This work was supported by a Natural Sciences and Engineering Research (NSERC)-USRA grant to S.J., and by an NSERC-Discovery Grant to I.M. We thank Richard Bourgault, Meghan Rains, and Amanda Fluke for technical assistance. Seeds of att1-1 and att1-2 mutants were kindly provided by Dr. Jian-Min Zhou, Institute of Genetics and Developmental Biology, Beijing, China.

ملاحظة: تم تكييف هذا البروتوكول من بونافنتور وآخرون. (2004)، مولينا وآخرون. (2006)، لي وآخرون. (2013) 7،10،11. وتتلخص الخطوات 1-5 في الشكل 1. 1. مناديل إزالة الشحميات ملاحظة: شطف دائما عن الأواني الزجاجية وقبعات مع الكلوروفورم، والسماح الجافة تحت غطاء الدخان، وقبل استخدام. تنبيه: إجراء تجانس الأنسجة وجميع الخطوات نقل المذيبات تحت غطاء الدخان. دائما ارتداء معطف المختبر، والقفازات ونظارات السلامة البداية لتجنب الاتصال المباشر مع المواد الكيميائية وحماية العينات من التلوث. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حمام ماء سخن وكتلة الحرارة إلى 85 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن حوالي 0.5 غرام من كل عينة ورقة إلى 20 ملم × 125 ملم اختبار أنابيب زجاجية وزنه قبل مع تترافلوروإيثيلين (PTFE) قبعات المسمار -faced. تشمل أربع مكررات لكل عينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع 2-بروبانول في دورق مخروطي (حوالي 125 مل، 25 مل غرام من عصيدة فيلو). إضافة 2،6 دى ثالثي بوتيل-4-methylphenol (المعروف أيضا باسم hydroxytoluene الأنيسول، BHT) إلى تركيز النهائي من 0.01٪ (ث / ت). ملاحظة: إضافة BHT من 5٪ (ث / ت) حل الأسهم في الميثانول (BHT يساعد على التقليل من أكسدة الأحماض الدهنية غير المشبعة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سخن حل 2-بروبانول إلى 85 درجة مئوية في حمام مائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 12 مل الساخن 2-بروبانول المذيبات لكل أنبوب عينة والحرارة لمدة 15 دقيقة في 85 درجة مئوية في كتلة الحرارة. هذه الخطوة يثبط نشاط الليباز التي قد أفرج عنه من الخلايا تعطلت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح أنابيب يبرد إلى درجة حرارة الغرفة وطحن الأنسجة تماما مع الخالط حتى يتم الحصول على تعليق متجانسة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع العينات في شاكر المداري ويهز لمدة 1-2 ساعات في 100 دورة في الدقيقة ودرجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 800 x ج وتجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة حجم مساو من 2 بروبانول ويهز لمدة 12 ساعة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 800 x ج وتجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 12 مل CHCL 3: CH 3 OH (2: 1، V / V) لبقايا (25 مل غرام من العينة في المائة) ويهز بين عشية وضحاها في 100 دورة في الدقيقة ودرجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 800 x ج وتجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 12 مل CHCl 3: CH 3 OH (1: 2، ت / ت) لبقايا ويهز بين عشية وضحاها في 100 دورة في الدقيقة ودرجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 800 x ج وإزالة المذيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح العينات الجافة تحت غطاء الدخان بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الهواء الجاف بقايا ثم ضع في مجفف فراغ على اللامائية CaCl 2 أو كبريتات 4 حتى يتم التوصل إلى وزن ثابت (3-5 أيام). </li></ol> 2. التحلل: تحلل الميثانول مع ميثوكسيد الصوديوم (الشكل 2) تنبيه: تنفيذ الخطوات 2،3-2،4، 2،7-2،8، 2،10-2،11، 2،13-2،15 و2،17-2،18 تحت غطاء الدخان. دائما ارتداء معطف المختبر، والقفازات ونظارات السلامة البداية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سخن كتلة الحرارة إلى 60 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن أنابيب الاختبار تحتوي على بقايا الجافة (مهمة لمزيد من العمليات الحسابية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة المعايير الداخلية لكل أنبوب: 25 ωL heptadecanoate الميثيل (1 ملغ / مل الأسهم) و 25 ميكرولتر ω-pentadecalactone (1 ملغ / مل الأوراق المالية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.9 مل خلات الميثيل، 1.5 مل ميثوكسيد الصوديوم، و 3.6 مل الميثانول إلى كل أنبوب ولحد منها. بدلا من ذلك، وإعداد مزيج التفاعل مع هذه الكواشف ثلاثة وإضافة قسامات 6 مل لكل عينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات الحرارة لمدة 2 ساعة على 60 درجة مئوية، ودوامة دوريا في 15 دقيقة فترات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح عينات يبرد إلى درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 مل من ثنائي كلوريد الميثيلين (CH 2 الكلورين 2) و 1.5 مل من حمض الخليك الجليدي لاستخراج الأحماض الدهنية استرات الميثيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة محلول ملحي (0.5 M كلوريد الصوديوم) لملء كل أنبوب وغطاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات دوامة لمدة 1 دقيقة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 800 ز س. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل المرحلة العضوية (أقل) لتنظيف أنابيب متوسطة الحجم (16 × 125 ملم أنابيب اختبار الزجاج مع بوليtetrafluoroethylene (PTFE) -faced سقف المسمار). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة محلول ملحي (0.5 M كلوريد الصوديوم) لملء كل أنبوب وغطاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات دوامة لمدة 1 دقيقة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 800 ز س. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة مائي (العلوي) مرحلة وكرر الخطوات 2،11-2،12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة جميع مائي (العلوي) المرحلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة كبريتات الصوديوم اللامائية (نا 2 SO 4) إلى مذيب، وكأب الأنابيب، ودوامة لمدة 1 دقيقة. يمكن الآن يقم عينات حتى اليوم التالي. عند هذه النقطة عينات يمكن ترك بين عشية وضحاها تحت غطاء الدخان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 800 x ج لضغط نا 2 SO 4 الملح في القاع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل المرحلة العضوية إلى أنبوب المتاح كوب صغير (13 × 100 ملم اختبار أنابيب زجاجية مع تترافلوروإيثيلين (PTFE) -faced سقف المسمار). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتبخر المذيب للجفاف تحت النيتروجين، والشروع في الخطوة اشتقاق. إذا لم تتم معالجتها على الفور، تبخرت تخزين العينات في -20 ° C (يمكن أن يكون عينات لتخزين يسوتو قبل الخطوة التبخر). </li></ol> 3. إعداد المشتقات للاللوني للغاز تنبيه: تنفيذ الخطوات 3.1.2 و3.1.5 - 3.1.8 تحت غطاء الدخان. دائما ارتداء معطف المختبر، والقفازات ونظارات السلامة البداية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المشتقات Trimethylsilyl <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سخن كتلة الحرارة إلى 100 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من البيريدين و 100 ميكرولتر من BSTFA (N، O البس trimethylsilyl-trifluoroacetamide) إلى كل أنبوب ولحد منها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات الحرارة عند 100 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح عينات يبرد إلى درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتبخر العينات تحت النيتروجين في درجة حرارة الغرفة. تجنب تطبيق الحرارة لعينات، أحادية متقلبة جدا في هذه المرحلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 500 ميكرولتر من 1: 1 (ت / ت) هيبتان: التولوين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات دوامة لمدة 1 دقيقة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 800 ز س. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى عينات قارورة GC، والشروع في تحليل GC / MS. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاسيتيلالمشتقات ملاحظة: للحصول على أستلة، تعديل الخطوات 3.1.1-3.1.3 أعلاه على النحو التالي (لا يظهر في الفيديو)؛ خطوات 3.1.4-3.1.8 هي نفسها: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سخن كتلة الحرارة إلى 60 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من البيريدين و 100 ميكرولتر من أنهيدريد الخل (AC 2 O) للأنابيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات الحرارة 1 ساعة عند 60 ° C. </li></ol></li></ol> 4. GC / MS تحليل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام عمود شعري HP-5 (30 م × 0.25 مم × 0.25 ميكرومتر سماكة الفيلم) أو ما يعادلها (أي.، 5٪ ثنائي الفينيل، 95٪ ثنائي ميثيل polysiloxane). برنامج GC مع تدفق الغاز الناقل الهيليوم وضعت في 1.5 مل / دقيقة ودرجة حرارة الفرن مبرمجة 150-300 درجة مئوية في 3 ° C / دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام حقن الانقسام (تقسيم نسبة 01:10) وتعيين مطياف الكتلة لفحص وضع أكثر من 40-600 اتحاد المغرب العربي (الإلكترون تأثير التأين). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء جدول تسلسل بما في ذلك المذيبات (فارغة)، WT ومكررات متحولة، كل باستخدام أسلوب التحليل كوتين المشار إليها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل مذيبوقارورة العينة على كاروسيل، إضافة الهكسان إلى قارورة-الشطف حقنة في الاوتوماتيكى إذا لزم الأمر، ويبدأ التسلسل. بعد اكتمال التسلسل، متاحة للجميع العينات مجموع آثار ايون اللوني. </li></ol> 5. تحليل البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد أحادية البوليستر الدهون بمقارنة الطيف الكتلي كل الذروة لنشر أطياف الشامل أو من خلال البحث في المكتبة التجارية إن وجدت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل الذروة المحددة في مجموع ايون اللوني الحالي، استخدم مرات الاحتفاظ كل منهما للعثور على المناطق على جدول النتائج التكامل من GC / MS البرنامج التكميلي (الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل مونومر (الأعمدة AB)، إضافة القيم المنطقة وجدت في الجدول التكامل (التكميلي الشكل 1، العمود D) إلى العمود المقابل لكل تكرار نموذج في جدول Excel من أحادية (ملف إضافي 2، والأعمدة CF)، وهو جدول لقياس نبات الأرابيدوبسيسالمشتقات كوتين TMSI. استخدام ملف إضافي 3 إذا كنت على استعداد المشتقات الأسيتيل بدلا من ذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة مجالات المعايير الداخلية (IS) إلى الأعمدة IS (HK). بالنسبة لأولئك مونومرات التي لم يتم derivatized، استرات الميثيل وهي الأحماض الدهنية (جوع)، وثنائي الكربوكسيل استرات ميثيل حمض (DCA DMEs)، استخدم 17: 0 FAME (IS1) كما هو لالكمي (خلايا الأرجواني المظللة في الجدول مونومر؛ التكميلي ملفات 2/3). لمونومرات الهيدروكسيلية، بما في ذلك الكحولات الأولية، وحمض الفيرليك والأحماض ω-هيدروكسي، استخدم 15: 0 FAME 15-هيدروكسي (IS2) كما هو الاختيار لتقدير مجمع (خلايا خضراء shadded في الجدول مونومر، وملفات التكميلي 2/3) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الوزن الجاف ورقة لكل تكرار لأعمدة AX-BA (ملف إضافي 2) أو AQ-AT (ملف إضافي 3)؛ بدلا من ذلك، فحص الأوراق لحساب المساحات السطحية وإضافة قيم منطقة إلى طاولة مونومر للتعبير عن الأحمال مونومر لكل وحدةمساحة السطح. </li></ol>

