This work was supported by a Natural Sciences and Engineering Research (NSERC)-USRA grant to S.J., and by an NSERC-Discovery Grant to I.M. We thank Richard Bourgault, Meghan Rains, and Amanda Fluke for technical assistance. Seeds of att1-1 and att1-2 mutants were kindly provided by Dr. Jian-Min Zhou, Institute of Genetics and Developmental Biology, Beijing, China.

Remarque: Ce protocole a été adapté à partir de Bonaventure et al. (2004), Molina et al. (2006), Li et al. (2013) 7,10,11. Les étapes 1-5 sont résumés dans la figure 1. 1. délipidation tissulaire Remarque: Toujours rincer la verrerie et les bouchons avec du chloroforme, laissant à sec sous une hotte, avant de l&#39;utiliser. ATTENTION: Effectuer homogénéisation des tissus et toutes les étapes de transfert de solvant sous une hotte; toujours porter blouse de laboratoire, des gants et des lunettes de sécurité anti-éclaboussures pour éviter le contact direct avec des produits chimiques et de protéger les échantillons de la contamination. <ol><li> Préchauffer le bain d&#39;eau et le bloc thermique à 85 ° C. </li><li> Peser environ 0,5 g de chaque échantillon de feuille en mm x 125 tubes à essai en verre de 20 mm avec pré-pesé polytétrafluoroéthylène (PTFE) -faced bouchons à vis. Inclure quatre répétitions par échantillon. </li><li> Placez 2-propanol dans un Erlenmeyer (environ 125 ml; 25 ml par g de sample). Ajouter 2,6-di-tert-butyl-4-méthylphénol (également connu comme l&#39;hydroxytoluène butylé, le BHT) à une concentration finale de 0,01% (p / v). Remarque: Ajouter BHT à partir d&#39;un 5% (p / v) solution stock dans le méthanol (BHT aide minimiser l&#39;oxydation des acides gras insaturés). </li><li> Préchauffer la solution de 2-propanol à 85 ° C dans un bain d&#39;eau. </li><li> Ajouter 12 ml chaude solvant 2-propanol à chaque tube de l&#39;échantillon et de la chaleur pendant 15 min à 85 ° C dans le bloc thermique. Cette étape inactive lipases qui peuvent être émises à partir de cellules rompues. </li><li> Laissez tubes de refroidir à la température ambiante et broient les tissus soigneusement avec homogénéisateur jusqu&#39;à obtenir une suspension homogène. </li><li> Placer les échantillons dans un agitateur orbital et agiter pendant 1-2 heures à 100 tours par minute et la température ambiante. </li><li> Centrifuger pendant 10 min à 800 xg et éliminer le surnageant. </li><li> Ajouter un volume égal de 2-propanol et agiter pendant 12 heures à température ambiante. </li><li> Centrifuger pendant 10 min à 800 xg et éliminer le surnageant. </li><li> Ajouter 12 ml CHCl 3: CH 3 OH (2: 1, v / v) au résidu (25 ml par g de l&#39;échantillon) et agiter une nuit à 100 tours par minute et la température ambiante. </li><li> Centrifuger pendant 10 min à 800 xg et éliminer le surnageant. </li><li> Ajouter 12 ml CHCl 3: CH 3 OH (1: 2, v / v) au résidu et agiter une nuit à 100 tours par minute et la température ambiante. </li><li> Centrifuger pendant 10 min à 800 xg et éliminer le solvant. </li><li> Laissez sécher les échantillons sous une hotte pendant une nuit à température ambiante. </li><li> Air-sécher le résidu, puis placer dans un dessiccateur à vide sur CaCl2 anhydre ou CaSO 4 jusqu&#39;à poids constant (3-5 jours). </li></ol> 2. dépolymérisation: méthanolyse avec le méthylate de sodium (Figure 2) ATTENTION: Effectuer les étapes 2.3 à 2.4, 2.7 à 2.8, 2.10 à 2.11, 2.13 à 2.15 et 2.17 à 2.18 sous une hotte; toujours porter blouse de laboratoire, des gants et des lunettes de protection contre les éclaboussures. <ol><li> Préchauffer le bloc de chauffage à 60 ° C. </li><li> Peser tubes à essai contenant le résidu sec (important pour d&#39;autres calculs). </li><li> Ajouter normes internes à chaque tube: 25 ωL heptadécanoate de méthyle (1 mg / ml d&#39;achat d&#39;actions) et 25 ul ω-pentadécalactone (1 mg / ml d&#39;achat d&#39;actions). </li><li> Ajouter 0,9 ml d&#39;acétate de méthyle, 1,5 ml de méthylate de sodium et 3,6 ml de methanol à chaque tube et les coiffer. En variante, préparer un mélange de réaction de ces trois réactifs et ajouter des aliquotes de 6 ml de chaque échantillon. </li><li> Des échantillons de la chaleur pendant 2 heures à 60 ° C et vortex périodiquement dans des intervalles de 15 min. </li><li> Laissez refroidir les échantillons à la température ambiante. </li><li> Ajouter 10 ml de dichlorure de méthylène (CH 2 Cl 2) et 1,5 ml d&#39;acide acétique glacial pour extraire les esters méthyliques d&#39;acides gras. </li><li> Ajouter une solution saline (NaCl 0,5 M) pour remplir chaque tube et bouchon. </li><li> Échantillons Vortex pendant 1 min et centrifuger pendant 10 min à 800 x g. </li><li> Transférer la phase organique (inférieure) pour nettoyer les tubes de taille moyenne (16 x 125 tubes à essai en verre mm avec polytétrafluoroéthylène (PTFE) de bouchon à vis -faced). </li><li> Ajouter une solution saline (NaCl 0,5 M) pour remplir chaque tube et bouchon. </li><li> Échantillons Vortex pendant 1 min et centrifuger pendant 10 min à 800 x g. </li><li> Retirer phase aqueuse (supérieure) et répétez les étapes 02.11 à 02.12. </li><li> Retirez tout phase aqueuse (supérieure). </li><li> Ajouter