This work was supported by a Natural Sciences and Engineering Research (NSERC)-USRA grant to S.J., and by an NSERC-Discovery Grant to I.M. We thank Richard Bourgault, Meghan Rains, and Amanda Fluke for technical assistance. Seeds of att1-1 and att1-2 mutants were kindly provided by Dr. Jian-Min Zhou, Institute of Genetics and Developmental Biology, Beijing, China.

Hinweis: Dieses Protokoll wurde von Bonaventure et al angepasst. (2004), Molina et al. (2006), Li et al. (2013) 7,10,11. Schritte 1-5 sind in Abbildung 1 zusammengefasst. 1. Tissue Delipidierung Hinweis: Spülen Sie alle Glaswaren und Mützen mit Chloroform, ließ trockenen unter Abzug, vor der Verwendung. ACHTUNG: Führen Sie Gewebehomogenisierung und alle Lösungsmittel-Transferschritte unter Abzug; immer tragen Laborkittel, Schutzhandschuhe und Spritzschutzbrille, um den direkten Kontakt mit Chemikalien zu vermeiden und um die Proben vor Verunreinigung zu schützen. <ol><li> Vorheizen Wasserbad und Heizblock auf 85 ° C. </li><li> Ein Gewicht von etwa 0,5 g jeder Blattprobe in vorgewogene 20 mm x 125 mm Glasröhrchen mit Polytetrafluorethylen (PTFE) -Flächen Schraubverschlüssen. Fügen Sie vier Wiederholungen pro Probe. </li><li> Platzieren 2-Propanol in einem Erlenmeyerkolben (etwa 125 ml; 25 ml pro g sample). Hinzufügen von 2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol (auch als butyliertes Hydroxytoluol, BHT bezeichnet) zu einer Endkonzentration von 0,01% (w / v). Anmerkung: BHT Hinzufügen von einem 5% (w / v) Stammlösung in Methanol (BHT trägt zur Minimierung Oxidation ungesättigter Fettsäuren). </li><li> Vorheizen 2-Propanol-Lösung auf 85 ° C im Wasserbad. </li><li> Hinzuzufügen 12 ml heißem 2-Propanol-Lösungsmittel zu jedem Probenröhrchen und Hitze für 15 Minuten bei 85 ° C im Heizblock. Dieser Schritt inaktiviert Lipasen, die aus zerstörten Zellen freigesetzt werden können. </li><li> Lassen Rohre abkühlen auf Raumtemperatur und schleifen Gewebe gründlich mit Homogenisator, bis eine homogene Suspension entstanden ist. </li><li> Legen Sie die Proben in einem Orbitalschüttler und schütteln Sie für 1-2 Stunden bei 100 UpM und Raumtemperatur. </li><li> Zentrifugieren für 10 Minuten bei 800 xg und Überstand verwerfen. </li><li> Fügen Sie ein gleiches Volumen 2-Propanol und schütteln für 12 Stunden bei Raumtemperatur. </li><li> Zentrifugieren für 10 Minuten bei 800 xg und Überstand verwerfen. </li><li> In 12 ml CHCl 3: CH 3 OH (2: 1, v / v) bis zu dem Rest (25 ml pro g Probe) und schüttelt über Nacht bei 100 rpm und Raumtemperatur. </li><li> Zentrifugieren für 10 Minuten bei 800 xg und Überstand verwerfen. </li><li> Hinzuzufügen 12 ml CHCl 3: CH 3 OH (1: 2, v / v) bis Rest und schütteln über Nacht bei 100 rpm und Raumtemperatur. </li><li> Zentrifugieren für 10 Minuten bei 800 xg und Lösungsmittel zu entfernen. </li><li> Lassen Proben trocknen unter Abzug Nacht bei Raumtemperatur. </li><li> Der Luft trocknen den Rückstand und legen Sie dann in einem Vakuumexsikkator über wasserfreiem CaCl 2 oder CaSO 4 bis zur Gewichtskonstanz (3-5 Tage) erreicht ist. </li></ol> 2. Depolymerisation: Methanolyse mit Natriummethoxid (Abbildung 2) ACHTUNG: Führen Sie die Schritte 2,3 bis 2,4, 2,7 bis 2,8, 2,10 bis 2,11, 2,13 bis 2,15 und 2,17 bis 2,18 unter Abzug; immer tragen Laborkittel, Schutzhandschuhe und Spritzschutzbrille. <ol><li> Vorheizwärmetauscher Block auf 60 ° C. </li><li> Wiegen Teströhrchen mit dem trockenen Rückstand (wichtig für die weiteren Berechnungen). </li><li> In internen Standards in jedes Röhrchen: 25 &amp; omega; L Methyl heptadecanoate (1 mg / ml Stamm) und 25 &amp; mgr; l ω-Pentadecalacton (1 mg / ml Stamm). </li><li> In 0,9 ml Essigsäuremethylester, 1,5 ml Natriummethylat und 3,6 ml Methanol zu jedem Röhrchen und diese abschließen. Alternativ bereiten eine Reaktionsmischung mit diesen drei Reagenzien und fügen 6-ml-Teilmengen zu jeder Probe. </li><li> Wärme Proben für 2 Stunden bei 60 ° C und Vortex periodisch in Intervallen von 15 min. </li><li> Lassen Proben abkühlen auf Raumtemperatur. </li><li> 10 ml Methylenchlorid (CH 2 Cl 2) und 1,5 ml Eisessig, um die Fettsäuremethylester zu extrahieren. </li><li> In Kochsalzlösung (0,5 M NaCl) in jedes Röhrchen und Kappe zu füllen. </li><li> Wirbel Proben für 1 min und zentrifugieren für 10 min bei 800 x g. </li><li> Übertragen Sie die organische Phase (unten) bis mittlere saubere Röhrchen (16 x 125 mm Glasröhrchen mit PolyTetrafluorethylen (PTFE) -Flächen Schraubkappe). </li><li> In Kochsalzlösung (0,5 M NaCl) in jedes Röhrchen und Kappe zu füllen. </li><li> Wirbel Proben für 1 min und zentrifugieren für 10 min bei 800 x g. </li><li> Entfernen wässrige (obere) Phase und wiederholen Sie die Schritte von 2,11 bis 2,12. </li><li> Entfernen Sie das gesamte wässrige (obere) Phase. </li><li> Wasserfreies