<ol>
	<li>Kolattukudy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biopolyester+membranes+of+plants:+cutin+and+suberin.">Biopolyester membranes of plants: cutin and suberin.</a> Science. 208 (4447), 990-1000 (1980).</li><li>Kolattukudy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyesters+in+higher+plants.">Polyesters in higher plants.</a> Adv. Biochem. Eng. Biot. 71, 1-49 (2001).</li><li>Yeats, T. H., Rose, J. K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+and+function+of+plant+cuticles.">The formation and function of plant cuticles.</a> Plant Physiol. 163 (1), 5-20 (2013).</li><li>Pollard, M., Beisson, F., Li, Y., Ohlrogge, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+lipid+barriers:+biosynthesis+of+cutin+and+suberin.">Building lipid barriers: biosynthesis of cutin and suberin.</a> Trends Plant Sci. 13 (5), 236-246 (2008).</li><li>Beisson, F., Li-Beisson, Y., Pollard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solving+the+puzzles+of+cutin+and+suberin+polymer+biosynthesis.">Solving the puzzles of cutin and suberin polymer biosynthesis.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 15 (3), 329-337 (2012).</li><li>Heredia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+and+biochemical+characteristics+of+cutin,+a+plant+barrier+biopolymer.">Biophysical and biochemical characteristics of cutin, a plant barrier biopolymer.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1620 (1-3), 1-7 (2003).</li><li>Bonaventure, G., Beisson, F., Ohlrogge, J., Pollard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+aliphatic+monomer+composition+of+polyesters+associated+with+Arabidopsis+epidermis:+occurrence+of+octadeca-cis-6,+cis-9-diene-1,+18-dioate+as+the+major+component.">Analysis of the aliphatic monomer composition of polyesters associated with Arabidopsis epidermis: occurrence of octadeca-cis-6, cis-9-diene-1, 18-dioate as the major component.</a> Plant J. 40 (6), 920-930 (2004).</li><li>Franke, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoplastic+polyesters+in+Arabidopsis+surface+tissues+-+A+typical+suberin+and+a+particular+cutin.">Apoplastic polyesters in Arabidopsis surface tissues - A typical suberin and a particular cutin.</a> Phytochemistry. 66 (22), 2643-2658 (2005).</li><li>Vogg, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+fruit+cuticular+waxes+and+their+effects+on+transpiration+barrier+properties:+functional+characterization+of+a+mutant+deficient+in+a+very-long-chain+fatty+acid+-ketoacyl-CoA+synthase.">Tomato fruit cuticular waxes and their effects on transpiration barrier properties: functional characterization of a mutant deficient in a very-long-chain fatty acid -ketoacyl-CoA synthase.</a> J. Exp. Bot. 55 (401), 1401-1410 (2004).</li><li>Molina, I., Bonaventure, G., Ohlrogge, J., Pollard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+polyester+composition+of+Arabidopsis+thaliana+and+Brassica+napus+seeds.">The lipid polyester composition of Arabidopsis thaliana and Brassica napus seeds.</a> Phytochemistry. 67 (23), 2597-2610 (2006).</li><li>Li-Beisson, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acyl-lipid+metabolism.">Acyl-lipid metabolism.</a> The Arabidopsis Book. 11, e0161 (2013).</li><li>Molina, I., Ohlrogge, J. B., Pollard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deposition+and+localization+of+lipid+polyester+in+developing+seeds+of+Brassica+napus+and+Arabidopsis+thaliana.">Deposition and localization of lipid polyester in developing seeds of Brassica napus and Arabidopsis thaliana.</a> Plant J. 53 (3), 437-449 (2008).</li><li>Xiao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+CYP86A2+represses+Pseudomonas+syringae+type+III+genes+and+is+required+for+cuticle+development.">Arabidopsis CYP86A2 represses Pseudomonas syringae type III genes and is required for cuticle development.</a> EMBO J. 23 (14), 2903-2913 (2004).</li><li>Christie, W. W., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lipid Analysis - Isolation, Separation, Identification and Lipidomic Analysis. , 446 (2010).</li><li>Walton, T. J., Kolattukudy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+structures+of+cutin+monomers+by+a+novel+depolymerization+procedure+and+combined+gas+chromatography+and+mass+spectrometry.">Determination of the structures of cutin monomers by a novel depolymerization procedure and combined gas chromatography and mass spectrometry.</a> Biochemistry. 11 (10), 1885-1896 (1972).</li><li>Matzke, K., Riederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+into+the+chemical+constitution+of+cutins+and+suberins+from+Picea+abies+(L.)+Karst.,+Quercus+robur+L.,+and+Fagus+sylvatica+L.">A comparative study into the chemical constitution of cutins and suberins from Picea abies (L.) Karst., Quercus robur L., and Fagus sylvatica L.</a> Planta. 185 (2), 233-245 (1991).</li><li>Riederer, M., Sch&#246;nherr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+gas+chromatographic+analysis+of+methyl+esters+of+hydroxy+fatty+acids+derived+from+plant+cutin.">Quantitative gas chromatographic analysis of methyl esters of hydroxy fatty acids derived from plant cutin.</a> J. Chromatogr. 360, 151-161 (1986).</li><li>Moire, L., Schmutz, A., Buchala, A., Yan, B., Stark, R., Ryser, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycerol+Is+a+Suberin+Monomer.+New+Experimental+Evidence+for+an+Old+Hypothesis.">Glycerol Is a Suberin Monomer. New Experimental Evidence for an Old Hypothesis.</a> Plant Physiol. 119 (3), 1137-1146 (1999).</li><li>Gra&#231;a, J., Schreiber, L., Rodrigues, J., Pereira, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycerol+and+glyceryl+esters+of+omega-hydroxyacids+in+cutins.">Glycerol and glyceryl esters of omega-hydroxyacids in cutins.</a> Phytochemistry. 61 (2), 205-215 (2002).</li><li>Eglinton, G., Hunneman, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas+chromatographic-mass+spectrometric+studies+of+long+chain+hydroxy+acids-I:+The+constituent+cutin+acids+of+apple+cuticle.">Gas chromatographic-mass spectrometric studies of long chain hydroxy acids-I: The constituent cutin acids of apple cuticle.</a> Phytochemistry. 7 (2), 313-322 (1968).</li><li>Espelie, K. E., K&#246;ller, W., Kolattukudy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=9,16-dihydroxy-10-oxo-hexadecanoic+acid,+a+novel+component+in+citrus+cutin.">9,16-dihydroxy-10-oxo-hexadecanoic acid, a novel component in citrus cutin.</a> Chem. Phys. Lipids. 32 (1), 13-26 (1983).</li><li>Holloway, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracuticular+lipids+of+spinach+leaves.">Intracuticular lipids of spinach leaves.</a> Phytochemistry. 13 (10), 2201-2207 (1974).</li><li>Holloway, P. J., Deas, A. H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epoxyoctadecanoic+acids+in+plant+cutins+and+suberins.">Epoxyoctadecanoic acids in plant cutins and suberins.</a> Phytochemistry. 12 (7), 1721-1735 (1973).</li><li>Holloway, P. J., Cutler, D. F., Alvin, K. L., Price, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The chemical constitution of plant cutins. , 45-85 (1982).</li><li>Croteau, R., Fagerson, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+constituent+cutin+acids+of+cranberry+cuticle.">The constituent cutin acids of cranberry cuticle.</a> Phytochemistry. 11 (1), 353-363 (1972).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

على عكس البوليمرات الحيوية الأخرى مثل الحمض النووي والبروتينات، ليست مصنوعة البوليستر الدهون النباتية من قالب. بدلا من ذلك، مؤلفاتهم تعتمد على خصوصية الإنزيمات الموجودة في الأنسجة التي تجعل من هذه البوليمرات خارج الخلية. كما يحلل هذا القبيل، كيميائي للناخب عناصر حاسمة لفهم تكوين البوليستر الدهون. الطرق الكيميائية ليلتصق السندات استر تشمل التصبين، hydrogenolysis، نقل الميثيل الحمضية المحفز، والمحفز قاعدة نقل الميثيل 2. كل منهم لديه مزايا وعيوب. التصبين تنتج حرة الأحماض الدهنية هيدروكسي التي يمكن أن تفاعلات الثانوية. Hydrogenolysis مع هيدريد الليثيوم الألمنيوم (LiAlH 4) 16 استخدمت لتحليل كوتين 7. Hydrogenolysis يقلل الكربون functionalized إلى الكحول وتحتاج الهياكل الأصلية ليتم الاستدلال على ذلك من خلال deuteriolysis مع ديوترايد الليثيوم الألومنيوم (LiAlD 4). العيب هذا النهج هو شرط عالية الدقة GC / MS لمقارنة درجة deuteriation من البوليولات الدهنية التي تم الحصول عليها لجعل المهام هياكلها. وقد أسترة حمض المحفزة مع المثيلي فلوريد البورون (BF 3) كثيرا ما تستخدم في كوتين وسوبيرين depolymerizations 8،17،18، ولكن رد الفعل لديه صلاحية محدودة ويمكن أن يعرض القطع الأثرية المقرر إلى جانب ردود الفعل 15. حامض الكبريتيك المثيلي ينتج أيضا استرات الميثيل للأحادية ولكن مع نسب أكبر من الأحماض الدهنية 2-هيدروكسي، التي يفترض أن لا مكونات البوليستر الدهون الحقيقية، بالمقارنة مع الطرق الأخرى 10. طريقة أسترة NaOMe المحفزة الموصوفة في هذا البروتوكول تنتج الأحماض الدهنية استرات الميثيل التي derivatized بواسطة silylation من مجموعات الهيدروكسيل، وتوفير مميزة أطياف الكتلة لتحديد الهوية، أو عن طريق أستلة لتوفير المشتقات أكثر استقرارا من مجموعات الهيدروكسيل FOص الكمي. عيب واحد من هذه التقنية هو أن التحلل يتنافس مع أسترة عندما تكون المياه موجودة في رد الفعل. يتفاعل الماء مع NaOMe (المحفز) وتنتج هيدروكسيد الصوديوم، والذي بدوره تتحلمأ الدهنية استرات الميثيل لانتاج حامض الأحماض الحرة (الشكل 2D). هذا هو رد فعل الجانب غير مرغوب فيه لقمتين سوف يكون حاضرا لكل الأحماض الدهنية: استر الميثيل واستر مشتق TMSI، مما يعقد التحليل. باستخدام الكواشف اللامائية وإضافة خلات الميثيل بوصفه مشاركا من المذيبات للتنافس مع التصبين خطوات بالتالي حاسمة لمنع التحلل (الشكل 2D). كوتين وسوبيرين تحتوي على ما بين 1 و 26٪ الجلسرين 4. ومع ذلك، لن يتم الكشف عن هذه مونومر بسبب الظروف التجريبية الموصوفة في هذا البروتوكول. الجلسرين هو ماء للغاية، وعلى عكس الأحماض الدهنية أحادية استر الميثيل، سيتم القضاء خلال الخطوات المذيبات غسل المائية. هذا القيد أيضايمكن تحديد pplies إلى طرق التحلل كوتين أخرى، ولكن الجلسرين في الطبقة المائية التي تم الحصول عليها بعد أسترة باستخدام أسلوب الأنزيمية. بدلا من ذلك، يمكن قياسها كميا باستخدام أوضاع أكثر اعتدالا (على سبيل المثال، 0.05 M NaOMe) دون مزيد من استخراج المياه للكشف عن أحادية، بما في ذلك الجلسرين 19،20 .على الرغم من المفيد لغرض الجلسرين الكمي، ظروف معتدلة عادة ما تعطي التحلل غير الكامل للكوتين و سوبيرين. إذا كان GC بالإضافة إلى كاشف اللهب التأين (ااا) هو متاح، جميع مكررات يمكن تحليلها في هذا الصك لأغراض الكمية، بعد أن تم التعرف على قمم عينة تمثيلية من قبل GC / MS. بدلا من ذلك، يمكن تحديد أحادية في GC / آثار ااا إذا عرفت مؤشرات الاحتفاظ بها. كاشف تأين اللهب لديه حساسية عالية خاصة ومجموعة واسعة من التناسب، وهو أمر حاسم لتقدير مكونات العينة الرئيسية والثانويةفي أشواط واحد. وبالإضافة إلى ذلك، فمن قوي وسهل لصيانة وتشغيل 15. بروتوكول صفها يسمح للموثوقة وقابلة للتكرار العزلة، وتحديد، وتقدير حجم الدهون النباتية أحادية البوليستر، والسماح للتوصيف الكيميائي للطفرات التي تختلف في تكوين واحد أو أكثر من الدهون أحادية البوليستر. هذا الإجراء هو تحجيم، ويمكن أن تتكيف بسهولة لمعالجة كميات سواء الصغيرة والسائبة من مختلف المواد النباتية، بما في ذلك الجذور والبذور والأوراق والسيقان والأزهار. وقد تم نشر البيانات الطيفية الجماعية للدهون أحادية البوليستر من العديد من الأنواع مثل، 21-26 وتشكل الموارد القيمة لتحديد أحادية غير معروفة عند التكيف مع هذا البروتوكول إلى الأنسجة و / أو الأنواع الأخرى. هذه الطريقة تنطبق على تحقيقات الحيوي، والتنظيم، وتوزيع البوليستر الدهون في النباتات العليا.

النباتات الوعائية تعتمد على طبقات الخلية التي تعمل كحواجز للماء بين الأنسجة النباتية والبيئة الخارجية. هذه الهياكل المرتبطة جدار الخلية محبة للدهون تقيد العدوى المسببة للأمراض وتنظم النقل السلبي من الغازات والماء والمواد الذائبة ويخرجون من الأنسجة النباتية 1. هذه الحواجز هي بشرة النبات، هيكل synapomorphic فريدة من نوعها للنباتات 2، ومختلف الحواجز نشر المحتوية على سوبيرين. بشرة طبقة أليف الزيت توليفها من قبل خلايا البشرة وملزمة لهم عبر طبقة pectinaceous على الجانب خارج الخلية من جدار الخلية 3-5. ذلك يغلف أجهزة جوية الأولية من النباتات العليا، يعمل كواجهة الحيوية بين أنسجة النبات والبيئة. كوتين، المصفوفة الهيكلية للبشرة، وسوبيرين نوعان من البوليستر glycerolipid غير قابلة للذوبان المرتبطة الشموع المذيبات القابلة للاستخراج 2،4. هذه ل البوليمروتتكون ipids المشبعة وغير المشبعة مشتقات حمض الدهنية وكلاهما هيكليا ووظيفيا مماثل. ومع ذلك، فهي تمييزها عن الاختلافات المميزة في تكوين وترسيب مواقع كيميائية. سوبيرين هو البوليستر الأليفاتية تقع داخل جدران الخلايا من بعض الأنسجة الخارجية والداخلية تشكيل الجدار الثانوي. وتشمل الأنسجة Suberized periderms الجذور والدرنات وأوراق الشجر، البشرة الداخلية الجذر، طبقات غلاف البذرة، والجروح تلتئم 2. على عكس كوتين، والبوليستر سوبيرين يحتوي عادة الكحول، المشبعة وغير المشبعة الأحماض أحادية ثنائي الكربوكسيل، ونسبة كبيرة من أحادية سلسلة طويلة جدا (C≥20). كوتين هو البوليستر الدهون الأكثر وفرة في النباتات الوعائية 6، ويتكون من الجلسرين وC16-C18 مشتقات الأحماض الدهنية interesterified، مثل هيدروكسي وهيدروكسي الايبوكسي استبدال الأحماض الدهنية 4. في حين أن تكوين البوليمرات كوتينيتفاوت بين الأنواع tracheophyte، وأحادية الأولية الأكثر الغالبة هي 10، 16 dihydroxy 16: 0، 18-هيدروكسي-9،10-الايبوكسي 18: 0، و9،10،18-trihydroxy 18: 0 الأحماض الدهنية. وتتألف ومن المثير للاهتمام، ورقة نبات الأرابيدوبسيس ووقف كوتين أساسا من 18: 2 حمض ثنائي الكربوكسيل 7،8. البشرة المصنع أيضا تقديم تفاوتا كبيرا في سماكة تتراوح من بضعة نانومتر إلى عدة ميكرومتر 9. منذ بشرة العزلة هي خطوة شاقة وتستغرق وقتا طويلا، وخاصة بالنسبة البشرة ورقة رقيقة جدا مثل تلك التي من نبات الأرابيدوبسيس thaliana 8، وقد تم تطوير الأساليب التي تجاوز بشرة العزلة والتحقق من صحة 7،8. هنا، نحن تصف بروتوكول مفصلة لدراسة تكوين مونومر من كوتين في أوراق نبات الأرابيدوبسيس thaliana التي كتبها ميثوكسيد الصوديوم (NaOMe) التحلل -catalyzed واللوني للغاز لاحق / قياس الطيف الكتلي (GC / MS) التحليل. هذا البروتوكول يوفر وسيلة قوية لمعايرة المشاركوقد تم تكييف mposition من البوليستر الدهون النباتية في أنسجة delipidated كلها، ومن البروتوكولات ذكرت سابقا 7،10،11. عينات الأنسجة كلها هي أول المتجانس وdelipidated شامل، وإزالة الدهون المذيبات للاستخراج بما في ذلك جليدية والشموع epicuticular، والدهون غشاء، وtriacylglycerols. ثم يتم depolymerized خلية بقايا التخصيب الجدار إلى المكونة أحادية استر الميثيل من خلال الصوديوم المحفز ميثوكسيد تحلل الميثانول. يتم استخراج الدهنية استرات الميثيل الحمضية على تحمض، وderivatized للحصول على المقابلة trimethylsilyl أو الاسيتيل المشتقات. بقايا Derivatized متقلبة للغاية، ويمكن مزال من عمود اللوني للغاز عند درجة حرارة معقولة دون تغيير التشكل الهيكلي خلال تحليل GC / MS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1105">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Chemicals</td>
			<td style="width:228px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">2-propanol</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">BPA451-4</td>
			<td style="width:301px;">Solvent for delipidation</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Anhydrous sodium sulfate</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">S421500</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Acetic anhydride</td>
			<td style="width:228px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">320102</td>
			<td style="width:301px;">Derivatization agent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">BSTFA (N,O-bis(trimethylsilyl)-trifluoroacetamide)</td>
			<td style="width:228px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">15222</td>
			<td style="width:301px;">Derivatization agent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Butylated hydroxytoluene (BHT)</td>
			<td style="width:228px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">101162</td>
			<td style="width:301px;">Antioxidant</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Calcium chloride, anhydrous</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">C614-3</td>
			<td style="width:301px;">Desiccation agent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Calcium suflate, anhydrous (DRIERITE- 8 MESH with indicator)</td>
			<td style="width:228px;">Acros Organics</td>
			<td>219090020</td>
			<td style="width:301px;">Desiccation agent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Chloroform (Trichloromethane)</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">C6074</td>
			<td style="width:301px;">Organic solvent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Glacial acetic acid</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">BP2401212</td>
			<td style="width:301px;">Acidification agent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Helium carrier gas, compressed</td>
			<td style="width:228px;">Air Liquide</td>
			<td style="width:153px;">ALPHAGAZ1-UN1046</td>
			<td style="width:301px;">Carrier gas, GC/MS</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Heptane</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">H3501</td>
			<td style="width:301px;">Organic solvent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Hexanes</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">H3024</td>
			<td style="width:301px;">Organic solvent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Methanol</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">A4124</td>
			<td style="width:301px;">Organic solvent, transmethylation reactive</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Methyl acetate</td>
			<td style="width:228px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">296996</td>
			<td style="width:301px;">Organic solvent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Methyl heptadecanoate</td>
			<td style="width:228px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">H4515</td>
			<td style="width:301px;">Internal standard (1mg/mL stock)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Methylene dichloride (Dichloromethane)</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">D374</td>
			<td style="width:301px;">Organic solvent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Nitrogen, compressed</td>
			<td style="width:228px;">Air Liquide</td>
			<td style="width:153px;">ALPHAGAZ1-UN1044</td>
			<td style="width:301px;">Carrier gas, GC-FID</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Pentadecanolactone</td>
			<td style="width:228px;">Fluka</td>
			<td style="width:153px;">76530</td>
			<td style="width:301px;">Internal standard (1 mg/mL stock)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Pyridine</td>
			<td style="width:228px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">270970</td>
			<td style="width:301px;">Co-solvent for derivatization</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">BP358212</td>
			<td style="width:301px;">Saline solution</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Sodium methoxide (25wt.%)</td>
			<td style="width:228px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">156256</td>
			<td style="width:301px;">Nucleophile</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Toluene</td>
			<td style="width:228px;">FIsher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">T2904</td>
			<td style="width:301px;">Organic solvent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Plant Growth Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:423px;">Pro-Mix PGX</td>
			<td>Premier Tech Horticulture Ltd</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;">Pro-Mix PGX is recommended to grow Arabidopsis plants (Eddy, R. and Hahn, D.T., 2012,http://docs.lib.purdue.edu/pmag/2) 
			Purdue Methods for Arabidopsis Growth.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">PermaNest Humidity Dome&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Grower&#39;s Solution, LLC, Cookeville, TN&#160;</td>
			<td style="width:153px;">GD2211-24</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">Perma-Nest Plant Trays (22x11in)</td>
			<td style="width:228px;">Grower&#39;s Solution, LLC, Cookeville, TN&#160;</td>
			<td style="width:153px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">Square greenhouse pots, 3.5 inch&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Grower&#39;s Solution, LLC, Cookeville, TN&#160;</td>
			<td style="width:153px;">P86</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:423px;">General Purpose Plant Fertilizer, Plant-Prod 20-20-20</td>
			<td style="width:228px;">Premier Tech Home and Garden In., Brantford, ON</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glassware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:423px;">13 x 100 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap</td>
			<td style="width:228px;">Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td>
			<td style="width:153px;">45066A-13100</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:423px;">16 x 125 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap</td>
			<td style="width:228px;">Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td>
			<td style="width:153px;">45066A-16125</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:423px;">20 x 125 mm glass test tubes with Teflon-faced screw cap</td>
			<td style="width:228px;">Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td>
			<td style="width:153px;">45066A-20125</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">GC vial caps</td>
			<td style="width:228px;">National Scientific</td>
			<td style="width:153px;">C400051A</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">GC vial microinserts</td>
			<td style="width:228px;">National Scientific</td>
			<td style="width:153px;">C4011631</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">GC vials</td>
			<td style="width:228px;">National Scientific</td>
			<td style="width:153px;">C40001</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Disposable pasteur pipets</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">1367820B</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Flasks</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Allegra X15R centrifuge</td>
			<td style="width:228px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Analytic balance</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:423px;">Belly dancer</td>
			<td style="width:228px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;">A shaker can be used for this purpose if Belly Dancer not available</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">DB-5 Capillary GC column</td>
			<td style="width:228px;">J&#38;W Scientific, CA, USA;&#160;</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;">30 m x 0.25 mm x 0.25 &#956;m film thickness</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Desiccator</td>
			<td style="width:228px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Isotemp 202 water bath</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">ISQ LT single quadupole mass spectrometer</td>
			<td style="width:228px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Heat block</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Nitrogen evaporator</td>
			<td style="width:228px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Polytron homogenizer</td>
			<td style="width:228px;">Birkmann</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Trace 1300 gas chromatograph</td>
			<td style="width:228px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Two-stage regulator</td>
			<td style="width:228px;">Air Liquide</td>
			<td style="width:153px;">Q1-318B-580</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Vacuum desiccator</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and compositional analysis of plant cuticle lipid polyester monomers

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester of glycerol and modified fatty acids that constitutes the framework of the cuticle that covers aerial plant surfaces. Suberin is a related lipid polyester that is deposited on the cell walls of certain tissues, including the root endodermis and the periderm of tubers, tree bark and roots. These lipid polymers are highly variable in composition among plant species, and often differ among tissues within a single species. Here, we describe a detailed protocol to study the monomer composition of cutin in Arabidopsis thaliana leaves by sodium methoxide (NaOMe)-catalyzed depolymerisation, derivatization, and subsequent gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS) analysis. This method can be used to investigate the monomers of insoluble polyesters isolated from whole delipidated plant tissues bearing either cutin or suberin. The method can by applied not only to characterize the composition of lipid polymers in species not previously analyzed, but also as an analytical tool in forward and reverse genetic approaches to assess candidate gene function.

يتم تعيين بروتوكول صفها في هذه المخطوطة إلى تحديد الدهون أحادية البوليستر، والتقليل من المساهمات من الدهون غير كوتين 10 الشكل 1 يقدم لمحة عامة عن الفحص، والتي تأخذ تماما بين 8 (أي، كوتين أو سوبيرين.) - 10 أيام (من حصاد الأنسجة الأولي إلى الحصول على بيانات GC)، اعتمادا على كيفية عينات طويلة ويترك ليجف. والمحفزة قاعدة تحلل الميثانول مختارة (الشكل 2) طريقة ليزيل البلمرة البوليستر والتحقق من صحتها من قبل لبذور نبات الأرابيدوبسيس، والتي تحتوي على كل كوتين وسوبيرين. ويتجانس الخليط أولا الأنسجة وdelipidated شامل لإزالة الدهون المذيبات القابلة للاستخراج. العائد بقايا بعد الاستخراج، كنسبة مئوية من الوزن الطازج الأولي، وعادة ما يكون 6٪ لA. thaliana العقيد-0 الأوراق. يتم تجفيفها خلية بقايا التخصيب الجدار في مجفف فراغ ثم depolymerized إلى المكونة أحادية استر الميثيل من قبلالمحفز قاعدة نقل الميثيل. وقد تم اختيار اثنين ساعة الحضانة كما الوقت الحرج اللازم لالتحلل الصحيح واستعادة مكونات البوليستر الدهون. أسفرت مرات حضانة أطول في زيادة في الأحماض 2-هيدروكسي. هذه يحتمل أن تكون مستمدة من الإسفنجية غشاء 10. A اللوني نموذجي إذا ثبت نبات الأرابيدوبسيس النوع البري ورقة كوتين في الشكل 3، لO -TMSi المشتقات الأثير (الشكل 3A) ومشتقاتها O -acetyl (الشكل 3B). وقد تم تحديد كل الذروة من خلال المقارنة مع أطياف الشامل من الأدب 7،8 وقاعدة بيانات عامة يظهر 12. لدينا بروتوكول الفيديو كيفية تحضير مشتقات TMSI، ولكن يمكن بدلا من ذلك أن عينات الأسيتيل إلى derivatize مجموعات الهيدروكسيل. المشتقات Silylated جيدة لأغراض تحديد الهوية لأنها تعطي التشخيص أطياف الكتلة. ومع ذلك، المشتقات الأسيتيل هي أكثر استقرارا وبديل جيد لsilylationوقد تم تحديد أحادية كانت يوما 10. للمساعدة في تنفيذ هذا البروتوكول في المختبرات التي لا تملك إلا GC بالإضافة إلى كاشف اللهب التأين (ااا)، GC / ااا آثار الموافق المشتقات الأسيتيل من WT أحادية رقة كوتين وإلى سلسلة homolog المعايير استر الأحماض الدهنية الميثيل ترد أيضا (الشكل التكميلي 4). هذا الأسلوب هو نوعي وبالكشف عن الاختلافات الكمية بين العينات، وبالتالي قيمته لتحليل متحولة. يتم تحديد مبالغ أحادية فردية باستخدام الطريقة المعيارية الداخلي الكمي، مما يتيح مقارنات فرة مونومر بين العينات. ينبغي توضيح ذلك، مع ذلك، أن حجم الذروة (مجموع التهم أيون) قد لا تعكس النسب المولية للأحادية في البوليستر. نحن بما في ذلك الجداول قابلة للتحرير أحادية لحساب كميات مونومر في أوراق نبات الأرابيدوبسيس كوتين كما الأحماض الدهنية استرات الميثيل ومشتقاتها TMSI (ملف إضافي 1)، أو الآس<html> المشتقات TYL (ملف إضافي 2) من الكحول. قد تحتاج إلى أن تتكيف إذا يتم استخراج عينات من أجهزة مختلفة أو أنواع النباتات هذه الجداول. وكمثال على ذلك، قمنا بتحليل نبات الأرابيدوبسيس تاليا غ كولومبيا (كو-0) أوراق النوع البري واثنين من الأليلات-اغية متحولة السمات التي تميزت سابقا من الجين CYP86A2 / ATT1، att1-1 (م-1) وatt1-2 (م-2 ) 13،14. monooxygenases السيتوكروم P450 من فصيلة CYP86A ترميز المفترضة oxydases ω وتشارك في سوبيرين وكوتين مونومر الحيوي. نتائجنا (الشكل 4) تبين تخفيضات كبيرة في كميات من ثلاثة أحادية الدهون كبيرة في الأوراق متحولة مقارنة الأوراق WT. واتساقا مع توقع وظيفة الإنزيم، 16: 0، 18: 2 و 18: 1 dicarboxylates تأثرت تحديدا في المسوخ att1. &quot;SRC =&quot; / ملفات / ftp_upload / 53386 / 53386fig1.jpg &quot;/&gt; الشكل 1. نظرة عامة على تحليل الدهون البوليستر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig2.jpg" /> الشكل 2. آلية للتفاعل نقل الميثيل NaOMe المحفزة. مهاجمة الأنيونات ميثوكسيد أليفة النواة الكربون cabonyl من البوليستر الدهون لتشكيل مستقر رباعي السطوح المتوسطة (A)، التي تنأى بسهولة إلى الأحماض الدهنية استرات الميثيل والأنيونات آلكوكسيد (B). هذه هي قواعد alkoxides المتقارن، وتتفاعل مع الميثانول، وتجديد الأنيونات ميثوكسيد ناشطة تحفيزيا، وبالتالي الحفاظ على ردود فعل التحلل إضافية (C). إذا كان الماء موجودا فيالنظام، وسوف تتفاعل مع ميثوكسيد الصوديوم لتكوين هيدروكسيد الصوديوم، قاعدة قوية تتحلمأ لا رجعة فيه استرات لإنتاج الأحماض الدهنية الحرة غير مرغوب فيها. يضاف خلات الميثيل بوصفه مشاركا المذيبات 15 لإزالة كميات صغيرة من هيدروكسيد الصوديوم داخل منظومة (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig3.jpg" /> الشكل (3). الممثل مجموع اللوني ايون البرية من نوع أوراق نبات الأرابيدوبسيس thaliana أحادية كوتين. (A) O -trimethylsilyl (TMSI) الأثير و (B) مشتقات الهيدروكسيل خلات. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> </و&gt; <img alt="الرقم 4" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig4.jpg" /> الرقم 4. كوتين تكوين مونومر من نبات الأرابيدوبسيس thaliana WT واثنين من الأليلات متحولة فارغة من الجين CYP86A2. (متحولة-1 = att1-1؛ متحولة-2 = att1-2) تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري للمتوسط ​​(ن = 4) . مقتبس من 13، بإذن من © دار نشر بلاكويل (2007). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig1.jpg" /> ويتم تحديد الشكل التكميلي 1. الذروة نتائج التكامل الجدول من GC / MS البرمجيات. قمم المقابلة لمونومرات المحددة والمعايير الداخلية التي كتبها retenti بهم<html> في الوقت المحدد (العمود C) ويتم جدولتها القيم منطقة في العمود D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_Figure_1.tif" target="_blank">يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.</a> <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig2.jpg" /> التكميلي ملف 2. الجدول من نبات الأرابيدوبسيس أحادية كوتين (المشتقات الأثير trimethylsilyl من هيدروكسي استرات الميثيل الأحماض الدهنية). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_File_2_Cutin_template_TMSi.xls" target="_blank">الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الملف.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig3.jpg" /> التكميلي ملف 3. الجدول من نبات الأرابيدوبسيس أحادية كوتين (المشتقات O -acetyl من هيدروكسي استرات الميثيل الأحماض الدهنية).كوم / ملفات / ftp_upload / 53386 / Supplemental_File_3_Cutin_template_Acetylated_derivatives.xlsx &quot;الهدف =&quot; _ فارغة &quot;&gt; اضغط هنا لتحميل هذا الملف. <img alt="الرقم 4" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig4.jpg" /> التكميلي الشكل 4. GC / آثار ااا من (AB) استر الأحماض الدهنية الميثيل (FAME) معايير مؤشر الاستبقاء (وصفت قمم مع كل المشبعة FAME طول السلسلة)؛ و (C) الأسيتيل A. thaliana WT رقة أحادية كوتين. الأرقام على ذروة تتوافق مع: 16: 0 FAME (1)، ferulate (2)، 18: 3 FAME (3)، 18: 18/01: 2 جوع (4)، 18: 0 FAME (5)، sinapate (6 ) 16: 0 DCA (7)، 16-OH 16: 0 FAME (8)، 18: 2 DCA (9)، 18: 1 DCA (10) 18: 0 DCA (11)، 18-OH 18: 2 FAME (12)، 18-OH 18: 1 FAME (13)، 20: 0 FAME (14)، 10،16-diOH 16: 0 FAME (15)، 24: 0 FAME (16). DCA: حمض ثنائي الكربوكسيل ميثيل استر. FAME: الدهنية استر الميثيل حامض. IS1: معيار الداخلية 1، 17: 0 FAME؛ IS2: الحادي الداخليandard 2، 15-OH 15: 0 FAME. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_Figure_4.tif" target="_blank">الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الملف.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers at JoVE.com

Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers

Lipid polyesters constitute the structural components of two cell wall modifications, the plant cuticle and suberin-containing diffusion barriers. In this video, we describe a method to depolymerize cutin from whole delipidated leaves. The method can be applied to investigating mutants compromised in either cutin or suberin biosynthesis.

العزلة والتركيبية تحليل النبات البشرة الدهن البوليستر مونمرات

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester ...

isolation-compositional-analysis-plant-cuticle-lipid-polyester

Research

JoVE Journal

Biology

16.6K Views.  Algoma University. Lipid polyesters constitute the structural components of two cell wall modifications, the plant cuticle and suberin-containing diffusion barriers. In this video, we describe a method to depolymerize cutin from whole delipidated leaves. The method can be applied to investigating mutants compromised in either cutin or suberin biosynthesis.

Video: Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers

Use of Arabidopsis eceriferum Mutants to Explore Plant Cuticle Biosynthesis

The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation, but is also an important barrier against the entry of pathogenic microorganisms.  The cuticle is made up of a tough crosslinked polymer called "cutin" and a protective wax layer that seals the plant surface.  The waxy layer of the cuticle is obvious on many plants, appearing as a shiny film on the ivy leaf or as a dusty outer covering on the surface of a grape or a cabbage leaf thanks to light scattering crystals present in the wax.  Because the cuticle is an essential adaptation of plants to a terrestrial environment, understanding the genes involved in plant cuticle formation has applications in both agriculture and forestry. Today, we'll show the analysis of plant cuticle mutants identified by forward and reverse genetics approaches.


The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation but is also an important barrier against the entry of pathogenic microorganisms. In this video, we demonstrate the analysis of plant cuticle mutants identified by forward and reverse genetics approaches.

استخدام متحولات eceriferum Arabidopsis لاستكشاف النبات البناء الحيوي البشرة

The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation, but is also an important barrier against the entry of ...

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and genetics because of its simple life cycle, ease of growth and manipulation for genetic analysis, genomic resources, and transformability of the nucleus and both organelles. Mating strains is a common practice when genetic approaches are used in Chlamydomonass, to create vegetative diploids for analysis of dominance, or following tetrad dissection to ascertain nuclear vs. organellar inheritance, to test allelism, to analyze epistasy, or to generate populations for the purpose of map-based cloning. Additionally, genetic crosses are routinely used to combine organellar genotypes with particular nuclear genotypes. Here we demonstrate standard methods for gametogenesis, mating, zygote germination and tetrad separation. This protocol consists of an easy-to-follow series of steps that will make genetic approaches amenable to scientists who are less familiar with Chlamydomonas. Key parameters and trouble spots are explained. Finally, resources for further information and alternative methods are provided.

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Mating and tetrad separation are required for genetic analysis in Chlamydomonas reinhardtii. Here we demonstrate standard methods for gametogenesis, mating, zygote germination and tetrad dissection. This protocol consists of an easy-to-follow series of steps that will make genetic approaches amenable to scientists who are less familiar with Chlamydomonas.

وفصل التزاوج من الرباعيات المتلحفة reinhardtii عن التحليل الوراثي

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part I: Lignin

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st century. This has rekindled interest in the use of plant products as industrial raw materials for the production of liquid fuels for transportation1 and other products such as biocomposite materials7. Plant biomass remains one of the greatest untapped reserves on the planet4. It is mostly comprised of cell walls that are composed of energy rich polymers including cellulose, various hemicelluloses (matrix polysaccharides, and the polyphenol lignin6 and thus sometimes termed lignocellulosics. However, plant cell walls have evolved to be recalcitrant to degradation as walls provide tensile strength to cells and the entire plants, ward off pathogens, and allow water to be transported throughout the plant; in the case of trees up to more the 100 m above ground level. Due to the various functions of walls, there is an immense structural diversity within the walls of different plant species and cell types within a single plant4. Hence, depending of what crop species, crop variety, or plant tissue is used for a biorefinery, the processing steps for depolymerization by chemical/enzymatic processes and subsequent fermentation of the various sugars to liquid biofuels need to be adjusted and optimized. This fact underpins the need for a thorough characterization of plant biomass feedstocks. Here we describe a comprehensive analytical methodology that enables the determination of the composition of lignocellulosics and is amenable to a medium to high-throughput analysis. In this first part we focus on the analysis of the polyphenol lignin (Figure 1). The method starts of with preparing destarched cell wall material. The resulting lignocellulosics are then split up to determine its lignin content by acetylbromide solubilization3, and its lignin composition in terms of its syringyl, guaiacyl- and p-hydroxyphenyl units5. The protocol for analyzing the carbohydrates in lignocellulosic biomass including cellulose content and matrix polysaccharide composition is discussed in Part II2.

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part I: Lignin

Plant biomass is a major carbon-neutral renewable resource that could be used for the production of biofuels. Plant biomass consists mainly of cell walls, a structurally complex composite material termed lignocellulosics. Here we describe a protocol for a comprehensive analysis of the content and composition of the polyphenolic lignin.

تحليل شامل للالتركيبية جدران الخلايا النباتية (الكتلة الحيوية Lignocellulosic) الجزء الأول : اللجنين

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st century. This has rekindled interest in the use of plant products as industrial raw materials for the production of liquid fuels for transportation2 and other products such as biocomposite materials6. Plant biomass remains one of the greatest untapped reserves on the planet4. It is mostly comprised of cell walls that are composed of energy rich polymers including cellulose, various hemicelluloses, and the polyphenol lignin5 and thus sometimes termed lignocellulosics. However, plant cell walls have evolved to be recalcitrant to degradation as walls contribute extensively to the strength and structural integrity of the entire plant. Despite its necessary rigidity, the cell wall is a highly dynamic entity that is metabolically active and plays crucial roles in numerous cell activities such as plant growth and differentiation5. Due to the various functions of walls, there is an immense structural diversity within the walls of different plant species and cell types within a single plant4. Hence, depending of what crop species, crop variety, or plant tissue is used for a biorefinery, the processing steps for depolymerisation by chemical/enzymatic processes and subsequent fermentation of the various sugars to liquid biofuels need to be adjusted and optimized. This fact underpins the need for a thorough characterization of plant biomass feedstocks. Here we describe a comprehensive analytical methodology that enables the determination of the composition of lignocellulosics and is amenable to a medium to high-throughput analysis (Figure 1). The method starts of with preparing destarched cell wall material. The resulting lignocellulosics are then split up to determine its monosaccharide composition of the hemicelluloses and other matrix polysaccharides1, and its content of crystalline cellulose7. The protocol for analyzing the lignin components in lignocellulosic biomass is discussed in Part I3.

