This work was supported by a Natural Sciences and Engineering Research (NSERC)-USRA grant to S.J., and by an NSERC-Discovery Grant to I.M. We thank Richard Bourgault, Meghan Rains, and Amanda Fluke for technical assistance. Seeds of att1-1 and att1-2 mutants were kindly provided by Dr. Jian-Min Zhou, Institute of Genetics and Developmental Biology, Beijing, China.

הערה: פרוטוקול זה הותאם מאל Bonaventure et. (2004), מולינה et al. (2006), לי ואח &#39;. (2013) 7,10,11. צעדים 1-5 מסוכמים באיור 1. Delipidation 1. רקמות הערה: תמיד לשטוף את כל כלי הזכוכית וכובעים עם כלורופורם, ומאפשר לי יבש מתחת למכסת מנוע קטר, לפני השימוש. זהירות: בצע הומוגניזציה רקמות וכל שלבי העברת הממס תחת מכסה המנוע קטר; תמיד לובשים מעיל, כפפות מעבדה ומשקפי בטיחות סנסציה כדי למנוע מגע ישיר עם כימיקלים וכדי להגן על הדגימות מזיהום. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אמבטיה מחממים מים ולחסום חום עד 85 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל כ 0.5 גרם של כל דגימת עלה לתוך צינורות 20 מ&quot;מ-שקל מראש x 125 מ&quot;מ מבחן זכוכית עם polytetrafluoroethylene פקקי הברגה (PTFE) -faced. כולל ארבעה חזרות לדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 2-propanol בארלנמייר (כ 125 מיליליטר, 25 מיליליטר לגרם של SAMPle). להוסיף 2,6-די-טרט-בוטיל-4-methylphenol (הידוע גם בhydroxytoluene butylated, BHT) לריכוז סופי של 0.01% (w / v). הערה: הוסף BHT מ% 5 (w / v) פתרון מניות במתנול (BHT מסייע למזער חמצון של חומצות שומן בלתי רוויות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון מחממים 2-propanol עד 85 מעלות צלזיוס באמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 12 מיליליטר ממס 2-propanol חם על צינור אחד מדגם וחום במשך 15 דקות על 85 מעלות צלזיוס בגוש חום. צעד זה מנטרל lipases שעשוי להשתחרר מהתאים שיבשו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו צינורות להתקרר לטמפרטורת חדר ולטחון רקמה ביסודיות עם homogenizer עד השעיה הומוגנית מתקבלת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הדגימות בייקר מסלולית וללחוץ במשך 1-2 שעות ב 100 סל&quot;ד וטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 800 XG ולהשליך supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נפח שווה של 2-propanol ולנער במשך 12 שעות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 800 XG ולהשליך supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 12 מיליליטר CH3 Cl: CH 3 OH (2: 1, נ / V) לשאריות (25 מיליליטר לגרם של מדגם) ולנער לילה ב 100 סל&quot;ד וטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 800 XG ולהשליך supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 12 מיליליטר CHCl 3: CH 3 OH (1: 2, נ / V) לשאריות ולנער לילה ב 100 סל&quot;ד וטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 800 XG ולהסיר ממס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו דגימות יבשות מתחת למכסת מנוע קטר הלילה בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האוויר יבש השאריות ולאחר מכן למקם בייבוש ואקום מעל CaCl נטול מים 2 או 4 קאסו עד שהגיע למשקל קבוע (3-5 ימים). </li></ol> 2. Depolymerization: Methanolysis עם נתרן methoxide (איור 2) זהירות: בצע צעדים 2.3-2.4, 2.7-2.8, 2.10-2.11, 2.13-2.15 ו2.17-2.18 מתחת למכסת מנוע קטר; תמיד לובשים מעיל, כפפות מעבדה ומשקפי בטיחות סנסציה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גוש חום מחממים עד 60 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול מבחנות המכילות שאריות יבשות (חשובות לחישובים נוספים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף תקנים פנימיים על צינור אחד: 25 heptadecanoate ωL תיל (1 מ&quot;ג / מיליליטר מניות) וω-pentadecalactone 25 μl (1 מ&quot;ג / מיליליטר מניות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 0.9 מיליליטר אצטט מתיל, 1.5 methoxide מיליליטר נתרן, ושל 3.6 מיליליטר מתנול על צינור אחד וכובעם. לחלופין, להכין תערובת תגובה עם שלושת ריאגנטים אלה ולהוסיף aliquots 6 מ&quot;ל לכל דגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות חום למשך 2 שעות ב 60 ° C ומערבולת מעת לעת במרווחים של 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו דגימות להתקרר לטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 10 מיליליטר של dichloride תילן (CH 2 Cl 2) ושל 1.5 מיליליטר של חומצה אצטית קרחונית כדי לחלץ את אסטרים מתיל חומצת שומן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף תמיסת מלח (0.5 M NaCl) למלא כל צינור וכובע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות מערבולת דקות 1 ו צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 800 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את השלב האורגני (נמוך) כדי לנקות צינורות בגודל בינוניים (16 x 125 מבחנות זכוכית מ&quot;מ עם פוליtetrafluoroethylene כובע בורג -faced (PTFE)). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף תמיסת מלח (0.5 M NaCl) למלא כל צינור וכובע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות מערבולת דקות 1 ו צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 800 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר שלב המימי (עליון) וחזור על שלבים 2.11-2.12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל השלב המימי (העליון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף סולפט נטול מים נתרן (Na 2 SO 4) לממס, מכסה את הצינורות, ומערבולת דקות 1; דגימות יכולות עכשיו להיות שנותרו עד היום הבא. בניתן להשאיר דגימות שלב זה הלילה מתחת למכסת מנוע קטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה למשך 2 דקות ב 800 XG קומפקטי מלח Na 2 SO 4 בתחתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את השלב האורגני לצינור חד פעמי זכוכית קטנה (13 x 100 מבחנות זכוכית מ&quot;מ עם polytetrafluoroethylene (כובע בורג -faced PTFE)). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאדות הממס ליובש תחת חנקן ולהמשיך לשלב derivatization. אם לא מעובד באופן מיידי, החנות התאדתה דגימות ב -20 ° C (דגימות יכולות להיותמאוחסן הסימפונית לפני שלב האידוי). </li></ol> 3. הכנה של נגזרים עבור גז כרומטוגרפיה זהירות: בצע את השלבים 3.1.2 ו3.1.5 - 3.1.8 מתחת למכסת מנוע קטר; תמיד לובשים מעיל, כפפות מעבדה ומשקפי בטיחות סנסציה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגזרי Trimethylsilyl <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גוש חום מחממים עד 100 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף של פירידין 100 μl ושל BSTFA (N, O Bis-trimethylsilyl-trifluoroacetamide) 100 μl לכל צינור ומכסה אותם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות חום של 100 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו דגימות להתקרר לטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאדות דגימות תחת חנקן בטמפרטורת חדר. הימנעו הפעלת חום לדגימות, מונומרים תנודתיות מאוד בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של 1: 1 (V / V) heptane: טולואן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות מערבולת דקות 1 ו צנטריפוגות במשך 2 דקות ב 800 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף דוגמאות לבקבוקוני GC ולהמשיך GC ניתוח / MS. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אצטילנגזרים הערה: acetylation, לשנות צעדים 3.1.1-3.1.3 לעיל כדלקמן (לא מוצג בוידאו); צעדים 3.1.4-3.1.8 זהים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גוש חום מחממים עד 60 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף של פירידין 100 μl ושל אנהידריד אצטית 100 μl (AC 2 O) לצינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות חום שעה 1 ב 60 ° C. </li></ol></li></ol> 4. GC / MS ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בעמודת נימים HP-5 (30 0.25 מ&quot;מ x 0.25 עובי MX מיקרומטר סרט) או (כלומר., Diphenyl 5%, polysiloxane דימתיל 95%) שווה ערך. תכנית GC עם זרימת ספק הליום גז שנקבעה ברמה של 1.5 מיליליטר / דקה וטמפרטורת תנור המתוכנת 150-300 מעלות צלזיוס ב 3 מעלות צלזיוס / דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בהזרקת פיצול (01:10 יחס פיצול) וספקטרומטר מסה מוגדר לסריקת מצב על 40-600 האמו (יינון השפעת אלקטרונים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור טבלת רצף כוללים ממס (ריק), WT ומשכפל מוטציה, כל שיטת ניתוח cutin באמצעות מצויינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממס עומסובקבוקוני מדגם על הקרוסלה, להוסיף הקסאן לבקבוקוני שטיפה-מזרק בautosampler במידת צורך, ולהתחיל את הרצף. לאחר הרצף הושלם, סך עקבות chromatogram היון זמינות עבור כל הדגימות. </li></ol> ניתוח נתונים 5. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות מונומרים פוליאסטר שומנים על ידי השוואת הספקטרום ההמוני של כל שיא לספקטרום מסה שפורסם או על ידי חיפוש בספרייה מסחרית אם זמין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשיא כל שזוהה בchromatogram הנוכחי היון הכולל, להשתמש הפעמים השמירה שלהם כדי למצוא את האזורים על שולחן תוצאות האינטגרציה מGC התוכנה / MS (איור משלימה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל מונומר (עמודות א.ב.), להוסיף את אזור הערכים נמצאו בטבלת האינטגרציה (איור 1 נוסף, עמודת D) לעמודה המתאימה לכל לשכפל מדגם בטבלת Excel של מונומרים (קובץ נוסף 2, טורי CF), שהוא גיליון אלקטרוני לכמת ארבידופסיסנגזרי cutin TMSi. השתמש בקובץ נוסף 3 אם נגזרי acetylated מוכנים במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את תחומי הסטנדרטים הפנימיים (IS) לעמודות (HK). לאלו מונומרים שאינם derivatized, אסטרים מתיל כלומר חומצות שומן (ג&#39;יימס), ואסטרים דימתיל חומצת dicarboxylic (DCA DMEs), להשתמש 17: 0 תהילה (IS1) כלכימות (תאים מוצלים סגולים בטבלת מונומר; נוסף קבצי 2/3). למונומרים hydroxylated, כוללים אלכוהול ראשוני, חומצת ferulic וחומצות ω-הידרוקסי, להשתמש 15: 0 FAME 15 הידרוקסי-(IS2) כבחירה לכימות מתחם (תאים-shadded ירוקים בטבלת מונומר; משלימה קבצי 2/3) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף משקל עלה יבש לכל לשכפל לעמודות AX-תואר ראשון (קובץ נוסף 2) או AQ-AT (קובץ נוסף 3); לחלופין, לסרוק עלים לחשב שטח פנים ולהוסיף ערכי שטח לשולחן מונומר להביע המון מונומר ליחידהשטח פנים. </li></ol>