Natriumsulfat (Na 2 SO 4) zu dem Lösungsmittel, Verschließe die Röhrchen und Wirbel für 1 min; Proben können nun bis zum nächsten Tag gelassen werden. An dieser Stelle Proben können über Nacht im Abzug belassen werden. </li><li> Zentrifugieren für 2 Minuten bei 800 · g, um die Na &amp; sub2; SO &amp; sub4; -Salz im Boden zu verdichten. </li><li> Übertragen Sie die organische Phase zu einem kleinen Glaseinwegrohr (13 x 100 mm Glasröhrchen mit Polytetrafluorethylen (PTFE) -Flächen Schraubkappe). </li><li> Man dampft das Lösungsmittel zur Trockene unter Stickstoff und fahren mit dem Derivatisierungsschritt. Wenn nicht sofort verarbeitet, eingedampft Proben bei -20 ° C (Proben kann eine sein,lso vor dem Verdampfungsschritt gespeichert). </li></ol> 3. Herstellung von Derivaten für die Gaschromatographie ACHTUNG: Führen Sie die Schritte 3.1.2 und 3.1.5 - 3.1.8 unter einer Abzugshaube; immer tragen Laborkittel, Schutzhandschuhe und Spritzschutzbrille. <ol><li> Trimethylsilylderivate <ol><li> Vorheizwärmetauscher Block auf 100 ° C. </li><li> 100 ul Pyridin und 100 ul BSTFA (N, O-Bis-trimethylsilyl trifluoracetamid) in jedes Röhrchen und diese abschließen. </li><li> Wärme Proben bei 100 ° C für 10 min. </li><li> Lassen Proben abkühlen auf Raumtemperatur. </li><li> Verdampfen Proben unter Stickstoff bei Raumtemperatur. Vermeiden Sie die Anwendung von Wärme, um Proben, sind Monomere sehr volatil in diesem Stadium. </li><li> Gib 500 ul einer 1: 1 (V / V) Heptan: Toluol. </li><li> Wirbel Proben für 1 min und zentrifugieren für 2 min bei 800 x g. </li><li> Proben, die GC-Vials hinzufügen und fahren Sie mit GC / MS-Analyse. </li></ol></li><li> AcetylDerivate Hinweis: Zur Acetylierung ändern Schritte 3.1.1-3.1.3 oben wie folgt (nicht im Video gezeigt); Schritte 3.1.4-3.1.8 sind die gleichen: <ol><li> Vorheizwärmetauscher Block auf 60 ° C. </li><li> 100 ul Pyridin und 100 ul Essigsäureanhydrid (Ac 2 O) in die Röhrchen. </li><li> Wärme Proben 1 Stunde bei 60 ° C. </li></ol></li></ol> 4. GC / MS-Analyse <ol><li> Verwenden Sie ein HP-5-Kapillarsäule (30 mx 0,25 mm x 0,25 um Filmdicke) oder gleichwertig (dh., 5% Diphenyl, 95% Dimethylpolysiloxan). Programmieren Sie die GC mit Helium-Trägergasstrom von 1,5 ml / min eingestellt und die Ofentemperatur von 150 bis 300 ° C bei 3 ° C / min programmiert. </li><li> Verwenden Teileinspritzung (Splitverhältnis 1:10), und legen Massenspektrometer-Modus über 40 bis 600 amu (Elektronenstoß-Ionisation) scannen. </li><li> Erstellen Sie eine Sequenztabelle einschließlich Lösungsmittel (blank), WT und Mutanten-Wiederholungen, jeder mit dem angegebenen Cutin Analyseverfahren. </li><li> Last Lösungsmittelund Probenfläschchen auf dem Karussell, fügen Hexan Spritzenspülung Fläschchen in den Autosampler wenn nötig, und starten Sie die Sequenz. Nachdem die Sequenz vollendet ist, sind insgesamt Ionenchromatogramm Spuren für alle Proben zur Verfügung. </li></ol> 5. Datenanalyse <ol><li> Identifizieren Lipid-Polyester-Monomere durch den Vergleich der einzelnen Spitzenmassenspektrum zu veröffentlichten Massenspektren oder durch die Suche Kommerzielle Bibliothek, falls verfügbar. </li><li> Für jedes identifizierte Peak im Gesamtionenstrom-Chromatogramm, verwenden ihre jeweiligen Retentionszeiten, die Bereiche auf der Integrationsergebnisse Tabelle aus der GC / MS-Software (Supplemental Abbildung 1) zu finden. </li><li> Für jedes Monomer (Spalten AB), fügen Sie die Bereichswerte im Integrationstabelle (Supplemental Abbildung 1, Spalte D) festgestellt, dass die entsprechende Spalte für jeden replizieren Probe in der Excel-Tabelle von Monomeren (Supplemental Datei 2, Spalten CF), das ist eine Tabellenkalkulation, um Arabidopsis zu quantifizierenCutin TMSi Derivate. Verwenden STADT Datei-3, wenn acetylierten Derivaten anstelle vorbereitet. </li><li> Fügen die Bereiche der internen Standards (IS) an den IS-Säulen (HK). Für jene Monomere, die nicht derivatisiert sind, nämlich Fettsäuremethylester (FAME) und Dicarbonsäuredimethylester (DCA DME), verwenden 17: 0 FAME (IS1), wie es für die Quantifizierung (violett schattierten Zellen in der Monomer-Tabelle; Supplemental Files 3.2). Für hydroxylierten Monomeren, einschließlich primäre Alkohole, Ferulasäure und ω-Hydroxysäuren, verwenden 15: 0 15-Hydroxy FAME (IS2), wie der Wahl für die Verbindung, die Quantifizierung (grün-shadded Zellen in der Monomer-Tabelle; Zusatzdateien 2/3) . </li><li> In trockenen Flügelgewicht für jede Wiederholung, um Spalten AX-BA (Supplemental Datei 2) oder AQ-AT (Supplemental Datei-3); Alternativ scannen Blätter Flächen berechnen und fügen Bereich Werte in das Monomer Tabelle Monomers Lasten pro Einheit zum Ausdruck bringenOberfläche. </li></ol>

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No conflicts of interest declared.

Im Gegensatz zu anderen Biopolymeren wie DNA und Proteine ​​werden Pflanzenlipid Polyester nicht aus einer Vorlage hergestellt. Stattdessen ihre Kompositionen sind abhängig von der Spezifität der in den Geweben, die diese extrazellulären Polymeren machen vorhandenen Enzyme. Als solche chemischen Analysen der einzelnen Komponenten sind wichtig, um Lipidpolyestermasse zu verstehen. Chemische Verfahren, um Esterbindungen zu spalten, umfassen Verseifung, Hydrogenolyse, sauer katalysierte Transmethylierung und basenkatalysierte Trans 2. Jede von ihnen hat Vorteile und Nachteile. Verseifung produziert freie Fettsäure-Hydroxy-Säuren, die Nebenreaktionen eingehen können. Hydrogenolyse mit Lithiumaluminiumhydrid (LiAlH 4) 16 für Cutin Analyse 7 verwendet. Hydrogenolyse reduziert funktionalisierten Kohlenstoffatomen zu Alkoholen und die ursprünglichen Strukturen müssen durch deuteriolysis mit Lithiumaluminiumdeuterid (LiAlD 4) zu entnehmen. DasNachteil dieser Vorgehensweise ist das Erfordernis hoher Auflösung GC / MS, den Grad der Deuterierung der Fett Polyolen Zuordnungen ihrer Strukturen bilden zu vergleichen. Säure-katalysierte Umesterung mit methanolischer Bortrifluorid (BF 3) ist mehrfach in Cutin und Suberin Depolymerisationen 8,17,18 verwendet, aber das Reagenz hat eine begrenzte Lagerfähigkeit und kann zu Artefakten aufgrund von Reaktionen 15 her einzuführen. Methanolischer Schwefelsäure ergibt auch Methylester von den Monomeren, aber mit größeren Anteilen von 2-Hydroxy-Fettsäuren, die vermutlich nicht wahr sind Lipidpolyesterkomponenten im Vergleich zu anderen Verfahren 10. Die in diesem Protokoll beschrieben NaOMe-katalysierten Umesterungsverfahren produziert Fettsäuremethylester, die durch Silylierung der Hydroxylgruppen derivatisiert sind, wodurch charakteristische Massenspektren zur Identifizierung oder durch Acetylierung, stabilere Derivate von Hydroxylgruppen fo liefernr Quantifizierung. Ein Nachteil dieser Technik ist, dass die Hydrolyse in Konkurrenz Umesterung, wenn Wasser in der Reaktion vorhanden ist. Wasser reagiert mit NaOMe (den Katalysator) und erzeugt NaOH, was wiederum hydrolysiert Fettsäuremethylestern zu freien Säuren (2D) zu erhalten. Dies ist eine unerwünschte Nebenreaktion, weil zwei Peaks für jede Fettsäure vorhanden sein: einem Methylester und einem TMSi Esterderivat, so verkomplizieren die Analyse. Verwendung von wasserfreien Reagenzien und Zugabe von Methylacetat als ein Co-Lösungsmittel mit Verseifung konkurrieren somit entscheidenden Schritte zur Hydrolyse (2D) zu verhindern. Cutin und Suberin enthalten zwischen 1 und 26% Glycerin 4. Jedoch wird dieses Monomer nicht durch die in diesem Protokoll beschriebenen Versuchsbedingungen festgestellt werden. Glycerin ist stark hydrophil und im Gegensatz zu den Fettsäuremethylester-Monomeren, während das wässrige Lösungsmittel-Waschschritte eliminiert werden. Diese Einschränkung auch einpplies zu anderen Cutin Depolymerisationsverfahren, aber Glycerin in der wässrigen Phase nach der Umesterung unter Verwendung eines enzymatischen Verfahrens erhalten bestimmt werden. Alternativ kann sie unter Verwendung von milderen Bedingungen ohne weitere Wasserentnahme quantifiziert werden (z. B. 0,05 M NaOMe), um alle Monomere zu detektieren, einschließlich Glycerin 19,20 .Obwohl zwecks Quantifizierung Glycerin nützlich milden Bedingungen in der Regel geben unvollständige Depolymerisation von Cutin und Suberin. Wenn ein GC zu einem Flammenionisationsdetektor (FID) angeschlossen ist, verfügbar sind, können alle Wiederholungen in diesem Instrument zur quantitativen Zwecken ausgewertet werden, wonach Peaks einer repräsentativen Probe wurden durch GC / MS identifiziert. Alternativ können Monomere in den GC / FID Spuren identifiziert, wenn ihre Retentionsindizes bekannt sind. Der Flammenionisationsdetektor eine besonders hohe Empfindlichkeit und eine breite Palette der Verhältnismäßigkeit, der entscheidend für die Quantifizierung von größeren und kleineren Probenkomponenten istin einzelnen Läufen. Darüber hinaus ist es robust und einfach zu warten und zu bedienen 15. Das beschriebene Protokoll ermöglicht die zuverlässige und reproduzierbare Isolierung, Identifizierung und Quantifizierung von pflanzlichen Lipid Polyestermonomere, wodurch die chemische Charakterisierung der Mutanten, die in der Zusammensetzung von einer oder mehreren Lipid Polyestermonomere abweichen. Das Verfahren ist skalierbar und kann leicht angepasst werden, um sowohl kleine als auch größere Mengen von verschiedenen Pflanzenmaterialien, einschließlich Wurzeln, Samen, Blätter, Stängel und Blüten zu verarbeiten. Massenspektraldaten von Lipid Polyestermonomere aus vielen Spezies wurden veröffentlicht z. B. 21-26 und stellen wertvolle Mittel zur unbekannten Monomere zu identifizieren, wenn eine Anpassung dieses Protokoll auf andere Gewebe und / oder Spezies. Dieses Verfahren ist anwendbar auf Untersuchungen der Biosynthese, Regelung und Verteilung von Lipid Polyestern in höheren Pflanzen.

Gefäßpflanzen verlassen sich auf extrazellulären Schichten, die als wasserdichte Barrieren zwischen Pflanzengewebe und der äußeren Umgebung zu funktionieren. Diese lipophilen Zellwand-assoziierten Strukturen beschränken pathogenen Infektionen und regulieren den passiven Transport von Gasen, Wasser und gelöste Stoffe in und aus Pflanzengeweben 1. Solche Barrieren sind die Kutikula, einem synapomorphic Struktur einzigartige Pflanzen 2 und verschiedenen Suberin haltigen Diffusionsbarrieren. Das Häutchen eine oleophile Schicht durch epidermale Zellen synthetisiert und an sie gebunden über eine pektinösen Schicht auf der extrazellulären Seite der Zellenwand 3-5. Er umhüllt die primären Luft Organe höherer Pflanzen, die als eine vitale Schnittstelle zwischen Pflanzengewebe und die Umwelt. Cutin, die Strukturmatrix der Kutikula und Suberin gibt zwei unlöslichen Glycerolipid Polyester mit Lösungsmittel extrahierbaren Wachse 2,4 verbunden. Diese polymeren lipids sind aus gesättigten und ungesättigten Fettsäurederivaten besteht und sowohl strukturell als auch funktionell ähnlich. Jedoch sind sie unterscheidbar durch charakteristische Unterschiede in der chemischen Zusammensetzung und die Abscheidungsstellen. Suberin ein aliphatischer Polyester ist in den Zellwänden bestimmter äußeren und inneren Geweben Bildung einer Sekundärwand. Korkartige Gewebe schließen periderms von Wurzeln, Knollen und Baumrinde, Wurzeln Endodermis, Samenschale Schichten und geheilten Wunden 2. Im Gegensatz Cutin, Suberin enthält der Polyester in der Regel Alkohole, gesättigte und mono-ungesättigten Dicarbonsäuren, und einen großen Anteil der sehr langkettigen Monomeren (C≥20). Cutin ist das häufigste Lipid Polyester in Gefäßpflanzen 6 und wird von Glycerin und C16-C18 umgeesterten Fettsäurederivate wie Hydroxy und Hydroxy-Epoxy-substituierten Fettsäuren 4 besteht. Während die Zusammensetzung der Cutin Polymerenvariiert über tracheophyte Arten, die vorherrschende Primär Monomere sind 10, 16-Dihydroxy 16: 0, 18-Hydroxy-9,10-Epoxy-18: 0 und 9,10,18-Trihydroxy 18: 0-Fettsäuren. 2 Dicarbonsäure 7,8: Interessant ist, dass Arabidopsis Blatt und Stamm Cutin hauptsächlich aus 18 zusammengesetzt ist. Pflanzen cuticles präsentieren auch eine beträchtliche Variabilität in der Dicke im Bereich von wenigen Nanometern bis einigen Mikrometern. 9 Da Kutikula Isolation ist ein mühsamer und zeitraubender Schritt, insbesondere für sehr dünne Blatt cuticles wie die von Arabidopsis thaliana 8. Verfahren, die Kutikula Isolierung umgehen, wurden entwickelt und validiert 7,8. Hier beschreiben wir ein ausführliches Protokoll, um die Monomerzusammensetzung von Cutin in Arabidopsis thaliana Blätter von Natriummethylat (NaOMe) -katalysierte Depolymerisation und anschließender Gaschromatographie / Massenspektrometrie (GC / MS) Analyse zu studieren. Dieses Protokoll bietet eine robuste Methode zur Untersuchung der ZusammenarbeitmPosition von Pflanzenlipid Polyester ganz delipidiertem Gewebe und hat sich von früher berichteten Protokolle 7,10,11 angepasst. Whole Gewebeproben werden zunächst homogenisiert und abschließend delipidierten, Entfernen von Lösungsmittel extrahierbaren Lipide einschließlich Kutikula und epikutikulären Wachse, Membranlipiden und Triacylglyceride. Zellwand-angereicherten Reste werden dann von Natriummethoxid-katalysierten Methanolyse in ihre konstituierenden Methylester-Monomeren depolymerisiert. Fettsäuremethylester werden nach Ansäuerung extrahiert, derivatisiert werden, um ihre entsprechenden Trimethylsilyl oder Acetyl-Derivaten erhalten. Derivatisierte Reste sind stark flüchtig und können aus einer Gaschromatographiesäule zu einem angemessenen Temperatur ohne Veränderung ihrer strukturellen Konformation während der GC / MS-Analyse eluiert werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1105">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Chemicals</td>
			<td style="width:228px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">2-propanol</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">BPA451-4</td>
			<td style="width:301px;">Solvent for delipidation</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Anhydrous sodium sulfate</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">S421500</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Acetic anhydride</td>
			<td style="width:228px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">320102</td>
			<td style="width:301px;">Derivatization agent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">BSTFA (N,O-bis(trimethylsilyl)-trifluoroacetamide)</td>
			<td style="width:228px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">15222</td>
			<td style="width:301px;">Derivatization agent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Butylated hydroxytoluene (BHT)</td>
			<td style="width:228px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">101162</td>
			<td style="width:301px;">Antioxidant</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Calcium chloride, anhydrous</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">C614-3</td>
			<td style="width:301px;">Desiccation agent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Calcium suflate, anhydrous (DRIERITE- 8 MESH with indicator)</td>
			<td style="width:228px;">Acros Organics</td>
			<td>219090020</td>
			<td style="width:301px;">Desiccation agent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Chloroform (Trichloromethane)</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">C6074</td>
			<td style="width:301px;">Organic solvent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Glacial acetic acid</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">BP2401212</td>
			<td style="width:301px;">Acidification agent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Helium carrier gas, compressed</td>
			<td style="width:228px;">Air Liquide</td>
			<td style="width:153px;">ALPHAGAZ1-UN1046</td>
			<td style="width:301px;">Carrier gas, GC/MS</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Heptane</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">H3501</td>
			<td style="width:301px;">Organic solvent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Hexanes</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">H3024</td>
			<td style="width:301px;">Organic solvent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Methanol</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">A4124</td>
			<td style="width:301px;">Organic solvent, transmethylation reactive</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Methyl acetate</td>
			<td style="width:228px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">296996</td>
			<td style="width:301px;">Organic solvent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Methyl heptadecanoate</td>
			<td style="width:228px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">H4515</td>
			<td style="width:301px;">Internal standard (1mg/mL stock)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Methylene dichloride (Dichloromethane)</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">D374</td>
			<td style="width:301px;">Organic solvent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Nitrogen, compressed</td>
			<td style="width:228px;">Air Liquide</td>
			<td style="width:153px;">ALPHAGAZ1-UN1044</td>
			<td style="width:301px;">Carrier gas, GC-FID</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Pentadecanolactone</td>
			<td style="width:228px;">Fluka</td>
			<td style="width:153px;">76530</td>
			<td style="width:301px;">Internal standard (1 mg/mL stock)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Pyridine</td>
			<td style="width:228px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">270970</td>
			<td style="width:301px;">Co-solvent for derivatization</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">BP358212</td>
			<td style="width:301px;">Saline solution</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Sodium methoxide (25wt.%)</td>
			<td style="width:228px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">156256</td>
			<td style="width:301px;">Nucleophile</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Toluene</td>
			<td style="width:228px;">FIsher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">T2904</td>
			<td style="width:301px;">Organic solvent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Plant Growth Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:423px;">Pro-Mix PGX</td>
			<td>Premier Tech Horticulture Ltd</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;">Pro-Mix PGX is recommended to grow Arabidopsis plants (Eddy, R. and Hahn, D.T., 2012,http://docs.lib.purdue.edu/pmag/2) 
			Purdue Methods for Arabidopsis Growth.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">PermaNest Humidity Dome&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Grower&#39;s Solution, LLC, Cookeville, TN&#160;</td>
			<td style="width:153px;">GD2211-24</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">Perma-Nest Plant Trays (22x11in)</td>
			<td style="width:228px;">Grower&#39;s Solution, LLC, Cookeville, TN&#160;</td>
			<td style="width:153px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">Square greenhouse pots, 3.5 inch&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Grower&#39;s Solution, LLC, Cookeville, TN&#160;</td>
			<td style="width:153px;">P86</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:423px;">General Purpose Plant Fertilizer, Plant-Prod 20-20-20</td>
			<td style="width:228px;">Premier Tech Home and Garden In., Brantford, ON</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glassware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:423px;">13 x 100 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap</td>
			<td style="width:228px;">Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td>
			<td style="width:153px;">45066A-13100</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:423px;">16 x 125 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap</td>
			<td style="width:228px;">Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td>
			<td style="width:153px;">45066A-16125</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:423px;">20 x 125 mm glass test tubes with Teflon-faced screw cap</td>
			<td style="width:228px;">Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td>
			<td style="width:153px;">45066A-20125</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">GC vial caps</td>
			<td style="width:228px;">National Scientific</td>
			<td style="width:153px;">C400051A</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">GC vial microinserts</td>
			<td style="width:228px;">National Scientific</td>
			<td style="width:153px;">C4011631</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">GC vials</td>
			<td style="width:228px;">National Scientific</td>
			<td style="width:153px;">C40001</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Disposable pasteur pipets</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">1367820B</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Flasks</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Allegra X15R centrifuge</td>
			<td style="width:228px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Analytic balance</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:423px;">Belly dancer</td>
			<td style="width:228px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;">A shaker can be used for this purpose if Belly Dancer not available</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">DB-5 Capillary GC column</td>
			<td style="width:228px;">J&#38;W Scientific, CA, USA;&#160;</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;">30 m x 0.25 mm x 0.25 &#956;m film thickness</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Desiccator</td>
			<td style="width:228px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Isotemp 202 water bath</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">ISQ LT single quadupole mass spectrometer</td>
			<td style="width:228px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Heat block</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Nitrogen evaporator</td>
			<td style="width:228px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Polytron homogenizer</td>
			<td style="width:228px;">Birkmann</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Trace 1300 gas chromatograph</td>
			<td style="width:228px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Two-stage regulator</td>
			<td style="width:228px;">Air Liquide</td>
			<td style="width:153px;">Q1-318B-580</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Vacuum desiccator</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and compositional analysis of plant cuticle lipid polyester monomers

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester of glycerol and modified fatty acids that constitutes the framework of the cuticle that covers aerial plant surfaces. Suberin is a related lipid polyester that is deposited on the cell walls of certain tissues, including the root endodermis and the periderm of tubers, tree bark and roots. These lipid polymers are highly variable in composition among plant species, and often differ among tissues within a single species. Here, we describe a detailed protocol to study the monomer composition of cutin in Arabidopsis thaliana leaves by sodium methoxide (NaOMe)-catalyzed depolymerisation, derivatization, and subsequent gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS) analysis. This method can be used to investigate the monomers of insoluble polyesters isolated from whole delipidated plant tissues bearing either cutin or suberin. The method can by applied not only to characterize the composition of lipid polymers in species not previously analyzed, but also as an analytical tool in forward and reverse genetic approaches to assess candidate gene function.

Die in dieser Handschrift beschriebenen Protokoll wird bis zu Lipid Polyester-Monomere bestimmen, eingestellt und minimiert die Beiträge von Nicht Cutin Lipide 10 Abbildung 1 zeigt einen Überblick über den Test, die insgesamt dauert zwischen 8 (dh Cutin oder Suberin.) -. 10 Tage (von der ersten Gewebeernte auf den Erhalt GC-Daten), je nachdem wie lange Proben trocknen gelassen. Der ausgewählte basenkatalysierte Methanolyse (Abbildung 2) Verfahren, um Polyester zu depolymerisieren, wurde zuvor für Arabidopsis Samen, die sowohl Cutin und Suberin enthalten validiert. Die Gewebe werden zuerst homogenisiert und abschließend delipidierten um Lösungsmittel extrahierbaren Lipide zu entfernen. Der Rückstand Ausbeute nach der Extraktion, als Prozentsatz der anfänglichen Frischgewicht, ist in der Regel 6% für A. thaliana Col-0 Blättern. Zellwand angereicherte Reste sind in einem Vakuumexsikkator getrocknet und dann durch in ihre konstituierenden Methylester-Monomeren depolymerisiertbasenkatalysierte Trans. Zweistündigen Inkubation wurde als die kritische Zeit für die ordnungsgemäße Depolymerisation und Rückgewinnung von Lipid-Polyester-Komponenten erforderlich gewählt. Längere Inkubationszeiten führten zu einer Zunahme der 2-Hydroxysäuren; diese möglicherweise stammen aus Membran Sphingolipide 10. Ein typisches Chromatogramm, wenn Arabidopsis-Wildtyp Blatt Cutin ist in Abbildung 3 gezeigt, für O -TMSi-Derivate (3A) und O-Acetyl-Derivate (3B). Jeder Peak wurde durch Vergleich mit Massenspektren aus der Literatur 7,8 und einer öffentlichen Datenbank 12 .Our Video-Protokoll zeigt, wie TMSi Derivate herzustellen identifiziert, aber Proben kann alternativ acetylierte Hydroxylgruppen derivatisieren. Silylierte Derivate sind gut für Identifikationszwecke, weil sie geben Diagnose-Massenspektren. Jedoch acetylierten Derivaten stabiler und eine gute Alternative zur Silylierungeinmal Monomere wurden identifiziert 10. , Zur Verwirklichung dieses Protokolls in den Labors, die nur GC Flammenionisationsdetektor (FID) gekoppelt ist, GC / FID Spuren entsprechend acetylierte Derivate von WT Blatt Cutin Monomeren und zu einem Homolog Reihe von Fettsäuremethylester-Standards werden auch gezeigt (Supplemental Abbildung 4). Diese Methode ist qualitative und quantitative erkennt Unterschiede zwischen Proben, daher der Wert für Mutanten-Analyse. Die Mengen der einzelnen Monomeren werden nach der Methode des internen Standards zur Quantifizierung, dass sie Vergleiche von Monomer Fluss zwischen den Proben bestimmt. Es sollte klargestellt werden, jedoch, dass die Spitzengröße (total ion counts) möglicherweise nicht die Molverhältnisse der Monomeren in der Polyester reflektieren. Wir sind inklusive editierbare Tabellen von Monomeren zu Monomermengen in Arabidopsis Blatt Cutin als Fettsäuremethylester und TMSi Derivate (Supplemental Datei 1), oder Ass berechnen<html> tyl-Derivate (Supplemental Datei 2) von Alkoholen. Diese Tabellen müssen möglicherweise angepasst werden, wenn Proben aus verschiedenen Organen oder Pflanzen extrahiert werden. Als Beispiel haben wir analysiert haben Arabidopsis Thalia na Columbia (Col-0) Wildtyp-Blätter und zwei bisher dadurch Null-Mutante Allele des CYP86A2 / ATT1 Gen att1-1 (m-1) und att1-2 (m-2 ) 13,14. Cytochrom-P450-Monooxygenasen der CYP86A Familie codieren vermeintliche ω-Oxydasen und beteiligen sich an Suberin und Cutin Monomer-Biosynthese. Die Ergebnisse (Figur 4) zeigen, signifikante Verringerungen in den Lasten der drei Hauptlipid Monomere in den mutierten Blätter im Vergleich zu WT-Blätter. In Übereinstimmung mit vorhergesagten Funktion des Enzyms, 16: 0, 18: 2 und 18: 1 Dicarboxylate sind speziell in att1 Mutanten beeinflusst. &quot;Src =&quot; / files / ftp_upload / 53.386 / 53386fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1. Übersicht über die Lipid Polyester-Analyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig2.jpg" /> Figur 2. Mechanismus der NaOMe-katalysierte Transmethylierung Reaktion. Die nucleophilen Methoxidanion greifen die Carbonyl Kohlen von Lipid Polyester eine instabile tetraedrische Zwischenprodukt (A), die leicht dissoziiert in Fettsäuremethylester und Alkoholat-Anionen (B) zu bilden. Diese Alkoholate sind konjugierte Basen, und zur Reaktion mit Methanol, die Regenerierung der katalytisch aktiven Methoxidanion dadurch erhalt zusätzliche Depolymerisationsreaktionen (C). Wenn Wasser in die GegenwartSystem, wird es mit Natriummethoxid reagieren, um Natriumhydroxid, eine starke Basis, die irreversibel hydrolysiert Ester, um unerwünschte freie Fettsäuren produzieren zu bilden. Essigsäuremethylester wird als Co-Lösungsmittels 15 hinzugefügt, um kleine Mengen von Natriumhydroxid innerhalb des Systems (D) entfernen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig3.jpg" /> Abbildung 3. Repräsentative Gesamt Ionenchromatogramm von Wildtyp-Arabidopsis thaliana Blatt Cutin Monomeren. (A) O -trimethylsilyl (TMSi) ether und (B) Acetat-Hydroxyl-Derivate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> </a&gt; <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig4.jpg" /> Abbildung 4. Cutin Monomerzusammensetzung von Arabidopsis thaliana WT und zwei Nullmutante Allele des CYP86A2-Gen. (Mutante-1 = att1-1; Mutant 2 = att1-2) Fehlerbalken stellen die Standardabweichung vom Mittelwert (n = 4) . Ab 13 angepasst ist, mit Erlaubnis von © Blackwell Publishing (2007). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig1.jpg" /> STADT Abbildung 1. Peak-Integrationsergebnisse Tabelle aus der GC / MS-Software. Peaks entsprechend dem ermittelten Monomere und internen Standards werden durch ihre retenti identifiziert<html> pünktlich (Spalte C) und Flächenwerte sind in der Spalte tabellarisch D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_Figure_1.tif" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig2.jpg" /> STADT Datei 2. Inhalts Arabidopsis Cutin Monomere (Trimethylsilylether-Derivate der Hydroxy-Fettsäuremethylester). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_File_2_Cutin_template_TMSi.xls" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig3.jpg" /> Zusätzliche Datei 3. Tabelle Arabidopsis Cutin Monomere (O-Acetyl-Derivate der Hydroxy-Fettsäuremethylester).com / files / ftp_upload / 53.386 / Supplemental_File_3_Cutin_template_Acetylated_derivatives.xlsx &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig4.jpg" /> STADT Abbildung 4. GC / FID Spuren von (AB) Fettsäuremethylester (FAME) Retentionsindex-Standards (Peaks werden mit jedem gesättigten FAME Kettenlänge bezeichnet); und (C) acetyliert A. thaliana WT Blatt Cutin Monomeren. Zahlen Sie auf Spitzen entsprechen: 16: 0 FAME (1), Ferulat (2), 18: 3 FAME (3), 18: 1/18: 2 FAME (4), 18: 0 FAME (5), Sinapinsäure (6 ), 16: 0 DCA (7), 16-OH 16: 0 FAME (8), 18: 2 DCA (9), 18: 1 DCA (10) 18: 0 DCA (11), 18-OH-18: 2 FAME (12), 18-OH 18: 1 FAME (13), 20: 0 FAME (14), 10,16-Dioh 16: 0 FAME (15), 24: 0 FAME (16). DCA: dicarbonsäuredimethylester; FAME: Fettsäuremethylester; IS1: interner Standard 1, 17: 0 FAME; IS2: Innen standard 2, 15-OH 15: 0 FAME. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_Figure_4.tif" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

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Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers

Lipid polyesters constitute the structural components of two cell wall modifications, the plant cuticle and suberin-containing diffusion barriers. In this video, we describe a method to depolymerize cutin from whole delipidated leaves. The method can be applied to investigating mutants compromised in either cutin or suberin biosynthesis.

Isolierung und Analyse der Zusammensetzung von Pflanzen Cuticle Lipid Polyester Monomere

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester ...

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Research

JoVE Journal

Biology

16.6K Aufrufe.  Algoma University. Lipid polyesters constitute the structural components of two cell wall modifications, the plant cuticle and suberin-containing diffusion barriers. In this video, we describe a method to depolymerize cutin from whole delipidated leaves. The method can be applied to investigating mutants compromised in either cutin or suberin biosynthesis.

Serie: Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers

Use of Arabidopsis eceriferum Mutants to Explore Plant Cuticle Biosynthesis

The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation, but is also an important barrier against the entry of pathogenic microorganisms.  The cuticle is made up of a tough crosslinked polymer called "cutin" and a protective wax layer that seals the plant surface.  The waxy layer of the cuticle is obvious on many plants, appearing as a shiny film on the ivy leaf or as a dusty outer covering on the surface of a grape or a cabbage leaf thanks to light scattering crystals present in the wax.  Because the cuticle is an essential adaptation of plants to a terrestrial environment, understanding the genes involved in plant cuticle formation has applications in both agriculture and forestry. Today, we'll show the analysis of plant cuticle mutants identified by forward and reverse genetics approaches.


The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation but is also an important barrier against the entry of pathogenic microorganisms. In this video, we demonstrate the analysis of plant cuticle mutants identified by forward and reverse genetics approaches.

Verwendung von Arabidopsis-Mutanten zu eceriferum Kutikula Biosynthese entdecken

The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation, but is also an important barrier against the entry of ...

Forschung

Biologie

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and genetics because of its simple life cycle, ease of growth and manipulation for genetic analysis, genomic resources, and transformability of the nucleus and both organelles. Mating strains is a common practice when genetic approaches are used in Chlamydomonass, to create vegetative diploids for analysis of dominance, or following tetrad dissection to ascertain nuclear vs. organellar inheritance, to test allelism, to analyze epistasy, or to generate populations for the purpose of map-based cloning. Additionally, genetic crosses are routinely used to combine organellar genotypes with particular nuclear genotypes. Here we demonstrate standard methods for gametogenesis, mating, zygote germination and tetrad separation. This protocol consists of an easy-to-follow series of steps that will make genetic approaches amenable to scientists who are less familiar with Chlamydomonas. Key parameters and trouble spots are explained. Finally, resources for further information and alternative methods are provided.

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Mating and tetrad separation are required for genetic analysis in Chlamydomonas reinhardtii. Here we demonstrate standard methods for gametogenesis, mating, zygote germination and tetrad dissection. This protocol consists of an easy-to-follow series of steps that will make genetic approaches amenable to scientists who are less familiar with Chlamydomonas.

Paarung und Tetrad Trennung von Chlamydomonas reinhardtii Für genetische Analysen

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part I: Lignin

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st century. This has rekindled interest in the use of plant products as industrial raw materials for the production of liquid fuels for transportation1 and other products such as biocomposite materials7. Plant biomass remains one of the greatest untapped reserves on the planet4. It is mostly comprised of cell walls that are composed of energy rich polymers including cellulose, various hemicelluloses (matrix polysaccharides, and the polyphenol lignin6 and thus sometimes termed lignocellulosics. However, plant cell walls have evolved to be recalcitrant to degradation as walls provide tensile strength to cells and the entire plants, ward off pathogens, and allow water to be transported throughout the plant; in the case of trees up to more the 100 m above ground level. Due to the various functions of walls, there is an immense structural diversity within the walls of different plant species and cell types within a single plant4. Hence, depending of what crop species, crop variety, or plant tissue is used for a biorefinery, the processing steps for depolymerization by chemical/enzymatic processes and subsequent fermentation of the various sugars to liquid biofuels need to be adjusted and optimized. This fact underpins the need for a thorough characterization of plant biomass feedstocks. Here we describe a comprehensive analytical methodology that enables the determination of the composition of lignocellulosics and is amenable to a medium to high-throughput analysis. In this first part we focus on the analysis of the polyphenol lignin (Figure 1). The method starts of with preparing destarched cell wall material. The resulting lignocellulosics are then split up to determine its lignin content by acetylbromide solubilization3, and its lignin composition in terms of its syringyl, guaiacyl- and p-hydroxyphenyl units5. The protocol for analyzing the carbohydrates in lignocellulosic biomass including cellulose content and matrix polysaccharide composition is discussed in Part II2.

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part I: Lignin

Plant biomass is a major carbon-neutral renewable resource that could be used for the production of biofuels. Plant biomass consists mainly of cell walls, a structurally complex composite material termed lignocellulosics. Here we describe a protocol for a comprehensive analysis of the content and composition of the polyphenolic lignin.

Umfassende Analyse der Zusammensetzung von pflanzlichen Zellwänden (Lignozellulose) Teil I: Lignin

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st century. This has rekindled interest in the use of plant products as industrial raw materials for the production of liquid fuels for transportation2 and other products such as biocomposite materials6. Plant biomass remains one of the greatest untapped reserves on the planet4. It is mostly comprised of cell walls that are composed of energy rich polymers including cellulose, various hemicelluloses, and the polyphenol lignin5 and thus sometimes termed lignocellulosics. However, plant cell walls have evolved to be recalcitrant to degradation as walls contribute extensively to the strength and structural integrity of the entire plant. Despite its necessary rigidity, the cell wall is a highly dynamic entity that is metabolically active and plays crucial roles in numerous cell activities such as plant growth and differentiation5. Due to the various functions of walls, there is an immense structural diversity within the walls of different plant species and cell types within a single plant4. Hence, depending of what crop species, crop variety, or plant tissue is used for a biorefinery, the processing steps for depolymerisation by chemical/enzymatic processes and subsequent fermentation of the various sugars to liquid biofuels need to be adjusted and optimized. This fact underpins the need for a thorough characterization of plant biomass feedstocks. Here we describe a comprehensive analytical methodology that enables the determination of the composition of lignocellulosics and is amenable to a medium to high-throughput analysis (Figure 1). The method starts of with preparing destarched cell wall material. The resulting lignocellulosics are then split up to determine its monosaccharide composition of the hemicelluloses and other matrix polysaccharides1, and its content of crystalline cellulose7. The protocol for analyzing the lignin components in lignocellulosic biomass is discussed in Part I3.

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part II: Carbohydrates

Plant biomass is a major carbon-neutral renewable resource that could be used for the production of biofuels. Plant biomass consists mainly of cell walls, a structurally complex composite material termed lignocellulosics. Here we describe a protocol for a comprehensive analysis of the content and composition of wall derived carbohydrates.

Umfassende Analyse der Zusammensetzung von pflanzlichen Zellwänden (Lignozellulose) Teil II: Kohlenhydrate

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

Effiziente und schnelle Isolierung von Frühphasen-Embryonen aus<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

Metabolische Markierung und Membran Fraktionierung für Vergleichende Proteomanalyse von<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Fahrwerk Zellkulturen

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex composition under different conditions. In this protocol the approach is demonstrated by comparing the composition of the protein complex responsible for cyclic electron flow (CEF) in Chlamydomonas reinhardtii, isolated from genetically different strains. The procedure comprises the isolation of thylakoid membranes, followed by their separation into multiprotein complexes by sucrose density gradient centrifugation, SDS-PAGE, immunodetection and comparative, quantitative mass spectrometry (MS) based on differential metabolic labeling (14N/15N) of the analyzed strains. Detergent solubilized thylakoid membranes are loaded on sucrose density gradients at equal chlorophyll concentration. After ultracentrifugation, the gradients are separated into fractions, which are analyzed by mass-spectrometry based on equal volume. This approach allows the investigation of the composition within the gradient fractions and moreover to analyze the migration behavior of different proteins, especially focusing on ANR1, CAS, and PGRL1. Furthermore, this method is demonstrated by confirming the results with immunoblotting and additionally by supporting the findings from previous studies (the identification and PSI-dependent migration of proteins that were previously described to be part of the CEF-supercomplex such as PGRL1, FNR, and cyt f). Notably, this approach is applicable to address a broad range of questions for which this protocol can be adopted and e.g. used for comparative analyses of multiprotein complex composition isolated from distinct environmental conditions.

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The described comparative, quantitative proteomic approach aims at obtaining insights into the composition of multiprotein complexes&#160;under different conditions and is demonstrated by comparing genetically different strains. For quantitative analysis equal volumes of different fractions from a sucrose density gradient are mixed and analyzed by mass spectrometry.

Ein neuer Ansatz für die vergleichende Analyse von Multiproteinkomplexen Basierend auf<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabolische Markierung und quantitative Massenspektrometrie

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force used to pump blood. Individual cardiomyocytes were first isolated over 40 years ago in order to better study the physiology and structure of heart muscle. Techniques have rapidly improved to include enzymatic digestion via coronary perfusion. More recently, analyzing the contractility and calcium flux of isolated myocytes has provided a vital tool in the cellular and sub-cellular analysis of heart failure. Echocardiography and EKGs provide information about the heart at an organ level only. Cardiomyocyte cell culture systems exist, but cells lack physiologically essential structures such as organized sarcomeres and t-tubules required for myocyte function within the heart. In the protocol presented here, cardiomyocytes are isolated via Langendorff perfusion. The heart is removed from the mouse, mounted via the aorta to a cannula, perfused with digestion enzymes, and cells are introduced to increasing calcium concentrations. Edge and sarcomere detection software is used to analyze contractility, and a calcium binding fluorescent dye is used to visualize calcium transients of electrically paced cardiomyocytes; increasing understanding of the role cellular changes play in heart dysfunction. Traditionally used to test drug effects on cardiomyocytes, we employ this system to compare myocytes from WT mice and mice with a mutation that causes dilated cardiomyopathy. This protocol is unique in its comparison of live cells from mice with known heart function and known genetics. Many experimental conditions are reliably compared, including genetic or environmental manipulation, infection, drug treatment, and more. Beyond physiologic data, isolated cardiomyocytes are easily fixed and stained for cytoskeletal elements. Isolating cardiomyocytes via perfusion is an extremely versatile method, useful in studying cellular changes that accompany or lead to heart failure in a variety of experimental conditions.

Individual cardiomyocytes from wild type and mutant mice can be isolated from the heart in order to study their contractility and calcium transients. This allows characterization of the contribution of cellular dysfunction to heart dysfunction from any cause.

Isolation und physiologische Analyse von Maus Kardiomyozyten

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while maintaining transparency of the visual axis. Perturbations to this delicate balance cause blinding illnesses, such as diabetic retinopathy. Therefore, the understanding of energy metabolism changes in the retina during disease is imperative to the development of rational therapies for various causes of vison loss. The recent advent of commercially-available extracellular flux analyzers has made the study of retinal energy metabolism more accessible. This protocol describes the use of such an analyzer to measure contributions to retinal energy supply through its two principle arms - oxidative phosphorylation and glycolysis - by quantifying changes in oxygen consumption rates (OCR) and extracellular acidification rates (ECAR) as proxies for these pathways. This technique is readily performed in explanted retinal tissue, facilitating assessment of responses to multiple pharmacologic agents in a single experiment. Metabolic signatures in retinas from animals lacking rod photoreceptor signaling are compared to wild-type controls using this method. A major limitation in this technique is the lack of ability to discriminate between light-adapted and dark-adapted energy utilization, an important physiologic consideration in retinal tissue.

This technique describes real time recording of oxygen consumption and extracellular acidification rates in explanted mouse retinal tissues using an extracellular flux analyzer.

Messung des Energiestoffwechsels in explantierten Netzhautgewebe extrazelluläre Flux-Analyse

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral lipids encased by a monolayer of phospholipids and proteins. Hepatic LD lipids, such as ceramides, and proteins are implicated in several diseases that cause hepatic steatosis. Although previous methods have been established for LD isolation, they require a time-consuming preparation of reagents and are not designed for the isolation of multiple subcellular compartments. We sought to establish a new protocol to enable the isolation of LDs, endoplasmic reticulum (ER), and lysosomes from a single mouse liver.
Further, all reagents used in the protocol presented here are commercially available and require minimal reagent preparation without sacrificing LD purity. Here we present data comparing this new protocol to a standard sucrose gradient protocol, demonstrating comparable purity, morphology, and yield. Additionally, we can isolate ER and lysosomes using the same sample, providing detailed insight into the formation and intracellular flux of lipids and their associated proteins.

This protocol establishes a novel method of lipid droplet isolation and purification from mouse livers, using a well-established endoplasmic reticulum isolation kit.

Rasche Lipid Droplet Isolation Protokoll verwendet eine gut etablierte Organell-Isolierungskit

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral ...