Die Autoren danken den Naturwissenschaften und Engineering Research Council of Canada (NSERC) für die Förderung dieser Arbeit.

1. Herstellung von Medien und Kulturen <ol><li> Für LB + Amp: Bereiten 500 ml Luria-Bertani-Brühe (LB) sterilisiert für 30 min einem Autoklaven bei 121 ° C verwendet wird. Supplement mit Ampicillin in einer Endkonzentration von 100 ug / ml Ampicillin und lagern bei 4 ° C zu erhalten, bis sie benötigt. </li><li> Für TB + Amp: Bereiten Sie sich auf große (500 ml oder mehr) Produktionsvolumina MiniString-. Bereiten 600 ml steriler Terrific Broth (TB) sterilisiert unter Verwendung eines Autoklaven bei 121 ° C für 30 min. Supplement mit Ampicillin in einer Endkonzentration von 100 ug / ml Ampicillin und lagern bei 4 ° C zu erhalten, bis sie benötigt. </li><li> Für LB-Agar + Amp: Bereiten sterile LB-Agarplatten mit LB + Amp mit 15 g / l Agar ergänzt vorbereitet. Aliquotieren ca. 15, - 20 ml in sterile Petrischalen und speichern den Kopf bei 4 ° C, bis sie benötigt. </li><li> Bereiten Sie eine Ausstrichplatte von W3NN [PDMS] von aseptisch Ausstreichen W3NN [PDMS] Zellen auf LB-Agar + Amp. Die Platte overnight bei 30 ° C, bis einzelne Kolonien beobachtet werden können. Sie brüten nicht W3NN oberhalb dieser Temperatur dereprimieren protelomerase Ausdruck zu vermeiden. </li><li> Aseptisch Transfer 5 ml LB + Amp in ein steriles Reagenzglas. Bereiten Sie eine Nacht-Kultur von W3NN [PDMS] durch dieses Volumen mit einer einzelnen Kolonie von der Ausstrichplatte Inokulation. Inkubieren der Kultur über Nacht bei 30 ° C in einem Schüttler bei 230-250 Umdrehungen pro Minute. </li></ol> 2. Wachstum Phase <ol><li> Aseptisch Transfer 10 ml LB + Amp in einen sterilen 125 ml Erlenmeyerkolben und impfen mit 100 &amp; mgr; l der über Nacht W3NN [PDMS] Kultur in die vorbereitete LB + Amp, so dass eine 1: 100-Verdünnung. <ol><li> Für größere Volumina, 500 &amp; mgr; l über Nacht Kultur in 50 ml TB + Amp in einem 250-ml-Erlenmeyerkolben, anstelle von LB + Amp. </li><li> Alternativ können Sie als zweite &quot;repräsentativ&quot; Kultur in Schritt 2.2. </li></ol></li><li> Inkubieren in einem Schüttelinkubator bei 30 ° C und 250 rpm bis zum culture erreicht durch eine optische Dichte (OD) oder Absorption bis zur späten logarithmischen Phase, angegeben mid: A 600 = 0,8. Nach 1-2 Stunden sollte das Medium beginnen mit dem bloßen Auge trüb erscheinen. <ol><li> Aseptisch 1 ml der Kultur auf eine saubere Spektrophotometerküvette. </li><li> Messen Sie die Lichtabsorption eines UV-VIS-Spektralphotometer mit der Wellenlänge auf 600 nm verwendet wird. Verwenden Sie 1 ml der Medien, in denen Zellen, die den Rohling (LB oder TB) zu setzen angebaut wurden. Optional können Sie die repräsentative Kultur aus Schritt statt 2.1.3 für diesen Schritt. </li><li> Wenn die Kultur noch nicht den entsprechenden OD erreicht, kehren Sie zu den Shaker geben und überprüfen Sie noch einmal jede halbe Stunde. Überprüfen Sie die OD häufiger als die A 600 0,8 nähert. </li></ol></li><li> Sobald die Kultur der späten log - Phase, angezeigt durch A 600 = 0,8, aseptisch übertragen die Kultur in sterile 50 ml Zentrifugenröhrchen erreicht hat. </li><li> Sammle die Zellen durch die Kultur bei 10.000 xg für 10 min zentrifugiert. Überprüfen Sie für eine peam Boden des Röhrchens llet. </li><li> Umfüllen geklärte Überstand in einen geeigneten Abfallbehälter Biohazard. Nicht das Zellpellet stören. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2,4-2,5, bis alle Zellen gesammelt wurden. </li><li> Re-suspend das Pellet in 100 ul LB + Amp. Absaugen mit einer Mikropipette oder einen Wirbelmischer verwenden. Für eine größere MiniString- Produktion, resuspendieren Sie das Pellet aus einem 50 ml TB + Amp-Kultur in 1 ml frischem LB + Amp-Medien. </li></ol> 3. Ministring Produktion <ol><li> Aseptisch 20 ml LB + Amp in einem 125 ml Erlenmeyerkolben und Wärme auf 42 ° C. Für eine höhere Produktions MiniString- bereiten 500 ml LB + Amp, vorgewärmt auf 42 ° C. </li><li> Übertragen Sie die Aufwirbelung in die vorgewärmte Medium. </li><li> Inkubieren bei 42 ° C und 250 rpm bis zum letzten logarithmischen Phase, angedeutet durch A 600 = 1,0. Lassen Sie keine 20 ml Kultur bei 42 ° C über 1 Stunde. </li><li> Reduzieren Sie die Temperatur auf 37 ° C und lassen Sie die Kultur für eine zusätztionale 90 min. Für 500 ml, lassen Sie die Kultur für eine zusätzliche Induktionszeit von 90 bis 120 min und nicht die Temperatur zu senken. </li><li> Reduzieren Sie die Temperatur auf 30 ° C und lassen Sie die Kultur bei 200 Umdrehungen pro Minute für eine zusätzliche Temperaturherunterschalten Zeitraum von 2 h schütteln. Für 500 ml, wobei die Temperatur Herunterschalten bis 4 Stunden verlängern oder über Nacht. </li></ol> 4. Ernten Ministrings <ol><li> Unter aseptischen Bedingungen wird die Kultur in sterile 50 ml Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge bei 10.000 g für 10 min und inspizieren für einen Pellet. </li><li> Den Überstand umfüllen in einen geeigneten Abfallbehälter Biohazard, ohne das Pellet zu stören. Wiederholen, bis alle Zellen gesammelt wurden. </li><li> Bewahren Sie das Pellet für Plasmid-Extraktion mit einer kommerziellen Extraktion und Endotoxinentfemung Kit oder Blitzeis in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C für die spätere Extraktion. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Wir beschreiben hier ein einfaches System zur Herstellung von LCC DNA Ministrings unter Verwendung eines einstufigen hitzeinduzierbaren Protokoll, das zur Seite keine spezielle Ausrüstung erfordert, von der, die in typischen Bakterienwachstum und Manipulation verwendet wird. DNA-Ministrings sind verwindungssteife, stabile lineare DNA-Expressionskassetten, frei von prokaryotischen genetischen Elementen. Sie können anstelle von konventionellen Verfahren für den Gentransfer, die Expression von Reportergenen, sowie in Abschätzungen in Richtung der Wirksamkeit der Transgen-Expression in eukaryotischen Systemen verwendet werden. DNA-Ministrings kombinieren, um die Biokompatibilität und erhöhte Transfektionseffizienz Vorteile von &quot;Mini&quot; Vektoren mit der überlegenen Sicherheitsprofil von linearen DNA-Vektoren. Unsere robuste Ein-Schritt - in - vivo - Produktionsplattform schnell und einfach produziert DNA Ministrings für jedes Gen - Transfer - Anwendung ohne die Notwendigkeit für mehrere teure In - vitro - Verfahren. Es gibt mehrere wichtige Schritte zusorgen für eine optimale MiniString- Produktion (Abbildungen 2 und 3). Wärmeinduktion ist der kritischste Schritt zur Herstellung MiniString-. Vollständiges Fehlen der Produktion von MiniString- ist höchstwahrscheinlich wegen des Mangels an Wärmeinduktion (Zellen bei 30 ° C gehalten), wo Unterdrückung der protelomerase Ausdruck Umwandlung von Vorläufer Plasmid LCC MiniString- verhindert. Im Anschluss an die Wärmeinduktion Protokoll, erwarten eine Produktionseffizienz von etwa 75%. Wärmeinduktion ist optimal, während Zellen in der log-Phase sind. Obwohl es in MiniString- PE keinen statistisch signifikanten Unterschied ist , wenn die Zellen in der stationären Phase ( &quot;Overgrown&quot;, Abbildung 3) verwenden, haben wir fast eine 50% ige Abnahme der Gesamt Plasmidausbeute beobachten. Die Erträge werden auf der verwendeten Plasmid-Extraktionsprotokoll abhängen. Für eine optimale MiniString- Produktion auslösen Wärmeinduktion, während Zellen in der log-Phase sind. Schlechte MiniString- Produktion wird höchstwahrscheinlich ein Ergebnis einer längeren Temperatur Hoch- oder insufficie seinnt Temperatur Herunterschalten. Längerer Temperatur Hochschalten wird abgeraten , da dies der E. aktiviert coli Hitzeschockantwort 15, die protelomerase Aktivität hemmen kann und mit dem Plasmid Stabilität stören. Daher die Temperatur Herunterschalten Timing ist ein weiterer wichtiger Schritt für eine effiziente MiniString- Produktion. Ohne zusätzliche Inkubationszeit bei 30 ° C wurde MiniString- Produktionseffizienz als sehr schlecht zu sein ( &quot;Early Removal&quot;, Abbildung 3). Dies kann auf die Menge an Zeit für Tel Expression und Aktivität erforderlich zurückzuführen. Der Ursprung Prophagen PY54 Codierung Tel protelomerase infiziert normalerweise Yersinia, die optimal wächst um 28 ° C 12, was darauf hinweist , dass 30 ° C auch für Tel Aktivität mehr optimal ist. Die DNA - minivector Produktionssystem verwendet eine in vivo Plattform qualitativ hochwertige bakterielle Sequenz freie DNA minivectors zu erzeugen. i Modifikationen des Protokolls kannnclude die Wachstumsmedien zu verändern Plasmid und die Proteinproduktion zu optimieren, um das Zellwachstum während der Wachstumsphase (TB anstelle von LB) zu fördern, oder die Effizienz zu steigern MiniString- Produktion und Umwandlung. Für größere Kulturvolumina (200 ml und mehr), Temperatur Herunterschalten und Inkubation bei 30 ° C kann auf MiniString- PE über Nacht ohne starke negative Auswirkung verlängert werden. Wir haben als Beispiel für die 500-ml-Kulturen Änderungen in unserem Protokoll enthalten. Reinigung von DNA - Ministrings können durch in vitro - Endonuklease - Verdau des prokaryotischen Rückgrat beschleunigt werden. Es gibt eine Anzahl von Endonuclease - Zielstellen (beispielsweise PI-SceI, PvuI, ScaI) auf dem prokaryotischen Rückgrat des Vorläufers Plasmid, das geschnitten werden kann , offen linear zu belichten endet, so dass für in vitro - Abbau des prokaryotischen Rückgrat. Isolierung von Ministrings aus anderen Vektorarten können auch durch Anionenaustauschermembran - Chromatographie 16 erreicht werden. Eine Strombegrenzung, die mit dem LCC-DNA-Vektor-Produktionssystem ist die Notwendigkeit einer Reinigung der DNA MiniString- von anderen LCC und CCC Produkte. Obwohl Verfahren unter Verwendung von Standard-Plasmidisolation leicht gereinigt, kann der Isolationsschritt noch ein Nachteil in einer groß angelegten Einstellung sein. Trennung des MiniString- kann AGE zu verwenden, wenn die Ministring und das LCC prokaryotischen Rückgrat zu ähnlich groß sein zeitraubend. Alternativ bieten kann Anionenaustauschermembran Chromatographie eine bessere Trennung von Ministrings von CCC Vektorarten 16. Temperatur Hochschalten kann eine weitere mögliche Einschränkung sein , da hohe Temperaturen auch die Hitzeschockantwort in E. aktivieren coli, das rekombinante Protein liefert 17 wirkt sich negativ auf und folglich Raten von Plasmid reduzieren Umstellung auf MiniString-. Wir berichten an anderer Stelle Optimierungen der Produktionsplattform zu umgehen und / oder zu mildern solche Effekte von Hitzeschock - 18. Wiroptimieren derzeit auch Methoden LCC Kontamination prokaryotischen Rückgrat in vivo zu beseitigen oder zu reduzieren. Chromosomale Integration der LCC DNA MiniString- stört das Wirtschromosom und unterzieht die Zelle zur Apoptose. Nicht nur, dass diese zu reduzieren, mögliche negative Auswirkungen von Insertionsmutagenese wie oncogenesis und Silencing von benachbarten Genen, wodurch die Verbesserung ihrer Sicherheit; die letale Wirkung kann auch als ideales Verfahren zum knock-in und gene replacement Untersuchungen ohne die damit verbundenen Nebenwirkungen und Beschädigungen der Integration dienen. DNA MiniString- Vektoren können in Richtung der Transfer und die Expression von Genen für die therapeutische Proteine, RNA, Antikörper oder Antigene in einem gegebenen Ziel in vivo angewendet werden , oder eine Fehl- oder nicht - funktionelle Allel ersetzen. Die einfache Ein-Schritt hitzeinduzierbaren in vivo Produktionssystem ermöglicht DNA MiniString- Vektoren leicht für klinische oder industrielle Anwendungen hergestellt werden.

