Os autores agradecem as Ciências Naturais e Engenharia do Conselho de Investigação do Canadá (NSERC) pelo financiamento deste trabalho.

1. Preparação de Mídia e Cultura <ol><li> Para LB + Amp: Preparar 500 ml de meio Luria-Bertani (LB) esterilizado utilizando um autoclave a 121 ° C durante 30 min. Suplemento com ampicilina para se obter uma concentração final de 100 ug / ml de ampicilina e armazenar a 4 ° C até ser necessário. </li><li> Para TB + Amp: Prepare-se para grandes (500 ml ou superior) volumes de ministring produção. Preparar 600 ml de solução estéril de Terrific Broth (TB) esterilizado utilizando um autoclave a 121 ° C durante 30 min. Suplemento com ampicilina para se obter uma concentração final de 100 ug / ml de ampicilina e armazenar a 4 ° C até ser necessário. </li><li> Para agar LB + Amp: Preparar placas de agar LB estéril através da preparação de LB + Amp suplementado com 15 g / L de agar. Alíquotas de aproximadamente 15 - 20 ml em placas de Petri estéreis e armazenamento de cabeça para baixo a 4 ° C até serem necessárias. </li><li> Prepare um prato raia de W3NN [PDMS], assepticamente, estrias W3NN [PDMS] células em LB agar + Amp. Incubar a placa overnight a 30 ° C, até que colónias individuais podem ser observadas. Não incube W3NN acima dessa temperatura para evitar derepressing expressão protelomerase. </li><li> Transfira assepticamente 5 ml de LB + Amp num tubo de ensaio estéril. Prepare uma cultura durante a noite de W3NN [PDMS] inoculando este volume com uma única colónia da placa de raia. Incubar durante a noite a cultura a 30 ° C num agitador a 230-250 rpm. </li></ol> 2. Fase de crescimento <ol><li> Transferir assepticamente 10 ml de LB + Amp num estéril de 125 ml e inocular balão de Erlenmeyer com 100 ul da cultura da noite W3NN [PDMS] no preparado de LB + Amp, fazendo uma diluição de 1: 100. <ol><li> Para volumes maiores, adicionar 500 mL de cultura durante a noite em 50 ml de TB + Amp num balão de Erlenmeyer de 250 ml, em vez de LB + Amp. </li><li> Em alternativa, utilizar como segunda cultura &quot;representante&quot; no passo 2.2. </li></ol></li><li> Incubar numa incubadora com agitação a 30 ° C e 250 rpm até que a cultura atinge a fase mid log tardia, indicada por uma densidade óptica (OD) ou absorvância: A 600 = 0,8. Após 1-2 hr, a forma deve começar a aparecer turvação a olho nu. <ol><li> Transfira assepticamente 1 ml de cultura em uma tina espectrofotômetro limpo. </li><li> Medir a absorvância de luz, utilizando um espectrofotómetro de UV-vis com o comprimento de onda ajustado para 600 nm. Use 1 ml dos meios de comunicação no qual as células foram cultivadas para definir o espaço em branco (LB ou TB). Opcionalmente, utilizar a cultura representativa a partir do passo 2.1.3 para este passo em vez disso. </li><li> Se a cultura ainda não atingiu o OD apropriado, retornar ao agitador e verificar mais uma vez a cada meia hora. Verifique a OD com mais frequência como o A 600 se aproxima de 0,8. </li></ol></li><li> Uma vez que a cultura atingiu a fase logarítmica tardia, indicado por A 600 = 0,8, Transferir assepticamente a cultura em 50 ml estéreis, tubos de centrífuga. </li><li> Recolher as células por centrifugação da cultura a 10000 xg durante 10 min. Verifique se há um epllet na parte inferior do tubo. </li><li> Decantar o sobrenadante clarificado para um recipiente de resíduos de risco biológico apropriado. Não perturbe o pellet celular. </li><li> Repita os passos de 2,4-2,5 até que todas as células foram recolhidas. </li><li> Re-suspender o sedimento em 100 mL de LB + Amp. Aspirar utilizando uma micropipeta ou usar um misturador de vórtice. Para uma maior produção ministring, re-suspender o pellet a partir de uma TB 50 ml + cultura Amp em 1 ml de meio LB + Amp fresco. </li></ol> 3. Ministring Produção <ol><li> Assepticamente adicionar 20 ml de LB + Amp num balão de Erlenmeyer de 125 ml e de calor a 42 ° C. Para uma maior produção ministring, preparar 500 ml de LB + Amp, pré-aquecido a 42 ° C. </li><li> Transferir a ressuspensão em meio pré-aquecido. </li><li> Incubar a 42 ° C e 250 rpm até a fase logarítmica passado, indicado por A 600 = 1,0. Não deixar 20 ml de cultura a 42 ° C após 1 hora. </li><li> Reduzir a temperatura a 37 ° C e deixar a cultura para um adicional 90 min. Para 500 ml, deixar a cultura durante um período de indução adicional de 90-120 min e não diminuir a temperatura. </li><li> Reduzir a temperatura a 30 ° C e deixar a cultura sob agitação a 200 rpm durante um período de temperatura de redução de marcha adicional de 2 h. Por 500 ml, estender a redução de marcha temperatura para 4 horas ou durante a noite. </li></ol> 4. Ministrings Colhendo <ol><li> Transferir assepticamente a cultura em estéreis 50 ml tubos de centrífuga. Centrifugar a 10.000 xg por 10 min e inspecionar para uma pelota. </li><li> Decantar o sobrenadante para um recipiente de resíduos de risco biológico apropriada sem perturbar o sedimento. Repetir até que todas as células foram recolhidas. </li><li> Manter a pelota para a extração de plasmídeo com qualquer extração comercial e kit de remoção de endotoxina ou congelamento de flash em nitrogênio líquido e armazenar a -80 ° C para posterior extração. </li></ol>

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	<li>Klinman, D. M., Ylt, A. K., Beaucaget, S. L., Conover, J., Kriegt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CpG+motifs+present+in+bacterial+DNA+rapidly+induce+lymphocytes+to+secrete+interleukin+6,+interleukin+12,+and+interferon+&#947;.">CpG motifs present in bacterial DNA rapidly induce lymphocytes to secrete interleukin 6, interleukin 12, and interferon &#947;.</a> Proc Natl Acad Sci. 93, 2879-2883 (1996).</li><li>Hodges, B. L., Taylor, K. M., Joseph, M. F., Bourgeois, S. A., Scheule, R. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+one-step+heat-inducible+in+vivo+mini+DNA+vector+production+system.">Optimization of a one-step heat-inducible in vivo mini DNA vector production system.</a> PLoS One. 9 (2), (2014).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Descrevemos aqui um sistema simples para a produção de ADN ministrings LCC utilizando um protocolo induzida pelo calor de um passo, o qual não requer nenhum equipamento especial para além de que o que é utilizado no crescimento bacteriano típico e manipulação. ministrings DNA são, cassetes lineares estáveis ​​livre de torção de expressão de ADN, desprovido de elementos genéticos procariotas. Eles podem ser utilizados em vez de métodos convencionais para a transferência de genes, a expressão de genes repórter, bem como nas avaliações para a eficiência de expressão do transgene em sistemas eucarióticos. ministrings ADN combinar a biocompatibilidade e benefícios aumentados eficiência de transfecção de &quot;mini&quot; vectores com o perfil de segurança superior de vectores de ADN lineares. A nossa robusta de um só passo em plataforma de produção in vivo de forma rápida e facilmente produz ministrings ADN para qualquer aplicação de transferência de genes, sem a necessidade de múltiplos processos dispendiosos in vitro. Há vários passos críticos paragarantir a produção ministring ideal (Figuras 2 e 3). indução de calor é a etapa mais importante para a produção ministring. Ministring completa falta de produção é muito provavelmente devido à falta de indução de calor (células retidos a 30 ° C), em que a repressão da expressão protelomerase impede a conversão do plasmídeo precursor para ministring LCC. Seguindo o protocolo de indução de calor, esperar uma eficiência de produção de aproximadamente 75%. indução de calor é optimizada, enquanto as células estão na fase log. Embora não haja nenhuma diferença estatisticamente significativa na ministring PE ao utilizar células em fase estacionária ( &quot;Overgrown&quot;, Figura 3), fizemos observar quase uma diminuição de 50% no rendimento global plasmídeo. Os rendimentos vão depender do protocolo de extracção de plasmídeo utilizado. Para a produção ministring ideal, desencadear indução de calor, enquanto as células estão em fase de registro. produção ministring pobres provavelmente será resultado de upshift temperatura prolongada ou insufficient downshift temperatura. Prolongada upshift temperatura é desencorajado, pois isso ativa a E. resposta de choque de calor coli 15, que pode inibir a actividade protelomerase e interferir com a estabilidade do plasmídeo. Portanto, cronometrando o downshift temperatura é mais um passo crítico para a produção ministring eficiente. Sem tempo de incubação adicional a 30 ° C, ministring eficiência de produção verificou-se ser muito baixa ( &quot;remoção precoce&quot;, Figura 3). Isto pode ser atribuído ao período de tempo necessário para a expressão e a actividade Tel. A originários profago PY54 codificação Tel protelomerase normalmente infecta Yersinia, que cresce optimamente cerca de 28 ° C 12, indicando que a 30 ° C também podem ser mais óptimo para a actividade Tel. O sistema de produção DNA minivector utiliza uma plataforma in vivo para gerar alta qualidade minivectors ADN livre de sequências bacterianas. Modificações para o protocolo pode include alterando os meios de crescimento para optimizar plasmídeo e produção de proteína, a fim de promover o crescimento de células durante a fase de crescimento (em vez de TB LB), ou aumentar ministring produção e eficiência de conversão. Para volumes maiores de cultura (200 ml e maiores), downshift temperatura e incubação a 30 ° C pode ser alargado durante a noite, sem impacto negativo severo sobre ministring PE. Nós incluímos modificações em nosso protocolo para 500 ml culturas como um exemplo. A purificação do ADN ministrings pode ser acelerada através de digestão in vitro de endonuclease da espinha dorsal procariótica. Há um número de locais-alvo da endonuclease de (por exemplo, PI-Scel, Pvul, ScaI) disponível na espinha dorsal do plasmídeo procariótica precursor, o qual pode ser cortado para expor linear extremidades abertas, para permitir que a degradação in vitro de a espinha dorsal procariótica. Isolamento de ministrings a partir de outras espécies de vectores pode também ser alcançada através de cromatograf ia de membrana de permuta aniónica 16. Uma limitação de corrente associado com o sistema de produção de vector de ADN LCC é a necessidade de purificação do DNA a partir de ministring outros produtos LCC e CCC. Embora facilmente purificado utilizando métodos de isolamento de plasmídeo padrão, o passo de isolamento pode ainda ser uma desvantagem numa configuração em larga escala. Separação do ministring pode ser usando idade, se o ministring e a espinha dorsal procariótica LCC são muito semelhantes em tamanho demorado. Alternativamente, a cromatografia de membrana de troca aniônica podem proporcionar uma melhor separação de ministrings a partir de espécies CCC vetor 16. Temperatura upshift pode ser outra limitação potencial como altas temperaturas também ativar a resposta ao choque térmico em E. coli, que afeta negativamente a proteína recombinante produz 17 e, consequentemente, reduzir as taxas de plasmídeo para ministring conversão. Nós relatamos em outros lugares otimizações da plataforma de produção para contornar e / ou mitigar esses efeitos de choque térmico 18. NósTambém estão otimizando os métodos actualmente para eliminar ou reduzir a contaminação LCC backbone procariotas in vivo. integração cromossómica do ADN ministring LCC perturba o cromossoma do hospedeiro e sujeita a célula a apoptose. Isto não só reduzir potenciais consequências negativas da mutagénese de inserção, tais como oncogênese e silenciamento de genes adjacentes, melhorando assim a sua segurança; o efeito letal pode também servir como um método ideal para a knock-in e estudos de substituição de genes, sem os efeitos colaterais associados e danos de integração. Os vectores de ADN ministring pode ser aplicado para a transferência e expressão de genes para proteínas terapêuticas, ARN, anticorpos ou antigénios num dado alvo in vivo ou substituir um alelo funcional inadequadamente ou não. O calor indutível-in vivo sistema simples de uma etapa de produção permite vectores de ADN ministring para ser facilmente produzidas para aplicações clínicas ou industriais.

O objetivo é produzir quantidades escaláveis ​​de linear covalentemente fechada minivectors (LCC) de ADN usando uma uma etapa in vivo DNA sistema de produção ministring induzida pelo calor da eficiência simples e alta. ministrings ADN fornecer uma estratégia não virai seguro e eficaz para entregar ADN. Elas combinam a segurança dos vectores LCC com a eficiência de minicirculos de ADN, e também oferecer uma alternativa mais segura para os vectores derivados de vírus sem comprometer a eficiência da transfecção. Para que um sistema de fornecimento de transgene a ser bem sucedida, o vector de ADN deve entrar na célula hospedeira alvo e expressam o transgene (s) codificados. Existem várias barreiras celulares que precisam de ser ultrapassados ​​na prática, particularmente em sistemas de mamíferos. A fim de evitar a degradação pelas nucleases do soro e detecção imunológica pelo sistema reticulo-endotelial, o vector de ADN devem ser bio- e imuno-compatível com o sistema de destino. DNA desprotegido é rapidamente digerido por nucleases de plasmae a membrana de plasmídeo é composto de barreiras de lipoproteínas densos de modo que o vector de ADN deve ser capaz de atravessar rapidamente a membrana plasmática das células alvo. Uma vez na célula, os vectores têm de atravessar o citoplasma e passar através da membrana nuclear para o núcleo para introduzir a expressão do transgene. técnicas de entrega de genes não virais concentrar no reforço da Tecido e célula-alvo. No entanto, a utilização de plasmídeos com estas técnicas convencionais reduz a eficiência da transfecção, devido à presença de sequências bacterianas imunogénicas, que silencia a expressão do gene rapidamente 1,2. plasmídeos convencionais normalmente carregam genes de resistência a antibióticos para manutenção em sistemas procariotas. No entanto, estes podem produzir efeitos adversos potenciais em hospedeiros humanos, a conferir resistência à ocorrência natural flora hospedeiras através de efeitos transferência horizontal de genes. Plasmídeos convencionais também contêm motivos dinucleótido CpG 2, o que pode desencadear uma resposta imunoestimuladora não desejada, potencialmentereduzir ou silenciar a expressão do transgene. Como eles são unicamente composta de a cassete de expressão eucariótica, minivectors ADN, tais como minicirculos de ADN 3, são a melhor alternativa para a entrega de genes que exibam uma biodisponibilidade melhorada extracelular e intracelular e expressão melhorada do gene devido ao seu tamanho reduzido e ausência de elementos procarióticas imunoestimuladores 4. As tarifas reduzidas tamanhos vector melhores no que diz respeito a resistência a forças de corte associadas com a administração in vivo a um local alvo 5. O maior número de cópias do vector por unidade de massa requer menos reagente de transfecção, diminuindo assim a toxicidade. No entanto, no caso de vector de integração aleatória num cromossoma do hospedeiro, circular covalentemente fechada (CCC) vectores, incluindo ambos os minicirculos de DNA e plasmídeos convencionais, conferir continuidade molecular e, por conseguinte, pode levar à mutagénese de inserção, que pode ter consequências devastadoras <s-se&gt; 6. Comparativamente, a integração de um vector de DNA linear interrompe o cromossoma e inicia percursos de morte celular, removendo assim a célula mutante a partir da população de células a proliferar e prevenção mutagénese de inserção 7. Vetores minimalistas expressão de genes imunologicamente definido (MIDGE) 8 e vetores micro-linear 9 (MiLV) são vectores de DNA LCC desenvolvidos in vitro. Vetores Midge exibiram até 17 vezes melhorada expressão do transgene in vivo em comparação com DNA plasmídeo convencional vetores 11, e têm demonstrado resultados promissores em terapia genética vacina 10 e câncer 8. Além disso, devido à estrutura livre de torção da minivector LCC, menos reagente de transfecção é necessário, em comparação com o homólogo CCC super-enrolado, reduzindo assim a toxicidade 7. Nossos vectores de DNA LCC avançados, ministrings DNA, demonstraram a eficiência expressão superior e bioavailabilidade 7. Além disso, ministrings de DNA são produzidos em um sistema de produção in vivo induzida pelo calor de um passo, uma alternativa conveniente e de baixo custo aos vectores MIDGE e MiLV LCC, que requerem etapas múltiplas in vitro. O sistema de produção ministring DNA a ser demonstrado é um processo termo-inducible simples realizado in vivo, tornando-a eficaz e facilmente escalável. Este sistema explora a Yersinia enterocolitica bacteriófago derivada-PY54 Tel / PAL protelomerase sistema de recombinação 12 para separar a cassete de expressão eucariótica mínima a partir da estrutura do plasmideo procariótica. Temos engenharia Escherichia coli (W3NN) para expressar Tel protelomerase sob o controle do promotor do bacteriófago λ induzida pelo calor, cl [TS] 857 13. Após expressão, Tel protelomerase age em locais-alvo pal presente dentro de &quot;Super Sequence&quot; (SS) sítios localizados no plasmídeo precursorpara produzir produtos LCC, a partir do qual o ministring ADN pode então ser purificado (Figura 1). Os locais de SS no plasmídeo de ADN ministring precursor também codificam locais alvo para outras recombinases incluindo a recombinase Cre (LOX), TELN protelomerase (telRL) e Flp recombinase (FRT), facilitando assim a produção de LCC isogénico e minivectors CCC a partir de um plasmídeo precursor. Além disso, cada sítio SS é flanqueado em ambos os lados por sequências de SV40 (SV40e), que servem para melhorar a translocação nuclear 14. Nós demonstramos noutro local que a adição sucessiva de SV40e confere progressivamente aumentos correspondentes na eficiência de transfecção 7. O plasmídeo precursor (pADN MiniString ou PDMS) contém um poli-ligante (Figura 1) para facilitar a inserção de qualquer gene desejado de interesse em fusão transcricional com o repórter fluorescente verde (GFP). A tecnologia de DNA minivector podeser utilizado em vez de métodos convencionais para a transferência de genes, a expressão de genes repórter, e as avaliações para a eficiência de expressão do transgene em sistemas eucarióticos. ministrings ADN combinar a biocompatibilidade e benefícios aumentados eficiência de transfecção de &quot;mini&quot; vectores com o perfil de segurança superior de vectores de ADN lineares. Nossa plataforma robusta de produção de uma etapa rápida e facilmente produz ministrings de DNA para qualquer aplicação de transferência de genes e oferece um perfil de segurança mais elevado.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1428">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">E. coli W3NN&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Mediphage</td>
			<td style="width:268px;"></td>
			<td style="width:492px;">strain for ministring processing: Nafissi &#38; Slavcev, 2012</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">pDMS.IRES.GFP</td>
			<td style="width:295px;">Mediphage</td>
			<td style="width:268px;"></td>
			<td>parent plasmid for ministring processing: also referred to as pDNA Ministring (pDMS)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:375px;">BD&#8482; Difco&#8482; Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani)</td>
			<td style="width:295px;">Fisher Scientific</td>
			<td>244620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Fisher BioReagents&#8482; Terrific Broth</td>
			<td style="width:295px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:268px;">BP2468500</td>
			<td style="width:492px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">BD&#8482; Bacto&#8482; Dehydrated Agar</td>
			<td style="width:295px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:268px;">214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Ampicilin</td>
			<td style="width:295px;">MP Biomedicals LCC</td>
			<td style="width:268px;">2190147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Ultrapure Milipore Water</td>
			<td style="width:295px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:268px;">Z00Q0V0US</td>
			<td>Model: Mili-Q Advantage A10 Water Purification System</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:375px;">Surgical Gloves</td>
			<td style="width:295px;">VWR</td>
			<td style="width:268px;">(S) 82026-424, (M)82026-426, (L) 82026-428, (XL) 82026-430&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:375px;">Fisherbrand&#8482; Petri Dishes with Clear Lid Raised Ridge (100 x 15 mm)</td>
			<td style="width:295px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:268px;">FB0875712&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">30 mL KIMAX&#174; Test Tubes</td>
			<td style="width:295px;">VWR</td>
			<td style="width:268px;">89001-448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Spectrophotometer Cuvette</td>
			<td style="width:295px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:268px;">67.74</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Sterile 15 mL Falcon Tubes</td>
			<td style="width:295px;">&#160;BD Falcon</td>
			<td>62406-200,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">&#160;Sterile 50 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:295px;">&#160;FroggaBio</td>
			<td>2930-S0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon&#8482; Disposable Polystyrene Serological Pipets 10 mL</td>
			<td style="width:295px;">BD Falcon</td>
			<td>13-675-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon&#8482; Disposable Polystyrene Serological Pipets 25 mL</td>
			<td style="width:295px;">BD Falcon</td>
			<td>13-668-2&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Micropipettor (100-1000 &#956;L)</td>
			<td style="width:295px;">FroggaBio</td>
			<td style="width:268px;">C1000-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Micropipettor (20-200 &#956;L)</td>
			<td style="width:295px;">FroggaBio</td>
			<td style="width:268px;">C200-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Sterile Pipette Tips (100-1250 &#956;L)</td>
			<td style="width:295px;">VWR</td>
			<td style="width:268px;">89079-472&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Sterile Pipette Tips (1-200 &#956;L)</td>
			<td style="width:295px;">VWR</td>
			<td style="width:268px;">89079-460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Fisher Scientific Economy Burner</td>
			<td style="width:295px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:268px;">03-917Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Incubator Shaker</td>
			<td style="width:295px;">New Brunswick Scientific&#160;</td>
			<td style="width:268px;">M1352-00000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Sterile Erlenmeyer Flask (125 mL)</td>
			<td style="width:295px;">Pyrex (Sigma Aldrich)</td>
			<td>CLS4980125 Aldrich&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Sterile Erlenmeyer Flask (250 mL)</td>
			<td style="width:295px;">Pyrex (Sigma Aldrich)</td>
			<td>CLS4980250 Aldrich&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">&#160;Sterile Erlenmeyer Flask (500 mL)</td>
			<td style="width:295px;">Pyrex (Sigma Aldrich)</td>
			<td>CLS4980500 Aldrich&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:268px;">335901</td>
			<td>Model: Genesys 10 Vis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Floor Centrifuge</td>
			<td style="width:295px;">Beckman Coulter&#160;</td>
			<td style="width:268px;">369001</td>
			<td>Model: Avanti J-E</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Benchtop Centrifuge</td>
			<td style="width:295px;">Beckman</td>
			<td style="width:268px;">362114</td>
			<td>Model: GS-6R</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Fisher Scientific Analog Vortex Mixer&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:268px;">02-215-365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">1 kb DNA Ladder</td>
			<td style="width:295px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:268px;">N3232S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of double-stranded dna ministrings

Construiu-lineares fechados covalentemente minivectors (LCC) de ADN como uma alternativa vetor de administração de genes não virais produzidas através de uma plataforma simples in vivo. Ministrings ADN possuem um perfil de segurança elevado e também produzir com eficiência de carga de ADN para células alvo. vectores de ADN convencionais transportar sequências procarióticas indesejáveis, incluindo os genes de resistência a antibióticos, motivos de CpG, e as origens bacterianas de replicação, o que pode levar à estimulação de respostas imunológicas do hospedeiro. A biodisponibilidade de vectores de ADN convencionais também está comprometida devido ao seu tamanho molecular maior. A sua natureza circular também pode conferir a integração cromossômica, levando a mutagénese de inserção. sequências bacterianas são excisadas do ADN minivectors, deixando apenas o gene de interesse (GOI) e necessários elementos de expressão eucarióticos. Nossos minivectors DNA LCC, ou ministrings DNA, são desprovidos de sequências bacterianas imunogénicas; melhorando assim thbiodisponibilidade EIR e expressão GOI. No caso do vector de integração no cromossoma, o ADN ministring LCC letalmente vai perturbar o cromossoma do hospedeiro, removendo desse modo o mutante potencialmente perigosos a partir da população de células em proliferação. Consequentemente, ministrings ADN proporcionam os benefícios de ADN &#39;minicrculo&#39; enquanto elimina o potencial para eventos de integração vector indesejáveis. Em comparação com os plasmídeos e os seus homólogos convencionais (CCC) isogénicas circular covalentemente fechado, ADN ministrings demonstrar biodisponibilidade superior, a eficiência de transfecção, e a cinética citoplasmáticos - se, assim, necessitam de quantidades inferiores de agentes tensioactivos catiónicos para a transfecção eficaz das células alvo. Construímos um um passo indutível sistema in vivo para a produção de ministrings ADN em Escherichia coli, que é simples de utilizar, rápido, e escalável.

Após a extracção do ADN, plasmídeo precursor residual, LCC procariótica espinha dorsal, e o ADN ministring vai ser recuperado. rendimento plasmídeo geral e pureza pode ser avaliada utilizando um espectrofotómetro. A pureza é estimada utilizando a razão da absorvância a 260 nm e 280 nm (A260 / A280), em que uma proporção de 1,9-2,0 é óptima. Todos os produtos LCC e CCC podem ser separados através de electroforese em gel de agarose (AGE) (Figura 2). AGE visualiza os resultados de ministring produção após a indução de calor, antes ministring purificação. Uma avaliação qualitativa da produção ministring podem ser feitas nesta fase através da comparação da intensidade da banda de ministring (2,4 kb) para o plasmídeo progenitor (5,6 kb) (Figura 2). DNA Ministring podem ser recuperados através de protocolos de extração de gel plasmídeo padrão seguintes AGE. Figura 3 resume ministring eficiências de produção sob várias condições que possam ocorrer enquanto carrying fora do protocolo. Ministring eficiência da produção foi determinada com base na intensidade da banda DNA usando o programa de análise do fabricante. Qualquer programa de densitometria semelhante pode ser usada para analisar os resultados de idade. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53177/53177fig1highres.jpg" width="700" /> Figura 1:. Visão de ministring produção (A) O vector pai contém um poliligante na fusão transcricional com um gene repórter, emoldurado pelos dois locais da SS. A espinha dorsal codifica beta-lactamase para a resistência à ampicilina e também contém vários locais únicos para cortar a espinha dorsal de digestão in vitro. (B) Visão geral do protocolo principal. Passos 2) fase de crescimento e 3) Ministring produção são representados num diagrama para fornecer um esquema geral dos passos envolvidos, destacando a simplicidade do protocolo. Indução (C) Ministring. Indução de calor inactiva o repressor sensível à temperatura, permitindo a expressão tel seguido pela atividade Tel em sites da SS nos plasmídeos pais. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53177/53177fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53177/53177fig2highres.jpg" width="350" /> Figura 2: Ministring produção após desvios de protocolo. 1: Controle, 2: não induzido, 3: Overgrown, 4: Overinduced, 5: remoção precoce. ministring DNA é de aproximadamente 2,4 kb, LCC backbone é de 3 kb, e pNN9 plasmídeo pai é de 5,6 kb. intensidade da banda de ministring e backbone LCC bandas cair com desvios do protocolo, indicando menor rendimento ministring. Da esquerda para a direita: 1 kb escada de New England Biolabs; Controle, seguindo o protocolo; Não induzidas, nenhuma mudança acima da temperatura; Repleto de Vegetação, temperatura upshift during fase estacionária; Overinduced, upshift temperatura ampliada; remoção precoce, sem redução de marcha temperatura. Os plasmídeos foram extraídos utilizando o Kit Omega-Biotek EZNA plasmídeo Mini. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53177/53177fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53177/53177fig3highres.jpg" width="550" /> Figura 3:. Efeitos de desvios de protocolo sobre a eficiência da produção ministring (PE) Os resultados são a média de 3 ensaios. PE é estimado a partir intensidade da banda relativa medida usando AlphaImager HP após a AGE. Os desvios ocorrem nas seguintes etapas: controle, seguindo o protocolo; Não induzidas, sem troca de marcha temperatura no passo 2; Repleto de Vegetação, upshift temperatura começou durante a fase estacionária no passo 1,6; Overinduced, upshift temperatura estendida no passo 2.3; remoção precoce, as células removida e extraídasem redução de marcha temperatura no passo 2.3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53177/53177fig3highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Production of Double-stranded DNA Ministrings at JoVE.com

Production of Double-stranded DNA Ministrings

The linear covalently closed (LCC) DNA minivector (DNA ministring) is a non-viral gene delivery vector offering high transfection efficiency and is relevant to any DNA delivery application. The production system is simple, rapid, and scalable in vivo. The following protocol provides visual step-by-step instructions for the production of DNA ministrings.

Produção de Double-stranded DNA Ministrings

We constructed linear covalently closed (LCC) DNA minivectors as a non-viral gene-delivery vector alternative produced via a simple platform in vivo. DNA ...

production-of-double-stranded-dna-ministrings

Research

JoVE Journal

Biology

10.2K visualizações.  University of Waterloo. The linear covalently closed (LCC) DNA minivector (DNA ministring) is a non-viral gene delivery vector offering high transfection efficiency and is relevant to any DNA delivery application. The production system is simple, rapid, and scalable in vivo. The following protocol provides visual step-by-step instructions for the production of DNA ministrings. 

Vídeo: Production of Double-stranded DNA Ministrings

Technical Demonstration of Whole Genome Array Comparative Genomic Hybridization

Array comparative genomic hybridization (array CGH) is a method for detecting gains and losses of DNA segments or gene dosage in the genome 1. Recent advances in this technology have enabled high resolution comparison of whole genomes for the identification of genetic alterations in cancer and other genetic diseases 2. The Sub-Megabase Resolution Tiling-set array (or SMRT) array is comprised of a set of approximately thirty thousand overlapping bacterial artificial chromosome (BAC) clones that span the human genome in ~100 kilobase pair (kb) segments 2. These BAC targets are individually synthesized and spotted in duplicate on a single glass slide 2-4. Array CGH is based on the principle of competitive hybridization. Sample and reference DNA are differentially labeled with Cyanine-3 and Cyanine-5 fluorescent dyes, and co-hybridized to the array. After an incubation period the unbound samples are washed from the slide and the array is imaged. A freely available custom software package called SeeGH (www.flintbox.ca) is used to process the large volume of data collected - a single experiment generates 53,892 data points. SeeGH visualizes the log2 signal intensity ratio between the 2 samples at each BAC target which is vertically aligned with chromosomal position 5,6. The SMRT array can detect alterations as small as 50 kb in size 7. The SMRT array can detect a variety of DNA rearrangement events including DNA gains, losses, amplifications and homozygous deletions. A unique advantage of the SMRT array is that one can use DNA isolated from formalin fixed paraffin embedded samples. When combined with the low input requirements of unamplified DNA (25-100ng) this allows profiling of precious samples such as those produced by microdissection 7,8. This is attributed to the large size of each BAC hybridization target that allows the binding of sufficient labeled samples to produce signals for detection. Another advantage of this platform is the tolerance of tissue heterogeneity, decreasing the need for tedious tissue microdissection 8. This video protocol is a step-by-step tutorial from labeling the input DNA through to signal acquisition for the whole genome tiling path SMRT array.

This video is a technical demonstration of the hybridization protocol for whole genome tiling path array CGH, which scans the entire human genome using only 25-100 ng of DNA that can be isolated from a variety of sources, including archival formalin fixed material.

Demonstração de técnicas Whole Genome hibridização genômica comparativa de matriz

Array comparative genomic hybridization (array CGH) is a method for detecting gains and losses of DNA segments or gene dosage in the genome 1.  Recent ...

Biologia

Methylated DNA Immunoprecipitation

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on gene expression, and is involved with normal development as well as disease 1-4. Thus, the ability to discriminate between methylated DNA and non-methylated DNA is essential for generating methylation profiles for such studies. Methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP) is an efficient technique for the extraction of methylated DNA from a sample of interest 5-7. A sample of as little as 200 ng of DNA is sufficient for the antibody, or immunoprecipitation (IP), reaction. DNA is sonicated into fragments ranging in size from 300-1000 bp, and is divided into immunoprecipitated (IP) and input (IN) portions. IP DNA is subsequently heat denatured and then incubated with anti-5'mC, allowing the monoclonal antibody to bind methylated DNA. After this, magnetic beads containing a secondary antibody with affinity for the primary antibody are added, and incubated. These bead-linked antibodies will bind the monoclonal antibody used in the first step. DNA bound to the antibody complex (methylated DNA) is separated from the rest of the DNA by using a magnet to pull the complexes out of solution. Several washes using IP buffer are then performed to remove the unbound, non-methylated DNA. The methylated DNA/antibody complexes are then digested with Proteinase K to digest the antibodies leaving only the methylated DNA intact. The enriched DNA is purified by phenol:chloroform extraction to remove the protein matter and then precipitated and resuspended in water for later use. PCR techniques can be used to validate the efficiency of the MeDIP procedure by analyzing the amplification products of IP and IN DNA for regions known to lack and known to contain methylated sequences. The purified methylated DNA can then be used for locus-specific (PCR) or genome-wide (microarray and sequencing) methylation studies, and is particularly useful when applied in conjunction with other research tools such as gene expression profiling and array comparative genome hybridization (CGH) 8. Further investigation into DNA methylation will lead to the discovery of new epigenetic targets, which in turn, may be useful in developing new therapeutic or prognostic research tools for diseases such as cancer that are characterized by aberrantly methylated DNA 2, 4, 9-11.

This video demonstrates the protocol for methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP). MeDIP is a two day procedure that selectively extracts methylated DNA fragments from a genomic DNA sample using antibodies with specificity for 5 -methylcytosine (anti-5 mC).

Imunoprecipitação DNA metilado

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on ...

Lentivirus Production

RNA interference (RNAi) is a system of gene silencing in living cells. In RNAi, genes homologous in sequence to short interfering RNAs (siRNA) are silenced at the post-transcriptional state. Short hairpin RNAs, precursors to siRNA, can be expressed using lentivirus, allowing for RNAi in a variety of cell types. Lentiviruses, such as the Human Immunodeficiency Virus, are capable to infecting both dividing and non-dividing cells. We will describe a procedure which to package lentiviruses. Packaging refers to the preparation of competent virus from DNA vectors. Lentiviral vector production systems are based on a 'split' system, where the natural viral genome has been split into individual helper plasmid constructs. This splitting of the different viral elements into four separate vectors diminishes the risk of creating a replication-capable virus by adventitious recombination of the lentiviral genome. Here, a vector containing the shRNA of interest and three packaging vectors (p-VSVG, pRSV, pMDL) are transiently transfected into human 293 cells. After at least a 48-hour incubation period, the virus containing supernatant is harvested and concentrated. Finally, virus titer is determined by reporter (fluorescent) expression with a flow cytometer.

To make lentiviruses, DNA vectors are transfected into human 293 cells. After harvest and concentrating the supernatant, virus titer is determined by fluorescence expression with a flow cytometer.

Produção lentivírus

RNA interference (RNAi) is a system of gene silencing in living cells. In RNAi, genes homologous in sequence to short interfering RNAs (siRNA) are ...

DNA Stable-Isotope Probing (DNA-SIP)

DNA stable-isotope probing (DNA-SIP) is a powerful technique for identifying active microorganisms that assimilate particular carbon substrates and nutrients into cellular biomass. As such, this cultivation-independent technique has been an important methodology for assigning metabolic function to the diverse communities inhabiting a wide range of terrestrial and aquatic environments. Following the incubation of an environmental sample with stable-isotope labelled compounds, extracted nucleic acid is subjected to density gradient ultracentrifugation and subsequent gradient fractionation to separate nucleic acids of differing densities. Purification of DNA from cesium chloride retrieves labelled and unlabelled DNA for subsequent molecular characterization (e.g. fingerprinting, microarrays, clone libraries, metagenomics). This JoVE video protocol provides visual step-by-step explanations of the protocol for density gradient ultracentrifugation, gradient fractionation and recovery of labelled DNA. The protocol also includes sample SIP data and highlights important tips and cautions that must be considered to ensure a successful DNA-SIP analysis.

DNA Stable-Isotope Probing DNA-SIP

DNA stable-isotope probing is a cultivation-independent method to identify and characterize active communities of microorganisms that are capable of utilizing specific substrates. Assimilation of substrate enriched in heavy isotope leads to incorporation of labelled atoms into microbial biomass. Density gradient ultracentrifugation retrieves labelled DNA for downstream molecular analyses.

DNA-Stable Isotope Probing (DNA-SIP)

DNA stable-isotope probing (DNA-SIP) is a powerful technique for identifying active microorganisms that assimilate particular carbon substrates and ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

Extração de DNA de material parafinado Embedded para análises genéticas e epigenéticas

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Iterative Optimization of DNA Duplexes for Crystallization of SeqA-DNA Complexes

Escherichia coli SeqA is a negative regulator of DNA replication that prevents premature reinitiation events by sequestering hemimethylated GATC clusters within the origin of replication1. Beyond the origin, SeqA is found at the replication forks, where it organizes newly replicated DNA into higher ordered structures2. SeqA associates only weakly with single GATC sequences, but it forms high affinity complexes with DNA duplexes containing multiple GATC sites. The minimal functional and structural unit of SeqA is a dimer, thereby explaining the requirement of at least two GATC sequences to form a high-affinity complex with hemimethylated DNA3. Additionally, the SeqA architecture, with the oligomerization and DNA-binding domains separated by a flexible linker, allows binding to GATC repeats separated by up to three helical turns. Therefore, understanding the function of SeqA at a molecular level requires the structural analysis of SeqA bound to multiple GATC sequences. In protein-DNA crystallization, DNA can have none to an exceptional effect on the packing interactions depending on the relative sizes and architecture of the protein and the DNA. If the protein is larger than the DNA or footprints most of the DNA, the crystal packing is primarily mediated by protein-protein interactions. Conversely, when the protein is the same size or smaller than the DNA or it only covers a fraction of the DNA, DNA-DNA and DNA-protein interactions dominate crystal packing. Therefore, crystallization of protein-DNA complexes requires the systematic screening of DNA length4 and DNA ends (blunt or overhang)5-7. In this report, we describe how to design, optimize, purify and crystallize hemimethylated DNA duplexes containing tandem GATC repeats in complex with a dimeric variant of SeqA (SeqA&Delta;(41-59)-A25R) to obtain crystals suitable for structure determination.

Crystal structure of protein&#x2013;DNA complexes can provide insight into protein function, mechanism, as well as, the nature of the specific interaction. Here, we report how to optimize the length, sequence and ends of duplex DNA for co-crystallization with Escherichia coli SeqA, a negative regulator of replication initiation.

Iterativo Otimização de Duplexos de DNA para Cristalização de SEQA-Complexos de DNA

Escherichia coli SeqA is a negative regulator of DNA replication that prevents premature reinitiation events by sequestering hemimethylated GATC clusters ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

Imagens em tempo real de uma única Engineered RNA transcritos em células vivas usando raciométrica Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Reduced-gravity Environment Hardware Demonstrations of a Prototype Miniaturized Flow Cytometer and Companion Microfluidic Mixing Technology

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If humans are to travel beyond low Earth orbit, a transition towards space-ready, point-of-care (POC) testing is required. Such testing needs to be comprehensive, easy to perform in a reduced-gravity environment, and unaffected by the stresses of launch and spaceflight. Countless POC devices have been developed to mimic laboratory scale counterparts, but most have narrow applications and few have demonstrable use in an in-flight, reduced-gravity environment. In fact, demonstrations of biomedical diagnostics in reduced gravity are limited altogether, making component choice and certain logistical challenges difficult to approach when seeking to test new technology. To help fill the void, we are presenting a modular method for the construction and operation of a prototype blood diagnostic device and its associated parabolic flight test rig that meet the standards for flight-testing onboard a parabolic flight, reduced-gravity aircraft. The method first focuses on rig assembly for in-flight, reduced-gravity testing of a flow cytometer and a companion microfluidic mixing chip. Components are adaptable to other designs and some custom components, such as a microvolume sample loader and the micromixer may be of particular interest. The method then shifts focus to flight preparation, by offering guidelines and suggestions to prepare for a successful flight test with regard to user training, development of a standard operating procedure (SOP), and other issues. Finally, in-flight experimental procedures specific to our demonstrations are described.

Spaceflight blood diagnostics need innovation. Few demonstrations have been published illustrating in-flight, reduced-gravity health diagnostic technology. Here we present a method for construction and operation of a parabolic flight test rig for a prototype point-of-care flow-cytometry design, with components and preparation strategies adaptable to other setups.

De gravidade reduzida Manifestações ambiente de hardware de uma tecnologia de mistura de fluxo Cytometer e Companion microfluídicos Prototype Miniaturized

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If ...

A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses performed. Considering that the use of new bacterial community analysis techniques (e.g., microbiomics, metagenomics) is becoming more prevalent in the agricultural and environmental sciences and many environmental samples within these disciplines can be physiochemically and microbiologically unique (e.g., fecal and litter/bedding samples from the poultry production spectrum), appropriate and effective DNA extraction methods need to be carefully chosen. Therefore, a novel semi-automated hybrid DNA extraction method was developed specifically for use with environmental poultry production samples. This method is a combination of the two major types of DNA extraction: mechanical and enzymatic. A two-step intense mechanical homogenization step (using bead-beating specifically formulated for environmental samples) was added to the beginning of the &#8220;gold standard&#8221; enzymatic DNA extraction method for fecal samples to enhance the removal of bacteria and DNA from the sample matrix and improve the recovery of Gram-positive bacterial community members. Once the enzymatic extraction portion of the hybrid method was initiated, the remaining purification process was automated using a robotic workstation to increase sample throughput and decrease sample processing error. In comparison to the strict mechanical and enzymatic DNA extraction methods, this novel hybrid method provided the best overall combined performance when considering quantitative (using 16S rRNA qPCR) and qualitative (using microbiomics) estimates of the total bacterial communities when processing poultry feces and litter samples.

A novel semi-automated hybrid DNA extraction method for use with environmental poultry production samples was developed and demonstrated improvements over a common mechanical and enzymatic extraction method in terms of the quantitative and qualitative estimates of the total bacterial communities.

Um método de extração de DNA híbrido para a Avaliação de comunidades bacterianas Qualitativa e Quantitativa de amostras de produção de aves de capoeira

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Verde Fluorescente à base de proteínas Expressão Rastreio de Proteínas de Membrana em<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...