وأيد هذا العمل من خلال منحة من مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية (31003A_135278) لطائرة أسرع من الصوت. MOP هو المستفيد من منحة الدكتوراه من صندوق البحوث AXA. نشكر باتريشيا Nigg للمساعدة في تصميم الشكل 1.

ملاحظة قبل البداية: غطاء محرك السيارة استخدام تدفق الصفحي والاحتواء المناسب عند العمل مع فيروسات حية. هنا، نحن تصف ظروف النمو المناسبة لسلالة فيروس الإنفلونزا الثقافة A / WSN / 33. قد تختلف وافر من العدوى (وزارة الداخلية) وحضانة مرات اعتمادا على سلالة الفيروس المستخدمة. 1. إعداد البيروكسيديز A / WSN / 33 الفيروسات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور مادين-داربي kindey الكلاب (MDCK) الخلايا في قارورة T175 سم 2 باستخدام Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة (DMEM) تستكمل مع 10٪ FBS و 1٪ البنسلين، الستربتومايسين (القلم / بكتيريا). خلايا الثقافة في 37 درجة مئوية حتى ما يقرب من 70٪ confluency يتم التوصل إليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل الإصابة، وإزالة المتوسطة وغسل الخلايا مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS، pH7.0-7.3) وذلك بإضافة كمية كبيرة كافية لتغطية أحادي الطبقة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة برنامج تلفزيوني وتصيب الخلايا مع A / WSN / 33 مع وزارة الداخلية من 10 -4. تمييع الفيروس في برنامج تلفزيوني تستكمل مع 0.02 ملغ المغنيسيوم 2+، 0.01 ملغ الكالسيوم 2+ &lt;/ سوب&gt;، 0.3٪ ألبومين المصل البقري (BSA)، و 1٪ من ركلة جزاء / بكتيريا (العدوى PBS). استخدام اللقاح من 4 مل لT175 سم 2 قارورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان خلايا 1 ساعة عند 37 ° C. إزالة اللقاح عن طريق الطموح وماصة 10 مل DMEM تستكمل مع 0.3٪ BSA، 20 ملي HEPES، و 1٪ من ركلة جزاء / بكتيريا في قارورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة ما يقرب من 3 أيام حتى تأثير الاعتلال الخلوي (CPE) مرئيا، ثم طاف الحصاد. ويمكن التعرف على CPE كما التقريب من الخلايا تليها مفرزة وموت خلايا 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور طاف في 450 x ج لمدة 5 دقائق لإزالة الحطام الخلية. نقل طاف في أنبوب الصقر الجديد وكرر هذه الخطوة مرة أخرى. تجاهل الكريات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> supernatants نقل إلى أنابيب نابذة فائقة السرعة وsupernatants الأساس الذي تقوم عليه مع 5 مل من السكروز 30٪ المخفف في NTE العازلة (10 ملي تريس [الرقم الهيدروجيني 7.4]، 100 ملي كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA). موازنة الأنابيب قبل تنبيذ فائق وملء مع PBS للوصول إلى وحدة تخزين نهاية 30 مل. تدور supernatants في 112398 x ج (الموافق 25،000 دورة في الدقيقة لمدة الدوار SW28) لمدة 90 دقيقة في نابذة فائقة السرعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية طاف قبل pipetting ونقع بيليه الفيروس بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في 250 ميكرولتر PBS. Resuspend بيليه بواسطة pipetting صعودا وهبوطا. قياس محتوى البروتين من فيروس تنقيته بواسطة برادفورد مقايسة 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مجموعة biotinylation لتوليد المعقدة البيروكسيديز A / WSN / 33. اتبع تعليمات الشركة المصنعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وباختصار، إضافة كمية مناسبة من البيوتين للفيروس المنقى واحتضان ل2H على الجليد. نقل الفيروس إلى أنبوب نابذة فائقة السرعة وملء الأنبوب مع برنامج تلفزيوني للوصول إلى وحدة تخزين نهاية 30 مل. تدور الفيروس في 112389 x ج لمدة 90 دقيقة في نابذة فائقة السرعة. إزالة طاف قبل pipetting وإضافة 250 ميكرولتر PBS. نقع بيليه أكثر من ليلة 4 درجات مئوية. قسامة وتخزين الفيروس البيروكسيديز المخزنة في -80 ° C حيث أنها سوف تكون مستقرة لمدة 24 شهرا على الأقل. ملاحظة: قد يكون مفيدا لتحديد عيار من ع المعقدة البيروكسيديزجبر IAV بواسطة فحص اللوحة القياسية. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن البروتوكول اللاحق سوف تقيس فقط جزيئات الفيروس المعقدة البيروكسيديز. سوف تبقى جسيمات unbiotinylated بسبب biotinylation ناقصة المساهمة في عيار المعدية عن طريق فحص اللوحة ولكن ليس على إشارة يقاس في فحص المرفق / تدخيل. </li></ol> 2. تحديد المبلغ المطلوب من الفيروسات المعقدة البيروكسيديز ملاحظة: قبل أن يتم تنفيذ فحص المرفق / تدخيل، فمن المهم تحديد كمية الفيروس المعقدة البيروكسيديز المطلوبة لتصيب جميع الخلايا لعينة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الثقافة والخلايا A549 يعرض للتريبسين وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. عد الخلايا باستخدام غرفة الخلية. ماصة الخلايا 200،000 A549 إلى FACS deepwell الأنابيب. تدور 3 دقيقة في 450 ز س. إزالة طاف و resuspend بيليه مع 200 ميكرولتر PBS. خلايا يبرد على الجليد لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 5 أضعاف التخفيفات التسلسلي للbiotiالأسهم فيروس nylated في العدوى PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب تدور تحتوي على خلايا في 4 درجة مئوية لمدة 3 دقائق في 450 ز س. إزالة طاف و resuspend بيليه مع 100 ميكرولتر التي تحتوي على فيروس العدوى PBS. كما استخدام السيطرة وهمية العدوى PBS دون الفيروسات المعقدة البيروكسيديز. احتضان الأنابيب على الجليد لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب تدور في 4 درجة مئوية لمدة 3 دقائق في 450 ز س. إزالة طاف و resuspend بيليه في 200 ميكرولتر PBS. كرر هذه الخطوة مرة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتثبيت، وأنابيب تدور في 4 درجة مئوية لمدة 3 دقائق في 450 ز س. إزالة طاف و resuspend بيليه في 100 ميكرولتر من 3.7٪ امتصاص العرق (PFA). احتضان لمدة 10 دقيقة في RT. ثم، كرر الخطوة غسل موضح في 2.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لpermeabilization، أنابيب تدور في 4 درجة مئوية لمدة 3 دقائق في 450 ز س. إزالة طاف و resuspend بيليه في 100 ميكرولتر PBS تحتوي على 0.5٪ تريتون X-100. احتضان لمدة 6 دقائق في RT. ثم، كرر الخطوة غسل موضح في 2.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب تدور في 4 درجة مئوية لمدة 3 دقائق في 450 ز س. إزالة طاف و resuspend بيلوآخرون في 50 ميكرولتر 2٪ BSA مخففة في برنامج تلفزيوني يحتوي على STV-CY3. (يرجى ملاحظة، ينبغي تحديد التركيز المناسب من STV-CY3 قبل بدء التجربة تبدأ بتركيز 1: 200 و اختبار التخفيفات 2-أضعاف ما يصل الى 1: 2400 في أيدينا، والتخفيف من 1: 1000 أثبت ليكون أفضل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان 1 ساعة في الظلام في RT. ثم، كرر غسل خطوة وصفها في 2.4 ولكن Resuspend وبيليه في 200 ميكرولتر 2٪ BSA مخففة في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل العينات عن طريق التدفق الخلوي 16. البوابة على السكان CY3 إيجابية. اختيار أقل تركيز من الفيروسات المعقدة البيروكسيديز مما أدى إلى أكبر عدد ممكن من خلايا CY3 إيجابية في عدد السكان A549. </li></ol> 3. تحديد المبلغ المطلوب من Streptavidin ملاحظة: كفاءة حجب إشارة المشتقة من الفيروس خارج الخلية تحدد اكتشاف مجموعة من الفحص. وبالتالي، فمن المهم لإلغاء إشارة STV-CY3 قدر الإمكان. عشرالبريد حاجة المبلغ المطلوب من STV يعتمد على كمية من الأوراق المالية الفيروسات المعقدة البيروكسيديز المستخدمة (المحدد في القسم 2). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتبع الخطوات 2،1-2،4، ولكن استخدام تركيز الفيروس المحددة في القسم 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد التخفيفات المسلسل خمسة أضعاف من STV المخفف في برنامج تلفزيوني يحتوي على 2٪ BSA و 0.1٪ أزيد الصوديوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب تدور في 4 درجة مئوية لمدة 3 دقائق في 450 ز س. إزالة طاف و resuspend بيليه في 50 ميكرولتر STV التخفيف. كما استخدام السيطرة وهمية PBS تحتوي على 2٪ BSA و 0.1٪ أزيد الصوديوم دون STV. احتضان الأنابيب لمدة 30 دقيقة على الجليد. ثم، خطوة تكرار غسل وصفها في 2.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتبع الخطوات 2،5-2،9. لفحص الداخلي، واختيار أقل تركيز من STV مما أدى إلى كتلة قوية من CY3 إشارة (مقارنة مع العينة التي لم STV الحالي). لهذا، فإن النسبة المئوية للخلايا CY3 إيجابية أو كثافة مضان متوسط ​​للإشارة CY3 يمكن استخدامها. من الناحية المثالية، ينبغي أن يكون إشارة CY3 العينات STV معاملة أقرب إلى إشارة من المصابين ساخرةالخلايا وقت ممكن. </li></ol> 4. المرفقات / التطبع الفحص ملاحظة: تأكد من إعداد جميع الكواشف قبل بدء الفحص. لمجموعات المراقبة الثلاثة المقدمة في قسم النتائج (الخلايا المصابة وهمية، النورامينيداز خلايا ما قبل المعالجة وخلايا أزيد الصوديوم المعالجة) التعديلات الصغيرة على بروتوكول مطلوبة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 16 أنابيب deepwell تحتوي كل منها على 200،000 خلايا A549. إلى جانب مجموعة تجريبية مكونة من 4 أنابيب، وهناك 3 شروط السيطرة، يتطلب كل منها 4 أنابيب: خلايا وهمية المصابة، النورامينيداز (NA) خلايا -pretreated والخلايا المعالجة أزيد الصوديوم. وتتكون كل مجموعة من 4 أنابيب وصفها بأنها &#39;0 دقيقة&#39;، &#39;0 دقيقة + STV&#39;، &#39;30 دقيقة &#39;، &#39;30 دقيقة + STV &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب تدور في 4 درجة مئوية لمدة 3 دقائق في 450 ز س. إزالة طاف و resuspend بيليه في 200 ميكرولتر PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب تدور في 4 ° C في 450 ز س. إزالة طاف و resuspend بيلوآخرون في 200 DMEM ميكرولتر تحتوي على 0.3٪ BSA، 20 ملي HEPES و 1٪ البنسلين ستربتومايسين (الحضانة المتوسطة). احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 ° C. ملاحظة: للحصول على سيطرة النورامينيداز: استخدام النورامينيداز البكتيرية (مثل سياليداز من ضمة الكوليرا) بتركيز 200 مو / مل المخفف في الحضانة المتوسطة إلى resuspend الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب تدور في 4 درجة مئوية لمدة 3 دقائق في 450 ز س. إزالة طاف و resuspend بيليه في 200 ميكرولتر PBS. كرر هذه الخطوة أكثر مرة واحدة، ثم أنابيب يبرد على الجليد لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب تدور في 4 درجة مئوية لمدة 3 دقائق في 450 ز س. إزالة طاف و resuspend بيليه في 100 ميكرولتر البيروكسيديز فيروس (استخدم تركيز الفيروس المحددة في القسم 2 مخففة في العدوى PBS). احتضان 1 ساعة على الجليد. ثم، خطوة تكرار غسل وصفها في 2.4. ملاحظة: للحصول على سيطرة وهمية المصابة: استخدم العدوى PBS دون الفيروس. لمراقبة أزيد الصوديوم: استخدام فيروس مخفف في العدوى PBS تستكمل مع 0.1٪ أزيد الصوديوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بروcessing من العينات بعد الإصابة على الجليد: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لعينات &#39;0 دقيقة &quot;، اتبع الخطوة 2.5 وتخزين العينات في 4 درجات مئوية حتى يتم إصلاح عينات أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ل&#39;0 دقيقة + STV &quot;العينات، أنابيب تدور في 4 درجة مئوية لمدة 3 دقائق في 450 ز س. إزالة طاف و resuspend بيليه في 50 ميكرولتر STV (استخدام تركيز محدد في القسم 3) المخفف في برنامج تلفزيوني يحتوي على 2٪ BSA و 0.1٪ أزيد الصوديوم (لمنع تدخيل أثناء التعامل مع العينة). احتضان 30 دقيقة على الجليد. اتبع الخطوة 2،4-2،5 وتخزين العينات في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ل &#39;&#39;30 دقيقة العينات، وأنابيب تدور في 4 درجة مئوية لمدة 3 دقائق في 450 ز س. إزالة طاف و resuspend بيليه في 200 ميكرولتر PBS تحتوي على 2٪ BSA. احتضان 30 دقيقة عند 37 ° C. اتبع الخطوة 2،4-2،5 وتخزين العينات في 4 درجات مئوية. ملاحظة: للحصول على سيطرة أزيد الصوديوم: استخدام PBS تستكمل مع 2٪ BSA و 0.1٪ أزيد الصوديوم للحضانة 30 دقيقة عند 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ل &#39;30 دقيقة + عينات STV &quot;تدور الأنابيب في 4 درجة مئوية لمدة 3 دقائق في 450 ز س. إزالة طاف و resuspend بيليه في 200 ميكرولتر PBS تحتوي على 2٪ BSA. احتضان 30 دقيقة عند 37 ° C. ثم، وأنابيب تدور في 4 درجة مئوية لمدة 3 دقائق في 450 ز س. إزالة طاف و resuspend بيليه في 50 ميكرولتر STV (استخدام تركيز محدد في القسم 3) المخفف في برنامج تلفزيوني يحتوي على 2٪ BSA و 0.1٪ أزيد الصوديوم (لمنع تدخيل أثناء التعامل مع العينة). احتضان 30 دقيقة على الجليد. اتبع الخطوة 2،4-2،5 وتخزين العينات في 4 درجات مئوية. ملاحظة: للحصول على سيطرة أزيد الصوديوم: استخدام PBS تستكمل مع 2٪ BSA و 0.1٪ أزيد الصوديوم للحضانة 30 دقيقة عند 37 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتبع الخطوات 2،6-2،8 وتحليل العينات عن طريق التدفق الخلوي. تحديد النسبة المئوية للخلايا CY3 إيجابية في كل عينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب نسبة تعلق الفيروس والكمية النسبية للفيروس المنضوية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لحساب كمية الفيروس المرفقة، استخدام النسبة المئوية من CY3-positiلقد الخلايا المغلقة أو متوسط ​​كثافة مضان إشارة CY3. وعلى سبيل المقارنة، تعيين الخلايا غير المعالجة إلى 100٪ (الشكل 4B). وصفت نسبة الفيروس التي توليها &quot;0 دقيقة&quot; عينة: ملاحظة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لحساب كمية الفيروس المنضوية، تأخذ نسبة &quot;30 دقيقة + STV&quot; عينة إلى &quot;30 دقيقة&quot; عينة (الشكل 5B). ملاحظة: كما ذكر أعلاه، فإن النسبة المئوية للCY3 الخلايا المغلقة إيجابية أو كثافة مضان متوسط ​​للإشارة CY3 يمكن استخدامها. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Edinger, T. O., Pohl, M. O., Stertz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+of+influenza+A+virus%3A+host+factors+and+antiviral+targets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Entry of influenza A virus: host factors and antiviral targets.</a> J Gen Virol. 95, 263-277 (2014).</li>
<li>Palese, P., Shaw, M. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPalese%2C+P+%22Fields+Virolog%22">Fields Virolog</a>. Knipe, D. M., Howley, P. M. 2, Lippincott Williams and Wilkins. (2007).</li>
<li>Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+entry+pathway+of+influenza+virus+in+a+canine+kidney+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line.</a> J Cell Biol. 91, 601-613 (1981).</li>
<li>Sieczkarski, S. B., Whittaker, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+virus+can+enter+and+infect+cells+in+the+absence+of+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Influenza virus can enter and infect cells in the absence of clathrin-mediated endocytosis.</a> J Virol. 76, 10455-10464 (2002).</li>
<li>Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+endocytic+machinery+around+individual+influenza+viruses+during+viral+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry.</a> Nat Struct Mol Biol. 11, 567-573 (2004).</li>
<li>Vries, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+the+influenza+A+virus+endocytic+routes+reveals+macropinocytosis+as+an+alternative+entry+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Dissection of the influenza A virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway.</a> PLoS Pathog. 7, e1001329(2011).</li>
<li>Vries, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+A+virus+entry+into+cells+lacking+sialylated+N-glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Influenza A virus entry into cells lacking sialylated N-glycans.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109, 7457-7462 (2012).</li>
<li>Londrigan, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-linked+glycosylation+facilitates+sialic+acid-independent+attachment+and+entry+of+influenza+A+viruses+into+cells+expressing+DC-SIGN+or+L-SIGN%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">N-linked glycosylation facilitates sialic acid-independent attachment and entry of influenza A viruses into cells expressing DC-SIGN or L-SIGN.</a> J Virol. 85, 2990-3000 (2011).</li>
<li>Wang, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DC-SIGN+mediates+avian+H5N1+influenza+virus+infection+in+cis+and+in+trans%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">DC-SIGN mediates avian H5N1 influenza virus infection in cis and in trans.</a> Biochem Biophys Res Commun. 373, 561-566 (2008).</li>
<li>Pohl, M. O., Edinger, T. O., Stertz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolidase+is+required+for+early+trafficking+events+during+influenza+A+virus+entry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Prolidase is required for early trafficking events during influenza A virus entry.</a> J Virol. 88, 11271-11283 (2014).</li>
<li>Konig, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+host+factors+required+for+influenza+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human host factors required for influenza virus replication.</a> Nature. 463, 813-817 (2010).</li>
<li>Ludwig, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cell+signalling+pathways+to+fight+the+flu%3A+towards+a+paradigm+change+in+anti-influenza+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemothe%22%5BJournal%5D)">Targeting cell signalling pathways to fight the flu: towards a paradigm change in anti-influenza therapy.</a> J Antimicrob Chemothe. 64, 1-4 (2009).</li>
<li>Simoes, S., Slepushkin, V., Duzgunes, N., Pedroso de Lima, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+mechanisms+of+internalization+and+intracellular+delivery+mediated+by+pH-sensitive+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">On the mechanisms of internalization and intracellular delivery mediated by pH-sensitive liposomes.</a> Biochim Biophys Acta. 1515, 23-37 (2001).</li>
<li>Tran, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+specific+host+factors+protects+against+influenza+virus-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+death%2C+and+disease%22%5BJournal%5D)">Knockdown of specific host factors protects against influenza virus-induced cell death.</a> Cell death, and disease. 4, e769(2013).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgramm+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgramm quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Macey, M. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMacey%2C+MG+%22Flow+Cytometry+Principles+and+Applications%22">Flow Cytometry Principles and Applications</a>. Macey, M. G. , Humana Press. (2007).</li>
<li>Burness, A. T., Pardoe, I. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+enzymes+on+the+attachment+of+influenza+and+encephalomyocarditis+viruses+to+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Viro%22%5BJournal%5D)">Effect of enzymes on the attachment of influenza and encephalomyocarditis viruses to erythrocytes.</a> J Gen Viro. 55, 275-288 (1981).</li>
</ol>

The authors have nothing to disclose.

يصف بروتوكول لدينا وسيلة سهلة لقياس مرفق الفيروس واستيعاب التدفق الخلوي. لأنها تتيح استخدام المسمى فيروس wildtype الذي يحاكي عن كثب العدوى بالفيروس مقارنة مع استخدام جزيئات الفيروسات مثل (فلب). في حين تم تحسين بروتوكول لدينا لقياس الحجز واستيعاب IAV يمكن بسهولة أن يتم تكي...

دخول فيروس الانفلونزا (IAV) هو عملية متعددة الخطوات التي تبدأ مع ربط الفيروس إلى المستقبلات على غشاء البلازما من الخلايا المستهدفة 1. مستقبلات للIAV هو الحامض اللعابي التي هي موجودة على مجموعة كبيرة ومتنوعة من البروتينات السكرية والسكرية. وهيماغلوتينين (HA) البروتين من IAV التي هي موجودة في المغلف الفيروسي بربط الحامض اللعابي وبالتالي يتوسط مرفق من الجسيمات الفيروسية إلى غشاء البلازما من الخلايا المستهدفة 2. ويدخل الفيروس الخلايا عن طريق بوساطة بالكلاذرين الإلتقام ولكن أيضا مسارات دخول بديلة، مثل macropinocytosis، وقد وصفت 3-6. التفاعل بين HA والحامض اللعابي يبدو أن يكون كافيا للوساطة على حد سواء، والتعلق واثار استيعاب جزيئات فيروسية 7. ومع ذلك، فقد تم اقتراح مستقبلات دخول بديلة ويجري حاليا التحقيق دورهم في دخول IAV 1،8،9. لئيماهلدف اليوم، وبذل الجهود لتحديد العوامل المضيفة التي تشارك في دورة حياة الفيروس بهدف تطوير العلاجات المضادة للفيروسات حاجة ماسة رواية 10-12. ان دخول الفيروس سيكون خطوة إيجابية لاستهداف النمو IAV من أجل منع العدوى الفيروسية في أقرب نقطة له. قياس مراحل مختلفة من دخول IAV هو تحدي تجريبيا كما هو مطلوب كميات كبيرة من الفيروس عادة للكشف عن الفيروسات واردة. وبالإضافة إلى ذلك، ومجموعة الكشف عن التغييرات في دخول الفيروس خطي الوحيد نظرا لعدم وجود تكاثر الفيروس. وهذا يؤكد الحاجة لفحوصات مع حساسية عالية. مقايسة نقدم هنا يسمح للكشف عن فيروس تعلق على سطح الخلية وكذلك الكشف عن فيروس المنضوية في ما يتعلق المبلغ الإجمالي للفيروس الخلايا المرتبطة. استخدام فيروس wildtype المعقدة البيروكسيديز يمكن قياس مريحة من خلال تلطيخ مع STV-CY3 وقراءات التدفق الخلوي. فيروس المعقدة البيروكسيديز هو الباردة المنضم إلى خليةالصورة للسماح للمرفق ولكن منع تدخيل الجسيمات الفيروسية. الخلايا يمكن أن تكون ثابتة، permeabilized وملطخة STV-CY3 لقياس الفيروسات المرفقة. إشارة من خارج الخلية، virions المرفقة يمكن إلغاؤها إذا تم تطبيق خطوة حجب قبل التثبيت التي يتم تحضين الخلايا مع streptavidin غير المسمى (STV). في الخطوة التالية، بعد الحجز على المعقدة البيروكسيديز IAV، هو تحول درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية، ويتم السماح استيعاب الجسيمات الفيروسية لتأخذ مكان. محمية جزيئات المنضوية من ربط STV مما يسمح للتمييز بين الفيروسات من خارج وداخل الخلايا. في حالة تجريبية، يطلب من أربع عينات: &#39;0 دقيقة&#39;: العينة الأولى، وصفت &#39;0 دقيقة، هو قياس فيروس البرد محددة على سطح الخلية. &#39;0 دقيقة + STV&#39;: النموذج الثاني، المسمى &#39;0 دقيقة + STV &quot;، ويعطي خط الأساس كثافة إشارة من التجربة. تم منع الفيروسات المرفقة الطرافةيجب أن تكون ح STV والإشارة التالية تلطيخ مع STV-CY3 أقل بكثير مقارنة مع عينة &#39;0 دقيقة. &#39;30 دقيقة &#39;: العينة الثالثة، &#39;30 دقيقة&#39; يحتوي المرفق والمنضوية الفيروس بسبب التحول درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. &#39;30 دقيقة + STV &#39;: العينة الرابعة، &#39;30 دقيقة + STV &quot;التدابير جزء داخل الخلايا من الفيروسات. يتم تطبيق الخطوة حجب STV بعد فترة الحضانة 30 دقيقة. ونتيجة لذلك، والجسيمات الفيروسية على سطح الخلية ملزمة STV ترك الفيروسات المنضوية متاحة فقط لتلطيخ مع STV-CY3. ويمكن حساب القيمة النسبية للفيروس المنضوية كنسبة من فيروس المنضوية (تقاس في دقيقة &#39;30 + STV &quot;عينة) مقسوما على المبلغ الإجمالي للفيروس (التي وصفها &#39;30 دقيقة &#39;العينة). والضوابط نقترح أن تتضمن خلايا وهمية المصابة. إشارة التالية STV-CY3 تلطيخ الخلايا وهمية المصابة يعطي الخلفيةالناتجة عن بروتوكول تلطيخ. عنصر تحكم لمرفق IAV هي المعالجة المسبقة من الخلايا البكتيرية مع النورامينيداز (NA). NA يشق قبالة الحامض اللعابي من بروتينات سكرية الخلوية، وبالتالي إزالة مستقبلات المرفق من سطح الخلية. أزيد الصوديوم (SA) هو المانع الأيضية قوية وبالتالي كتل الإلتقام 13. الخلايا تعامل مع أزيد الصوديوم يجب أن تكون إيجابية لفيروس ملزم ولكن السلبي لاستيعاب.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>41966-052</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-169&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>VWR Calbiochem</td><td>126579</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630-100</td><td></td></tr><tr><td>D-Sucrose</td><td>Fluka</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Biosolve BV</td><td>20092391</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3680</td><td></td></tr><tr><td>EZ-LINK NHS-SS-BIOTIN kit</td><td>Fisher Scientific</td><td>&lt;a href=&quot;https://extranet.fisher.co.uk/insight2_ch/getProduct.do?productCode=W9971E&quot;&gt;W9971E&amp;nbsp;&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Bio Rad Protein Bio Assay</td><td>Bio Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>deepwell tubes (1.2 ml microtubes)</td><td>Milian</td><td>82 00 001</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>&amp;nbsp;Lucerna chem&amp;nbsp; Electron microscopy sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>ultracentrifuge tubes</td><td>Hemotec HmbH</td><td>253070</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fluka</td><td>93420</td><td></td></tr><tr><td>STV-Cy3</td><td>Life Technologies</td><td>43-4315</td><td></td></tr><tr><td>STV</td><td>Life Technologies</td><td>43-4302</td><td></td></tr><tr><td>sodium azide</td><td>Fluka</td><td>71290</td><td></td></tr><tr><td>bacterial neuraminidase/sialidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6514-1UN</td><td></td></tr></tbody></table>

measuring attachment and internalization of influenza a virus in a549 cells by flow cytometry

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed protocol for measuring relative changes in the amount of viral particles that attach to A549 cells, a human lung epithelial cell line, as well as in the amount of particles that are internalized into the cell. We use biotinylated virus which can be easily detected following staining with Cy3-labeled streptavidin (STV-Cy3). We describe the growth, purification and biotinylation of A/WSN/33, a widely used IAV laboratory strain. Cold-bound biotinylated IAV particles on A549 cells are stained with STV-Cy3 and measured using flow cytometry. To investigate uptake of viral particles, cold-bound virus is allowed to internalize at 37 &#176;C. In order to differentiate between external and internalized viral particles, a blocking step is applied: Free binding spots on the biotin of attached virus on the cell surface are bound by unlabeled streptavidin (STV). Subsequent cell permeabilization and staining with STV-Cy3 then enables detection of internalized viral particles. We present a calculation to determine the relative amount of internalized virus. This assay is suitable to measure effects of drug-treatments or other manipulations on attachment or internalization of IAV.

ويرد الكرتون واصفا الشروط الأربعة تجريبية مختلفة في الشكل 1 يتم عرض نتائج تجربة تمثيلية في الشكلين 2 - 5. في &quot;0 دقيقة&quot; عينة والفيروسات المعقدة البيروكسيديز بارد محددة لاستهداف الخلايا التي يمكن تصور من قبل STV-CY3 تلطيخ (الشكلان 1 و 2).</str...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry at JoVE.com

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

We present a protocol describing a semi-quantitative method for measuring both, the attachment of influenza A virus to A549 cells, as well as the internalization of virus particles into the target cells by flow cytometry.

قياس مرفق والتطبع الأنفلونزا A الفيروسات في خلايا A549 بواسطة التدفق الخلوي

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

measuring-attachment-internalization-influenza-virus-a549-cells-flow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.1K Views.  University of Zurich. We present a protocol describing a semi-quantitative method for measuring both, the attachment of influenza A virus to A549 cells, as well as the internalization of virus particles into the target cells by flow cytometry. 

Video: Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

الإنتاجية العالية لطريقة الكشف عن فيروس الإنفلونزا

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

عزل تدفق Cytometric من نوع خلايا الفئران الابتدائية السنخية II طلائي للدراسات الوظيفية والجزيئية

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion events, making it difficult to quantitatively analyze the sequence of the molecular steps involved. We have developed an in vitro, two-color fluorescence assay to monitor kinetics of single virus particles fusing with a target bilayer on an essentially fluid support.
Influenza viral particles are incubated with a green lipophilic fluorophore to stain the membrane and a red hydrophilic fluorophore to stain the viral interior. We deposit a ganglioside-containing lipid bilayer on the dextran-functionilized glass surface of a flow cell, incubate the viral particles on the planar bilayer and image the fluorescence of a 100 x 100 &mu;m2 area, containing several hundreds of particles, on a CCD camera. By imaging both the red and green fluorescence, we can simultaneously monitor the behavior of the membrane dye (green) and the aqueous content (red) of the particles.
Upon lowering the pH to a value below the fusion pH, the particles will fuse with the membrane. Hemifusion, the merging of the outer leaflet of the viral membrane with the outer leaflet of the target membrane, will be visible as a sudden change in the green fluorescence of a particle. Upon the subsequent fusion of the two remaining distal leaflets a pore will be formed and the red-emitting fluorophore in the viral particle will be released under the target membrane. This event will give rise to a decrease of the red fluorescence of individual particles. Finally, the integrated fluorescence from a pH-sensitive fluorophore that is embedded in the target membrane reports on the exact time of the pH drop.
From the three fluorescence-time traces, all the important events (pH drop, lipid mixing upon hemifusion, content mixing upon pore formation) can now be extracted in a straightforward manner and for every particle individually. By collecting the elapsed times for the various transitions for many individual particles in histograms, we can determine the lifetimes of the corresponding intermediates. Even hidden intermediates that do not have a direct fluorescent observable can be visualized directly from these histograms.

We present an in vitro, two-color fluorescence assay to visualize the fusion of single virus particles with a fluid target bilayer. By labeling viral particles with fluorophores that differentially stain the viral membrane and its interior, we are able to monitor the kinetics of hemifusion and pore formation.

طريقة لقياس حركية الانصهار الفيروسي على مستوى الجسيمات واحدة

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Biology

Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. While virus-cell attachment can be measured through the use of virions labeled with biotin, radioactive isotopes, or fluorescent dyes, these approaches typically require high multiplicities of infection (MOI) to enable detection of bound virus. We describe a quantitative (q)RT-PCR-based assay that measures Junin virus strain Candid 1 attachment via quantitation of virion-packaged viral genomic RNA. This assay has several advantages including its extreme sensitivity and ability to measure attachment over a large dynamic range of MOIs without the need to purify or label input virus. Importantly, this approach can be easily tailored for use with other viruses through the use of virus-specific qRT-PCR reagents. Further, this assay can be modified to permit measurement of particle endocytosis and genome uncoating. In conclusion, we describe a simple, yet robust assay for highly sensitive measurement of arenavirus-cell attachment.

The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. We report a quantitative (q)RT-PCR-based assay for ultrasensitive detection and quantitation of arenavirus attachment events.

الفحص حساس للغاية لقياس مرفق الفيروسة الرملية خلية

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

قياس الأنفلونزا النورامينيداز تثبيط الجسم المضاد التتر من قبل انزيم مرتبط كتين الفحص

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and Fc-regions. Here, we describe how to measure the activation of Fc effector functions by monoclonal antibodies targeting the influenza virus hemagglutinin with the use of a genetically engineered Jurkat cell line expressing an activating type 1 Fc-Fc&#947;R. Using this method, the contribution of specific Fc-Fc&#947;R interactions conferred by immunoglobulins can be determined using an in vitro assay.

We describe a method to measure the activation of Fc-mediated effector functions by antibodies that target the influenza virus hemagglutinin. This assay can also be adapted to assess the ability of monoclonal antibodies or polyclonal sera targeting other viral surface glycoproteins to induce Fc-mediated immunity.

أسلوب لتقييم وظائف المستجيب Fc بوساطة الناجم عن الإنفلونزا هيماغلوتينين أجسام مضادة محددة

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are cleared from the human lung alveoli by being phagocytosed by innate monocytes and/or neutrophils. This protocol offers a fast and reliable measurement of phagocytosis by flow cytometry using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled conidia for co-incubation with human leukocytes and subsequent counterstaining with an anti-FITC antibody to allow discrimination of internalized and cell-adherent conidia. Major advantages of this protocol are its rapidness, the possibility to combine the assay with cytometric analysis of other cell markers of interest, the simultaneous analysis of monocytes and neutrophils from a single sample and its applicability to other cell wall-bearing fungi or bacteria. Determination of percentages of phagocytosing leukocytes provides a means to microbiologists for evaluating virulence of a pathogen or for comparing pathogen wildtypes and mutants as well as to immunologists for investigating human leukocyte capabilities to combat pathogens.

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

This protocol provides a fast and reliable method to quantitatively measure phagocytosis of Aspergillus fumigatus conidia by human primary phagocytes using flow cytometry and to discriminate phagocytosis of conidia from mere adhesion to leukocytes.

قياس كثرة الفندره من الرشاشيات تبخير كونيديا من قبل الكريات البيضاء البشرية باستخدام تدفق الخلوي

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...

Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are either time-consuming or unable to detect small variations. Presented here is a protocol for the precise quantification of viral titer by analyzing electrical impedance variations of infected cells in real-time. Cellular impedance is measured through gold microelectrode biosensors located under the cells in microplates, in which magnitude depends on the number of cells as well as their size and shape. This protocol allows real-time analysis of cell proliferation, viability, morphology and migration with enhanced sensitivity. Also provided is an example of a practical application by quantifying the decay of influenza A virus (IAV) submitted to various physicochemical parameters affecting viral infectivity over time (i.e., temperature, salinity, and pH). For such applications, the protocol reduces the workload needed while also generating precise quantification data of infectious virus particles. It allows the comparison of inactivation slopes among different IAV, which reflects their capacity to persist in given environment. This protocol is easy to perform, is highly reproducible, and can be applied to any virus producing cytopathic effects in cell culture.

Reported here is a protocol for the quantification of infectious viral particles using real-time monitoring of electrical impedance of infected cells. A practical application of this method is presented by quantifying influenza A virus decay under different physicochemical parameters mimicking environmental conditions.

رصد بقاء فيروس الأنفلونزا خارج المضيف باستخدام تحليل الخلايا في الوقت الحقيقي

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are ...

Measuring the Activation of Fc-Mediated Effector Functions by HA Antibodies

Source: Bailey, M. J., et al. <a href="https://app.jove.com/v/56256">A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates an assay measuring the antibody-mediated activation of T cell effector functions. Adding an influenza virus hemagglutinin (HA)-specific monoclonal antibody to transfected mammalian cells expressing HA results in the formation of immune complexes with HA. Upon introducing engineered T cells expressing Fc receptors and a luciferase reporter, the T cells are activated by the antibody-HA complexes, and this activation is detected by adding a luciferase substrate and measuring the produced bioluminescence.

قياس تنشيط وظائف المستجيب بوساطة FC بواسطة الأجسام المضادة ل HA

1. Expression of Influenza Virus Hemagglutinin via Transfection

	Plate Human Embryonic Kidney (HEK 293T) cells at a density of 2 x 104 cells/well in a ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Antibody-Based Technologies

Characterization and Functional Analysis

Detection of Bacterial Adherence to Host Cells Using Fluorescence Imaging

Source: Yang, J., et al. <a href="https://app.jove.com/v/62764">Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells.</a> J. Vis. Exp. (2021)
This video demonstrates the bacterial adherence assay to evaluate GFP-tagged bacterial adherence to epithelial cell culture to study the dynamics of host-pathogen interactions using fluorescence microscopy-based imaging.

الكشف عن التصاق البكتيريا بالخلايا المضيفة باستخدام التصوير الفلوري

1. Bacterial adherence and host cell staining

	First, wash the seeded A549 cell monolayers three times with warm 1x PBS. For each wash, add 100 &#956;L ...