Das Ziel ist , skalierbare Mengen von linearen zu produzieren kovalent geschlossen (LCC) DNA minivectors mit einem einfachen und einen hohen Wirkungsgrad in einem Schritt hitzeinduzierbarer in vivo DNA MiniString- Produktionssystem. DNA-Ministrings bieten eine sichere und wirksame nicht-viralen Strategie DNA zu liefern. Sie kombinieren die Sicherheit von LCC-Vektoren mit der Effizienz von DNA-Minicircles, und bieten auch eine sicherere Alternative zu Virus-abgeleiteten Vektoren ohne Transfektionseffizienz zu beeinträchtigen. Damit ein Transgen Verabreichungssystem erfolgreich zu sein, muss die DNA Vektor, der die Ziel-Wirtszelle ein und das codierte Transgen (e) exprimieren. Es gibt mehrere zelluläre Barrieren, die vor allem in Säugersystemen in der Praxis überwunden werden müssen. Um den Abbau durch Nukleasen und Serumimmundetektion durch retikuloendothelialen System, das DNA-Vektor muss bio- und immun kompatibel sein mit dem Zielsystem zu vermeiden. Ungeschützte DNA wird schnell durch Plasma-Nukleasen verdautund die Plasmid-Membran besteht aus dichten Lipoprotein Barrieren besteht, so dass die DNA-Vektor schnell der Lage sein muss, die Plasmamembran von Zielzellen kreuzen. Einmal in der Zelle, Vektoren müssen das Zytoplasma durchqueren und die Kernmembran durchqueren den Kern für die Transgen-Expression einzugeben. Nicht-virale Techniken Genübertragung Fokus auf Verbesserung der Gewebe- und Zell-Targeting. Jedoch verringert die Verwendung von herkömmlichen Plasmiden mit diesen Techniken Transfektionseffizienz aufgrund des Vorhandenseins von immunogenen bakteriellen Sequenzen, die sich rasch Genexpression 1,2 verstummen. Herkömmliche Plasmide tragen typischerweise Antibiotika-Resistenzgene für die Wartung in prokaryotischen Systemen. Diese können jedoch mögliche schädliche Wirkungen auf menschliche Wirte produzieren oder Resistenz gegenüber natürlich vorkommenden Wirts Flora über den horizontalen Gentransfer Effekte verleihen. Herkömmliche Plasmiden auch Dinukleotid CpG - Motive 2, enthalten , die eine unerwünschte immunstimulierende Reaktion auslösen können, potenziellReduzierung oder Transgen-Expression zum Schweigen zu bringen. Da sie nur aus den eukaryotischen Expressionskassette enthalten sind, DNA minivectors, wie DNA - Miniringe 3 sind eine bessere Alternative für die Genabgabe wie sie extrazelluläre und intrazelluläre Bioverfügbarkeit und verbesserte Genexpression aufgrund ihrer verringerten Größe und Abwesenheit von immunstimulatorischen prokaryotischen Elemente verbessert aufweisen 4. Die reduzierten Vektorgröße Tarife besser in Bezug auf Beständigkeit gegen Scherkräfte , die mit in - vivo - Verabreichung an eine Zielstelle 5. Die höhere Kopienzahl des Vektors pro Masseneinheit erfordert weniger Transfektionsreagenz, wodurch die Toxizität verringert wird. Jedoch im Falle der Zufallsvektor Integration in ein Wirtschromosom, zirkular kovalent geschlossene (CCC) Vektoren, die sowohl DNA-Miniringe und konventionellen Plasmiden, molekulare Kontinuität verleihen und damit zu Insertionsmutagenese führen kann, was verheerende Folgen haben kann <sbis&gt; 6. Vergleichsweise, die Integration eines linearen DNA - Vektor , stört das Chromosom und initiiert Zelltod Wege, wodurch die mutierte Zelle aus der proliferierenden Zellpopulation zu entfernen und Insertionsmutagenese 7 verhindert wird . Minimalistische immunologisch definierte Genexpression (MIDGE) Vektoren 8 und Mikro-linearen Vektoren 9 (MiLV) sind LCC DNA - Vektoren in vitro entwickelt. MIDGE - Vektoren wurden auf eine 17-fache verbessert Transgen - Expression in vivo zeigten sich im Vergleich zu herkömmlichen Plasmid - DNA - Vektoren 11 und haben vielversprechende Ergebnisse in Impfstoff 10 und Krebs 8 Gentherapie demonstriert. Darüber hinaus aufgrund der verwindungsfreie Struktur des LCC minivector weniger Transfektionsreagenz ist im Vergleich zu dem CCC supercoiled Gegenstück erforderlich, wodurch die Toxizität reduzieren 7. Unsere verbesserte LCC DNA-Vektoren, DNA-Ministrings haben überlegen Expressionseffizienz und bioavai demonstriertLabilität 7. Weiterhin DNA Ministrings auf einem einstufigen hitzeinduzierbaren in vivo Produktionssystem produziert, eine zweckmäßige und kostengünstige Alternative zu MIDGE und MiLV LCC - Vektoren, die in vitro mehrere Schritte erfordern. Die DNA MiniString- Produktionssystem gezeigt werden , ist eine einfache hitzeinduzierbaren Verfahren in vivo durchgeführt wird , ist es sowohl kostengünstiger und leicht skalierbar macht. Dieses System nutzt die Yersinia enterocolitica Bakteriophagen PY54-derived Tel / pal protelomerase 12 Rekombinationssystem die minimal eukaryotischen Expressionskassette aus dem prokaryotischen Plasmidrückgrat zu trennen. Wir haben Escherichia coli - Zellen entwickelt (W3NN) Tel protelomerase unter der Kontrolle des hitzeinduzierbaren Bakteriophagen - λ - Promotor, cI [Ts] 857 13 auszudrücken. Bei der Expression wirkt Tel protelomerase auf pal Zielstellen , die innerhalb &quot;Super - Sequence&quot; (SS) Stellen auf dem Vorläufer Plasmid befindetLCC Produkte zu ergeben, aus dem das DNA MiniString- kann dann gereinigt werden (Figur 1). Die SS - Stellen auf der DNA MiniString- Vorläufer Plasmid codieren auch Zielstellen für andere Rekombinasen einschließlich Cre - Rekombinase (LOX), TelN protelomerase (telRL) und Flp - Rekombinase (FRT), wodurch die Herstellung von isogenen LCC und CCC minivectors von einem Vorläufer - Plasmid zu erleichtern. Zusätzlich wird jede SS Seite auf beiden Seiten von SV40 - Enhancer (SV40e) Sequenzen flankiert, die dazu dienen , 14 nukleäre Translokation zu verbessern. Wir haben an anderer Stelle gezeigt , dass sukzessive Zugabe von SV40e schrittweise Erhöhungen der Transfektionseffizienz 7 verleiht. Der Vorläufer - Plasmid (pDNA MiniString- oder PDMS) enthält einen Polylinker (Abbildung 1) Einführen eines beliebigen Gens von Interesse in transkriptionale Fusion mit dem grün fluoreszierenden Reporter (GFP) zu erleichtern. Die DNA-minivector Technologie kannanstelle von herkömmlichen Methoden für den Gentransfer, die Expression von Reportergenen und Beurteilungen auf die Effizienz der Transgen-Expression in eukaryotischen Systemen verwendet werden. DNA-Ministrings kombinieren, um die Biokompatibilität und erhöhte Transfektionseffizienz Vorteile von &quot;Mini&quot; Vektoren mit der überlegenen Sicherheitsprofil von linearen DNA-Vektoren. Unsere robuste Ein-Schritt-Produktionsplattform schnell und einfach produziert DNA Ministrings für jedes Gen-Transfer-Anwendung und bietet ein höheres Sicherheitsprofil.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1428">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">E. coli W3NN&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Mediphage</td>
			<td style="width:268px;"></td>
			<td style="width:492px;">strain for ministring processing: Nafissi &#38; Slavcev, 2012</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">pDMS.IRES.GFP</td>
			<td style="width:295px;">Mediphage</td>
			<td style="width:268px;"></td>
			<td>parent plasmid for ministring processing: also referred to as pDNA Ministring (pDMS)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:375px;">BD&#8482; Difco&#8482; Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani)</td>
			<td style="width:295px;">Fisher Scientific</td>
			<td>244620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Fisher BioReagents&#8482; Terrific Broth</td>
			<td style="width:295px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:268px;">BP2468500</td>
			<td style="width:492px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">BD&#8482; Bacto&#8482; Dehydrated Agar</td>
			<td style="width:295px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:268px;">214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Ampicilin</td>
			<td style="width:295px;">MP Biomedicals LCC</td>
			<td style="width:268px;">2190147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Ultrapure Milipore Water</td>
			<td style="width:295px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:268px;">Z00Q0V0US</td>
			<td>Model: Mili-Q Advantage A10 Water Purification System</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:375px;">Surgical Gloves</td>
			<td style="width:295px;">VWR</td>
			<td style="width:268px;">(S) 82026-424, (M)82026-426, (L) 82026-428, (XL) 82026-430&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:375px;">Fisherbrand&#8482; Petri Dishes with Clear Lid Raised Ridge (100 x 15 mm)</td>
			<td style="width:295px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:268px;">FB0875712&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">30 mL KIMAX&#174; Test Tubes</td>
			<td style="width:295px;">VWR</td>
			<td style="width:268px;">89001-448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Spectrophotometer Cuvette</td>
			<td style="width:295px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:268px;">67.74</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Sterile 15 mL Falcon Tubes</td>
			<td style="width:295px;">&#160;BD Falcon</td>
			<td>62406-200,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">&#160;Sterile 50 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:295px;">&#160;FroggaBio</td>
			<td>2930-S0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon&#8482; Disposable Polystyrene Serological Pipets 10 mL</td>
			<td style="width:295px;">BD Falcon</td>
			<td>13-675-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon&#8482; Disposable Polystyrene Serological Pipets 25 mL</td>
			<td style="width:295px;">BD Falcon</td>
			<td>13-668-2&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Micropipettor (100-1000 &#956;L)</td>
			<td style="width:295px;">FroggaBio</td>
			<td style="width:268px;">C1000-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Micropipettor (20-200 &#956;L)</td>
			<td style="width:295px;">FroggaBio</td>
			<td style="width:268px;">C200-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Sterile Pipette Tips (100-1250 &#956;L)</td>
			<td style="width:295px;">VWR</td>
			<td style="width:268px;">89079-472&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Sterile Pipette Tips (1-200 &#956;L)</td>
			<td style="width:295px;">VWR</td>
			<td style="width:268px;">89079-460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Fisher Scientific Economy Burner</td>
			<td style="width:295px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:268px;">03-917Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Incubator Shaker</td>
			<td style="width:295px;">New Brunswick Scientific&#160;</td>
			<td style="width:268px;">M1352-00000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Sterile Erlenmeyer Flask (125 mL)</td>
			<td style="width:295px;">Pyrex (Sigma Aldrich)</td>
			<td>CLS4980125 Aldrich&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Sterile Erlenmeyer Flask (250 mL)</td>
			<td style="width:295px;">Pyrex (Sigma Aldrich)</td>
			<td>CLS4980250 Aldrich&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">&#160;Sterile Erlenmeyer Flask (500 mL)</td>
			<td style="width:295px;">Pyrex (Sigma Aldrich)</td>
			<td>CLS4980500 Aldrich&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:268px;">335901</td>
			<td>Model: Genesys 10 Vis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Floor Centrifuge</td>
			<td style="width:295px;">Beckman Coulter&#160;</td>
			<td style="width:268px;">369001</td>
			<td>Model: Avanti J-E</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Benchtop Centrifuge</td>
			<td style="width:295px;">Beckman</td>
			<td style="width:268px;">362114</td>
			<td>Model: GS-6R</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Fisher Scientific Analog Vortex Mixer&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:268px;">02-215-365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">1 kb DNA Ladder</td>
			<td style="width:295px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:268px;">N3232S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of double-stranded dna ministrings