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part II: Carbohydrates

Plant biomass is a major carbon-neutral renewable resource that could be used for the production of biofuels. Plant biomass consists mainly of cell walls, a structurally complex composite material termed lignocellulosics. Here we describe a protocol for a comprehensive analysis of the content and composition of wall derived carbohydrates.

التركيبية تحليل شامل لجدران الخلايا النباتية (الكتلة الحيوية Lignocellulosic) الجزء الثاني : الكربوهيدرات

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

العزلة الفعالة والسريعة من الأجنة المبكرة مرحلة من<em&gt; thaliana نبات الأرابيدوبسيس</em&gt; بذور

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

الأيضية وصفها وغشاء التقطير للالمقارن تحليل البروتين من<em&gt; نبات الأرابيدوبسيس thaliana</em&gt; الثقافات تعليق خلية

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex composition under different conditions. In this protocol the approach is demonstrated by comparing the composition of the protein complex responsible for cyclic electron flow (CEF) in Chlamydomonas reinhardtii, isolated from genetically different strains. The procedure comprises the isolation of thylakoid membranes, followed by their separation into multiprotein complexes by sucrose density gradient centrifugation, SDS-PAGE, immunodetection and comparative, quantitative mass spectrometry (MS) based on differential metabolic labeling (14N/15N) of the analyzed strains. Detergent solubilized thylakoid membranes are loaded on sucrose density gradients at equal chlorophyll concentration. After ultracentrifugation, the gradients are separated into fractions, which are analyzed by mass-spectrometry based on equal volume. This approach allows the investigation of the composition within the gradient fractions and moreover to analyze the migration behavior of different proteins, especially focusing on ANR1, CAS, and PGRL1. Furthermore, this method is demonstrated by confirming the results with immunoblotting and additionally by supporting the findings from previous studies (the identification and PSI-dependent migration of proteins that were previously described to be part of the CEF-supercomplex such as PGRL1, FNR, and cyt f). Notably, this approach is applicable to address a broad range of questions for which this protocol can be adopted and e.g. used for comparative analyses of multiprotein complex composition isolated from distinct environmental conditions.

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The described comparative, quantitative proteomic approach aims at obtaining insights into the composition of multiprotein complexes&#160;under different conditions and is demonstrated by comparing genetically different strains. For quantitative analysis equal volumes of different fractions from a sucrose density gradient are mixed and analyzed by mass spectrometry.

نهج جديد لتحليل مقارن لMultiprotein مجمعات بناء على<sup&gt; 15</sup&gt; N الأيض وصفها والكمية الطيف الكتلي

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force used to pump blood. Individual cardiomyocytes were first isolated over 40 years ago in order to better study the physiology and structure of heart muscle. Techniques have rapidly improved to include enzymatic digestion via coronary perfusion. More recently, analyzing the contractility and calcium flux of isolated myocytes has provided a vital tool in the cellular and sub-cellular analysis of heart failure. Echocardiography and EKGs provide information about the heart at an organ level only. Cardiomyocyte cell culture systems exist, but cells lack physiologically essential structures such as organized sarcomeres and t-tubules required for myocyte function within the heart. In the protocol presented here, cardiomyocytes are isolated via Langendorff perfusion. The heart is removed from the mouse, mounted via the aorta to a cannula, perfused with digestion enzymes, and cells are introduced to increasing calcium concentrations. Edge and sarcomere detection software is used to analyze contractility, and a calcium binding fluorescent dye is used to visualize calcium transients of electrically paced cardiomyocytes; increasing understanding of the role cellular changes play in heart dysfunction. Traditionally used to test drug effects on cardiomyocytes, we employ this system to compare myocytes from WT mice and mice with a mutation that causes dilated cardiomyopathy. This protocol is unique in its comparison of live cells from mice with known heart function and known genetics. Many experimental conditions are reliably compared, including genetic or environmental manipulation, infection, drug treatment, and more. Beyond physiologic data, isolated cardiomyocytes are easily fixed and stained for cytoskeletal elements. Isolating cardiomyocytes via perfusion is an extremely versatile method, useful in studying cellular changes that accompany or lead to heart failure in a variety of experimental conditions.

Individual cardiomyocytes from wild type and mutant mice can be isolated from the heart in order to study their contractility and calcium transients. This allows characterization of the contribution of cellular dysfunction to heart dysfunction from any cause.

العزلة والفسيولوجية تحليل ماوس العضلية

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while maintaining transparency of the visual axis. Perturbations to this delicate balance cause blinding illnesses, such as diabetic retinopathy. Therefore, the understanding of energy metabolism changes in the retina during disease is imperative to the development of rational therapies for various causes of vison loss. The recent advent of commercially-available extracellular flux analyzers has made the study of retinal energy metabolism more accessible. This protocol describes the use of such an analyzer to measure contributions to retinal energy supply through its two principle arms - oxidative phosphorylation and glycolysis - by quantifying changes in oxygen consumption rates (OCR) and extracellular acidification rates (ECAR) as proxies for these pathways. This technique is readily performed in explanted retinal tissue, facilitating assessment of responses to multiple pharmacologic agents in a single experiment. Metabolic signatures in retinas from animals lacking rod photoreceptor signaling are compared to wild-type controls using this method. A major limitation in this technique is the lack of ability to discriminate between light-adapted and dark-adapted energy utilization, an important physiologic consideration in retinal tissue.

This technique describes real time recording of oxygen consumption and extracellular acidification rates in explanted mouse retinal tissues using an extracellular flux analyzer.

قياس استقلاب الطاقة في اكسبلانتيد نسيج الشبكية باستخدام تحليل الجريان خارج الخلية

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral lipids encased by a monolayer of phospholipids and proteins. Hepatic LD lipids, such as ceramides, and proteins are implicated in several diseases that cause hepatic steatosis. Although previous methods have been established for LD isolation, they require a time-consuming preparation of reagents and are not designed for the isolation of multiple subcellular compartments. We sought to establish a new protocol to enable the isolation of LDs, endoplasmic reticulum (ER), and lysosomes from a single mouse liver.
Further, all reagents used in the protocol presented here are commercially available and require minimal reagent preparation without sacrificing LD purity. Here we present data comparing this new protocol to a standard sucrose gradient protocol, demonstrating comparable purity, morphology, and yield. Additionally, we can isolate ER and lysosomes using the same sample, providing detailed insight into the formation and intracellular flux of lipids and their associated proteins.

This protocol establishes a novel method of lipid droplet isolation and purification from mouse livers, using a well-established endoplasmic reticulum isolation kit.

دهن السريع الحبرية العزلة بروتوكول استخدام عدة عزل عضية الراسخة

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral ...