Los autores agradecen a las Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá (NSERC) para financiar este trabajo.

1. Preparación de Medios de Comunicación y Culturas <ol><li> Para LB + Amp: preparar 500 ml de caldo Luria-Bertani (LB) esterilizar usando un autoclave a 121 ° C durante 30 min. Suplemento con ampicilina para dar una concentración final de 100 mg / ml de ampicilina y se almacena a 4 ° C hasta su utilización. </li><li> Para la TB + Amp: Prepárese para grandes (500 ml) o mayores volúmenes de producción Ministring. Preparar 600 ml de estéril Caldo Terrific (TB) esterilizadas usando un autoclave a 121 ° C durante 30 min. Suplemento con ampicilina para dar una concentración final de 100 mg / ml de ampicilina y se almacena a 4 ° C hasta su utilización. </li><li> Para LB agar + Amp: Preparar placas de agar LB estériles mediante la preparación de LB + Amp complementado con 15 g / L de agar. Alícuotas de aproximadamente 15 - 20 ml en placas de Petri estériles y almacenar al revés a 4 ° C hasta su utilización. </li><li> Preparar una placa racha de W3NN [PDMS] asépticamente rayas W3NN [PDMS] células en agar LB + Amp. Incubar la placa overnilucha a 30 ° C, hasta que las colonias individuales se pueden observar. No incubar W3NN por encima de esta temperatura para evitar derepressing expresión protelomerase. </li><li> transferencia asépticamente 5 ml de LB + Amp en un tubo de ensayo estéril. Preparar un cultivo de una noche de W3NN [] PDMS mediante la inoculación de este volumen con una sola colonia de la placa consecutivas. Incubar durante la noche el cultivo a 30 ° C en un agitador a 230 a 250 rpm. </li></ol> 2. Fase de crecimiento <ol><li> Transferir asépticamente 10 ml de LB + Amp en un estéril 125 ml matraz Erlenmeyer y inocular con 100 l de cultivo de una noche W3NN [PDMS] en el preparado LB + Amp, haciendo una dilución 1: 100. <ol><li> Para volúmenes mayores, añadir 500 l de cultivo durante la noche en 50 ml de TB + Amp en un Erlenmeyer de 250 ml, en lugar de LB + Amp. </li><li> Como alternativa, el uso como el segundo cultivo &quot;representante&quot; en el paso 2.2. </li></ol></li><li> Incubar en una incubadora de agitación a 30 ° C y 250 rpm hasta que el cultura alcanza mediados a fase logarítmica tardía, indicado por una densidad óptica (DO) o absorbancia: A 600 = 0,8. Después de 1-2 horas, el medio debe comenzar a aparecer turbia a simple vista. <ol><li> transferencia asépticamente 1 ml de cultivo a una cubeta de espectrofotómetro limpia. </li><li> Medir la absorbancia de la luz usando un espectrofotómetro UV-vis con la longitud de onda ajustado a 600 nm. Usar 1 ml de los medios de comunicación en el que se cultivan las células para establecer el blanco (LB o TB). Opcionalmente, utilice la cultura representativa de la etapa 2.1.3 para este paso en su lugar. </li><li> Si la cultura no ha alcanzado todavía la OD apropiada, vuelva a la coctelera y comprobar una vez más cada media hora. Compruebe el diámetro exterior mayor frecuencia como el A 600 se aproxima a 0,8. </li></ol></li><li> Una vez que el cultivo ha alcanzado la fase logarítmica tardía, indicada por A 600 = 0.8, transferir asépticamente el cultivo a tubos de centrífuga estéril de 50 ml. </li><li> Recoger las células por centrifugación del cultivo a 10.000 xg durante 10 min. Inspeccionar para una peLlet en la parte inferior del tubo. </li><li> Decantar el sobrenadante clarificado en un contenedor adecuado de residuos biopeligrosos. No perturbar el sedimento celular. </li><li> Repita los pasos 2.4-2.5 hasta que se hayan recogido todas las células. </li><li> Vuelva a suspender el precipitado en 100 l de LB + Amp. Aspirar el uso de una micropipeta o utilizar un mezclador de vórtice. Para mayor producción MiniString, volver a suspender el sedimento de una TB 50 ml + Amp cultura en 1 ml de medio LB fresco + Amp. </li></ol> 3. Producción Ministring <ol><li> Asépticamente añadir 20 ml de LB + Amp en un matraz Erlenmeyer de 125 ml y el calor a 42 ° C. Para mayor producción MiniString, preparar 500 ml de LB + Amp calentada a una temperatura de 42 ° C. </li><li> La transferencia de la resuspensión en el medio precalentado. </li><li> Incubar a 42 ° C y 250 rpm hasta que la fase de registro pasado, indicada por A 600 = 1,0. No deje de 20 ml de cultivo a 42 ° C pasada 1 hora. </li><li> Reducir la temperatura a 37 ° C y dejar la cultura de una adicional 90 min. Para 500 ml, dejar el cultivo durante un período de inducción adicional de 90 - 120 minutos y no disminuir la temperatura. </li><li> Reducir la temperatura a 30 ° C y dejar el cultivo con agitación a 200 rpm durante un período de reducción de marcha de temperatura adicional de 2 hr. Para 500 ml, extender el cambio hacia abajo a la temperatura de 4 horas o durante la noche. </li></ol> 4. Recolección de Ministrings <ol><li> transferir asépticamente el cultivo a tubos de centrífuga estéril de 50 ml. Centrifugar a 10.000 xg durante 10 minutos e inspeccione por un pellet. </li><li> Decantar el sobrenadante en un contenedor adecuado de residuos biopeligrosos sin perturbar el sedimento. Repita hasta que se hayan recogido todas las células. </li><li> Retener el sedimento para la extracción del plásmido con cualquier extracción comercial y el kit de eliminación de endotoxina o congelación de flash en nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C para su posterior extracción. </li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Se describe aquí un sistema simple para la producción de ADN ministrings LCC utilizando un protocolo inducible por calor de un solo paso, que no requiere ningún equipo especial aparte de la que se usa en el crecimiento y la manipulación bacteriana típica. ministrings de ADN están libres de torsión y estables casetes de expresión de ADN lineales, desprovistos de elementos genéticos procariotas. Se pueden usar en lugar de los métodos convencionales para la transferencia de genes, la expresión de genes indicadores, así como en las evaluaciones hacia la eficacia de la expresión del transgen en los sistemas eucariotas. ministrings ADN combinan la biocompatibilidad y el aumento de los beneficios de la eficiencia de transfección de vectores &quot;mini&quot; con el perfil de seguridad superior de vectores de ADN lineales. Nuestra sólida de un solo paso en la plataforma de producción in vivo rápidamente y fácilmente produce ministrings de ADN para cualquier aplicación de la transferencia de genes sin la necesidad de múltiples procesos costosos en vitro. Hay varios pasos críticos paraasegurar una producción óptima MiniString (Figuras 2 y 3). la inducción de calor es el paso más crítico para la producción Ministring. la falta completa de MiniString producción es más probable debido a la falta de inducción de calor (células retenidas a 30 ° C), donde la represión de la expresión protelomerase impide la conversión del plásmido precursor de MiniString LCC. Siguiendo el protocolo de inducción de calor, le espera una eficiencia de producción de aproximadamente 75%. la inducción de calor es óptima mientras que las células están en la fase de registro. Aunque no existe una diferencia estadísticamente significativa en Ministring PE utilizando las células en fase estacionaria ( &quot;Overgrown&quot;, Figura 3), lo hicimos observar casi un 50% de disminución en el rendimiento global del plásmido. Los rendimientos dependerán del protocolo de extracción de plásmido utilizado. Para la producción óptima MiniString, desencadenar la inducción de calor mientras que las células están en la fase de registro. la producción MiniString pobres será muy probablemente un resultado de aumento de marcha temperatura prolongado o insufficiereducción de marcha temperatura nt. Cambio ascendente temperatura prolongada no se recomienda ya que esto activa el E. coli respuesta de choque térmico 15, que puede inhibir la actividad de protelomerase e interferir con la estabilidad del plásmido. Por lo tanto, el momento de la reducción de marcha temperatura es un paso fundamental para la producción MiniString eficiente. Sin tiempo de incubación adicional a 30 ° C, se encontró MiniString eficiencia de la producción a ser muy pobre ( &quot;Extracción temprano&quot;, Figura 3). Esto se puede atribuir a la cantidad de tiempo requerido para la expresión y la actividad Tel. El originario profago PY54 codificación Tel protelomerase normalmente infecta a Yersinia, que crece de forma óptima alrededor de 28 ° C 12, lo que indica que 30 ° C también puede ser más óptimo para la actividad Tel. El sistema de producción minivector ADN utiliza una plataforma in vivo para generar minivectors ADN libre de secuencias bacterianas de alta calidad. Las modificaciones al protocolo de mayo iNCLUDE alterando el medio de cultivo para optimizar el plásmido y la producción de proteínas con el fin de promover el crecimiento celular durante la fase de crecimiento (TB en lugar de LB), o aumentar MiniString eficiencia de la producción y la conversión. Para volúmenes más grandes de cultivo (200 ml) y una mayor reducción de marcha, la temperatura y la incubación a 30 ° C durante la noche puede ser extendida sin graves repercusiones sobre la Ministring PE. Hemos incluido modificaciones en nuestro protocolo de cultivos de 500 ml como un ejemplo. Purificación de ministrings de ADN se puede acelerar a través de la digestión in vitro de endonucleasa de la columna vertebral procariota. Hay un número de sitios diana de endonucleasas (por ejemplo, PI-SceI, PvuI, ScaI) disponibles en la columna vertebral del plásmido procariota precursor, que puede ser cortado para exponer lineal extremos abiertos, lo que permite la degradación in vitro de la columna vertebral procariota. Aislamiento de ministrings de otras especies de vectores también se puede lograr a través de cromatografía de membrana de intercambio aniónico 16. Una limitación de corriente asociado con el sistema de producción de vector de ADN LCC es la necesidad de la purificación de la MiniString ADN de otros productos de LCC y CCC. Aunque fácilmente purificado utilizando métodos de aislamiento de plásmidos estándar, la etapa de aislamiento todavía puede ser una desventaja en un entorno a gran escala. La separación de la MiniString puede llevar mucho tiempo utilizando la edad si el MiniString y la columna vertebral procariota LCC son muy similares en tamaño. Como alternativa, la cromatografía de membrana de intercambio aniónico puede proporcionar una mejor separación de ministrings a partir de especies de vectores CCC 16. Cambio ascendente de la temperatura puede ser otra limitación potencial como altas temperaturas también activan la respuesta de choque térmico en E. coli, que afecta negativamente a la proteína recombinante produce 17 y por lo tanto reducir las tasas de plásmido a Ministring conversión. Se presenta en otro lugar optimizaciones de la plataforma de producción para eludir y / o mitigar esos efectos de choque térmico 18. NosotrosActualmente también se están optimizando los métodos para eliminar o reducir la contaminación LCC columna vertebral procariota in vivo. integración cromosómica del ADN MiniString LCC interrumpe el cromosoma del huésped y somete la célula a la apoptosis. Esto no sólo reducir posibles consecuencias negativas de la mutagénesis de inserción, tales como la oncogénesis y el silenciamiento de genes adyacentes, mejorando de este modo su seguridad; el efecto letal también puede servir como un método ideal para knock-in y estudios de sustitución de genes, sin los efectos secundarios asociados y daños de la integración. Vectores MiniString ADN se pueden aplicar a la transferencia y expresión de genes para proteínas terapéuticas, ARN, anticuerpos o antígenos en un objetivo determinado in vivo o sustituir un alelo funcional mal- o no. El simple inducible por calor en el sistema de producción in vivo de una sola etapa permite vectores MiniString ADN para ser producidos fácilmente para aplicaciones clínicas o industriales.

El objetivo es producir cantidades escalables de lineal cerrado covalentemente minivectors (LCC) de ADN usando un sistema simple y de alta eficiencia de un solo paso inducible por calor in vivo de ADN de producción MiniString. ministrings de ADN proporcionan una estrategia no viral seguro y eficaz para suministrar el ADN. Se combinan la seguridad de los vectores de LCC con la eficiencia de minicircles de ADN, y también ofrecen una alternativa más segura a los vectores derivados de virus sin comprometer la eficiencia de la transfección. Para que un sistema de suministro de transgén para tener éxito, el vector de ADN debe entrar en la célula huésped diana y expresar el transgén (s) codificada. Hay varias barreras celulares que hay que superar en la práctica, en particular en los sistemas de mamíferos. Con el fin de evitar la degradación por nucleasas de suero y la detección inmune por el sistema retículo-endotelial, el vector de ADN debe ser bio- y compatible-inmune con sistema de destino. ADN sin protección es digerida rápidamente por las nucleasas de plasmay la membrana plásmido se compone de barreras de lipoproteínas densas por lo que el vector de ADN debe ser capaz de atravesar rápidamente la membrana plasmática de las células diana. Una vez en la célula, los vectores deben atravesar el citoplasma y pasar a través de la membrana nuclear para entrar en el núcleo para la expresión del transgen. técnicas de suministro de genes no virales se centran en la mejora de los tejidos y las células de metas. Sin embargo, el uso de plásmidos convencionales con estas técnicas reduce la eficacia de transfección debido a la presencia de secuencias bacterianas inmunogénicas, que silencia rápidamente la expresión génica 1,2. plásmidos convencionales suelen llevar los genes de resistencia a antibióticos para el mantenimiento en los sistemas procariotas. Sin embargo, éstos pueden producir efectos adversos potenciales en huéspedes humanos o conferir resistencia a la flora natural de acogida a través de los efectos de transferencia horizontal de genes. Plásmidos convencionales también contienen dinucleótido CpG motivos 2, que puede desencadenar una respuesta inmunoestimuladora no deseado, potencialmentela reducción o silenciamiento de la expresión del transgen. A medida que se exclusivamente compuestos por el casete de expresión eucariota, minivectors ADN, tales como minicircles de ADN 3, son una mejor alternativa para la entrega de genes, ya que muestran una biodisponibilidad mejorada extracelular e intracelular y la mejora de la expresión de genes debido a su tamaño reducido y la ausencia de elementos procariotas inmunoestimulantes 4. Las tarifas de tamaño reducido vector mejor con respecto a la resistencia a las fuerzas de cizallamiento asociadas con la administración in vivo a un sitio diana 5. El mayor número de copias del vector por unidad de masa requiere menos reactivo de transfección, disminuyendo así la toxicidad. Sin embargo, en el caso de la integración vector aleatorio en un cromosoma huésped, circular cerrado covalentemente vectores (CCC), incluyendo tanto minicircles de ADN y plásmidos convencionales, impartir continuidad molecular y por lo tanto puede conducir a la mutagénesis de inserción, lo que puede tener consecuencias devastadoras <sarriba&gt; 6. Comparativamente, la integración de un vector de ADN lineal interrumpe el cromosoma e inicia vías de muerte celular, eliminando de este modo la célula mutante de la población de células en proliferación y la prevención de la mutagénesis de inserción 7. La expresión de genes inmunológicamente definido (MIDGE) vectores minimalistas 8 y vectores micro-lineal 9 (MiLV) son vectores de ADN LCC desarrollados in vitro. Vectores MIDGE han mostrado hasta un expresión del transgen mejorado 17 veces in vivo en comparación con ADN de plásmido convencional vectores 11, y han demostrado resultados prometedores en la terapia génica de la vacuna 10 y el cáncer 8. Además, debido a la estructura libre de torsión de la minivector LCC, se requiere menos reactivo de transfección en comparación con la contraparte CCC superenrollado, reduciendo así la toxicidad 7. Nuestros vectores de ADN LCC mejorados, ministrings de ADN, han demostrado eficacia de expresión superior y bioavailabilidad 7. Además, ministrings de ADN se producen en un sistema de un solo paso inducible por calor in vivo la producción, una alternativa conveniente y rentable de MIDGE y MiLV LCC vectores, que requieren varios pasos en vitro. El sistema de producción MiniString ADN que ser demostrada es un proceso inducible por calor sencillo realizado in vivo, lo que es tanto rentable y fácilmente escalable. Este sistema aprovecha la Yersinia enterocolitica bacteriófago PY54 derivado de Tel / PAL protelomerase sistema de recombinación 12 para separar el casete de expresión eucariota mínima por parte del esqueleto del plásmido procariota. Hemos diseñado Escherichia coli células (W3NN) para expresar Tel protelomerase bajo el control del promotor del bacteriófago λ-inducible por calor, cI [Ts] 857 13. Tras la expresión, Tel protelomerase actúa sobre sitios diana pal presentes dentro de &quot;Super Sequence&quot; (SS) sitios ubicados en el plásmido precursorpara dar productos de LCC, de los cuales el MiniString ADN puede entonces ser purificado (Figura 1). Los sitios de la SS en el plásmido precursor MiniString ADN también codifican sitios diana para otras recombinasas incluyendo la recombinasa Cre (LOX), TELN protelomerase (telRL) y Flp recombinasa (FRT), facilitando de este modo la producción de LCC isogénicas y minivectors CCC de un plásmido precursor. Además, cada sitio SS está flanqueado en ambos lados por secuencias de SV40 Enhancer (SV40E), que sirven para mejorar la translocación nuclear 14. Hemos demostrado en otro lugar que la adición sucesiva de SV40E confiere progresivamente los correspondientes incrementos en la eficiencia de la transfección 7. El plásmido precursor (pDNA MiniString o PDMS) contiene un polienlazador (Figura 1) para facilitar la inserción de cualquier gen deseado de interés en fusión transcripcional con el reportero fluorescente verde (GFP). La tecnología de ADN pueden minivectorser utilizado en lugar de los métodos convencionales para la transferencia de genes, la expresión de genes informadores, y las evaluaciones hacia la eficacia de la expresión del transgen en los sistemas eucariotas. ministrings ADN combinan la biocompatibilidad y el aumento de los beneficios de la eficiencia de transfección de vectores &quot;mini&quot; con el perfil de seguridad superior de vectores de ADN lineales. Nuestra sólida plataforma de producción de un solo paso con rapidez y facilidad produce ministrings de ADN para cualquier aplicación de la transferencia de genes y ofrece un perfil de seguridad superior.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; W3NN</td><td>Mediphage</td><td></td><td>strain for ministring processing: Nafissi &amp;amp; Slavcev, 2012</td></tr><tr><td>pDMS.IRES.GFP</td><td>Mediphage</td><td></td><td>parent plasmid for ministring processing: also referred to as pDNA Ministring (pDMS)</td></tr><tr><td>BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani)</td><td>Fisher Scientific</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents Terrific Broth</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2468500</td><td></td></tr><tr><td>BD Bacto Dehydrated Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilin</td><td>MP Biomedicals LCC</td><td>2190147</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure Milipore Water</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>Z00Q0V0US</td><td>Model: Mili-Q Advantage A10 Water Purification System</td></tr><tr><td>Surgical Gloves</td><td>VWR</td><td>(S) 82026-424, (M)82026-426, (L) 82026-428, (XL) 82026-430&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid Raised Ridge (100&amp;nbsp;x&amp;nbsp;15&amp;nbsp;mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>30 ml KIMAX Test Tubes</td><td>VWR</td><td>89001-448</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer Cuvette</td><td>Sarstedt</td><td>67.74</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 15 ml Falcon Tubes</td><td>&amp;nbsp;BD Falcon</td><td>62406-200,</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 50 ml Centrifuge Tubes</td><td>&amp;nbsp;FroggaBio</td><td>2930-S0</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Disposable Polystyrene Serological Pipets 10 ml</td><td>BD Falcon</td><td>13-675-20</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Disposable Polystyrene Serological Pipets 25 ml</td><td>BD Falcon</td><td>13-668-2&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Micropipettor (100-1,000&amp;nbsp;&amp;mu;l)</td><td>FroggaBio</td><td>C1000-1</td><td></td></tr><tr><td>Micropipettor (20-200&amp;nbsp;&amp;mu;l)</td><td>FroggaBio</td><td>C200-1</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Pipette Tips (100-1,250&amp;nbsp;&amp;mu;l)</td><td>VWR</td><td>89079-472&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Pipette Tips (1-200&amp;nbsp;&amp;mu;l)</td><td>VWR</td><td>89079-460</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific Economy Burner</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-917Q</td><td></td></tr><tr><td>Incubator Shaker</td><td>New Brunswick Scientific&amp;nbsp;</td><td>M1352-00000</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Erlenmeyer Flask (125 ml)</td><td>Pyrex (Sigma Aldrich)</td><td>CLS4980125 Aldrich&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Erlenmeyer Flask (250 ml)</td><td>Pyrex (Sigma Aldrich)</td><td>CLS4980250 Aldrich&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Erlenmeyer Flask (500 ml)</td><td>Pyrex (Sigma Aldrich)</td><td>CLS4980500 Aldrich&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>335901</td><td>Model: Genesys 10 Vis</td></tr><tr><td>Floor Centrifuge</td><td>Beckman Coulter&amp;nbsp;</td><td>369001</td><td>Model: Avanti J-E</td></tr><tr><td>Benchtop Centrifuge</td><td>Beckman</td><td>362114</td><td>Model: GS-6R</td></tr><tr><td>Fisher Scientific Analog Vortex Mixer&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>02-215-365</td><td></td></tr><tr><td>1 kb DNA Ladder</td><td>New England BioLabs</td><td>N3232S</td><td></td></tr></tbody></table>

production of double-stranded dna ministrings

Hemos construido lineales cerrados covalentemente minivectors (LCC) de ADN como un gen de entrega alternativa vector no viral producido a través de una plataforma sencilla in vivo. Ministrings de ADN poseen un perfil de seguridad elevado y también proporcionan de manera eficiente la carga de ADN a las células diana. vectores de ADN convencionales llevan secuencias procarióticas indeseables, incluyendo genes de resistencia a antibióticos, motivos CpG, y orígenes bacterianos de replicación, que puede conducir a la estimulación de las respuestas inmunológicas host. La biodisponibilidad de vectores de ADN convencionales también se ve comprometida debido a su tamaño molecular más grande. Su naturaleza circular puede impartir también la integración cromosómica, que conduce a la mutagénesis de inserción. secuencias bacterianas se escindieron de minivectors de ADN, dejando sólo el gen de interés (GOI) y elementos de expresión eucariotas necesarios. Nuestros minivectors ADN LCC, o ministrings de ADN, están desprovistos de secuencias bacterianas inmunogénicas; por lo tanto, la mejora de THEIR biodisponibilidad y la expresión GOI. En el caso de la integración del vector en el cromosoma, la MiniString ADN LCC se letalmente interrumpir el cromosoma del huésped, eliminando de este modo el mutante potencialmente peligrosa de la población de células en proliferación. En consecuencia, ministrings de ADN ofrecen los beneficios de ADN &#39;minicircle&#39; al tiempo que elimina el potencial de eventos de integración vector indeseables. En comparación con los plásmidos convencionales y sus contrapartes isogénicas circulares cerradas covalentemente (CCC), ministrings ADN demuestran una biodisponibilidad superior, la eficiencia de transfección, y la cinética citoplasmáticos - que por lo tanto requieren menores cantidades de tensioactivos catiónicos para la transfección eficaz de células diana. Hemos construido un solo paso inducible sistema in vivo para la producción de ministrings de ADN en Escherichia coli que es fácil de usar, rápido y escalable.

Después de la extracción de ADN, el plásmido precursor residual, LCC columna vertebral procariota, y la MiniString DNA serán recuperados. En general el rendimiento y la pureza plásmido se pueden evaluar usando un espectrofotómetro. La pureza se estimó utilizando la relación de la absorbancia a 260 nm y 280 nm (A260 / A280), donde una proporción de 1,9 a 2,0 es óptimo. Todos los productos de LCC y CCC se pueden separar a través de electroforesis en gel de agarosa (AGE) (Figura 2). EDAD visualiza los resultados de la producción Ministring después de la inducción de calor, antes de la Ministring purificación. Una evaluación cualitativa de la producción Ministring se puede hacer en esta etapa mediante la comparación de la intensidad de banda de la MiniString (2,4 kb) de plásmido parental (5,6 kb) (Figura 2). ADN Ministring se puede recuperar a través de protocolos de extracción de gel plásmido estándar siguientes EDAD. La figura 3 resume Ministring eficiencia de producción en diversas condiciones que puedan producirse mientras acarreoing a cabo el protocolo. MiniString eficiencia de producción se determinó sobre la base de la intensidad de banda de ADN utilizando el programa de análisis del fabricante. Cualquier programa de densitometría similar se puede utilizar para analizar los resultados de AGE. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53177/53177fig1highres.jpg" width="700" /> Figura 1:. Descripción general de MiniString de producción (A) El vector parental contiene un polienlazador en fusión transcripcional con un gen reportero, enmarcado por los dos sitios SS. La columna vertebral codifica beta-lactamasa para resistencia a ampicilina y también contiene varios sitios de corte únicos para la columna vertebral de la digestión in vitro. (B) Descripción general del protocolo principal. Pasos 2) fase de crecimiento y 3) Producción Ministring están representados en un diagrama para proporcionar un esquema general de los pasos implicados, destacando la simplicidad del protocolo. Inducción (C) Ministring. La inducción de calor inactiva el represor sensible a la temperatura, permitiendo la expresión tel seguido por la actividad de los sitios Tel SS en los plásmidos parentales. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53177/53177fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53177/53177fig2highres.jpg" width="350" /> Figura 2: Ministring producción después de las desviaciones de protocolo. 1: Control, 2: no inducidas, 3: Cubierto de vegetación, 4: Overinduced, 5: La eliminación temprana. MiniString ADN es de aproximadamente 2,4 kb, columna vertebral LCC es de 3 kb y pNN9 plásmido parental es de 5,6 kb. la intensidad de banda de las bandas MiniString y en troncales LCC caer con desviaciones de protocolo, lo que indica un rendimiento MiniString inferior. De izquierda a derecha: 1 kb escalera de New England Biolabs; Control, siguiendo el protocolo; No inducido, no cambio ascendente de la temperatura; Cubierto de vegetación, temperatura de cambio ascendente during fase estacionaria; Overinduced, cambio ascendente de temperatura ampliado; La remoción temprana, sin reducir la marcha de la temperatura. Los plásmidos se extrajeron mediante el Omega-Biotek EZNA plásmido Mini Kit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53177/53177fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/53177/53177fig3highres.jpg" width="550" /> Figura 3:. Efectos de las desviaciones de protocolo en MiniString eficiencia de la producción (PE) Los resultados son la media de 3 ensayos. PE se estima a partir de la intensidad de banda relativo medido usando AlphaImager HP después de la edad. Las desviaciones se producen en los siguientes pasos: Control, siguiendo el protocolo; No inducido, sin cambio ascendente temperatura en el paso 2; Cubierto de vegetación, cambio ascendente temperatura empezó durante la fase estacionaria en el paso 1.6; Overinduced, cambio ascendente de temperatura ampliado en el paso 2.3; La remoción temprana, las células retira y se extrajosin reducir la marcha de temperatura en el paso 2.3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53177/53177fig3highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Production of Double-stranded DNA Ministrings

The linear covalently closed (LCC) DNA minivector (DNA ministring) is a non-viral gene delivery vector offering high transfection efficiency and is relevant to any DNA delivery application. The production system is simple, rapid, and scalable in vivo. The following protocol provides visual step-by-step instructions for the production of DNA ministrings.

Producción de ADN de doble cadena Ministrings

We constructed linear covalently closed (LCC) DNA minivectors as a non-viral gene-delivery vector alternative produced via a simple platform in vivo. DNA ...

production-of-double-stranded-dna-ministrings

Research

JoVE Journal

Biology

10.3K vistas.  University of Waterloo. The linear covalently closed (LCC) DNA minivector (DNA ministring) is a non-viral gene delivery vector offering high transfection efficiency and is relevant to any DNA delivery application. The production system is simple, rapid, and scalable in vivo. The following protocol provides visual step-by-step instructions for the production of DNA ministrings. 

Video: Production of Double-stranded DNA Ministrings

DNA Curtains Shed Light on Complex Molecular Systems During Homologous Recombination

Homologous recombination (HR) is important for the repair of double-stranded DNA breaks (DSBs) and stalled replication forks in all organisms. Defects in HR are closely associated with a loss of genome integrity and oncogenic transformation in human cells. HR involves coordinated actions of a complex set of proteins, many of which remain poorly understood. The key aspect of the research described here is a technology called "DNA curtains", a technique which allows for the assembly of aligned DNA molecules on the surface of a microfluidic sample chamber. They can then be visualized by total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). DNA curtains was pioneered by our laboratory and allows for direct access to spatiotemporal information at millisecond time scales and nanometer scale resolution, which cannot be easily revealed through other methodologies. A major advantage of DNA curtains is that it simplifies the collection of statistically relevant data from single molecule experiments. This research continues to yield new insights into how cells regulate and preserve genome integrity.

<meta charset="utf8"></head><body>Las cortinas de ADN arrojan luz sobre sistemas moleculares complejos durante la recombinación homóloga

DNA curtains present a novel method for visualizing hundreds or even thousands of DNA-binding proteins in real-time as they interact with DNA molecules aligned on the surface of a microfluidic sample chamber.

Las cortinas de ADN arrojan luz sobre sistemas moleculares complejos durante la recombinación homóloga

Homologous recombination (HR) is important for the repair of double-stranded DNA breaks (DSBs) and stalled replication forks in all organisms. Defects in ...

Investigación

Genética

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. Linearized &lambda; DNA is modified to have a biotin on the end of one strand, and a digoxigenin moiety on the other end of the same strand. The biotinylated end is attached to a functionalized glass coverslip and the digoxigeninated end to a small bead. The assembly of these DNA-bead tethers on the surface of a flow cell allows a laminar flow to be applied to exert a drag force on the bead. As a result, the DNA is stretched close to and parallel to the surface of the coverslip at a force that is determined by the flow rate (Figure 1). The length of the DNA is measured by monitoring the position of the bead. Length differences between single- and double-stranded DNA are utilized to obtain real-time information on the activity of the replication proteins at the fork. Measuring the position of the bead allows precise determination of the rates and processivities of DNA unwinding and polymerization (Figure 2).

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system.

La observación directa de ADN Enzimas Replicar El uso de un ADN de una sola molécula de estiramiento de ensayo

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

Biología

<meta charset="utf8"></head><body>Desenrollamiento del ADN mediado por CMG observado por el crecimiento del tracto ssDNA-RPA

Single-Molecule Real-Time Visualization of DNA Unwinding by CMG Helicase

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a dynamic complex of proteins termed the replisome. At the heart of the replisome is the&#160;CDC45-MCM2-7-GINS (CMG) helicase, which separates the two strands of the DNA double helix such that DNA polymerases can copy each strand. During genome duplication, replisomes must overcome a plethora of obstacles and challenges. Each of these threatens genome stability, as failure to replicate DNA completely and accurately can lead to mutations, diseases, or cell death. Therefore, it is of great interest to understand how CMG functions in the replisome during both normal replication and replication stress. Here, we describe a total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy assay using recombinant purified proteins, which allows for real-time visualization of surface-tethered stretched DNA molecules by individual CMG complexes. This assay provides a powerful platform to investigate CMG behavior at the single-molecule level, allowing helicase dynamics to be directly observed with real-time control over reaction conditions.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor destacado: Desentrañando la dinámica de la replicación del ADN eucariota a través de la visualización de una sola molécula

This protocol demonstrates performing a single-molecule assay for live visualization of DNA unwinding by CMG helicase. It describes (1) preparing a DNA substrate, (2) purifying fluorescently labeled Drosophila melanogaster CMG helicase, (3) preparing a microfluidic flow cell for total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, and (4) the single-molecule DNA unwinding assay.

Visualización en tiempo real de una sola molécula del desenrollado del ADN mediante CMG Helicase

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a ...

Bioquímica

Strand-Specific Analysis of Proteins at Replicating DNA Strands by Enrichment and Sequencing of Protein-Associated Nascent DNA Method

Genome duplication is orchestrated by replisome proteins, including helicases, which unwind double-stranded DNA into individual antiparallel single strands, each requiring distinct modes of replication: continuous (leading) and discontinuous (lagging). Understanding the interactions of chromatin-associated proteins with replicating DNA strands in vivo is crucial for elucidating the mechanisms of chromatin assembly and DNA repair coupled to DNA replication. This protocol presents the enrichment and sequencing of protein-associated nascent DNA (eSPAN) method, designed to quantify relative protein levels on nascent leading and lagging DNA strands at replication forks. The eSPAN procedure starts with chromatin immunoprecipitation (ChIP, in yeast) or cleavage under targets and tagmentation (CUT&amp;Tag; in mammalian cells) of a protein of interest, followed by enrichment of the protein-associated nascent DNA by bromodeoxyuridine (BrdU) immunoprecipitation. Strand-specific next-generation sequencing is applied to isolated ssDNA. This technique can be used to determine whether a protein is enriched at leading or lagging replication forks. The eSPAN provides genome-wide strand-preference of chromatin-associated proteins, including histones at replication forks.

Enrichment and sequencing of protein-associated nascent DNA (eSPAN) was developed to detect the relative abundance of a chromatin-associated protein on two replicating DNA strands, thereby revealing molecular insight into chromatin replication and its coupled processes. This protocol describes eSPAN procedures in yeast and mouse embryonic stem (ES) cells.

Genome duplication is orchestrated by replisome proteins, including helicases, which unwind double-stranded DNA into individual antiparallel single ...

The DNA Replication Fork

An organism&#8217;s genome needs to be duplicated in an efficient and error-free manner for its growth and survival. The replication fork is a Y-shaped active region where two strands of DNA are separated and replicated continuously. The coupling of DNA unzipping and complementary strand synthesis is a characteristic feature of a replication fork.&#160;&#160; Organisms with small circular DNA, such as E. coli, often have a single origin of replication; therefore, they have only two replication forks, one in each direction leading away from the location of the initial opening.&#160; In organisms with large genomes, the replication of DNA is not done from a single point of origin but in many distinct, localized replication forks.&#160;
The unhindered progression of the replication fork is necessary for complete DNA replication and genome stability; however, the replication fork is often stalled by internal or external factors that can slow or stop its progression, resulting in replication stress. Replication stress causes genomic instability, which is a hallmark of diseases like cancer. Genomic instability is characterized by genomic alterations and increased frequency of harmful mutations. The movement of the replication fork can stop due to several reasons. For example, the drug hydroxyurea depletes the pool of nucleotides available for incorporation into the daughter strand, stalling the replication fork. Other problems that may hinder the progression of the replication fork include DNA lesions, a collision between a replication fork and a transcription complex, and defects in the enzymes involved in DNA replication.
The cell has a variety of repair mechanisms to reinitiate the stalled replication fork.&#160; S-phase checkpoints do not allow cells to begin mitosis until DNA repair is complete. Additionally, fork repriming can restart DNA synthesis by bypassing a DNA lesion or block. Despite these robust mechanisms, sometimes stalled forks cannot be reinitiated, which leads to the collapse of a fork, halting DNA replication.

La horquilla de replicación del ADN

An organism&#8217;s genome needs to be duplicated in an efficient and error-free manner for its growth and survival. The replication fork is a Y-shaped ...

Educación

JoVE Core

Biología Molecular

Unit 1

DNA Replication

TÉRMINOS Y CONCEPTOS CLAVES

Fixing Double-strand Breaks

The double-stranded structure of DNA has two major advantages. First, it serves as a safe repository of genetic information where one strand serves as the back-up in case the other strand is damaged. Second, the double-helical structure can be wrapped around proteins called histones to form nucleosomes, which can then be tightly wound to form chromosomes. This way, DNA chains up to 2 inches long can be contained within microscopic structures in a cell. A double-stranded break not only damages both copies of genetic information but also disrupts the continuity of DNA, making the chromosome fragile.
In a cell, there are an estimated ten double-strand breaks (DSBs) per day. The primary source of damage is metabolic by-products such as Reactive Oxygen Species and environmental factors such as ionizing radiations. Although less common, malfunctioning nuclear enzymes can also cause DSBs. Failure of enzymes like type II topoisomerases, which cut both strands of DNA and rejoin them while disentangling chromosomes, can inadvertently result in DSBs. Mechanical stress on the DNA duplex can also lead to DSBs. In prokaryotes, prolonged desiccation strains DNA, causing DSBs.
Of the two mechanisms for DNA repair, homologous recombination depends on a sister chromatid being nearby, which happens during the S and G2 phases. Due to this restriction, in the absence of a homology donor, cells have to resort to Nonhomologous end joining (NHEJ), even though it is much less accurate. It has been hypothesized that the reason higher eukaryotes can afford to preferentially utilize NHEJ for DSB repairs is that they have abundant non-coding DNA, which permits nucleotide substitutions, deletions or additions without grievous consequences.

Double-strand Breaks DSB &amp; Nonhomologous End Joining NHEJ

Fijación de roturas de doble hebra

The double-stranded structure of DNA has two major advantages. First, it serves as a safe repository of genetic information where one strand serves as the ...

Reparación y recombinación del ADN

Replication in Prokaryotes

DNA replication has three main steps: initiation, elongation, and termination. Replication in prokaryotes begins when initiator proteins bind to the single origin of replication (ori) on the cell&#39;s circular chromosome. Replication then proceeds around the entire circle of the chromosome in each direction from the two replication forks, resulting in two DNA molecules.
Many Proteins Work Together to Replicate the Chromosome
Replication is coordinated and carried out by a host of specialized proteins. Topoisomerase breaks one side of the double-stranded DNA phosphate-sugar backbone, allowing the DNA helix to unwind more rapidly, while helicase breaks the bonds between base pairs at the fork, separating the DNA into two template strands. Proteins that bind single-stranded DNA molecules stabilize the strands as the replication fork travels along the chromosome. DNA can only be synthesized in the 5&#39; to 3&#39; direction, so one strand of the template&#8212;the leading strand&#8212;is elongated continuously, while the other strand&#8212;the lagging strand&#8212;is synthesized in shorter pieces of 1,000&#8211;2,000 base pairs called Okazaki fragments.
Multiple Polymerases Take Part in Elongation
Much of the research to understand prokaryotic DNA replication has been performed in the bacterium Escherichia coli, a commonly-used model organism. E. coli has five DNA polymerases: Pol I, II, III, IV, and V. Pol III is responsible for the majority of DNA replication. It can polymerize about 1,000 base pairs per second. This astonishing pace allows the machinery present at the two replication forks to duplicate the E. coli chromosome&#8212;4.6 million base pairs&#8212;in roughly 40 minutes. DNA polymerase I is also well-characterized. Its primary role is to process the RNA primers on the lagging strand.
When Division Outpaces Duplication
Under favorable growth conditions, E. coli can divide every 20 minutes, about half the amount of time that it takes to replicate the genome. But how is this possible when both daughter cells must have their own DNA? Scientists found that the bacteria can begin another round of DNA replication from the origin of replication before the first round is complete; this means that daughter cells receive a chromosome that is already in the process of being copied and are prepared to divide again very quickly.

Replicación en procariotas

DNA replication has three main steps: initiation, elongation, and termination. Replication in prokaryotes begins when initiator proteins bind to the ...

Producción de ADN de doble cadena Ministrings

Resumen

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Las cortinas de ADN arrojan luz sobre sistemas moleculares complejos durante la recombinación homóloga

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La observación directa de ADN Enzimas Replicar El uso de un ADN de una sola molécula de estiramiento de ensayo

Visualización en tiempo real de una sola molécula del desenrollado del ADN mediante CMG Helicase

Visualización en tiempo real de una sola molécula del desenrollado del ADN mediante CMG Helicase

Visualización en tiempo real de una sola molécula del desenrollado del ADN mediante CMG Helicase

Strand-Specific Analysis of Proteins at Replicating DNA Strands by Enrichment and Sequencing of Protein-Associated Nascent DNA Method

La horquilla de replicación del ADN

Fijación de roturas de doble hebra

Replicación en procariotas