Wir konstruierten linearen kovalent geschlossen (LCC) DNA minivectors als nicht-virale alternative Gen-Delivery - Vektor über eine einfache Plattform in vivo produziert. DNA - Ministrings ein erhöhtes Sicherheitsprofil besitzen und auch DNA - Ladung gezielt Zellen effizient zu liefern. Herkömmliche DNA Vektoren tragen unerwünschte prokaryotische Sequenzen, einschließlich Antibiotika-Resistenzgene, CpG-Motiven und bakterielle Replikationsursprünge, die an der Stimulation der Wirtsimmunreaktionen führen können. Die Bioverfügbarkeit von herkömmlichen DNA-Vektoren wird auch aufgrund ihrer grßeren Molekülgrße kompromittiert. Ihr Kreis Natur kann auch chromosomale Integration vermitteln, zu Insertionsmutagenese führt. Bakterielle Sequenzen werden von DNA minivectors ausgeschnitten, nur das Gen von Interesse (GOI) und notwendige eukaryotischen Expressionselemente zu verlassen. Unsere LCC DNA minivectors oder DNA-Ministrings, sind frei von immunogenen bakteriellen Sequenzen; daher die Verbesserung der thEIR Bioverfügbarkeit und GOI Ausdruck. Im Falle der Vektor-Integration in das Chromosom wird das LCC DNA MiniString- letal das Wirtschromosom zu stören, wodurch die möglicherweise gefährliche Mutante aus der proliferierenden Zellpopulation zu entfernen. Folglich bieten DNA-Ministrings die Vorteile von &#39;Minicircle-&#39; DNA, während das Potenzial für unerwünschte Vektorintegration Ereignisse zu beseitigen. Im Vergleich zu herkömmlichen Plasmiden und ihren isogenen Kreis kovalent geschlossene (CCC) Pendants zeigen DNA Ministrings überlegene Bioverfügbarkeit Transfektionseffizienz und cytoplasmatischen Kinetik - also sie geringere Mengen an kationischen Tensiden zur effektiven Transfektion von Zielzellen erforderlich ist. Wir haben ein Ein-Schritt - induzierbare in vivo - System für die Herstellung von DNA - Ministrings in Escherichia coli konstruiert , das einfach zu bedienen ist , schnelle und skalierbar.

Nach der DNA-Extraktion, wird Restvorläufer Plasmid, LCC prokaryotischen Rückgrat und die DNA MiniString- zurückgewonnen werden. Insgesamt Plasmid Ausbeute und Reinheit kann mit einem Spektralphotometer bewertet werden. Reinheit wird bei 260 nm und 280 nm (A260 / A280), wobei ein Verhältnis von 1,9-2,0 ist optimal mit dem Verhältnis der Absorption geschätzt. Alle LCC und CCC - Produkte können durch Agarose - Gelelektrophorese (AGE) (Abbildung 2) getrennt werden. AGE visualisiert die Ergebnisse der MiniString- Produktion nach der Wärmeinduktion, vor MiniString- Reinigung. Eine qualitative Bewertung der MiniString- Produktion kann durch den Vergleich Bandenintensität des MiniString- (2,4 kb) an die Mutter Plasmid (5,6 kb) (Abbildung 2) zu diesem Zeitpunkt durchgeführt werden. Ministring- DNA kann über Standard - Plasmid -Gelextraktions Protokolle folgende AGE zurückgewonnen werden. Abbildung 3 fasst MiniString- Produktionseffizienz unter verschiedenen Bedingungen wahrscheinlich auftreten , während carrying das Protokoll aus. MiniString- Produktionseffizienz wurde auf Basis von DNA-Bandenintensität bestimmt das Analyseprogramm des Herstellers mit. Jede ähnliche Densitometrie Programm kann verwendet werden, um die Ergebnisse von AGE zu analysieren. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53177/53177fig1highres.jpg" width="700" /> Abb . 1: Übersicht über die MiniString- Produktion (A) Der Elternvektor enthält einen Polylinker in Transkriptions Fusion mit einem Reporter - Gen, eingerahmt von den beiden SS - Sites. Das Rückgrat kodiert Beta-Lactamase für Ampicillin - Resistenz und enthält auch mehrere Schnitt Websites einzigartig für das Rückgrat für die in vitro Verdauung. (B) Überblick über das Hauptprotokoll. Die Schritte 2) Wachstumsphase und 3) Ministring Produktion werden in einem Diagramm dargestellt auf eine schematische Gesamt der Schritte zur Verfügung zu stellen, die Einfachheit des Protokolls hervorheben. (C) Ministring Induktion. Wärmeinduktion inaktiviert die temperaturempfindlichen Repressor, so dass tel Ausdruck von Tel Aktivität auf SS - Sites in den übergeordneten Plasmide gefolgt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53177/53177fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53177/53177fig1highres.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53177/53177fig2highres.jpg" width="350" /> Abbildung 2: MiniString- Produktion nach Abweichungen vom Protokoll. 1: Kontrolle, 2: Nicht induzierte, 3: Overgrown, 4: Overinduced, 5: frühzeitige Entfernung. DNA MiniString- ist etwa 2,4 kb, LCC Rückgrat 3 kb ist, und pNN9 Mutter Plasmid beträgt 5,6 kb. Band Intensität von MiniString- und LCC-Backbone Bänder fallen mit Abweichungen vom Protokoll, was auf niedrigere MiniString- Ausbeute. Von links nach rechts: 1 kb Leiter von New England Biolabs; Kontrolle, folgende Protokoll; Nicht induzierte, kein Hochschalttemperatur; Überwachsen, Temperatur upshift during stationäre Phase; Overinduced, erweiterter Temperaturhochschalten; Frühe Entfernung, kein Temperaturherunterschalten. Die Plasmide wurden extrahiert , um die Omega-Biotek EZNA Plasmid Mini Kit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53177/53177fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53177/53177fig2highres.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53177/53177fig3highres.jpg" width="550" /> Abbildung 3:. Auswirkungen von Abweichungen vom Protokoll auf MiniString- Produktionseffizienz (PE) Die Ergebnisse sind der Mittelwert von drei Versuchen. PE wird aus der relativen Bandenintensität gemessen mit AlphaImager HP nach AGE geschätzt. Die Abweichungen treten bei den folgenden Schritten: Kontrolle, folgende Protokoll; Nicht induzierte, kein Temperaturhochschalten bei Schritt 2; Überwachsen, Temperatur Hochschalt- begann während der stationären Phase in Schritt 1,6; Overinduced, erweiterter Temperaturhochschalten bei Schritt 2.3; Frühe Entfernung, Zellen entfernt und extrahiertohne Temperaturherunterschalten bei Schritt 2.3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53177/53177fig3highres.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53177/53177fig3highres.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Production of Double-stranded DNA Ministrings

The linear covalently closed (LCC) DNA minivector (DNA ministring) is a non-viral gene delivery vector offering high transfection efficiency and is relevant to any DNA delivery application. The production system is simple, rapid, and scalable in vivo. The following protocol provides visual step-by-step instructions for the production of DNA ministrings.

Die Produktion von Doppelstrang-DNA-Ministrings

We constructed linear covalently closed (LCC) DNA minivectors as a non-viral gene-delivery vector alternative produced via a simple platform in vivo. DNA ...

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Research

JoVE Journal

Biology

10.3K Aufrufe.  University of Waterloo. The linear covalently closed (LCC) DNA minivector (DNA ministring) is a non-viral gene delivery vector offering high transfection efficiency and is relevant to any DNA delivery application. The production system is simple, rapid, and scalable in vivo. The following protocol provides visual step-by-step instructions for the production of DNA ministrings. 

Serie: Production of Double-stranded DNA Ministrings

Technical Demonstration of Whole Genome Array Comparative Genomic Hybridization

Array comparative genomic hybridization (array CGH) is a method for detecting gains and losses of DNA segments or gene dosage in the genome 1. Recent advances in this technology have enabled high resolution comparison of whole genomes for the identification of genetic alterations in cancer and other genetic diseases 2. The Sub-Megabase Resolution Tiling-set array (or SMRT) array is comprised of a set of approximately thirty thousand overlapping bacterial artificial chromosome (BAC) clones that span the human genome in ~100 kilobase pair (kb) segments 2. These BAC targets are individually synthesized and spotted in duplicate on a single glass slide 2-4. Array CGH is based on the principle of competitive hybridization. Sample and reference DNA are differentially labeled with Cyanine-3 and Cyanine-5 fluorescent dyes, and co-hybridized to the array. After an incubation period the unbound samples are washed from the slide and the array is imaged. A freely available custom software package called SeeGH (www.flintbox.ca) is used to process the large volume of data collected - a single experiment generates 53,892 data points. SeeGH visualizes the log2 signal intensity ratio between the 2 samples at each BAC target which is vertically aligned with chromosomal position 5,6. The SMRT array can detect alterations as small as 50 kb in size 7. The SMRT array can detect a variety of DNA rearrangement events including DNA gains, losses, amplifications and homozygous deletions. A unique advantage of the SMRT array is that one can use DNA isolated from formalin fixed paraffin embedded samples. When combined with the low input requirements of unamplified DNA (25-100ng) this allows profiling of precious samples such as those produced by microdissection 7,8. This is attributed to the large size of each BAC hybridization target that allows the binding of sufficient labeled samples to produce signals for detection. Another advantage of this platform is the tolerance of tissue heterogeneity, decreasing the need for tedious tissue microdissection 8. This video protocol is a step-by-step tutorial from labeling the input DNA through to signal acquisition for the whole genome tiling path SMRT array.

This video is a technical demonstration of the hybridization protocol for whole genome tiling path array CGH, which scans the entire human genome using only 25-100 ng of DNA that can be isolated from a variety of sources, including archival formalin fixed material.

Technische Demonstration von Whole Genome Array Comparative Genomic Hybridization

Array comparative genomic hybridization (array CGH) is a method for detecting gains and losses of DNA segments or gene dosage in the genome 1.  Recent ...

Forschung

Biologie

Methylated DNA Immunoprecipitation

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on gene expression, and is involved with normal development as well as disease 1-4. Thus, the ability to discriminate between methylated DNA and non-methylated DNA is essential for generating methylation profiles for such studies. Methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP) is an efficient technique for the extraction of methylated DNA from a sample of interest 5-7. A sample of as little as 200 ng of DNA is sufficient for the antibody, or immunoprecipitation (IP), reaction. DNA is sonicated into fragments ranging in size from 300-1000 bp, and is divided into immunoprecipitated (IP) and input (IN) portions. IP DNA is subsequently heat denatured and then incubated with anti-5'mC, allowing the monoclonal antibody to bind methylated DNA. After this, magnetic beads containing a secondary antibody with affinity for the primary antibody are added, and incubated. These bead-linked antibodies will bind the monoclonal antibody used in the first step. DNA bound to the antibody complex (methylated DNA) is separated from the rest of the DNA by using a magnet to pull the complexes out of solution. Several washes using IP buffer are then performed to remove the unbound, non-methylated DNA. The methylated DNA/antibody complexes are then digested with Proteinase K to digest the antibodies leaving only the methylated DNA intact. The enriched DNA is purified by phenol:chloroform extraction to remove the protein matter and then precipitated and resuspended in water for later use. PCR techniques can be used to validate the efficiency of the MeDIP procedure by analyzing the amplification products of IP and IN DNA for regions known to lack and known to contain methylated sequences. The purified methylated DNA can then be used for locus-specific (PCR) or genome-wide (microarray and sequencing) methylation studies, and is particularly useful when applied in conjunction with other research tools such as gene expression profiling and array comparative genome hybridization (CGH) 8. Further investigation into DNA methylation will lead to the discovery of new epigenetic targets, which in turn, may be useful in developing new therapeutic or prognostic research tools for diseases such as cancer that are characterized by aberrantly methylated DNA 2, 4, 9-11.

This video demonstrates the protocol for methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP). MeDIP is a two day procedure that selectively extracts methylated DNA fragments from a genomic DNA sample using antibodies with specificity for 5 -methylcytosine (anti-5 mC).

Methylierte DNA Immunpräzipitation

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on ...

Lentivirus Production

RNA interference (RNAi) is a system of gene silencing in living cells. In RNAi, genes homologous in sequence to short interfering RNAs (siRNA) are silenced at the post-transcriptional state. Short hairpin RNAs, precursors to siRNA, can be expressed using lentivirus, allowing for RNAi in a variety of cell types. Lentiviruses, such as the Human Immunodeficiency Virus, are capable to infecting both dividing and non-dividing cells. We will describe a procedure which to package lentiviruses. Packaging refers to the preparation of competent virus from DNA vectors. Lentiviral vector production systems are based on a 'split' system, where the natural viral genome has been split into individual helper plasmid constructs. This splitting of the different viral elements into four separate vectors diminishes the risk of creating a replication-capable virus by adventitious recombination of the lentiviral genome. Here, a vector containing the shRNA of interest and three packaging vectors (p-VSVG, pRSV, pMDL) are transiently transfected into human 293 cells. After at least a 48-hour incubation period, the virus containing supernatant is harvested and concentrated. Finally, virus titer is determined by reporter (fluorescent) expression with a flow cytometer.

To make lentiviruses, DNA vectors are transfected into human 293 cells. After harvest and concentrating the supernatant, virus titer is determined by fluorescence expression with a flow cytometer.

Lentivirus Produktion

RNA interference (RNAi) is a system of gene silencing in living cells. In RNAi, genes homologous in sequence to short interfering RNAs (siRNA) are ...

DNA Stable-Isotope Probing (DNA-SIP)

DNA stable-isotope probing (DNA-SIP) is a powerful technique for identifying active microorganisms that assimilate particular carbon substrates and nutrients into cellular biomass. As such, this cultivation-independent technique has been an important methodology for assigning metabolic function to the diverse communities inhabiting a wide range of terrestrial and aquatic environments. Following the incubation of an environmental sample with stable-isotope labelled compounds, extracted nucleic acid is subjected to density gradient ultracentrifugation and subsequent gradient fractionation to separate nucleic acids of differing densities. Purification of DNA from cesium chloride retrieves labelled and unlabelled DNA for subsequent molecular characterization (e.g. fingerprinting, microarrays, clone libraries, metagenomics). This JoVE video protocol provides visual step-by-step explanations of the protocol for density gradient ultracentrifugation, gradient fractionation and recovery of labelled DNA. The protocol also includes sample SIP data and highlights important tips and cautions that must be considered to ensure a successful DNA-SIP analysis.

DNA Stable-Isotope Probing DNA-SIP

DNA stable-isotope probing is a cultivation-independent method to identify and characterize active communities of microorganisms that are capable of utilizing specific substrates. Assimilation of substrate enriched in heavy isotope leads to incorporation of labelled atoms into microbial biomass. Density gradient ultracentrifugation retrieves labelled DNA for downstream molecular analyses.

DNA stable-isotope probing (DNA-SIP) is a powerful technique for identifying active microorganisms that assimilate particular carbon substrates and ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

DNA-Extraktion aus in Paraffin eingebettete Material für genetische und epigenetische Analysen

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Iterative Optimization of DNA Duplexes for Crystallization of SeqA-DNA Complexes

Escherichia coli SeqA is a negative regulator of DNA replication that prevents premature reinitiation events by sequestering hemimethylated GATC clusters within the origin of replication1. Beyond the origin, SeqA is found at the replication forks, where it organizes newly replicated DNA into higher ordered structures2. SeqA associates only weakly with single GATC sequences, but it forms high affinity complexes with DNA duplexes containing multiple GATC sites. The minimal functional and structural unit of SeqA is a dimer, thereby explaining the requirement of at least two GATC sequences to form a high-affinity complex with hemimethylated DNA3. Additionally, the SeqA architecture, with the oligomerization and DNA-binding domains separated by a flexible linker, allows binding to GATC repeats separated by up to three helical turns. Therefore, understanding the function of SeqA at a molecular level requires the structural analysis of SeqA bound to multiple GATC sequences. In protein-DNA crystallization, DNA can have none to an exceptional effect on the packing interactions depending on the relative sizes and architecture of the protein and the DNA. If the protein is larger than the DNA or footprints most of the DNA, the crystal packing is primarily mediated by protein-protein interactions. Conversely, when the protein is the same size or smaller than the DNA or it only covers a fraction of the DNA, DNA-DNA and DNA-protein interactions dominate crystal packing. Therefore, crystallization of protein-DNA complexes requires the systematic screening of DNA length4 and DNA ends (blunt or overhang)5-7. In this report, we describe how to design, optimize, purify and crystallize hemimethylated DNA duplexes containing tandem GATC repeats in complex with a dimeric variant of SeqA (SeqA&Delta;(41-59)-A25R) to obtain crystals suitable for structure determination.

Crystal structure of protein&#x2013;DNA complexes can provide insight into protein function, mechanism, as well as, the nature of the specific interaction. Here, we report how to optimize the length, sequence and ends of duplex DNA for co-crystallization with Escherichia coli SeqA, a negative regulator of replication initiation.

Iterative Optimierung der DNA-Duplexes für Kristallisation von SeqA-DNA-Komplexen

Escherichia coli SeqA is a negative regulator of DNA replication that prevents premature reinitiation events by sequestering hemimethylated GATC clusters ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

Echtzeit-Bildgebung von Einzel Engineered RNA-Transkripte in lebenden Zellen Mit Ratiometrische Bimolekulare Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Reduced-gravity Environment Hardware Demonstrations of a Prototype Miniaturized Flow Cytometer and Companion Microfluidic Mixing Technology

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If humans are to travel beyond low Earth orbit, a transition towards space-ready, point-of-care (POC) testing is required. Such testing needs to be comprehensive, easy to perform in a reduced-gravity environment, and unaffected by the stresses of launch and spaceflight. Countless POC devices have been developed to mimic laboratory scale counterparts, but most have narrow applications and few have demonstrable use in an in-flight, reduced-gravity environment. In fact, demonstrations of biomedical diagnostics in reduced gravity are limited altogether, making component choice and certain logistical challenges difficult to approach when seeking to test new technology. To help fill the void, we are presenting a modular method for the construction and operation of a prototype blood diagnostic device and its associated parabolic flight test rig that meet the standards for flight-testing onboard a parabolic flight, reduced-gravity aircraft. The method first focuses on rig assembly for in-flight, reduced-gravity testing of a flow cytometer and a companion microfluidic mixing chip. Components are adaptable to other designs and some custom components, such as a microvolume sample loader and the micromixer may be of particular interest. The method then shifts focus to flight preparation, by offering guidelines and suggestions to prepare for a successful flight test with regard to user training, development of a standard operating procedure (SOP), and other issues. Finally, in-flight experimental procedures specific to our demonstrations are described.

Spaceflight blood diagnostics need innovation. Few demonstrations have been published illustrating in-flight, reduced-gravity health diagnostic technology. Here we present a method for construction and operation of a parabolic flight test rig for a prototype point-of-care flow-cytometry design, with components and preparation strategies adaptable to other setups.

Reduzierte Gravitationsbereich Hardware Demonstrationen eines Prototyps Miniaturisierte Durchflusszytometer und Companion Microfluidic Mischtechnik

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If ...

A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses performed. Considering that the use of new bacterial community analysis techniques (e.g., microbiomics, metagenomics) is becoming more prevalent in the agricultural and environmental sciences and many environmental samples within these disciplines can be physiochemically and microbiologically unique (e.g., fecal and litter/bedding samples from the poultry production spectrum), appropriate and effective DNA extraction methods need to be carefully chosen. Therefore, a novel semi-automated hybrid DNA extraction method was developed specifically for use with environmental poultry production samples. This method is a combination of the two major types of DNA extraction: mechanical and enzymatic. A two-step intense mechanical homogenization step (using bead-beating specifically formulated for environmental samples) was added to the beginning of the &#8220;gold standard&#8221; enzymatic DNA extraction method for fecal samples to enhance the removal of bacteria and DNA from the sample matrix and improve the recovery of Gram-positive bacterial community members. Once the enzymatic extraction portion of the hybrid method was initiated, the remaining purification process was automated using a robotic workstation to increase sample throughput and decrease sample processing error. In comparison to the strict mechanical and enzymatic DNA extraction methods, this novel hybrid method provided the best overall combined performance when considering quantitative (using 16S rRNA qPCR) and qualitative (using microbiomics) estimates of the total bacterial communities when processing poultry feces and litter samples.

A novel semi-automated hybrid DNA extraction method for use with environmental poultry production samples was developed and demonstrated improvements over a common mechanical and enzymatic extraction method in terms of the quantitative and qualitative estimates of the total bacterial communities.

Ein Hybrid-DNA-Extraktionsmethode für die qualitative und quantitative Bewertung der bakteriellen Gemeinschaften aus Zucht Proben

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein-basierte Screening Expression von Membranproteinen in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...