<ol>
	<li>Kolattukudy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biopolyester+membranes+of+plants:+cutin+and+suberin.">Biopolyester membranes of plants: cutin and suberin.</a> Science. 208 (4447), 990-1000 (1980).</li><li>Kolattukudy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyesters+in+higher+plants.">Polyesters in higher plants.</a> Adv. Biochem. Eng. Biot. 71, 1-49 (2001).</li><li>Yeats, T. H., Rose, J. K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+and+function+of+plant+cuticles.">The formation and function of plant cuticles.</a> Plant Physiol. 163 (1), 5-20 (2013).</li><li>Pollard, M., Beisson, F., Li, Y., Ohlrogge, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+lipid+barriers:+biosynthesis+of+cutin+and+suberin.">Building lipid barriers: biosynthesis of cutin and suberin.</a> Trends Plant Sci. 13 (5), 236-246 (2008).</li><li>Beisson, F., Li-Beisson, Y., Pollard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solving+the+puzzles+of+cutin+and+suberin+polymer+biosynthesis.">Solving the puzzles of cutin and suberin polymer biosynthesis.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 15 (3), 329-337 (2012).</li><li>Heredia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+and+biochemical+characteristics+of+cutin,+a+plant+barrier+biopolymer.">Biophysical and biochemical characteristics of cutin, a plant barrier biopolymer.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1620 (1-3), 1-7 (2003).</li><li>Bonaventure, G., Beisson, F., Ohlrogge, J., Pollard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+aliphatic+monomer+composition+of+polyesters+associated+with+Arabidopsis+epidermis:+occurrence+of+octadeca-cis-6,+cis-9-diene-1,+18-dioate+as+the+major+component.">Analysis of the aliphatic monomer composition of polyesters associated with Arabidopsis epidermis: occurrence of octadeca-cis-6, cis-9-diene-1, 18-dioate as the major component.</a> Plant J. 40 (6), 920-930 (2004).</li><li>Franke, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoplastic+polyesters+in+Arabidopsis+surface+tissues+-+A+typical+suberin+and+a+particular+cutin.">Apoplastic polyesters in Arabidopsis surface tissues - A typical suberin and a particular cutin.</a> Phytochemistry. 66 (22), 2643-2658 (2005).</li><li>Vogg, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+fruit+cuticular+waxes+and+their+effects+on+transpiration+barrier+properties:+functional+characterization+of+a+mutant+deficient+in+a+very-long-chain+fatty+acid+-ketoacyl-CoA+synthase.">Tomato fruit cuticular waxes and their effects on transpiration barrier properties: functional characterization of a mutant deficient in a very-long-chain fatty acid -ketoacyl-CoA synthase.</a> J. Exp. Bot. 55 (401), 1401-1410 (2004).</li><li>Molina, I., Bonaventure, G., Ohlrogge, J., Pollard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+polyester+composition+of+Arabidopsis+thaliana+and+Brassica+napus+seeds.">The lipid polyester composition of Arabidopsis thaliana and Brassica napus seeds.</a> Phytochemistry. 67 (23), 2597-2610 (2006).</li><li>Li-Beisson, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acyl-lipid+metabolism.">Acyl-lipid metabolism.</a> The Arabidopsis Book. 11, e0161 (2013).</li><li>Molina, I., Ohlrogge, J. B., Pollard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deposition+and+localization+of+lipid+polyester+in+developing+seeds+of+Brassica+napus+and+Arabidopsis+thaliana.">Deposition and localization of lipid polyester in developing seeds of Brassica napus and Arabidopsis thaliana.</a> Plant J. 53 (3), 437-449 (2008).</li><li>Xiao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+CYP86A2+represses+Pseudomonas+syringae+type+III+genes+and+is+required+for+cuticle+development.">Arabidopsis CYP86A2 represses Pseudomonas syringae type III genes and is required for cuticle development.</a> EMBO J. 23 (14), 2903-2913 (2004).</li><li>Christie, W. W., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lipid Analysis - Isolation, Separation, Identification and Lipidomic Analysis. , 446 (2010).</li><li>Walton, T. J., Kolattukudy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+structures+of+cutin+monomers+by+a+novel+depolymerization+procedure+and+combined+gas+chromatography+and+mass+spectrometry.">Determination of the structures of cutin monomers by a novel depolymerization procedure and combined gas chromatography and mass spectrometry.</a> Biochemistry. 11 (10), 1885-1896 (1972).</li><li>Matzke, K., Riederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+into+the+chemical+constitution+of+cutins+and+suberins+from+Picea+abies+(L.)+Karst.,+Quercus+robur+L.,+and+Fagus+sylvatica+L.">A comparative study into the chemical constitution of cutins and suberins from Picea abies (L.) Karst., Quercus robur L., and Fagus sylvatica L.</a> Planta. 185 (2), 233-245 (1991).</li><li>Riederer, M., Sch&#246;nherr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+gas+chromatographic+analysis+of+methyl+esters+of+hydroxy+fatty+acids+derived+from+plant+cutin.">Quantitative gas chromatographic analysis of methyl esters of hydroxy fatty acids derived from plant cutin.</a> J. Chromatogr. 360, 151-161 (1986).</li><li>Moire, L., Schmutz, A., Buchala, A., Yan, B., Stark, R., Ryser, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycerol+Is+a+Suberin+Monomer.+New+Experimental+Evidence+for+an+Old+Hypothesis.">Glycerol Is a Suberin Monomer. New Experimental Evidence for an Old Hypothesis.</a> Plant Physiol. 119 (3), 1137-1146 (1999).</li><li>Gra&#231;a, J., Schreiber, L., Rodrigues, J., Pereira, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycerol+and+glyceryl+esters+of+omega-hydroxyacids+in+cutins.">Glycerol and glyceryl esters of omega-hydroxyacids in cutins.</a> Phytochemistry. 61 (2), 205-215 (2002).</li><li>Eglinton, G., Hunneman, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas+chromatographic-mass+spectrometric+studies+of+long+chain+hydroxy+acids-I:+The+constituent+cutin+acids+of+apple+cuticle.">Gas chromatographic-mass spectrometric studies of long chain hydroxy acids-I: The constituent cutin acids of apple cuticle.</a> Phytochemistry. 7 (2), 313-322 (1968).</li><li>Espelie, K. E., K&#246;ller, W., Kolattukudy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=9,16-dihydroxy-10-oxo-hexadecanoic+acid,+a+novel+component+in+citrus+cutin.">9,16-dihydroxy-10-oxo-hexadecanoic acid, a novel component in citrus cutin.</a> Chem. Phys. Lipids. 32 (1), 13-26 (1983).</li><li>Holloway, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracuticular+lipids+of+spinach+leaves.">Intracuticular lipids of spinach leaves.</a> Phytochemistry. 13 (10), 2201-2207 (1974).</li><li>Holloway, P. J., Deas, A. H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epoxyoctadecanoic+acids+in+plant+cutins+and+suberins.">Epoxyoctadecanoic acids in plant cutins and suberins.</a> Phytochemistry. 12 (7), 1721-1735 (1973).</li><li>Holloway, P. J., Cutler, D. F., Alvin, K. L., Price, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The chemical constitution of plant cutins. , 45-85 (1982).</li><li>Croteau, R., Fagerson, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+constituent+cutin+acids+of+cranberry+cuticle.">The constituent cutin acids of cranberry cuticle.</a> Phytochemistry. 11 (1), 353-363 (1972).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

שלא כמו biopolymers האחר כגון דנ&quot;א וחלבונים, השומנים פוליאסטר צמח אינו עשוי מתבנית. במקום זאת, יצירותיהם תלויות בספציפית של האנזימים הנמצאים ברקמות שהופכות את הפולימרים תאיים אלה. ככזה, אנליזות כימיות של מרכיב רכיבים קריטיים להבין הרכב פוליאסטר שומנים. שיטות כימיות לדבוק אג&quot;ח אסתר כוללות סבון, hydrogenolysis, transmethylation-זרז חומצה, ו- זרז בסיס transmethylation 2. לכל אחד מהם יתרונות וחסרונות. סבון מייצר חומצות שומן חופשיות הידרוקסי שיכול לעבור תגובות המשניות. Hydrogenolysis עם ליתיום אלומיניום הידריד (4 LiAlH) 16 שמש במשך ניתוח cutin 7. Hydrogenolysis מפחית פחמנים פונקציונליות לאלכוהול והמבנים המקוריים צריכים להסיק על ידי deuteriolysis עם deuteride אלומיניום ליתיום (LiAlD 4).חסרון של גישה זו הוא הדרישה של GC / MS ברזולוציה גבוהה כדי להשוות את מידת deuteriation של polyols השומן שהושג לעשות משימות של המבנים שלהם. transesterification זרז-חומצה עם trifluoride ורון methanolic (BF 3) כבר בשימוש תכוף בdepolymerizations cutin ושַׁעֲמָן 8,17,18, אבל יש מגיב חיי מדף מוגבלים ועשוי להציג את החפצים בשל תופעות תגובות 15. חומצה גופרתית methanolic גם תשואות אסטרים מתיל של מונומרים אבל עם פרופורציות גדולות יותר של חומצות שומן 2-הידרוקסי, אשר ככל הנראה לא רכיבי פוליאסטר השומנים נכונים, בהשוואה לשיטות אחרות 10. שיטת transesterification הזרז-NaOMe המתוארת בפרוטוקול זה מייצרת אסטרים מתיל חומצת השומן שderivatized על ידי silylation של קבוצות הידרוקסיל, מתן ספקטרום מסה אופייני לזיהוי, או על ידי acetylation לספק נגזרים יציבים יותר של קבוצות הידרוקסיל FOכימות r. חסרון אחד של שיטה זו הוא שהידרוליזה מתחרה עם transesterification כאשר המים נמצאים בתגובה. מים מגיבים עם NaOMe (הזרז) ומייצרים NaOH, אשר בתורו hydrolyses אסטרים מתיל חומצת שומן להניב חומצות חופשיות (איור 2 ד). זה צד תגובה רצויה משום ששתי פסגות תהיה נוכחת לכל חומצת שומן: תיל אסטר ונגזר אסתר TMSi, ובכך מסבכים את הניתוח. שימוש בחומרים כימיים נטול מים והוספה מתיל אצטט כשיתוף ממס להתחרות עם סבון הם צעדים חיוניים ובכך למנוע הידרוליזה (איור 2 ד). Cutin ושַׁעֲמָן מכילים בין גליצרול 1 ו -26% 4. עם זאת, מונומר זה לא יזוהה על ידי תנאי הניסוי מתוארים בפרוטוקול זה. גליצרול הוא הידרופילי מאוד, ובניגוד למונומרים התיל אסטר חומצת שומן, יבוטל במהלך שלבי ממס השטיפה מימיים. מגבלה זו גםpplies לשיטות אחרות cutin depolymerization, אבל גליצרול ניתן לקבוע בשכבה המימית המתקבלת לאחר transesterification באמצעות שיטה האנזימטית. לחלופין, ניתן לכמת באמצעות תנאים מתונים יותר (לדוגמא., 0.05 M NaOMe) ללא מיצוי במים נוסף כדי לזהות את כל מונומרים, כולל גליצרול 19,20 .Although שימושי לצורך כימות גליצרול, תנאים קלים בדרך כלל לתת depolymerization שלם של cutin ו שַׁעֲמָן. אם GC מצמידים את גלאי יינון להבה (FID) זמין, ניתן לנתח את כל משכפל במכשיר זה למטרות כמותי, אחרי פסגות של מדגם מייצג זוהו על ידי GC / MS. לחלופין, ניתן לזהות מונומרים בGC / עקבות FID אם ידועים מדדי שימורם. יש גלאי יינון הלהבה גבוהה במיוחד רגישות ומגוון רחב של מידתיות, שהוא קריטי לכימות של רכיבי מדגם גדולים והקטניםבריצות יחידה. בנוסף, הוא חזק וקל לתחזוקה ותפעול 15. הפרוטוקול המתואר מאפשר הבידוד, זיהוי, וכימות אמין ושחזור של מונומרים פוליאסטר שומנים צמחיים, המאפשר אפיון הכימי של מוטציות שונות בהרכב של מונומרים פוליאסטר שומנים אחד או יותר. ההליך הוא מדרגי, זה יכול להתאים בקלות לעבד כמויות קטנות וכמות גדולות של חומרים צמחיים שונים, כוללים שורשים, זרעים, עלים, גבעולים ופרחים. נתוני רפאים המוניים של מונומרים פוליאסטר שומנים ממינים רבים שפורסמו לדוגמא., 21-26 ומהווים משאבים יקרי ערך כדי לזהות מונומרים ידועים מתי התאמת פרוטוקול זה לרקמות ו / או מינים אחרים. שיטה זו ישימה לחקירות של ביוסינתזה, רגולציה, וההפצה של פוליאסטר שומנים בצמחים גבוהים יותר.

צמחים עילאיים להסתמך על שכבות תאיים המתפקדות כמחסומים עמידים למים בין רקמות צמח והסביבה החיצונית. המבנים הקשורים קיר תא lipophilic אלה מגבילים את הזיהום פתוגניים ולהסדיר את התחבורה הפסיבית של גזים, מים, וחומרים מומסים ובמתוך רקמות צמח 1. מחסומים כאלה הם ציפורן הצמח, מבנה synapomorphic ייחודי לצמחים 2, ומחסומי דיפוזיה המכיל שַׁעֲמָן שונים. הציפורן היא שכבת oleophilic המסונתזת על ידי תאי האפידרמיס וחייבת אותם באמצעות שכבת pectinaceous בצד תאי של דופן התא 3-5. זה סוגר את האיברים אוויריים העיקריים של צמחים גבוהים יותר, המתפקד כממשק חיוני בין רקמות צמח והסביבה. Cutin, המטריצה ​​המבנית של הציפורן, ושַׁעֲמָן שני פוליאסטר glycerolipid מסיס הקשורים שעוות ממס נשלף 2,4. l פולימרים אלהipids מורכב של נגזרי חומצת שומן רוויים ובלתי רוויים והם גם מבני ותפקודי דומים. עם זאת, הם נבדלים על ידי הבדלים אופייניים באתרי הרכב ותצהיר כימיים. שַׁעֲמָן הוא פוליאסטר אליפטי הממוקם בתוך קירות התא של רקמות פנימיות וחיצוניות מסוימות ויוצרות קיר המשני. רקמות Suberized כוללות periderms של שורשים, פקעות וקליפת עץ, endodermis שורש, שכבות מעיל זרע, ופצעים הגלידו 2. שלא כמו cutin, פוליאסטר שַׁעֲמָן בדרך כלל מכיל אלכוהול, רווי וחומצות dicarboxylic מונו-בלתי רווי, וחלק גדול ממונומרים מאוד ארוכת-שרשרת (C≥20). Cutin הוא פוליאסטר שומנים הנפוץ ביותר בצמחים עילאיים 6, והוא מורכב מגליצרול ונגזרי חומצת שומן interesterified C16-C18, כגון חומצות שומן-אפוקסי הידרוקסי הידרוקסי והוחלף 4. בעוד ההרכב של פולימרים cutinמשתנה בין מיני tracheophyte, מונומרים העיקריים השולט ביותר הם 10, 16-dihydroxy 16: 0,-9,10-אפוקסי 18-הידרוקסי 18: 0, ו9,10,18-trihydroxy 18: 0 חומצות שומן. מעניין לציין, עלה ארבידופסיס ונובע cutin מורכב בעיקר של 18: 2 חומצת dicarboxylic 7,8. שורש צמח גם להציג שונות ניכר בעובי, החל כמה ננומטרים לכמה מיקרומטרים 9. מאז בידוד ציפורן הוא צעד מייגע וגוזל זמן, במיוחד לעור קרני עלה דק מאוד כמו אלה של thaliana ארבידופסיס 8, שיטות העוקפות בידוד ציפורן פותחו ומאומתים 7,8. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט ללמוד הקומפוזיציה מונומר של cutin בעלי thaliana ארבידופסיס ידי methoxide נתרן (NaOMe) depolymerization -catalyzed וגז כרומטוגרפיה הבאה / ספקטרומטר מסה (GC / MS) ניתוח. פרוטוקול זה מציע שיטה חזקה למנסה לאמוד את שיתוףmposition של פוליאסטר שומנים צמח ברקמות delipidated כל, והותאם מפרוטוקולים שדווחו בעבר 7,10,11. דגימות רקמה שלמות הן ראשון הומוגני וממצה delipidated, הסרת שומני ממס לחילוץ כולל cuticular ושעוות epicuticular, שומני קרום, וtriacylglycerols. אז שאריות מועשרות קיר תא depolymerized למונומרים התיל אסטר המרכיבים אותן על ידי methanolysis-זרז methoxide נתרן. אסטרים מתיל חומצת שומן מופקים על החמצה, וderivatized להשיג נגזרי trimethylsilyl או אצטיל המקביל שלהם. שאריות derivatized תנודתיות מאוד, ויכולות להיות eluted מעמודת גז כרומטוגרפיה בטמפרטורה סבירה מבלי לשנות קונפורמציה המבנית שלהם במהלך ניתוח GC / MS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1105">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Chemicals</td>
			<td style="width:228px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">2-propanol</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">BPA451-4</td>
			<td style="width:301px;">Solvent for delipidation</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Anhydrous sodium sulfate</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">S421500</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Acetic anhydride</td>
			<td style="width:228px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">320102</td>
			<td style="width:301px;">Derivatization agent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">BSTFA (N,O-bis(trimethylsilyl)-trifluoroacetamide)</td>
			<td style="width:228px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">15222</td>
			<td style="width:301px;">Derivatization agent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Butylated hydroxytoluene (BHT)</td>
			<td style="width:228px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">101162</td>
			<td style="width:301px;">Antioxidant</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Calcium chloride, anhydrous</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">C614-3</td>
			<td style="width:301px;">Desiccation agent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Calcium suflate, anhydrous (DRIERITE- 8 MESH with indicator)</td>
			<td style="width:228px;">Acros Organics</td>
			<td>219090020</td>
			<td style="width:301px;">Desiccation agent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Chloroform (Trichloromethane)</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">C6074</td>
			<td style="width:301px;">Organic solvent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Glacial acetic acid</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">BP2401212</td>
			<td style="width:301px;">Acidification agent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Helium carrier gas, compressed</td>
			<td style="width:228px;">Air Liquide</td>
			<td style="width:153px;">ALPHAGAZ1-UN1046</td>
			<td style="width:301px;">Carrier gas, GC/MS</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Heptane</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">H3501</td>
			<td style="width:301px;">Organic solvent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Hexanes</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">H3024</td>
			<td style="width:301px;">Organic solvent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Methanol</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">A4124</td>
			<td style="width:301px;">Organic solvent, transmethylation reactive</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Methyl acetate</td>
			<td style="width:228px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">296996</td>
			<td style="width:301px;">Organic solvent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Methyl heptadecanoate</td>
			<td style="width:228px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">H4515</td>
			<td style="width:301px;">Internal standard (1mg/mL stock)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Methylene dichloride (Dichloromethane)</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">D374</td>
			<td style="width:301px;">Organic solvent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Nitrogen, compressed</td>
			<td style="width:228px;">Air Liquide</td>
			<td style="width:153px;">ALPHAGAZ1-UN1044</td>
			<td style="width:301px;">Carrier gas, GC-FID</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Pentadecanolactone</td>
			<td style="width:228px;">Fluka</td>
			<td style="width:153px;">76530</td>
			<td style="width:301px;">Internal standard (1 mg/mL stock)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Pyridine</td>
			<td style="width:228px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">270970</td>
			<td style="width:301px;">Co-solvent for derivatization</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">BP358212</td>
			<td style="width:301px;">Saline solution</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Sodium methoxide (25wt.%)</td>
			<td style="width:228px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">156256</td>
			<td style="width:301px;">Nucleophile</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Toluene</td>
			<td style="width:228px;">FIsher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">T2904</td>
			<td style="width:301px;">Organic solvent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Plant Growth Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:423px;">Pro-Mix PGX</td>
			<td>Premier Tech Horticulture Ltd</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;">Pro-Mix PGX is recommended to grow Arabidopsis plants (Eddy, R. and Hahn, D.T., 2012,http://docs.lib.purdue.edu/pmag/2) 
			Purdue Methods for Arabidopsis Growth.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">PermaNest Humidity Dome&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Grower&#39;s Solution, LLC, Cookeville, TN&#160;</td>
			<td style="width:153px;">GD2211-24</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">Perma-Nest Plant Trays (22x11in)</td>
			<td style="width:228px;">Grower&#39;s Solution, LLC, Cookeville, TN&#160;</td>
			<td style="width:153px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">Square greenhouse pots, 3.5 inch&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Grower&#39;s Solution, LLC, Cookeville, TN&#160;</td>
			<td style="width:153px;">P86</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:423px;">General Purpose Plant Fertilizer, Plant-Prod 20-20-20</td>
			<td style="width:228px;">Premier Tech Home and Garden In., Brantford, ON</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glassware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:423px;">13 x 100 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap</td>
			<td style="width:228px;">Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td>
			<td style="width:153px;">45066A-13100</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:423px;">16 x 125 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap</td>
			<td style="width:228px;">Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td>
			<td style="width:153px;">45066A-16125</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:423px;">20 x 125 mm glass test tubes with Teflon-faced screw cap</td>
			<td style="width:228px;">Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td>
			<td style="width:153px;">45066A-20125</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">GC vial caps</td>
			<td style="width:228px;">National Scientific</td>
			<td style="width:153px;">C400051A</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">GC vial microinserts</td>
			<td style="width:228px;">National Scientific</td>
			<td style="width:153px;">C4011631</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">GC vials</td>
			<td style="width:228px;">National Scientific</td>
			<td style="width:153px;">C40001</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Disposable pasteur pipets</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">1367820B</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Flasks</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Allegra X15R centrifuge</td>
			<td style="width:228px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Analytic balance</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:423px;">Belly dancer</td>
			<td style="width:228px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;">A shaker can be used for this purpose if Belly Dancer not available</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">DB-5 Capillary GC column</td>
			<td style="width:228px;">J&#38;W Scientific, CA, USA;&#160;</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;">30 m x 0.25 mm x 0.25 &#956;m film thickness</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Desiccator</td>
			<td style="width:228px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Isotemp 202 water bath</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">ISQ LT single quadupole mass spectrometer</td>
			<td style="width:228px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Heat block</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Nitrogen evaporator</td>
			<td style="width:228px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Polytron homogenizer</td>
			<td style="width:228px;">Birkmann</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Trace 1300 gas chromatograph</td>
			<td style="width:228px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Two-stage regulator</td>
			<td style="width:228px;">Air Liquide</td>
			<td style="width:153px;">Q1-318B-580</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Vacuum desiccator</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and compositional analysis of plant cuticle lipid polyester monomers

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester of glycerol and modified fatty acids that constitutes the framework of the cuticle that covers aerial plant surfaces. Suberin is a related lipid polyester that is deposited on the cell walls of certain tissues, including the root endodermis and the periderm of tubers, tree bark and roots. These lipid polymers are highly variable in composition among plant species, and often differ among tissues within a single species. Here, we describe a detailed protocol to study the monomer composition of cutin in Arabidopsis thaliana leaves by sodium methoxide (NaOMe)-catalyzed depolymerisation, derivatization, and subsequent gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS) analysis. This method can be used to investigate the monomers of insoluble polyesters isolated from whole delipidated plant tissues bearing either cutin or suberin. The method can by applied not only to characterize the composition of lipid polymers in species not previously analyzed, but also as an analytical tool in forward and reverse genetic approaches to assess candidate gene function.

הפרוטוקול המתואר בכתב היד הזה הוא להגדיר כדי לקבוע מונומרים פוליאסטר שומנים, צמצום התרומות של שומנים שאינם cutin 10 איור 1 מציג סקירה של assay, שלגמרי לוקח בין 8 (כלומר, cutin או שַׁעֲמָן.) -. 10 ימים (מקצירת רקמה ראשונית לקבלת נתונים GC), תלוי כמה זמן דגימות להתייבש. Methanolysis נבחר-זרז הבסיס (איור 2) השיטה לdepolymerize פוליאסטר קבלה תוקף בעבר לזרעי ארבידופסיס, המכילים שני cutin ושַׁעֲמָן. רקמות ראשונות הומוגני וממצות delipidated כדי להסיר שומני ממס שניתן להפיק. תשואת השאריות לאחר חילוץ, כאחוז ממשקל הטרי ראשוני, היא בדרך כלל 6% לא thaliana Col-0 עלים. שאריות מועשרות קיר תא מיובשות בייבוש ואקום ולאחר מכן depolymerized למונומרים התיל אסטר המרכיבים אותן על ידיזרז-בסיס transmethylation. דגירה של שעות נבחרה כזמן הקריטי הנדרש לdepolymerization והתאוששות של רכיבי פוליאסטר שומנים נכונים. פעמים דגירה כבר הביאו לעלייה בחומצות 2-הידרוקסי; אלה שעלולים לנבוע מsphingolipids קרום 10. Chromatogram טיפוסי אם cutin עלה סוג בר ארבידופסיס מוצג באיור 3, לנגזרי O -TMSi אתר (איור 3 א) ונגזרי -acetyl O (איור 3). שיא כל זוהה על ידי השוואה לספקטרום המוני מהספרות 7,8 ומאגר נתונים ציבורי 12 פרוטוקול וידאו .our מראה כיצד להכין נגזרי TMSi, אבל לחלופין ניתן acetylated דגימות לderivatize קבוצות הידרוקסיל. נגזרי Silylated טובים למטרות זיהוי משום שהם נותנים ספקטרום המוני אבחון. עם זאת, נגזרי acetylated הם יציבים יותר ואלטרנטיבה טובה לsilylationמונומרים פעם זוהו 10. (איור נוסף כדי לעזור ליישם פרוטוקול זה במעבדות שרק לי GC מצמידים את גלאי יינון להבה (FID), GC / FID עקבות מתאים לנגזרי acetylated של מונומרים cutin עלה WT ולסדרת הומולוג של סטנדרטים תיל אסטר חומצת שומן מוצג גם 4). שיטה זו היא איכותית ומזהה הבדלים כמותיים בין דגימות, ומכאן הערך שלה עבור ניתוח שעבר מוטציה. הכמויות של מונומרים פרט נקבעות תוך שימוש בשיטה סטנדרטית הפנימית של כימות, המאפשרת השוואות של שפע מונומר בין דגימות. יובהר, עם זאת, כי גודל השיא (סה&quot;כ ספירת יון) עלול שלא לשקף יחסים הטוחנות של מונומרים בפוליאסטר. אנו כוללים שולחנות עריכה של מונומרים לחשב כמויות מונומר בcutin עלה ארבידופסיס כאסטרים של חומצות שומן מתיל ונגזרי TMSi (קובץ נוסף 1), או אס<html> נגזרי Tyl (קובץ נוסף 2) של אלכוהול. לוחות אלה ייתכן שיהיו צורך מותאם אם דגימות שחולצו מאיברים שונים או מיני צמחים. ארבידופסיס תאליה na קולומביה כדוגמא, יש לנו ניתחתי (Col-0) עלים סוג בר ושני אללים null-המוטציה אפיינו בעבר את של גן CYP86A2 / ATT1, att1-1 (m-1) וatt1-2 (m-2 ) 13,14. monooxygenases ציטוכרום P450 של תת-משפחת CYP86A לקודד ω-oxydases המשוער ולהשתתף שבַׁעֲמָן וביוסינתזה מונומר cutin. התוצאות שלנו (איור 4) להפגין ירידה משמעותית בעומסים של שלושה מונומרים שומנים גדולים בעלי המוטציה בהשוואה לעלי WT. עולה בקנה אחד עם התפקוד של האנזים שחזה, 16: 0, 18: 2, 18 ו: 1 dicarboxylates הושפע במיוחד במוטציות att1. &quot;Src =&quot; / קבצים / ftp_upload / 53,386 / /&gt; 53386fig1.jpg &quot; איור 1. סקירה כללית של ניתוח פוליאסטר השומנים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig2.jpg" /> איור 2. מנגנון של תגובת transmethylation זרז-NaOMe. אניוני methoxide nucleophilic לתקוף את הפחמן cabonyl של פוליאסטר שומנים כדי ליצור יציב tetrahedral ביניים (א), שמנתק קלות לאסטרים מתיל חומצת השומן ואניוני alkoxide (B). alkoxides אלה הם בסיסי המצומד, ומגיב עם מתנול, התחדשות אניוני methoxide catalytically הפעיל, ובכך לשמר את תגובות נוספות depolymerization (C). אם מים נמצאים במערכת, שהיא תגיב עם methoxide נתרן כדי ליצור סודיום הידרוקסיד, בסיס חזק שאופן בלתי הפיך hydrolyses אסטרים לייצר חומצות שומן חופשיות בלתי רצויות. מתיל אצטט נוסף כ-15 שיתוף הממס להסיר כמויות קטנות של נתרן הידרוקסידי בתוך המערכת (ד &#39;). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig3.jpg" /> איור 3. Chromatogram הנציג הכולל יון של מונומרים cutin עלה thaliana ארבידופסיס wild-type. (א) אתר O -trimethylsilyl (TMSi) ו- (ב) נגזרי הידרוקסיל אצטט. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> </&gt; <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig4.jpg" /> איור 4. הרכב Cutin מונומר של WT thaliana ארבידופסיס ושני אללים המוטציה null של גן CYP86A2. (מוטציה-1 = att1-1; מוטציה-2 = att1-2) ברים שגיאה מייצגים סטיית התקן של הממוצע (n = 4) . מעובד מתוך 13, באישור © לקוול ההוצאה לאור (2007). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig4large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig1.jpg" /> איור נוסף טבלת 1. שיא תוצאות האינטגרציה מGC התוכנה / MS. פסגות המתאימות מונומרים מזוהים וסטנדרטים פנימיים מזוהות על ידי retenti<html> בזמן (העמודה C) וערכי אזור הם נספר בטור ד <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_Figure_1.tif" target="_blank">&#39;אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig2.jpg" /> קובץ 2. טבלה נוספת של מונומרים ארבידופסיס cutin (נגזרי אתר trimethylsilyl של אסטרים תיל חומצת שומן הידרוקסי). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_File_2_Cutin_template_TMSi.xls" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig3.jpg" /> קובץ 3. לוח נוסף של מונומרים ארבידופסיס cutin (נגזרי -acetyl O של אסטרים תיל חומצת שומן הידרוקסי).com / קבצים / ftp_upload / 53,386 &quot;target =&quot; / Supplemental_File_3_Cutin_template_Acetylated_derivatives.xlsx _ blank &quot;&gt; אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig4.jpg" /> GC איור 4. נוסף / עקבות FID של (AB) תיל אסטר חומצת שומן (תהילה) סטנדרטים מדד שימור (פסגות מסומנות עם כל אורך שרשרת FAME רווי); ו- (ג) acetylated א מונומרים cutin עלה WT thaliana. מספרים בשיא מתאים ל: 16: 0 תהילה (1), ferulate (2), 18: 3 תהילה (3), 18: 1/18: 2 FAMEs (4), 18: 0 תהילה (5), sinapate (6 ), 16: 0 DCA (7), 16-OH 16: 0 תהילה (8), 18: 2 DCA (9), 18: 1 DCA (10) 18: 0 DCA (11), 18-OH 18: 2 תהילה (12), 18 18-OH: FAME 1 (13), 20: 0 תהילה (14), 10,16-diOH 16: 0 תהילה (15), 24: 0 תהילה (16). DCA: אסתר דימתיל חומצת dicarboxylic; תהילה: תיל אסטר חומצת שומן; IS1: תקן פנימי 1, 17: 0 תהילה; IS2: רח הפנימיandard 2, 15-OH 15: 0 תהילה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_Figure_4.tif" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers at JoVE.com

Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers

Lipid polyesters constitute the structural components of two cell wall modifications, the plant cuticle and suberin-containing diffusion barriers. In this video, we describe a method to depolymerize cutin from whole delipidated leaves. The method can be applied to investigating mutants compromised in either cutin or suberin biosynthesis.

בידוד והלחנת ניתוח של צמח מונומרים פוליאסטר שומנים ציפורן

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester ...

isolation-compositional-analysis-plant-cuticle-lipid-polyester

Research

JoVE Journal

Biology

16.6K Views.  Algoma University. Lipid polyesters constitute the structural components of two cell wall modifications, the plant cuticle and suberin-containing diffusion barriers. In this video, we describe a method to depolymerize cutin from whole delipidated leaves. The method can be applied to investigating mutants compromised in either cutin or suberin biosynthesis.

Video: Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers

Use of Arabidopsis eceriferum Mutants to Explore Plant Cuticle Biosynthesis

The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation, but is also an important barrier against the entry of pathogenic microorganisms.  The cuticle is made up of a tough crosslinked polymer called "cutin" and a protective wax layer that seals the plant surface.  The waxy layer of the cuticle is obvious on many plants, appearing as a shiny film on the ivy leaf or as a dusty outer covering on the surface of a grape or a cabbage leaf thanks to light scattering crystals present in the wax.  Because the cuticle is an essential adaptation of plants to a terrestrial environment, understanding the genes involved in plant cuticle formation has applications in both agriculture and forestry. Today, we'll show the analysis of plant cuticle mutants identified by forward and reverse genetics approaches.


The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation but is also an important barrier against the entry of pathogenic microorganisms. In this video, we demonstrate the analysis of plant cuticle mutants identified by forward and reverse genetics approaches.

השימוש מוטאנטים eceriferum ארבידופסיס לחקור לציפורן ביוסינתזה הצמח

The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation, but is also an important barrier against the entry of ...

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and genetics because of its simple life cycle, ease of growth and manipulation for genetic analysis, genomic resources, and transformability of the nucleus and both organelles. Mating strains is a common practice when genetic approaches are used in Chlamydomonass, to create vegetative diploids for analysis of dominance, or following tetrad dissection to ascertain nuclear vs. organellar inheritance, to test allelism, to analyze epistasy, or to generate populations for the purpose of map-based cloning. Additionally, genetic crosses are routinely used to combine organellar genotypes with particular nuclear genotypes. Here we demonstrate standard methods for gametogenesis, mating, zygote germination and tetrad separation. This protocol consists of an easy-to-follow series of steps that will make genetic approaches amenable to scientists who are less familiar with Chlamydomonas. Key parameters and trouble spots are explained. Finally, resources for further information and alternative methods are provided.

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Mating and tetrad separation are required for genetic analysis in Chlamydomonas reinhardtii. Here we demonstrate standard methods for gametogenesis, mating, zygote germination and tetrad dissection. This protocol consists of an easy-to-follow series of steps that will make genetic approaches amenable to scientists who are less familiar with Chlamydomonas.

הזדווגות והפרדה של הטטרדה Chlamydomonas reinhardtii עבור ניתוח גנטי

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part I: Lignin

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st century. This has rekindled interest in the use of plant products as industrial raw materials for the production of liquid fuels for transportation1 and other products such as biocomposite materials7. Plant biomass remains one of the greatest untapped reserves on the planet4. It is mostly comprised of cell walls that are composed of energy rich polymers including cellulose, various hemicelluloses (matrix polysaccharides, and the polyphenol lignin6 and thus sometimes termed lignocellulosics. However, plant cell walls have evolved to be recalcitrant to degradation as walls provide tensile strength to cells and the entire plants, ward off pathogens, and allow water to be transported throughout the plant; in the case of trees up to more the 100 m above ground level. Due to the various functions of walls, there is an immense structural diversity within the walls of different plant species and cell types within a single plant4. Hence, depending of what crop species, crop variety, or plant tissue is used for a biorefinery, the processing steps for depolymerization by chemical/enzymatic processes and subsequent fermentation of the various sugars to liquid biofuels need to be adjusted and optimized. This fact underpins the need for a thorough characterization of plant biomass feedstocks. Here we describe a comprehensive analytical methodology that enables the determination of the composition of lignocellulosics and is amenable to a medium to high-throughput analysis. In this first part we focus on the analysis of the polyphenol lignin (Figure 1). The method starts of with preparing destarched cell wall material. The resulting lignocellulosics are then split up to determine its lignin content by acetylbromide solubilization3, and its lignin composition in terms of its syringyl, guaiacyl- and p-hydroxyphenyl units5. The protocol for analyzing the carbohydrates in lignocellulosic biomass including cellulose content and matrix polysaccharide composition is discussed in Part II2.

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part I: Lignin

Plant biomass is a major carbon-neutral renewable resource that could be used for the production of biofuels. Plant biomass consists mainly of cell walls, a structurally complex composite material termed lignocellulosics. Here we describe a protocol for a comprehensive analysis of the content and composition of the polyphenolic lignin.

ניתוח מקיף של ההלחנה קירות התא הצומח (ביומסה Lignocellulosic) חלק א: ליגנין

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st century. This has rekindled interest in the use of plant products as industrial raw materials for the production of liquid fuels for transportation2 and other products such as biocomposite materials6. Plant biomass remains one of the greatest untapped reserves on the planet4. It is mostly comprised of cell walls that are composed of energy rich polymers including cellulose, various hemicelluloses, and the polyphenol lignin5 and thus sometimes termed lignocellulosics. However, plant cell walls have evolved to be recalcitrant to degradation as walls contribute extensively to the strength and structural integrity of the entire plant. Despite its necessary rigidity, the cell wall is a highly dynamic entity that is metabolically active and plays crucial roles in numerous cell activities such as plant growth and differentiation5. Due to the various functions of walls, there is an immense structural diversity within the walls of different plant species and cell types within a single plant4. Hence, depending of what crop species, crop variety, or plant tissue is used for a biorefinery, the processing steps for depolymerisation by chemical/enzymatic processes and subsequent fermentation of the various sugars to liquid biofuels need to be adjusted and optimized. This fact underpins the need for a thorough characterization of plant biomass feedstocks. Here we describe a comprehensive analytical methodology that enables the determination of the composition of lignocellulosics and is amenable to a medium to high-throughput analysis (Figure 1). The method starts of with preparing destarched cell wall material. The resulting lignocellulosics are then split up to determine its monosaccharide composition of the hemicelluloses and other matrix polysaccharides1, and its content of crystalline cellulose7. The protocol for analyzing the lignin components in lignocellulosic biomass is discussed in Part I3.

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part II: Carbohydrates

Plant biomass is a major carbon-neutral renewable resource that could be used for the production of biofuels. Plant biomass consists mainly of cell walls, a structurally complex composite material termed lignocellulosics. Here we describe a protocol for a comprehensive analysis of the content and composition of wall derived carbohydrates.

ניתוח מקיף של ההלחנה קירות התא הצומח (ביומסה Lignocellulosic) חלק II: פחמימות

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

בידוד יעיל ומהיר של עוברים משלבים מוקדמים<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; זרעים

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

מטבולית תיוג וממברנה היפוך חלוקה לניתוח השוואתי של proteomic<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; תא תרבויות השעיה

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex composition under different conditions. In this protocol the approach is demonstrated by comparing the composition of the protein complex responsible for cyclic electron flow (CEF) in Chlamydomonas reinhardtii, isolated from genetically different strains. The procedure comprises the isolation of thylakoid membranes, followed by their separation into multiprotein complexes by sucrose density gradient centrifugation, SDS-PAGE, immunodetection and comparative, quantitative mass spectrometry (MS) based on differential metabolic labeling (14N/15N) of the analyzed strains. Detergent solubilized thylakoid membranes are loaded on sucrose density gradients at equal chlorophyll concentration. After ultracentrifugation, the gradients are separated into fractions, which are analyzed by mass-spectrometry based on equal volume. This approach allows the investigation of the composition within the gradient fractions and moreover to analyze the migration behavior of different proteins, especially focusing on ANR1, CAS, and PGRL1. Furthermore, this method is demonstrated by confirming the results with immunoblotting and additionally by supporting the findings from previous studies (the identification and PSI-dependent migration of proteins that were previously described to be part of the CEF-supercomplex such as PGRL1, FNR, and cyt f). Notably, this approach is applicable to address a broad range of questions for which this protocol can be adopted and e.g. used for comparative analyses of multiprotein complex composition isolated from distinct environmental conditions.

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The described comparative, quantitative proteomic approach aims at obtaining insights into the composition of multiprotein complexes&#160;under different conditions and is demonstrated by comparing genetically different strains. For quantitative analysis equal volumes of different fractions from a sucrose density gradient are mixed and analyzed by mass spectrometry.

גישה חדשה לניתוח השוואתי של multiprotein מכלולים בהתבסס על<sup&gt; 15</sup&gt; N מטבולית תיוג וכמותי ספקטרומטריית המסה

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force used to pump blood. Individual cardiomyocytes were first isolated over 40 years ago in order to better study the physiology and structure of heart muscle. Techniques have rapidly improved to include enzymatic digestion via coronary perfusion. More recently, analyzing the contractility and calcium flux of isolated myocytes has provided a vital tool in the cellular and sub-cellular analysis of heart failure. Echocardiography and EKGs provide information about the heart at an organ level only. Cardiomyocyte cell culture systems exist, but cells lack physiologically essential structures such as organized sarcomeres and t-tubules required for myocyte function within the heart. In the protocol presented here, cardiomyocytes are isolated via Langendorff perfusion. The heart is removed from the mouse, mounted via the aorta to a cannula, perfused with digestion enzymes, and cells are introduced to increasing calcium concentrations. Edge and sarcomere detection software is used to analyze contractility, and a calcium binding fluorescent dye is used to visualize calcium transients of electrically paced cardiomyocytes; increasing understanding of the role cellular changes play in heart dysfunction. Traditionally used to test drug effects on cardiomyocytes, we employ this system to compare myocytes from WT mice and mice with a mutation that causes dilated cardiomyopathy. This protocol is unique in its comparison of live cells from mice with known heart function and known genetics. Many experimental conditions are reliably compared, including genetic or environmental manipulation, infection, drug treatment, and more. Beyond physiologic data, isolated cardiomyocytes are easily fixed and stained for cytoskeletal elements. Isolating cardiomyocytes via perfusion is an extremely versatile method, useful in studying cellular changes that accompany or lead to heart failure in a variety of experimental conditions.

Individual cardiomyocytes from wild type and mutant mice can be isolated from the heart in order to study their contractility and calcium transients. This allows characterization of the contribution of cellular dysfunction to heart dysfunction from any cause.

בידוד ופיזיולוגי ניתוח של שריר לב העכבר

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while maintaining transparency of the visual axis. Perturbations to this delicate balance cause blinding illnesses, such as diabetic retinopathy. Therefore, the understanding of energy metabolism changes in the retina during disease is imperative to the development of rational therapies for various causes of vison loss. The recent advent of commercially-available extracellular flux analyzers has made the study of retinal energy metabolism more accessible. This protocol describes the use of such an analyzer to measure contributions to retinal energy supply through its two principle arms - oxidative phosphorylation and glycolysis - by quantifying changes in oxygen consumption rates (OCR) and extracellular acidification rates (ECAR) as proxies for these pathways. This technique is readily performed in explanted retinal tissue, facilitating assessment of responses to multiple pharmacologic agents in a single experiment. Metabolic signatures in retinas from animals lacking rod photoreceptor signaling are compared to wild-type controls using this method. A major limitation in this technique is the lack of ability to discriminate between light-adapted and dark-adapted energy utilization, an important physiologic consideration in retinal tissue.

This technique describes real time recording of oxygen consumption and extracellular acidification rates in explanted mouse retinal tissues using an extracellular flux analyzer.

מדידה של חילוף החומרים האנרגיה ברקמת הרשתית Explanted באמצעות ניתוח השטף חוץ-תאית

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral lipids encased by a monolayer of phospholipids and proteins. Hepatic LD lipids, such as ceramides, and proteins are implicated in several diseases that cause hepatic steatosis. Although previous methods have been established for LD isolation, they require a time-consuming preparation of reagents and are not designed for the isolation of multiple subcellular compartments. We sought to establish a new protocol to enable the isolation of LDs, endoplasmic reticulum (ER), and lysosomes from a single mouse liver.
Further, all reagents used in the protocol presented here are commercially available and require minimal reagent preparation without sacrificing LD purity. Here we present data comparing this new protocol to a standard sucrose gradient protocol, demonstrating comparable purity, morphology, and yield. Additionally, we can isolate ER and lysosomes using the same sample, providing detailed insight into the formation and intracellular flux of lipids and their associated proteins.

This protocol establishes a novel method of lipid droplet isolation and purification from mouse livers, using a well-established endoplasmic reticulum isolation kit.

השומנים מהירה Droplet בידוד פרוטוקול באמצעות ערכת בידוד להקציע אברון

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral ...