. </li><li> Wenn die Kultur noch nicht den entsprechenden OD erreicht, kehren Sie zu den Shaker geben und überprüfen Sie noch einmal jede halbe Stunde. Überprüfen Sie die OD häufiger als die A 600 0,8 nähert. </li></ol></li><li> Sobald die Kultur der späten log - Phase, angezeigt durch A 600 = 0,8, aseptisch übertragen die Kultur in sterile 50 ml Zentrifugenröhrchen erreicht hat. </li><li> Sammle die Zellen durch die Kultur bei 10.000 xg für 10 min zentrifugiert. Überprüfen Sie für eine peam Boden des Röhrchens llet. </li><li> Umfüllen geklärte Überstand in einen geeigneten Abfallbehälter Biohazard. Nicht das Zellpellet stören. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2,4-2,5, bis alle Zellen gesammelt wurden. </li><li> Re-suspend das Pellet in 100 ul LB + Amp. Absaugen mit einer Mikropipette oder einen Wirbelmischer verwenden. Für eine größere MiniString- Produktion, resuspendieren Sie das Pellet aus einem 50 ml TB + Amp-Kultur in 1 ml frischem LB + Amp-Medien. </li></ol> 3. Ministring Produktion <ol><li> Aseptisch 20 ml LB + Amp in einem 125 ml Erlenmeyerkolben und Wärme auf 42 ° C. Für eine höhere Produktions MiniString- bereiten 500 ml LB + Amp, vorgewärmt auf 42 ° C. </li><li> Übertragen Sie die Aufwirbelung in die vorgewärmte Medium. </li><li> Inkubieren bei 42 ° C und 250 rpm bis zum letzten logarithmischen Phase, angedeutet durch A 600 = 1,0. Lassen Sie keine 20 ml Kultur bei 42 ° C über 1 Stunde. </li><li> Reduzieren Sie die Temperatur auf 37 ° C und lassen Sie die Kultur für eine zusätztionale 90 min. Für 500 ml, lassen Sie die Kultur für eine zusätzliche Induktionszeit von 90 bis 120 min und nicht die Temperatur zu senken. </li><li> Reduzieren Sie die Temperatur auf 30 ° C und lassen Sie die Kultur bei 200 Umdrehungen pro Minute für eine zusätzliche Temperaturherunterschalten Zeitraum von 2 h schütteln. Für 500 ml, wobei die Temperatur Herunterschalten bis 4 Stunden verlängern oder über Nacht. </li></ol> 4. Ernten Ministrings <ol><li> Unter aseptischen Bedingungen wird die Kultur in sterile 50 ml Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge bei 10.000 g für 10 min und inspizieren für einen Pellet. </li><li> Den Überstand umfüllen in einen geeigneten Abfallbehälter Biohazard, ohne das Pellet zu stören. Wiederholen, bis alle Zellen gesammelt wurden. </li><li> Bewahren Sie das Pellet für Plasmid-Extraktion mit einer kommerziellen Extraktion und Endotoxinentfemung Kit oder Blitzeis in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C für die spätere Extraktion. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Wir beschreiben hier ein einfaches System zur Herstellung von LCC DNA Ministrings unter Verwendung eines einstufigen hitzeinduzierbaren Protokoll, das zur Seite keine spezielle Ausrüstung erfordert, von der, die in typischen Bakterienwachstum und Manipulation verwendet wird. DNA-Ministrings sind verwindungssteife, stabile lineare DNA-Expressionskassetten, frei von prokaryotischen genetischen Elementen. Sie können anstelle von konventionellen Verfahren für den Gentransfer, die Expression von Reportergenen, sowie in Abschätzungen in Richtung der Wirksamkeit der Transgen-Expression in eukaryotischen Systemen verwendet werden. DNA-Ministrings kombinieren, um die Biokompatibilität und erhöhte Transfektionseffizienz Vorteile von &quot;Mini&quot; Vektoren mit der überlegenen Sicherheitsprofil von linearen DNA-Vektoren. Unsere robuste Ein-Schritt - in - vivo - Produktionsplattform schnell und einfach produziert DNA Ministrings für jedes Gen - Transfer - Anwendung ohne die Notwendigkeit für mehrere teure In - vitro - Verfahren. Es gibt mehrere wichtige Schritte zusorgen für eine optimale MiniString- Produktion (Abbildungen 2 und 3). Wärmeinduktion ist der kritischste Schritt zur Herstellung MiniString-. Vollständiges Fehlen der Produktion von MiniString- ist höchstwahrscheinlich wegen des Mangels an Wärmeinduktion (Zellen bei 30 ° C gehalten), wo Unterdrückung der protelomerase Ausdruck Umwandlung von Vorläufer Plasmid LCC MiniString- verhindert. Im Anschluss an die Wärmeinduktion Protokoll, erwarten eine Produktionseffizienz von etwa 75%. Wärmeinduktion ist optimal, während Zellen in der log-Phase sind. Obwohl es in MiniString- PE keinen statistisch signifikanten Unterschied ist , wenn die Zellen in der stationären Phase ( &quot;Overgrown&quot;, Abbildung 3) verwenden, haben wir fast eine 50% ige Abnahme der Gesamt Plasmidausbeute beobachten. Die Erträge werden auf der verwendeten Plasmid-Extraktionsprotokoll abhängen. Für eine optimale MiniString- Produktion auslösen Wärmeinduktion, während Zellen in der log-Phase sind. Schlechte MiniString- Produktion wird höchstwahrscheinlich ein Ergebnis einer längeren Temperatur Hoch- oder insufficie seinnt Temperatur Herunterschalten. Längerer Temperatur Hochschalten wird abgeraten , da dies der E. aktiviert coli Hitzeschockantwort 15, die protelomerase Aktivität hemmen kann und mit dem Plasmid Stabilität stören. Daher die Temperatur Herunterschalten Timing ist ein weiterer wichtiger Schritt für eine effiziente MiniString- Produktion. Ohne zusätzliche Inkubationszeit bei 30 ° C wurde MiniString- Produktionseffizienz als sehr schlecht zu sein ( &quot;Early Removal&quot;, Abbildung 3). Dies kann auf die Menge an Zeit für Tel Expression und Aktivität erforderlich zurückzuführen. Der Ursprung Prophagen PY54 Codierung Tel protelomerase infiziert normalerweise Yersinia, die optimal wächst um 28 ° C 12, was darauf hinweist , dass 30 ° C auch für Tel Aktivität mehr optimal ist. Die DNA - minivector Produktionssystem verwendet eine in vivo Plattform qualitativ hochwertige bakterielle Sequenz freie DNA minivectors zu erzeugen. i Modifikationen des Protokolls kannnclude die Wachstumsmedien zu verändern Plasmid und die Proteinproduktion zu optimieren, um das Zellwachstum während der Wachstumsphase (TB anstelle von LB) zu fördern, oder die Effizienz zu steigern MiniString- Produktion und Umwandlung. Für größere Kulturvolumina (200 ml und mehr), Temperatur Herunterschalten und Inkubation bei 30 ° C kann auf MiniString- PE über Nacht ohne starke negative Auswirkung verlängert werden. Wir haben als Beispiel für die 500-ml-Kulturen Änderungen in unserem Protokoll enthalten. Reinigung von DNA - Ministrings können durch in vitro - Endonuklease - Verdau des prokaryotischen Rückgrat beschleunigt werden. Es gibt eine Anzahl von Endonuclease - Zielstellen (beispielsweise PI-SceI, PvuI, ScaI) auf dem prokaryotischen Rückgrat des Vorläufers Plasmid, das geschnitten werden kann , offen linear zu belichten endet, so dass für in vitro - Abbau des prokaryotischen Rückgrat. Isolierung von Ministrings aus anderen Vektorarten können auch durch Anionenaustauschermembran - Chromatographie 16 erreicht werden. Eine Strombegrenzung, die mit dem LCC-DNA-Vektor-Produktionssystem ist die Notwendigkeit einer Reinigung der DNA MiniString- von anderen LCC und CCC Produkte. Obwohl Verfahren unter Verwendung von Standard-Plasmidisolation leicht gereinigt, kann der Isolationsschritt noch ein Nachteil in einer groß angelegten Einstellung sein. Trennung des MiniString- kann AGE zu verwenden, wenn die Ministring und das LCC prokaryotischen Rückgrat zu ähnlich groß sein zeitraubend. Alternativ bieten kann Anionenaustauschermembran Chromatographie eine bessere Trennung von Ministrings von CCC Vektorarten 16. Temperatur Hochschalten kann eine weitere mögliche Einschränkung sein , da hohe Temperaturen auch die Hitzeschockantwort in E. aktivieren coli, das rekombinante Protein liefert 17 wirkt sich negativ auf und folglich Raten von Plasmid reduzieren Umstellung auf MiniString-. Wir berichten an anderer Stelle Optimierungen der Produktionsplattform zu umgehen und / oder zu mildern solche Effekte von Hitzeschock - 18. Wiroptimieren derzeit auch Methoden LCC Kontamination prokaryotischen Rückgrat in vivo zu beseitigen oder zu reduzieren. Chromosomale Integration der LCC DNA MiniString- stört das Wirtschromosom und unterzieht die Zelle zur Apoptose. Nicht nur, dass diese zu reduzieren, mögliche negative Auswirkungen von Insertionsmutagenese wie oncogenesis und Silencing von benachbarten Genen, wodurch die Verbesserung ihrer Sicherheit; die letale Wirkung kann auch als ideales Verfahren zum knock-in und gene replacement Untersuchungen ohne die damit verbundenen Nebenwirkungen und Beschädigungen der Integration dienen. DNA MiniString- Vektoren können in Richtung der Transfer und die Expression von Genen für die therapeutische Proteine, RNA, Antikörper oder Antigene in einem gegebenen Ziel in vivo angewendet werden , oder eine Fehl- oder nicht - funktionelle Allel ersetzen. Die einfache Ein-Schritt hitzeinduzierbaren in vivo Produktionssystem ermöglicht DNA MiniString- Vektoren leicht für klinische oder industrielle Anwendungen hergestellt werden.

Das Ziel ist , skalierbare Mengen von linearen zu produzieren kovalent geschlossen (LCC) DNA minivectors mit einem einfachen und einen hohen Wirkungsgrad in einem Schritt hitzeinduzierbarer in vivo DNA MiniString- Produktionssystem. DNA-Ministrings bieten eine sichere und wirksame nicht-viralen Strategie DNA zu liefern. Sie kombinieren die Sicherheit von LCC-Vektoren mit der Effizienz von DNA-Minicircles, und bieten auch eine sicherere Alternative zu Virus-abgeleiteten Vektoren ohne Transfektionseffizienz zu beeinträchtigen. Damit ein Transgen Verabreichungssystem erfolgreich zu sein, muss die DNA Vektor, der die Ziel-Wirtszelle ein und das codierte Transgen (e) exprimieren. Es gibt mehrere zelluläre Barrieren, die vor allem in Säugersystemen in der Praxis überwunden werden müssen. Um den Abbau durch Nukleasen und Serumimmundetektion durch retikuloendothelialen System, das DNA-Vektor muss bio- und immun kompatibel sein mit dem Zielsystem zu vermeiden. Ungeschützte DNA wird schnell durch Plasma-Nukleasen verdautund die Plasmid-Membran besteht aus dichten Lipoprotein Barrieren besteht, so dass die DNA-Vektor schnell der Lage sein muss, die Plasmamembran von Zielzellen kreuzen. Einmal in der Zelle, Vektoren müssen das Zytoplasma durchqueren und die Kernmembran durchqueren den Kern für die Transgen-Expression einzugeben. Nicht-virale Techniken Genübertragung Fokus auf Verbesserung der Gewebe- und Zell-Targeting. Jedoch verringert die Verwendung von herkömmlichen Plasmiden mit diesen Techniken Transfektionseffizienz aufgrund des Vorhandenseins von immunogenen bakteriellen Sequenzen, die sich rasch Genexpression 1,2 verstummen. Herkömmliche Plasmide tragen typischerweise Antibiotika-Resistenzgene für die Wartung in prokaryotischen Systemen. Diese können jedoch mögliche schädliche Wirkungen auf menschliche Wirte produzieren oder Resistenz gegenüber natürlich vorkommenden Wirts Flora über den horizontalen Gentransfer Effekte verleihen. Herkömmliche Plasmiden auch Dinukleotid CpG - Motive 2, enthalten , die eine unerwünschte immunstimulierende Reaktion auslösen können, potenziellReduzierung oder Transgen-Expression zum Schweigen zu bringen. Da sie nur aus den eukaryotischen Expressionskassette enthalten sind, DNA minivectors, wie DNA - Miniringe 3 sind eine bessere Alternative für die Genabgabe wie sie extrazelluläre und intrazelluläre Bioverfügbarkeit und verbesserte Genexpression aufgrund ihrer verringerten Größe und Abwesenheit von immunstimulatorischen prokaryotischen Elemente verbessert aufweisen 4. Die reduzierten Vektorgröße Tarife besser in Bezug auf Beständigkeit gegen Scherkräfte , die mit in - vivo - Verabreichung an eine Zielstelle 5. Die höhere Kopienzahl des Vektors pro Masseneinheit erfordert weniger Transfektionsreagenz, wodurch die Toxizität verringert wird. Jedoch im Falle der Zufallsvektor Integration in ein Wirtschromosom, zirkular kovalent geschlossene (CCC) Vektoren, die sowohl DNA-Miniringe und konventionellen Plasmiden, molekulare Kontinuität verleihen und damit zu Insertionsmutagenese führen kann, was verheerende Folgen haben kann <sbis&gt; 6. Vergleichsweise, die Integration eines linearen DNA - Vektor , stört das Chromosom und initiiert Zelltod Wege, wodurch die mutierte Zelle aus der proliferierenden Zellpopulation zu entfernen und Insertionsmutagenese 7 verhindert wird . Minimalistische immunologisch definierte Genexpression (MIDGE) Vektoren 8 und Mikro-linearen Vektoren 9 (MiLV) sind LCC DNA - Vektoren in vitro entwickelt. MIDGE - Vektoren wurden auf eine 17-fache verbessert Transgen - Expression in vivo zeigten sich im Vergleich zu herkömmlichen Plasmid - DNA - Vektoren 11 und haben vielversprechende Ergebnisse in Impfstoff 10 und Krebs 8 Gentherapie demonstriert. Darüber hinaus aufgrund der verwindungsfreie Struktur des LCC minivector weniger Transfektionsreagenz ist im Vergleich zu dem CCC supercoiled Gegenstück erforderlich, wodurch die Toxizität reduzieren 7. Unsere verbesserte LCC DNA-Vektoren, DNA-Ministrings haben überlegen Expressionseffizienz und bioavai demonstriertLabilität 7. Weiterhin DNA Ministrings auf einem einstufigen hitzeinduzierbaren in vivo Produktionssystem produziert, eine zweckmäßige und kostengünstige Alternative zu MIDGE und MiLV LCC - Vektoren, die in vitro mehrere Schritte erfordern. Die DNA MiniString- Produktionssystem gezeigt werden , ist eine einfache hitzeinduzierbaren Verfahren in vivo durchgeführt wird , ist es sowohl kostengünstiger und leicht skalierbar macht. Dieses System nutzt die Yersinia enterocolitica Bakteriophagen PY54-derived Tel / pal protelomerase 12 Rekombinationssystem die minimal eukaryotischen Expressionskassette aus dem prokaryotischen Plasmidrückgrat zu trennen. Wir haben Escherichia coli - Zellen entwickelt (W3NN) Tel protelomerase unter der Kontrolle des hitzeinduzierbaren Bakteriophagen - λ - Promotor, cI [Ts] 857 13 auszudrücken. Bei der Expression wirkt Tel protelomerase auf pal Zielstellen , die innerhalb &quot;Super - Sequence&quot; (SS) Stellen auf dem Vorläufer Plasmid befindetLCC Produkte zu ergeben, aus dem das DNA MiniString- kann dann gereinigt werden (Figur 1). Die SS - Stellen auf der DNA MiniString- Vorläufer Plasmid codieren auch Zielstellen für andere Rekombinasen einschließlich Cre - Rekombinase (LOX), TelN protelomerase (telRL) und Flp - Rekombinase (FRT), wodurch die Herstellung von isogenen LCC und CCC minivectors von einem Vorläufer - Plasmid zu erleichtern. Zusätzlich wird jede SS Seite auf beiden Seiten von SV40 - Enhancer (SV40e) Sequenzen flankiert, die dazu dienen , 14 nukleäre Translokation zu verbessern. Wir haben an anderer Stelle gezeigt , dass sukzessive Zugabe von SV40e schrittweise Erhöhungen der Transfektionseffizienz 7 verleiht. Der Vorläufer - Plasmid (pDNA MiniString- oder PDMS) enthält einen Polylinker (Abbildung 1) Einführen eines beliebigen Gens von Interesse in transkriptionale Fusion mit dem grün fluoreszierenden Reporter (GFP) zu erleichtern. Die DNA-minivector Technologie kannanstelle von herkömmlichen Methoden für den Gentransfer, die Expression von Reportergenen und Beurteilungen auf die Effizienz der Transgen-Expression in eukaryotischen Systemen verwendet werden. DNA-Ministrings kombinieren, um die Biokompatibilität und erhöhte Transfektionseffizienz Vorteile von &quot;Mini&quot; Vektoren mit der überlegenen Sicherheitsprofil von linearen DNA-Vektoren. Unsere robuste Ein-Schritt-Produktionsplattform schnell und einfach produziert DNA Ministrings für jedes Gen-Transfer-Anwendung und bietet ein höheres Sicherheitsprofil.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; W3NN</td><td>Mediphage</td><td></td><td>strain for ministring processing: Nafissi &amp;amp; Slavcev, 2012</td></tr><tr><td>pDMS.IRES.GFP</td><td>Mediphage</td><td></td><td>parent plasmid for ministring processing: also referred to as pDNA Ministring (pDMS)</td></tr><tr><td>BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani)</td><td>Fisher Scientific</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents Terrific Broth</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2468500</td><td></td></tr><tr><td>BD Bacto Dehydrated Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilin</td><td>MP Biomedicals LCC</td><td>2190147</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure Milipore Water</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>Z00Q0V0US</td><td>Model: Mili-Q Advantage A10 Water Purification System</td></tr><tr><td>Surgical Gloves</td><td>VWR</td><td>(S) 82026-424, (M)82026-426, (L) 82026-428, (XL) 82026-430&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid Raised Ridge (100&amp;nbsp;x&amp;nbsp;15&amp;nbsp;mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>30 ml KIMAX Test Tubes</td><td>VWR</td><td>89001-448</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer Cuvette</td><td>Sarstedt</td><td>67.74</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 15 ml Falcon Tubes</td><td>&amp;nbsp;BD Falcon</td><td>62406-200,</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 50 ml Centrifuge Tubes</td><td>&amp;nbsp;FroggaBio</td><td>2930-S0</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Disposable Polystyrene Serological Pipets 10 ml</td><td>BD Falcon</td><td>13-675-20</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Disposable Polystyrene Serological Pipets 25 ml</td><td>BD Falcon</td><td>13-668-2&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Micropipettor (100-1,000&amp;nbsp;&amp;mu;l)</td><td>FroggaBio</td><td>C1000-1</td><td></td></tr><tr><td>Micropipettor (20-200&amp;nbsp;&amp;mu;l)</td><td>FroggaBio</td><td>C200-1</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Pipette Tips (100-1,250&amp;nbsp;&amp;mu;l)</td><td>VWR</td><td>89079-472&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Pipette Tips (1-200&amp;nbsp;&amp;mu;l)</td><td>VWR</td><td>89079-460</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific Economy Burner</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-917Q</td><td></td></tr><tr><td>Incubator Shaker</td><td>New Brunswick Scientific&amp;nbsp;</td><td>M1352-00000</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Erlenmeyer Flask (125 ml)</td><td>Pyrex (Sigma Aldrich)</td><td>CLS4980125 Aldrich&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Erlenmeyer Flask (250 ml)</td><td>Pyrex (Sigma Aldrich)</td><td>CLS4980250 Aldrich&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Erlenmeyer Flask (500 ml)</td><td>Pyrex (Sigma Aldrich)</td><td>CLS4980500 Aldrich&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>335901</td><td>Model: Genesys 10 Vis</td></tr><tr><td>Floor Centrifuge</td><td>Beckman Coulter&amp;nbsp;</td><td>369001</td><td>Model: Avanti J-E</td></tr><tr><td>Benchtop Centrifuge</td><td>Beckman</td><td>362114</td><td>Model: GS-6R</td></tr><tr><td>Fisher Scientific Analog Vortex Mixer&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>02-215-365</td><td></td></tr><tr><td>1 kb DNA Ladder</td><td>New England BioLabs</td><td>N3232S</td><td></td></tr></tbody></table>

production of double-stranded dna ministrings

Wir konstruierten linearen kovalent geschlossen (LCC) DNA minivectors als nicht-virale alternative Gen-Delivery - Vektor über eine einfache Plattform in vivo produziert. DNA - Ministrings ein erhöhtes Sicherheitsprofil besitzen und auch DNA - Ladung gezielt Zellen effizient zu liefern. Herkömmliche DNA Vektoren tragen unerwünschte prokaryotische Sequenzen, einschließlich Antibiotika-Resistenzgene, CpG-Motiven und bakterielle Replikationsursprünge, die an der Stimulation der Wirtsimmunreaktionen führen können. Die Bioverfügbarkeit von herkömmlichen DNA-Vektoren wird auch aufgrund ihrer grßeren Molekülgrße kompromittiert. Ihr Kreis Natur kann auch chromosomale Integration vermitteln, zu Insertionsmutagenese führt. Bakterielle Sequenzen werden von DNA minivectors ausgeschnitten, nur das Gen von Interesse (GOI) und notwendige eukaryotischen Expressionselemente zu verlassen. Unsere LCC DNA minivectors oder DNA-Ministrings, sind frei von immunogenen bakteriellen Sequenzen; daher die Verbesserung der thEIR Bioverfügbarkeit und GOI Ausdruck. Im Falle der Vektor-Integration in das Chromosom wird das LCC DNA MiniString- letal das Wirtschromosom zu stören, wodurch die möglicherweise gefährliche Mutante aus der proliferierenden Zellpopulation zu entfernen. Folglich bieten DNA-Ministrings die Vorteile von &#39;Minicircle-&#39; DNA, während das Potenzial für unerwünschte Vektorintegration Ereignisse zu beseitigen. Im Vergleich zu herkömmlichen Plasmiden und ihren isogenen Kreis kovalent geschlossene (CCC) Pendants zeigen DNA Ministrings überlegene Bioverfügbarkeit Transfektionseffizienz und cytoplasmatischen Kinetik - also sie geringere Mengen an kationischen Tensiden zur effektiven Transfektion von Zielzellen erforderlich ist. Wir haben ein Ein-Schritt - induzierbare in vivo - System für die Herstellung von DNA - Ministrings in Escherichia coli konstruiert , das einfach zu bedienen ist , schnelle und skalierbar.

Nach der DNA-Extraktion, wird Restvorläufer Plasmid, LCC prokaryotischen Rückgrat und die DNA MiniString- zurückgewonnen werden. Insgesamt Plasmid Ausbeute und Reinheit kann mit einem Spektralphotometer bewertet werden. Reinheit wird bei 260 nm und 280 nm (A260 / A280), wobei ein Verhältnis von 1,9-2,0 ist optimal mit dem Verhältnis der Absorption geschätzt. Alle LCC und CCC - Produkte können durch Agarose - Gelelektrophorese (AGE) (Abbildung 2) getrennt werden. AGE visualisiert die Ergebnisse der MiniString- Produktion nach der Wärmeinduktion, vor MiniString- Reinigung. Eine qualitative Bewertung der MiniString- Produktion kann durch den Vergleich Bandenintensität des MiniString- (2,4 kb) an die Mutter Plasmid (5,6 kb) (Abbildung 2) zu diesem Zeitpunkt durchgeführt werden. Ministring- DNA kann über Standard - Plasmid -Gelextraktions Protokolle folgende AGE zurückgewonnen werden. Abbildung 3 fasst MiniString- Produktionseffizienz unter verschiedenen Bedingungen wahrscheinlich auftreten , während carrying das Protokoll aus. MiniString- Produktionseffizienz wurde auf Basis von DNA-Bandenintensität bestimmt das Analyseprogramm des Herstellers mit. Jede ähnliche Densitometrie Programm kann verwendet werden, um die Ergebnisse von AGE zu analysieren. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53177/53177fig1highres.jpg" width="700" /> Abb . 1: Übersicht über die MiniString- Produktion (A) Der Elternvektor enthält einen Polylinker in Transkriptions Fusion mit einem Reporter - Gen, eingerahmt von den beiden SS - Sites. Das Rückgrat kodiert Beta-Lactamase für Ampicillin - Resistenz und enthält auch mehrere Schnitt Websites einzigartig für das Rückgrat für die in vitro Verdauung. (B) Überblick über das Hauptprotokoll. Die Schritte 2) Wachstumsphase und 3) Ministring Produktion werden in einem Diagramm dargestellt auf eine schematische Gesamt der Schritte zur Verfügung zu stellen, die Einfachheit des Protokolls hervorheben. (C) Ministring Induktion. Wärmeinduktion inaktiviert die temperaturempfindlichen Repressor, so dass tel Ausdruck von Tel Aktivität auf SS - Sites in den übergeordneten Plasmide gefolgt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53177/53177fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53177/53177fig1highres.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53177/53177fig2highres.jpg" width="350" /> Abbildung 2: MiniString- Produktion nach Abweichungen vom Protokoll. 1: Kontrolle, 2: Nicht induzierte, 3: Overgrown, 4: Overinduced, 5: frühzeitige Entfernung. DNA MiniString- ist etwa 2,4 kb, LCC Rückgrat 3 kb ist, und pNN9 Mutter Plasmid beträgt 5,6 kb. Band Intensität von MiniString- und LCC-Backbone Bänder fallen mit Abweichungen vom Protokoll, was auf niedrigere MiniString- Ausbeute. Von links nach rechts: 1 kb Leiter von New England Biolabs; Kontrolle, folgende Protokoll; Nicht induzierte, kein Hochschalttemperatur; Überwachsen, Temperatur upshift during stationäre Phase; Overinduced, erweiterter Temperaturhochschalten; Frühe Entfernung, kein Temperaturherunterschalten. Die Plasmide wurden extrahiert , um die Omega-Biotek EZNA Plasmid Mini Kit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53177/53177fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53177/53177fig2highres.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53177/53177fig3highres.jpg" width="550" /> Abbildung 3:. Auswirkungen von Abweichungen vom Protokoll auf MiniString- Produktionseffizienz (PE) Die Ergebnisse sind der Mittelwert von drei Versuchen. PE wird aus der relativen Bandenintensität gemessen mit AlphaImager HP nach AGE geschätzt. Die Abweichungen treten bei den folgenden Schritten: Kontrolle, folgende Protokoll; Nicht induzierte, kein Temperaturhochschalten bei Schritt 2; Überwachsen, Temperatur Hochschalt- begann während der stationären Phase in Schritt 1,6; Overinduced, erweiterter Temperaturhochschalten bei Schritt 2.3; Frühe Entfernung, Zellen entfernt und extrahiertohne Temperaturherunterschalten bei Schritt 2.3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53177/53177fig3highres.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53177/53177fig3highres.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Production of Double-stranded DNA Ministrings

The linear covalently closed (LCC) DNA minivector (DNA ministring) is a non-viral gene delivery vector offering high transfection efficiency and is relevant to any DNA delivery application. The production system is simple, rapid, and scalable in vivo. The following protocol provides visual step-by-step instructions for the production of DNA ministrings.

Die Produktion von Doppelstrang-DNA-Ministrings

We constructed linear covalently closed (LCC) DNA minivectors as a non-viral gene-delivery vector alternative produced via a simple platform in vivo. DNA ...

production-of-double-stranded-dna-ministrings

Research

JoVE Journal

Biology

10.3K Aufrufe.  University of Waterloo. The linear covalently closed (LCC) DNA minivector (DNA ministring) is a non-viral gene delivery vector offering high transfection efficiency and is relevant to any DNA delivery application. The production system is simple, rapid, and scalable in vivo. The following protocol provides visual step-by-step instructions for the production of DNA ministrings. 

Serie: Production of Double-stranded DNA Ministrings

DNA Curtains Shed Light on Complex Molecular Systems During Homologous Recombination

Homologous recombination (HR) is important for the repair of double-stranded DNA breaks (DSBs) and stalled replication forks in all organisms. Defects in HR are closely associated with a loss of genome integrity and oncogenic transformation in human cells. HR involves coordinated actions of a complex set of proteins, many of which remain poorly understood. The key aspect of the research described here is a technology called "DNA curtains", a technique which allows for the assembly of aligned DNA molecules on the surface of a microfluidic sample chamber. They can then be visualized by total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). DNA curtains was pioneered by our laboratory and allows for direct access to spatiotemporal information at millisecond time scales and nanometer scale resolution, which cannot be easily revealed through other methodologies. A major advantage of DNA curtains is that it simplifies the collection of statistically relevant data from single molecule experiments. This research continues to yield new insights into how cells regulate and preserve genome integrity.

<meta charset="utf8"></head><body>DNA-Vorhänge geben Aufschluss über komplexe molekulare Systeme während der homologen Rekombination

DNA curtains present a novel method for visualizing hundreds or even thousands of DNA-binding proteins in real-time as they interact with DNA molecules aligned on the surface of a microfluidic sample chamber.

DNA-Vorhänge geben Aufschluss über komplexe molekulare Systeme während der homologen Rekombination

Homologous recombination (HR) is important for the repair of double-stranded DNA breaks (DSBs) and stalled replication forks in all organisms. Defects in ...

Forschung

Genetik

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. Linearized &lambda; DNA is modified to have a biotin on the end of one strand, and a digoxigenin moiety on the other end of the same strand. The biotinylated end is attached to a functionalized glass coverslip and the digoxigeninated end to a small bead. The assembly of these DNA-bead tethers on the surface of a flow cell allows a laminar flow to be applied to exert a drag force on the bead. As a result, the DNA is stretched close to and parallel to the surface of the coverslip at a force that is determined by the flow rate (Figure 1). The length of the DNA is measured by monitoring the position of the bead. Length differences between single- and double-stranded DNA are utilized to obtain real-time information on the activity of the replication proteins at the fork. Measuring the position of the bead allows precise determination of the rates and processivities of DNA unwinding and polymerization (Figure 2).

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system.

Direkte Beobachtung von Enzymen Replizieren DNA Mit einem Single-Molekül DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

Biologie

<meta charset="utf8"></head><body>CMG-vermittelte DNA-Dewindung durch Wachstum des ssDNA-RPA-Trakts beobachtet

Single-Molecule Real-Time Visualization of DNA Unwinding by CMG Helicase

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a dynamic complex of proteins termed the replisome. At the heart of the replisome is the&#160;CDC45-MCM2-7-GINS (CMG) helicase, which separates the two strands of the DNA double helix such that DNA polymerases can copy each strand. During genome duplication, replisomes must overcome a plethora of obstacles and challenges. Each of these threatens genome stability, as failure to replicate DNA completely and accurately can lead to mutations, diseases, or cell death. Therefore, it is of great interest to understand how CMG functions in the replisome during both normal replication and replication stress. Here, we describe a total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy assay using recombinant purified proteins, which allows for real-time visualization of surface-tethered stretched DNA molecules by individual CMG complexes. This assay provides a powerful platform to investigate CMG behavior at the single-molecule level, allowing helicase dynamics to be directly observed with real-time control over reaction conditions.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Entschlüsselung der Dynamik der eukaryotischen DNA-Replikation durch Einzelmolekül-Visualisierung

This protocol demonstrates performing a single-molecule assay for live visualization of DNA unwinding by CMG helicase. It describes (1) preparing a DNA substrate, (2) purifying fluorescently labeled Drosophila melanogaster CMG helicase, (3) preparing a microfluidic flow cell for total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, and (4) the single-molecule DNA unwinding assay.

Einzelmolekül-Echtzeit-Visualisierung der DNA-Abwicklung durch CMG-Helikase

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a ...

Biochemie

Strand-Specific Analysis of Proteins at Replicating DNA Strands by Enrichment and Sequencing of Protein-Associated Nascent DNA Method

Genome duplication is orchestrated by replisome proteins, including helicases, which unwind double-stranded DNA into individual antiparallel single strands, each requiring distinct modes of replication: continuous (leading) and discontinuous (lagging). Understanding the interactions of chromatin-associated proteins with replicating DNA strands in vivo is crucial for elucidating the mechanisms of chromatin assembly and DNA repair coupled to DNA replication. This protocol presents the enrichment and sequencing of protein-associated nascent DNA (eSPAN) method, designed to quantify relative protein levels on nascent leading and lagging DNA strands at replication forks. The eSPAN procedure starts with chromatin immunoprecipitation (ChIP, in yeast) or cleavage under targets and tagmentation (CUT&amp;Tag; in mammalian cells) of a protein of interest, followed by enrichment of the protein-associated nascent DNA by bromodeoxyuridine (BrdU) immunoprecipitation. Strand-specific next-generation sequencing is applied to isolated ssDNA. This technique can be used to determine whether a protein is enriched at leading or lagging replication forks. The eSPAN provides genome-wide strand-preference of chromatin-associated proteins, including histones at replication forks.

Enrichment and sequencing of protein-associated nascent DNA (eSPAN) was developed to detect the relative abundance of a chromatin-associated protein on two replicating DNA strands, thereby revealing molecular insight into chromatin replication and its coupled processes. This protocol describes eSPAN procedures in yeast and mouse embryonic stem (ES) cells.

Genome duplication is orchestrated by replisome proteins, including helicases, which unwind double-stranded DNA into individual antiparallel single ...

The DNA Replication Fork

An organism&#8217;s genome needs to be duplicated in an efficient and error-free manner for its growth and survival. The replication fork is a Y-shaped active region where two strands of DNA are separated and replicated continuously. The coupling of DNA unzipping and complementary strand synthesis is a characteristic feature of a replication fork.&#160;&#160; Organisms with small circular DNA, such as E. coli, often have a single origin of replication; therefore, they have only two replication forks, one in each direction leading away from the location of the initial opening.&#160; In organisms with large genomes, the replication of DNA is not done from a single point of origin but in many distinct, localized replication forks.&#160;
The unhindered progression of the replication fork is necessary for complete DNA replication and genome stability; however, the replication fork is often stalled by internal or external factors that can slow or stop its progression, resulting in replication stress. Replication stress causes genomic instability, which is a hallmark of diseases like cancer. Genomic instability is characterized by genomic alterations and increased frequency of harmful mutations. The movement of the replication fork can stop due to several reasons. For example, the drug hydroxyurea depletes the pool of nucleotides available for incorporation into the daughter strand, stalling the replication fork. Other problems that may hinder the progression of the replication fork include DNA lesions, a collision between a replication fork and a transcription complex, and defects in the enzymes involved in DNA replication.
The cell has a variety of repair mechanisms to reinitiate the stalled replication fork.&#160; S-phase checkpoints do not allow cells to begin mitosis until DNA repair is complete. Additionally, fork repriming can restart DNA synthesis by bypassing a DNA lesion or block. Despite these robust mechanisms, sometimes stalled forks cannot be reinitiated, which leads to the collapse of a fork, halting DNA replication.

Die DNA-Replikationsgabel

An organism&#8217;s genome needs to be duplicated in an efficient and error-free manner for its growth and survival. The replication fork is a Y-shaped ...

Lehre

JoVE Core

Molekularbiologie

Unit 1

DNA Replication

SCHLÜSSELBEGRIFFE UND KONZEPTE

Fixing Double-strand Breaks

The double-stranded structure of DNA has two major advantages. First, it serves as a safe repository of genetic information where one strand serves as the back-up in case the other strand is damaged. Second, the double-helical structure can be wrapped around proteins called histones to form nucleosomes, which can then be tightly wound to form chromosomes. This way, DNA chains up to 2 inches long can be contained within microscopic structures in a cell. A double-stranded break not only damages both copies of genetic information but also disrupts the continuity of DNA, making the chromosome fragile.
In a cell, there are an estimated ten double-strand breaks (DSBs) per day. The primary source of damage is metabolic by-products such as Reactive Oxygen Species and environmental factors such as ionizing radiations. Although less common, malfunctioning nuclear enzymes can also cause DSBs. Failure of enzymes like type II topoisomerases, which cut both strands of DNA and rejoin them while disentangling chromosomes, can inadvertently result in DSBs. Mechanical stress on the DNA duplex can also lead to DSBs. In prokaryotes, prolonged desiccation strains DNA, causing DSBs.
Of the two mechanisms for DNA repair, homologous recombination depends on a sister chromatid being nearby, which happens during the S and G2 phases. Due to this restriction, in the absence of a homology donor, cells have to resort to Nonhomologous end joining (NHEJ), even though it is much less accurate. It has been hypothesized that the reason higher eukaryotes can afford to preferentially utilize NHEJ for DSB repairs is that they have abundant non-coding DNA, which permits nucleotide substitutions, deletions or additions without grievous consequences.

Double-strand Breaks DSB &amp; Nonhomologous End Joining NHEJ

Reparatur von Doppelstrangbrüchen

The double-stranded structure of DNA has two major advantages. First, it serves as a safe repository of genetic information where one strand serves as the ...

DNA-Reparatur und Rekombination

Replication in Prokaryotes

DNA replication has three main steps: initiation, elongation, and termination. Replication in prokaryotes begins when initiator proteins bind to the single origin of replication (ori) on the cell&#39;s circular chromosome. Replication then proceeds around the entire circle of the chromosome in each direction from the two replication forks, resulting in two DNA molecules.
Many Proteins Work Together to Replicate the Chromosome
Replication is coordinated and carried out by a host of specialized proteins. Topoisomerase breaks one side of the double-stranded DNA phosphate-sugar backbone, allowing the DNA helix to unwind more rapidly, while helicase breaks the bonds between base pairs at the fork, separating the DNA into two template strands. Proteins that bind single-stranded DNA molecules stabilize the strands as the replication fork travels along the chromosome. DNA can only be synthesized in the 5&#39; to 3&#39; direction, so one strand of the template&#8212;the leading strand&#8212;is elongated continuously, while the other strand&#8212;the lagging strand&#8212;is synthesized in shorter pieces of 1,000&#8211;2,000 base pairs called Okazaki fragments.
Multiple Polymerases Take Part in Elongation
Much of the research to understand prokaryotic DNA replication has been performed in the bacterium Escherichia coli, a commonly-used model organism. E. coli has five DNA polymerases: Pol I, II, III, IV, and V. Pol III is responsible for the majority of DNA replication. It can polymerize about 1,000 base pairs per second. This astonishing pace allows the machinery present at the two replication forks to duplicate the E. coli chromosome&#8212;4.6 million base pairs&#8212;in roughly 40 minutes. DNA polymerase I is also well-characterized. Its primary role is to process the RNA primers on the lagging strand.
When Division Outpaces Duplication
Under favorable growth conditions, E. coli can divide every 20 minutes, about half the amount of time that it takes to replicate the genome. But how is this possible when both daughter cells must have their own DNA? Scientists found that the bacteria can begin another round of DNA replication from the origin of replication before the first round is complete; this means that daughter cells receive a chromosome that is already in the process of being copied and are prepared to divide again very quickly.

Replikation in Prokaryoten

DNA replication has three main steps: initiation, elongation, and termination. Replication in prokaryotes begins when initiator proteins bind to the ...

Die Produktion von Doppelstrang-DNA-Ministrings

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

DNA-Vorhänge geben Aufschluss über komplexe molekulare Systeme während der homologen Rekombination

DNA-Vorhänge geben Aufschluss über komplexe molekulare Systeme während der homologen Rekombination

Direkte Beobachtung von Enzymen Replizieren DNA Mit einem Single-Molekül DNA Stretching Assay

Einzelmolekül-Echtzeit-Visualisierung der DNA-Abwicklung durch CMG-Helikase

Einzelmolekül-Echtzeit-Visualisierung der DNA-Abwicklung durch CMG-Helikase

Einzelmolekül-Echtzeit-Visualisierung der DNA-Abwicklung durch CMG-Helikase

Strand-Specific Analysis of Proteins at Replicating DNA Strands by Enrichment and Sequencing of Protein-Associated Nascent DNA Method

Die DNA-Replikationsgabel

Reparatur von Doppelstrangbrüchen

Replikation in Prokaryoten