sulfate de sodium anhydre (Na 2 SO 4) pour le solvant, coiffer les tubes et les vortex pendant 1 min; échantillons peuvent maintenant être laissés jusqu&#39;au lendemain. À ce point les échantillons peuvent être laissés toute la nuit sous la hotte. </li><li> Centrifuger pendant 2 min à 800 x g pour compacter le Na 2 SO 4 dans le fond de sel. </li><li> Transférer la phase organique dans un tube jetable petit verre (13 x 100 mm des tubes à essai en verre avec de polytétrafluoroéthylène (PTFE) de bouchon à vis -faced). </li><li> Evaporer le solvant à siccité sous azote et passer à l&#39;étape de dérivatisation. Si pas traités immédiatement, magasin évaporé échantillons à -20 ° C (échantillons peuvent être unlso stocké avant l&#39;étape d&#39;évaporation). </li></ol> 3. Préparation de dérivés pour chromatographie en phase gazeuse ATTENTION: Effectuer les étapes 3.1.2 et 3.1.5 - 3.1.8 sous une hotte; toujours porter blouse de laboratoire, des gants et des lunettes de protection contre les éclaboussures. <ol><li> Dérivés triméthylsilyle <ol><li> Préchauffer le bloc de la chaleur à 100 ° C. </li><li> Ajouter 100 ul de pyridine et 100 ul de BSTFA (N, O bis-triméthylsilyl-trifluoroacétamide) à chaque tube et les coiffer. </li><li> Des échantillons de chaleur à 100 ° C pendant 10 min. </li><li> Laissez refroidir les échantillons à la température ambiante. </li><li> Évaporer échantillons sous azote à la température ambiante. Éviter l&#39;application de chaleur à des échantillons, les monomères sont très volatiles à ce stade. </li><li> Ajouter 500 ul de 1: 1 (v / v) d&#39;heptane: toluène. </li><li> Échantillons Vortex pendant 1 min et centrifuger 2 min à 800 x g. </li><li> Ajouter échantillons dans des flacons de GC et de procéder à l&#39;analyse GC / MS. </li></ol></li><li> Acétyldérivés Remarque: Pour acétylation, modifier étapes 3.1.1-3.1.3 ci-dessus comme suit (non représenté sur la vidéo); 3.1.4-3.1.8 étapes sont les mêmes: <ol><li> Préchauffer le bloc de chauffage à 60 ° C. </li><li> Ajouter 100 ul de pyridine et 100 ul d&#39;anhydride acétique (Ac 2 O) vers les tubes. </li><li> Échantillons de chaleur de 1 heure à 60 ° C. </li></ol></li></ol> 4. GC / MS Analysis <ol><li> Utilisez une colonne (30 mx 0,25 mm x 0,25 um d&#39;épaisseur de film) ou équivalent (ie., 5% diphényle, 95% diméthylpolysiloxane) HP-5 capillaire. Programme GC avec le flux de gaz porteur d&#39;hélium fixé à 1,5 ml / min et la température du four programmée de 150 à 300 ° C à 3 ° C / min. </li><li> Utilisez injection split (rapport de division de 1:10) et définir spectromètre de masse en mode numériser sur 40-600 uma (ionisation par impact électronique). </li><li> Créer une table de séquence y compris des solvants (vierge), WT et répétitions mutantes, chacun utilisant la méthode d&#39;analyse cutine indiqué. </li><li> Solvant de chargeet flacons d&#39;échantillon sur le carrousel, ajoutent hexane dans des flacons de seringues-rinçage dans l&#39;échantillonneur automatique si nécessaire, et de commencer la séquence. Après la séquence est terminée, le total des traces de chromatogramme d&#39;ions sont disponibles pour tous les échantillons. </li></ol> Analyse des données 5. <ol><li> Identifier les monomères de polyester lipidique en comparant le spectre de masse de chaque pic de spectres de masse publié ou en recherchant une bibliothèque commerciale si disponible. </li><li> Pour chaque pic identifié dans le chromatogramme ionique total actuel, utiliser leurs temps de rétention respectifs de trouver les zones sur le tableau des résultats d&#39;intégration à partir du logiciel GC / MS (Figure 1 supplémentaire). </li><li> Pour chaque monomère (colonnes AB), ajoutez les valeurs de la zone trouvés dans le tableau de l&#39;intégration (figure supplémentaire 1, colonne D) à la colonne correspondante pour chaque répliquer échantillon dans le tableau Excel de monomères (Fichier supplémentaire 2, colonnes FC), qui est une feuille de calcul pour quantifier Arabidopsisdérivés cutine TMSi. Utilisez la commande Fichier supplémentaire 3 si dérivés acétylés sont préparés à la place. </li><li> Ajouter les domaines des normes internes (IS) à colonnes est (HK). Pour les monomères qui ne sont pas transformés en dérivés, les esters méthyliques savoir d&#39;acides gras (EMAG), et esters de diméthyle d&#39;acide dicarboxyliques (DCA PDEM), utiliser 17: 0 FAME (IS1) comme il est, pour la quantification (cellules violettes-ombragée dans le tableau de monomère; supplémentaire Fichiers 2/3). Pour les monomères hydroxylés, y compris les alcools primaires, l&#39;acide férulique et des acides ω-hydroxy, utiliser 15: 0 FAME 15-hydroxy (IS2), tout comme de choix pour la quantification de composés (cellules vertes-parties ombragées dans le tableau de monomère; fichiers supplémentaires 2/3) . </li><li> Ajouter du poids à sec de la feuille pour chaque répliquer aux colonnes AX-BA (Fichier supplémentaire 2) ou AQ-AT (Fichier supplémentaire 3); alternativement, balayer les feuilles pour calculer les zones de surface et ajouter des valeurs de la zone à la table de monomère pour exprimer des charges par unité de monomèressurface. </li></ol>

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No conflicts of interest declared.

Contrairement à d&#39;autres biopolymères tels que les protéines et l&#39;ADN, des polyesters de lipides des plantes ne sont pas fabriquées à partir d&#39;un modèle. Au lieu de cela, leurs compositions dépendent de la spécificité des enzymes présentes dans les tissus qui font de ces polymères extracellulaires. Comme de telles analyses, chimiques du constituant composants sont essentiels pour comprendre la composition de polyester lipidique. Les méthodes chimiques pour couper des liaisons ester comprennent saponification, l&#39;hydrogénolyse, transmethylation catalyse acide, et catalysée par une base transmethylation 2. Chacun d&#39;eux a ses avantages et ses inconvénients. Saponification produit des acides gras hydroxyles libres qui peuvent subir des réactions secondaires. L&#39;hydrogénolyse avec de l&#39;hydrure de lithium-aluminium (LiAlH 4) 16 a été utilisé pour l&#39;analyse de la cutine 7. Hydrogénolyse réduit carbones fonctionnalisés d&#39;alcools et les structures originales doivent être inférée par deuteriolysis de lithium-aluminium deutérure (LiAlD 4). Lainconvénient de cette approche est l&#39;exigence de haute résolution GC / MS de comparer le degré de deuteriation des polyols gras obtenus à effectuer des affectations de leurs structures. Transestérification à catalyse acide avec méthanolique de trifluorure de bore (BF3) a été fréquemment utilisé dans la cutine et subérine dépolymérisations 8,17,18, mais le réactif a une durée de vie limitée et peut introduire des artefacts dus à des réactions secondaires 15. L&#39;acide sulfurique méthanolique donne aussi des esters méthyliques des monomères mais avec de plus grandes proportions d&#39;acides gras 2-hydroxy, qui sont probablement pas de vrais composants de polyester de lipides, par rapport à 10 d&#39;autres méthodes. Le procédé de transestérification NaOMe catalysée décrit dans le présent protocole produit des esters méthyliques d&#39;acides gras qui sont transformés en dérivés par silylation des groupes hydroxyle, en fournissant les spectres de masse caractéristique d&#39;identification, ou par acétylation pour donner des dérivés plus stables de groupes hydroxyle for quantification. Un inconvénient de cette technique est que l&#39;hydrolyse est en concurrence avec la transestérification en présence d&#39;eau dans la réaction. L&#39;eau réagit avec NaOMe (le catalyseur) et de NaOH produit, qui à son tour hydrolyse des esters gras méthyliques d&#39;acide pour donner les acides libres (Figure 2D). Ceci est une réaction secondaire indésirable parce que deux pics sont présents pour chaque acide gras: un ester de méthyle et d&#39;un dérivé d&#39;ester TMSi, ce qui complique l&#39;analyse. En utilisant des réactifs anhydres et en ajoutant de l&#39;acétate de méthyle comme co-solvant de rivaliser avec saponification sont des étapes cruciales pour empêcher ainsi l&#39;hydrolyse (figure 2D). Cutine et subérine contiennent entre 1 et 26% de glycerol 4. Toutefois, ce monomère ne sera pas détecté par les conditions expérimentales décrites dans ce protocole. Le glycérol est hautement hydrophile et, à la différence des monomères d&#39;ester de méthyle d&#39;acide gras, seront éliminées au cours des étapes solvant aqueux de lavage. Cette limitation a égalementpplies à d&#39;autres méthodes de dépolymérisation cutine, mais glycerol peuvent être déterminées dans la couche aqueuse obtenue après la transestérification en utilisant une méthode enzymatique. En variante, il peut être quantifiée en utilisant des conditions plus douces (par exemple., 0,05 M de NaOMe) sans autre extraction à l&#39;eau afin de détecter tous les monomères, y compris le glycérol 19,20 .Bien utile à des fins de quantification glycérol, des conditions douces donnent généralement dépolymérisation incomplète de la cutine et subérine. Si un GC couplée à un détecteur à ionisation de flamme (FID) est disponible, toutes les répétitions peuvent être analysés dans cet instrument à des fins quantitatives, après les pics d&#39;un échantillon représentatif ont été identifiés par GC / MS. Alternativement, les monomères dans les GC / FID traces peuvent être identifiés si leurs indices de rétention sont connus. Le détecteur à ionisation de flamme a surtout une sensibilité élevée et une large gamme de proportionnalité, ce qui est essentiel pour la quantification des majeurs et mineurs composants de l&#39;échantillondans les courses individuelles. En outre, il est robuste et facile à entretenir et exploiter 15. Le protocole décrit permet l&#39;isolement fiable et reproductible, l&#39;identification et la quantification des lipides des plantes monomères de polyester, ce qui permet la caractérisation chimique des mutants qui diffèrent par la composition d&#39;un ou plusieurs monomères de polyester lipidiques. La procédure est évolutif, il peut être facilement adapté pour traiter à la fois les petites et les grosses quantités de diverses matières végétales, y compris les racines, graines, feuilles, tiges et fleurs. Données spectrales de masse de lipides polyester monomères de nombreuses espèces ont été publiés par ex., 21-26 et constituent des ressources précieuses pour identifier les monomères inconnus lors de l&#39;adaptation de ce protocole à d&#39;autres tissus et / ou espèces. Cette méthode est applicable aux enquêtes de la biosynthèse, la réglementation, et la distribution de polyesters lipidiques chez les plantes supérieures.

Les plantes vasculaires reposent sur des couches extracellulaires qui fonctionnent comme des barrières étanches entre les tissus végétaux et l&#39;environnement externe. Ces structures de parois cellulaires associées à une infection pathogène lipophile limitent et régulent le transport passif de gaz, l&#39;eau et les substances dissoutes dans et hors des tissus végétaux 1. Ces obstacles sont la cuticule de la plante, une structure unique de plantes synapomorphes 2, et les différentes barrières de diffusion contenant subérine. La cuticule est une couche oléophile synthétisé par les cellules épidermiques et lié à eux par l&#39;intermédiaire d&#39;une couche de pectine sur le côté extracellulaire de la paroi cellulaire 5.3. Il enveloppe les organes aériens primaires de plantes supérieures, fonctionnant comme une interface vitale entre les tissus végétaux et l&#39;environnement. Cutin, la matrice de structure de la cuticule, et subérine sont deux polyesters glycérolipides insolubles associés avec des cires solvant extractibles 2,4. Ces l polymèreipids sont constitués de dérivés saturés et insaturés et d&#39;acides gras sont à la fois structurellement et fonctionnellement similaire. Toutefois, elles se distinguent par des différences dans les caractéristiques de composition et de dépôt des sites chimiques. Subérine est un polyester aliphatique situé à l&#39;intérieur des parois cellulaires de certains tissus externes et internes formant une paroi secondaire. Tissus subérisées comprennent péridermes de racines, de tubercules et de l&#39;écorce d&#39;arbre, endoderme profondes, couches de revêtement de semences, et les plaies guéries 2. Contrairement à la cutine, la subérine de polyester contient typiquement des alcools, des acides dicarboxyliques saturés et mono-insaturés, et une grande proportion de monomères à très longue chaîne (C≥20). Cutin polyester lipidique est le plus abondant dans les plantes vasculaires 6, et est composé de glycérol et en C16-C18 dérivés d&#39;acides gras interestérifié, tels que les acides gras hydroxy et hydroxy-4 époxy substitué. Bien que la composition de polymères cutinevarie selon les espèces de tracheophyte, les monomères principaux sont plus prédominants 10, 16-dihydroxy 16: 0, 18-hydroxy-9,10-époxy 18: 0, et 9,10,18-trihydroxy 18: 0 des acides gras. Fait intéressant, la feuille et la tige Arabidopsis cutine est composé principalement de 18: 2 acide dicarboxylique 7,8. Cuticules végétales présentent aussi une grande variabilité dans l&#39;épaisseur, allant de quelques nanomètres à plusieurs micromètres 9. Depuis l&#39;isolement de la cuticule est une étape laborieuse et prend du temps, en particulier pour les très minces cuticules des feuilles tels que ceux d&#39;Arabidopsis thaliana 8, méthodes qui contournent l&#39;isolement de la cuticule ont été développés et validés 7,8. Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour étudier la composition de monomères de cutine dans des feuilles d&#39;Arabidopsis thaliana par le méthoxyde de sodium (NaOMe) et dépolymérisation catalysée par chromatographie en phase gazeuse subséquente / spectrométrie de masse (CG / SM) d&#39;analyse. Ce protocole offre une méthode robuste pour le dosage de la composition de polyesters de lipides dans les tissus de la plante délipidés entiers, et a été adapté à partir de protocoles précédemment rapportés 7,10,11. Des échantillons de tissus entiers sont d&#39;abord homogénéisé et exhaustive délipidé, enlever les lipides solvant extractible y compris la cuticule et les cires épicuticulaires, lipides membranaires, et triglycérides. Des résidus de parois cellulaires sont enrichis ensuite dépolymérisés en leurs monomères constitutifs ester méthylique par du méthylate de sodium méthanolyse catalysée. Gras esters méthyliques d&#39;acide sont extraites lors de l&#39;acidification et dérivés pour obtenir leurs dérivés triméthylsilyle ou acétyle correspondantes. Résidus dérivés sont très volatiles et peuvent être éluées d&#39;une colonne de chromatographie en phase gazeuse à une température raisonnable sans modification de leur conformation structurelle lors de l&#39;analyse GC / MS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1105">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Chemicals</td>
			<td style="width:228px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">2-propanol</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">BPA451-4</td>
			<td style="width:301px;">Solvent for delipidation</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Anhydrous sodium sulfate</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">S421500</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Acetic anhydride</td>
			<td style="width:228px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">320102</td>
			<td style="width:301px;">Derivatization agent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">BSTFA (N,O-bis(trimethylsilyl)-trifluoroacetamide)</td>
			<td style="width:228px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">15222</td>
			<td style="width:301px;">Derivatization agent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Butylated hydroxytoluene (BHT)</td>
			<td style="width:228px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">101162</td>
			<td style="width:301px;">Antioxidant</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Calcium chloride, anhydrous</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">C614-3</td>
			<td style="width:301px;">Desiccation agent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Calcium suflate, anhydrous (DRIERITE- 8 MESH with indicator)</td>
			<td style="width:228px;">Acros Organics</td>
			<td>219090020</td>
			<td style="width:301px;">Desiccation agent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Chloroform (Trichloromethane)</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">C6074</td>
			<td style="width:301px;">Organic solvent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Glacial acetic acid</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">BP2401212</td>
			<td style="width:301px;">Acidification agent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Helium carrier gas, compressed</td>
			<td style="width:228px;">Air Liquide</td>
			<td style="width:153px;">ALPHAGAZ1-UN1046</td>
			<td style="width:301px;">Carrier gas, GC/MS</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Heptane</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">H3501</td>
			<td style="width:301px;">Organic solvent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Hexanes</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">H3024</td>
			<td style="width:301px;">Organic solvent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Methanol</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">A4124</td>
			<td style="width:301px;">Organic solvent, transmethylation reactive</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Methyl acetate</td>
			<td style="width:228px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">296996</td>
			<td style="width:301px;">Organic solvent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Methyl heptadecanoate</td>
			<td style="width:228px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">H4515</td>
			<td style="width:301px;">Internal standard (1mg/mL stock)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Methylene dichloride (Dichloromethane)</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">D374</td>
			<td style="width:301px;">Organic solvent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Nitrogen, compressed</td>
			<td style="width:228px;">Air Liquide</td>
			<td style="width:153px;">ALPHAGAZ1-UN1044</td>
			<td style="width:301px;">Carrier gas, GC-FID</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Pentadecanolactone</td>
			<td style="width:228px;">Fluka</td>
			<td style="width:153px;">76530</td>
			<td style="width:301px;">Internal standard (1 mg/mL stock)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Pyridine</td>
			<td style="width:228px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">270970</td>
			<td style="width:301px;">Co-solvent for derivatization</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">BP358212</td>
			<td style="width:301px;">Saline solution</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Sodium methoxide (25wt.%)</td>
			<td style="width:228px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">156256</td>
			<td style="width:301px;">Nucleophile</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Toluene</td>
			<td style="width:228px;">FIsher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">T2904</td>
			<td style="width:301px;">Organic solvent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Plant Growth Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:423px;">Pro-Mix PGX</td>
			<td>Premier Tech Horticulture Ltd</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;">Pro-Mix PGX is recommended to grow Arabidopsis plants (Eddy, R. and Hahn, D.T., 2012,http://docs.lib.purdue.edu/pmag/2) 
			Purdue Methods for Arabidopsis Growth.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">PermaNest Humidity Dome&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Grower&#39;s Solution, LLC, Cookeville, TN&#160;</td>
			<td style="width:153px;">GD2211-24</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">Perma-Nest Plant Trays (22x11in)</td>
			<td style="width:228px;">Grower&#39;s Solution, LLC, Cookeville, TN&#160;</td>
			<td style="width:153px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">Square greenhouse pots, 3.5 inch&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Grower&#39;s Solution, LLC, Cookeville, TN&#160;</td>
			<td style="width:153px;">P86</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:423px;">General Purpose Plant Fertilizer, Plant-Prod 20-20-20</td>
			<td style="width:228px;">Premier Tech Home and Garden In., Brantford, ON</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glassware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:423px;">13 x 100 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap</td>
			<td style="width:228px;">Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td>
			<td style="width:153px;">45066A-13100</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:423px;">16 x 125 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap</td>
			<td style="width:228px;">Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td>
			<td style="width:153px;">45066A-16125</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:423px;">20 x 125 mm glass test tubes with Teflon-faced screw cap</td>
			<td style="width:228px;">Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td>
			<td style="width:153px;">45066A-20125</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">GC vial caps</td>
			<td style="width:228px;">National Scientific</td>
			<td style="width:153px;">C400051A</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">GC vial microinserts</td>
			<td style="width:228px;">National Scientific</td>
			<td style="width:153px;">C4011631</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">GC vials</td>
			<td style="width:228px;">National Scientific</td>
			<td style="width:153px;">C40001</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Disposable pasteur pipets</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">1367820B</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Flasks</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Allegra X15R centrifuge</td>
			<td style="width:228px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Analytic balance</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:423px;">Belly dancer</td>
			<td style="width:228px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;">A shaker can be used for this purpose if Belly Dancer not available</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">DB-5 Capillary GC column</td>
			<td style="width:228px;">J&#38;W Scientific, CA, USA;&#160;</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;">30 m x 0.25 mm x 0.25 &#956;m film thickness</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Desiccator</td>
			<td style="width:228px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Isotemp 202 water bath</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">ISQ LT single quadupole mass spectrometer</td>
			<td style="width:228px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Heat block</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Nitrogen evaporator</td>
			<td style="width:228px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Polytron homogenizer</td>
			<td style="width:228px;">Birkmann</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Trace 1300 gas chromatograph</td>
			<td style="width:228px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Two-stage regulator</td>
			<td style="width:228px;">Air Liquide</td>
			<td style="width:153px;">Q1-318B-580</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Vacuum desiccator</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and compositional analysis of plant cuticle lipid polyester monomers

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester of glycerol and modified fatty acids that constitutes the framework of the cuticle that covers aerial plant surfaces. Suberin is a related lipid polyester that is deposited on the cell walls of certain tissues, including the root endodermis and the periderm of tubers, tree bark and roots. These lipid polymers are highly variable in composition among plant species, and often differ among tissues within a single species. Here, we describe a detailed protocol to study the monomer composition of cutin in Arabidopsis thaliana leaves by sodium methoxide (NaOMe)-catalyzed depolymerisation, derivatization, and subsequent gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS) analysis. This method can be used to investigate the monomers of insoluble polyesters isolated from whole delipidated plant tissues bearing either cutin or suberin. The method can by applied not only to characterize the composition of lipid polymers in species not previously analyzed, but also as an analytical tool in forward and reverse genetic approaches to assess candidate gene function.

Le protocole décrit dans ce manuscrit est mis en place pour déterminer lipides monomères de polyester, de minimiser les apports de lipides non-cutine 10 la figure 1 présente un aperçu de l&#39;analyse, qui prend au total entre 8 (c.-à-cutine ou subérine.) -. 10 jours (à partir de prélèvement de tissu initial pour obtenir des données de GC), en fonction du temps des échantillons sont mis à sécher. La méthanolyse catalysée par une base choisie (figure 2) Procédé pour dépolymériser des polyesters a été préalablement validé pour les graines d&#39;Arabidopsis, qui contiennent à la fois la cutine et subérine. Les tissus sont d&#39;abord homogénéisés et exhaustive délipidées à éliminer les lipides solvant-extractibles. Le rendement de résidu après extraction, en pourcentage du poids frais initial, est habituellement de 6% pour A. thaliana Col-0 feuilles. Des résidus de parois cellulaires enrichies sont séchés dans un dessiccateur sous vide et ensuite dépolymérisés en leurs monomères d&#39;ester méthylique constitutifs parcatalysée par une base transmethylation. Incubation de deux heures a été choisi comme le temps critique nécessaire pour la dépolymérisation et la récupération des composants de polyester lipidiques appropriée. De plus longs temps d&#39;incubation conduit à augmentation des acides 2-hydroxy; ceux-ci proviennent de sphingolipides potentiellement à membrane 10. Un chromatogramme typique si Arabidopsis de type sauvage feuilles cutine est montré dans la figure 3, pour les dérivés O -TMSi éther (figure 3A) et dérivés de O-acétyl (figure 3B). Chaque pic a été identifié par comparaison de spectres de masse à partir de la littérature 7,8 et une base de données publique 12 .Our protocole vidéo montre comment préparer des dérivés TMSI, mais peut en variante être des échantillons acétylé pour dériver des groupes hydroxyle. Dérivés silylés sont bonnes pour des fins d&#39;identification parce qu&#39;ils donnent des spectres de masse de diagnostic. Cependant, les dérivés acétylés sont plus stables et une bonne alternative à Silylationmonomères fois ont été identifiés 10. Pour aider à mettre en œuvre ce protocole dans les laboratoires qui ont seulement GC couplé à ionisation de flamme détecteur (FID), GC / FID traces correspondant à des dérivés acétylés de WT monomères feuille de cutine et à une série homologue des normes d&#39;esters méthyliques gras d&#39;acide sont également représentées (figure supplémentaire 4). Cette méthode est qualitative et détecte des différences quantitatives entre les échantillons, d&#39;où sa valeur pour l&#39;analyse mutant. Les quantités de monomères individuels sont déterminées en utilisant la méthode standard interne de quantification, permettant des comparaisons d&#39;abondance de monomère entre les échantillons. Il convient de préciser, cependant, que la taille maximale (compteurs d&#39;ions totaux) peut ne pas refléter les rapports molaires des monomères dans le polyester. Nous incluons des tableaux modifiables de monomères pour calculer les montants de monomères dans Arabidopsis feuille cutine que les esters d&#39;acides gras de méthyle et les dérivés TMSi (Fichier supplémentaire 1), ou ACE<html> dérivés tyl (Fichier supplémentaire 2) d&#39;alcools. Peuvent avoir besoin d&#39;être adapté si les échantillons sont extraites de différents organes ou d&#39;espèces végétales Ces tableaux. A titre d&#39;exemple, nous avons analysé Arabidopsis Thalia na-Britannique (Col-0) de feuilles de type sauvage et deux allèles nuls mutant précédemment caractérisés du gène CYP86A2 / ATT1, att1-1 (m-1) et att1-2 (m-2 ) 13,14. Monooxygénases cytochrome P450 de la sous-famille de CYP86A codent oméga-oxydases putatifs et participent à la subérine et cutine biosynthèse de monomère. Les résultats (figure 4) montrent des réductions significatives de la charge de monomères trois principaux lipides dans les feuilles de mutants par rapport aux feuilles WT. En accord avec la fonction de l&#39;enzyme prédite, 16: 0, 18: 2 et 18: 1 dicarboxylates ont été spécifiquement affectés à des mutants de att1. &quot;Src =&quot; / files / ftp_upload / 53386 / 53386fig1.jpg &quot;/&gt; Figure 1. Aperçu de l&#39;analyse de polyester lipidique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig2.jpg" /> Figure 2. Mécanisme de la réaction de transméthylation NaOMe catalysée. Les anions méthoxyde nucléophile attaque le carbone cabonyl de polyesters de lipides pour former un instable intermédiaire tétraédrique (A), qui se dissocie facilement en esters méthyliques d&#39;acides gras et les anions alcoolates (B). Ces alcoxydes sont des bases conjuguées, et de réagir avec le methanol, la régénération des anions méthoxyde catalytiquement actifs, soutenant ainsi les réactions de dépolymérisation supplémentaire (C). Si de l&#39;eau est présent dans lesystème, il va réagir avec du méthylate de sodium pour former de l&#39;hydroxyde de sodium, une base forte qui hydrolyse de manière irréversible pour produire des esters d&#39;acides gras libres indésirables. L&#39;acétate de méthyle est ajouté comme co-solvant 15 pour éliminer les petites quantités d&#39;hydroxyde de sodium dans le système (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig3.jpg" /> Figure 3. Représentant de chromatogramme ionique total de type sauvage monomères cutine Arabidopsis thaliana de feuilles. (A) O -trimethylsilyl (TMSi) éther et (B) des dérivés hydroxyles acétate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> </a&gt; <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig4.jpg" /> Figure 4. Composition de monomère Cutin d&#39;Arabidopsis thaliana WT et deux alleles mutants nuls du gène CYP86A2. (Mutant att1-1-1 =; = 2-mutant att1-2) barres d&#39;erreur représentent l&#39;écart type de la moyenne (n = 4) . Adapté à partir du 13, avec la permission de © Blackwell Publishing (2007). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig1.jpg" /> Figure supplémentaire 1. Pic résultats d&#39;intégration table à partir du logiciel GC / MS. Pics correspondant aux monomères identifiés et des normes internes sont identifiés par leur retenti<html> sur le temps (colonne C) et les valeurs de la région sont indiquées dans la colonne D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_Figure_1.tif" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig2.jpg" /> Fichier supplémentaire 2. Table des Arabidopsis monomères cutine (dérivés d&#39;éthers de triméthylsilyle de hydroxy esters méthyliques d&#39;acides gras). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_File_2_Cutin_template_TMSi.xls" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig3.jpg" /> Tableau 3. Fichier supplémentaire de monomères Arabidopsis cutine (dérivés O-acétyl d&#39;hydroxy esters méthyliques d&#39;acide gras).com / files / ftp_upload / 53386 / Supplemental_File_3_Cutin_template_Acetylated_derivatives.xlsx &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig4.jpg" /> Supplement figure 4. GC / FID de traces (AB) ester gras méthylique de l&#39;acide (FAME) des normes d&#39;indice de rétention (pics sont marqués avec chaque FAME saturés de longueur de chaîne); et (C) acétyle A. thaliana WT feuilles monomères cutine. Numéros sur la visière correspondent à: 16: 0 FAME (1), férulate (2), 18: 3 FAME (3), 18: 1/18: 2 FAMEs (4), 18: 0 FAME (5), sinapate (6 ), 16: 0 DCA (7), 16-OH 16: 0 FAME (8), 18: 2 DCA (9), 18: 1 DAC (10) 18: 0 DCA (11), 18-OH 18: 2 FAME (12), 18-OH 18: 1 FAME (13), 20: 0 FAME (14), 10,16 diOH-16: 0 FAME (15), 24: 0 FAME (16). DCA: ester diméthylique de l&#39;acide dicarboxylique; FAME: ester méthylique d&#39;acide gras; IS1: standard interne 1, 17: 0 FAME; IS2: st interneAndard 2, 15-OH 15: 0 FAME. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_Figure_4.tif" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

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Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers

Lipid polyesters constitute the structural components of two cell wall modifications, the plant cuticle and suberin-containing diffusion barriers. In this video, we describe a method to depolymerize cutin from whole delipidated leaves. The method can be applied to investigating mutants compromised in either cutin or suberin biosynthesis.

Isolement et compositionnelle Analyse des plantes cuticules lipidiques polyester monomères

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester ...

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Research

JoVE Journal

Biology

16.6K vues.  Algoma University. Lipid polyesters constitute the structural components of two cell wall modifications, the plant cuticle and suberin-containing diffusion barriers. In this video, we describe a method to depolymerize cutin from whole delipidated leaves. The method can be applied to investigating mutants compromised in either cutin or suberin biosynthesis.

Vidéo: Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers

Use of Arabidopsis eceriferum Mutants to Explore Plant Cuticle Biosynthesis

The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation, but is also an important barrier against the entry of pathogenic microorganisms.  The cuticle is made up of a tough crosslinked polymer called "cutin" and a protective wax layer that seals the plant surface.  The waxy layer of the cuticle is obvious on many plants, appearing as a shiny film on the ivy leaf or as a dusty outer covering on the surface of a grape or a cabbage leaf thanks to light scattering crystals present in the wax.  Because the cuticle is an essential adaptation of plants to a terrestrial environment, understanding the genes involved in plant cuticle formation has applications in both agriculture and forestry. Today, we'll show the analysis of plant cuticle mutants identified by forward and reverse genetics approaches.


The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation but is also an important barrier against the entry of pathogenic microorganisms. In this video, we demonstrate the analysis of plant cuticle mutants identified by forward and reverse genetics approaches.

L&#39;utilisation de mutants d&#39;Arabidopsis eceriferum à explorer Biosynthèse cuticules végétales

The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation, but is also an important barrier against the entry of ...

Recherche

Biologie

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and genetics because of its simple life cycle, ease of growth and manipulation for genetic analysis, genomic resources, and transformability of the nucleus and both organelles. Mating strains is a common practice when genetic approaches are used in Chlamydomonass, to create vegetative diploids for analysis of dominance, or following tetrad dissection to ascertain nuclear vs. organellar inheritance, to test allelism, to analyze epistasy, or to generate populations for the purpose of map-based cloning. Additionally, genetic crosses are routinely used to combine organellar genotypes with particular nuclear genotypes. Here we demonstrate standard methods for gametogenesis, mating, zygote germination and tetrad separation. This protocol consists of an easy-to-follow series of steps that will make genetic approaches amenable to scientists who are less familiar with Chlamydomonas. Key parameters and trouble spots are explained. Finally, resources for further information and alternative methods are provided.

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Mating and tetrad separation are required for genetic analysis in Chlamydomonas reinhardtii. Here we demonstrate standard methods for gametogenesis, mating, zygote germination and tetrad dissection. This protocol consists of an easy-to-follow series of steps that will make genetic approaches amenable to scientists who are less familiar with Chlamydomonas.

L&#39;accouplement et la séparation des Tétrade Chlamydomonas reinhardtii Pour l&#39;analyse génétique

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part I: Lignin

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st century. This has rekindled interest in the use of plant products as industrial raw materials for the production of liquid fuels for transportation1 and other products such as biocomposite materials7. Plant biomass remains one of the greatest untapped reserves on the planet4. It is mostly comprised of cell walls that are composed of energy rich polymers including cellulose, various hemicelluloses (matrix polysaccharides, and the polyphenol lignin6 and thus sometimes termed lignocellulosics. However, plant cell walls have evolved to be recalcitrant to degradation as walls provide tensile strength to cells and the entire plants, ward off pathogens, and allow water to be transported throughout the plant; in the case of trees up to more the 100 m above ground level. Due to the various functions of walls, there is an immense structural diversity within the walls of different plant species and cell types within a single plant4. Hence, depending of what crop species, crop variety, or plant tissue is used for a biorefinery, the processing steps for depolymerization by chemical/enzymatic processes and subsequent fermentation of the various sugars to liquid biofuels need to be adjusted and optimized. This fact underpins the need for a thorough characterization of plant biomass feedstocks. Here we describe a comprehensive analytical methodology that enables the determination of the composition of lignocellulosics and is amenable to a medium to high-throughput analysis. In this first part we focus on the analysis of the polyphenol lignin (Figure 1). The method starts of with preparing destarched cell wall material. The resulting lignocellulosics are then split up to determine its lignin content by acetylbromide solubilization3, and its lignin composition in terms of its syringyl, guaiacyl- and p-hydroxyphenyl units5. The protocol for analyzing the carbohydrates in lignocellulosic biomass including cellulose content and matrix polysaccharide composition is discussed in Part II2.

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part I: Lignin

Plant biomass is a major carbon-neutral renewable resource that could be used for the production of biofuels. Plant biomass consists mainly of cell walls, a structurally complex composite material termed lignocellulosics. Here we describe a protocol for a comprehensive analysis of the content and composition of the polyphenolic lignin.

Partie analyse complète de la composition des parois des cellules végétales (biomasse lignocellulosique) I: La lignine

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st century. This has rekindled interest in the use of plant products as industrial raw materials for the production of liquid fuels for transportation2 and other products such as biocomposite materials6. Plant biomass remains one of the greatest untapped reserves on the planet4. It is mostly comprised of cell walls that are composed of energy rich polymers including cellulose, various hemicelluloses, and the polyphenol lignin5 and thus sometimes termed lignocellulosics. However, plant cell walls have evolved to be recalcitrant to degradation as walls contribute extensively to the strength and structural integrity of the entire plant. Despite its necessary rigidity, the cell wall is a highly dynamic entity that is metabolically active and plays crucial roles in numerous cell activities such as plant growth and differentiation5. Due to the various functions of walls, there is an immense structural diversity within the walls of different plant species and cell types within a single plant4. Hence, depending of what crop species, crop variety, or plant tissue is used for a biorefinery, the processing steps for depolymerisation by chemical/enzymatic processes and subsequent fermentation of the various sugars to liquid biofuels need to be adjusted and optimized. This fact underpins the need for a thorough characterization of plant biomass feedstocks. Here we describe a comprehensive analytical methodology that enables the determination of the composition of lignocellulosics and is amenable to a medium to high-throughput analysis (Figure 1). The method starts of with preparing destarched cell wall material. The resulting lignocellulosics are then split up to determine its monosaccharide composition of the hemicelluloses and other matrix polysaccharides1, and its content of crystalline cellulose7. The protocol for analyzing the lignin components in lignocellulosic biomass is discussed in Part I3.

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part II: Carbohydrates

Plant biomass is a major carbon-neutral renewable resource that could be used for the production of biofuels. Plant biomass consists mainly of cell walls, a structurally complex composite material termed lignocellulosics. Here we describe a protocol for a comprehensive analysis of the content and composition of wall derived carbohydrates.

Analyse de la composition globale de la paroi cellulaire végétale (biomasse lignocellulosique) Partie II: Glucides

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

Isolation efficace et rapide des embryons à un stade précoce de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Graines

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

Marquage métabolique et la membrane de fractionnement pour comparative Analyse protéomique de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Cultures Suspension cellulaires

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex composition under different conditions. In this protocol the approach is demonstrated by comparing the composition of the protein complex responsible for cyclic electron flow (CEF) in Chlamydomonas reinhardtii, isolated from genetically different strains. The procedure comprises the isolation of thylakoid membranes, followed by their separation into multiprotein complexes by sucrose density gradient centrifugation, SDS-PAGE, immunodetection and comparative, quantitative mass spectrometry (MS) based on differential metabolic labeling (14N/15N) of the analyzed strains. Detergent solubilized thylakoid membranes are loaded on sucrose density gradients at equal chlorophyll concentration. After ultracentrifugation, the gradients are separated into fractions, which are analyzed by mass-spectrometry based on equal volume. This approach allows the investigation of the composition within the gradient fractions and moreover to analyze the migration behavior of different proteins, especially focusing on ANR1, CAS, and PGRL1. Furthermore, this method is demonstrated by confirming the results with immunoblotting and additionally by supporting the findings from previous studies (the identification and PSI-dependent migration of proteins that were previously described to be part of the CEF-supercomplex such as PGRL1, FNR, and cyt f). Notably, this approach is applicable to address a broad range of questions for which this protocol can be adopted and e.g. used for comparative analyses of multiprotein complex composition isolated from distinct environmental conditions.

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The described comparative, quantitative proteomic approach aims at obtaining insights into the composition of multiprotein complexes&#160;under different conditions and is demonstrated by comparing genetically different strains. For quantitative analysis equal volumes of different fractions from a sucrose density gradient are mixed and analyzed by mass spectrometry.

Une nouvelle approche pour l&#39;analyse comparative des complexes multiprotéiques Basé sur<sup&gt; 15</sup&gt; N Marquage métabolique et spectrométrie de masse quantitative

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force used to pump blood. Individual cardiomyocytes were first isolated over 40 years ago in order to better study the physiology and structure of heart muscle. Techniques have rapidly improved to include enzymatic digestion via coronary perfusion. More recently, analyzing the contractility and calcium flux of isolated myocytes has provided a vital tool in the cellular and sub-cellular analysis of heart failure. Echocardiography and EKGs provide information about the heart at an organ level only. Cardiomyocyte cell culture systems exist, but cells lack physiologically essential structures such as organized sarcomeres and t-tubules required for myocyte function within the heart. In the protocol presented here, cardiomyocytes are isolated via Langendorff perfusion. The heart is removed from the mouse, mounted via the aorta to a cannula, perfused with digestion enzymes, and cells are introduced to increasing calcium concentrations. Edge and sarcomere detection software is used to analyze contractility, and a calcium binding fluorescent dye is used to visualize calcium transients of electrically paced cardiomyocytes; increasing understanding of the role cellular changes play in heart dysfunction. Traditionally used to test drug effects on cardiomyocytes, we employ this system to compare myocytes from WT mice and mice with a mutation that causes dilated cardiomyopathy. This protocol is unique in its comparison of live cells from mice with known heart function and known genetics. Many experimental conditions are reliably compared, including genetic or environmental manipulation, infection, drug treatment, and more. Beyond physiologic data, isolated cardiomyocytes are easily fixed and stained for cytoskeletal elements. Isolating cardiomyocytes via perfusion is an extremely versatile method, useful in studying cellular changes that accompany or lead to heart failure in a variety of experimental conditions.

Individual cardiomyocytes from wild type and mutant mice can be isolated from the heart in order to study their contractility and calcium transients. This allows characterization of the contribution of cellular dysfunction to heart dysfunction from any cause.

L&#39;isolement et l&#39;analyse physiologique de cardiomyocytes de souris

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while maintaining transparency of the visual axis. Perturbations to this delicate balance cause blinding illnesses, such as diabetic retinopathy. Therefore, the understanding of energy metabolism changes in the retina during disease is imperative to the development of rational therapies for various causes of vison loss. The recent advent of commercially-available extracellular flux analyzers has made the study of retinal energy metabolism more accessible. This protocol describes the use of such an analyzer to measure contributions to retinal energy supply through its two principle arms - oxidative phosphorylation and glycolysis - by quantifying changes in oxygen consumption rates (OCR) and extracellular acidification rates (ECAR) as proxies for these pathways. This technique is readily performed in explanted retinal tissue, facilitating assessment of responses to multiple pharmacologic agents in a single experiment. Metabolic signatures in retinas from animals lacking rod photoreceptor signaling are compared to wild-type controls using this method. A major limitation in this technique is the lack of ability to discriminate between light-adapted and dark-adapted energy utilization, an important physiologic consideration in retinal tissue.

This technique describes real time recording of oxygen consumption and extracellular acidification rates in explanted mouse retinal tissues using an extracellular flux analyzer.

Mesure du métabolisme énergétique chez Explanté tissu rétinien en utilisant l’analyse de Flux extracellulaire

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral lipids encased by a monolayer of phospholipids and proteins. Hepatic LD lipids, such as ceramides, and proteins are implicated in several diseases that cause hepatic steatosis. Although previous methods have been established for LD isolation, they require a time-consuming preparation of reagents and are not designed for the isolation of multiple subcellular compartments. We sought to establish a new protocol to enable the isolation of LDs, endoplasmic reticulum (ER), and lysosomes from a single mouse liver.
Further, all reagents used in the protocol presented here are commercially available and require minimal reagent preparation without sacrificing LD purity. Here we present data comparing this new protocol to a standard sucrose gradient protocol, demonstrating comparable purity, morphology, and yield. Additionally, we can isolate ER and lysosomes using the same sample, providing detailed insight into the formation and intracellular flux of lipids and their associated proteins.

This protocol establishes a novel method of lipid droplet isolation and purification from mouse livers, using a well-established endoplasmic reticulum isolation kit.

Protocole d’isolement de gouttelettes lipidiques rapide à l’aide d’un Kit d’Isolation des organites bien établie

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral ...