This work was supported by a Natural Sciences and Engineering Research (NSERC)-USRA grant to S.J., and by an NSERC-Discovery Grant to I.M. We thank Richard Bourgault, Meghan Rains, and Amanda Fluke for technical assistance. Seeds of att1-1 and att1-2 mutants were kindly provided by Dr. Jian-Min Zhou, Institute of Genetics and Developmental Biology, Beijing, China.

注：このプロトコルは、ボナベンチャーらから適応されました。 （2004）、モリーナら。 （2006）、Liら。 （2013）7,10,11。ステップ1-5は、図1に要約されています。 1.組織脱脂注：必ず使用する前に、ヒュームフードの下で乾燥させる、クロロホルムですべてのガラス器具とキャップをすすぎます。 注意：組織の均質化およびヒュームフードの下にあるすべての溶媒の転送手順を実行します。常に化学物質との直接接触を避けるために、汚染からサンプルを保護するために、実験室のコート、手袋、スプラッシュ安全ゴーグルを着用してください。 <ol><li> 85℃に予熱水浴とヒートブロック。 </li><li>ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）-facedスクリューキャップで予め秤量した20ミリメートル×125 mmのガラス製試験管に各葉サンプルの約0.5グラムを秤量します。サンプルごとに4つの複製を含めます。 </li><li>三角フラスコ（約125ミリリットルに2-プロパノールを置き、SAMPのグラム当たり25ミリリットルル）。 0.01％の最終濃度になるように（また、ブチル化ヒドロキシトルエン、BHTとしても知られる）、2,6-ジ-tert-ブチル-4-メチルフェノールを加える（w / v）の。 注：（BHTは、不飽和脂肪酸の酸化を最小限に抑えることができます）をメタノール中の5％（w / v）のストック溶液からBHTを加えます。 </li><li>水浴中で85℃に予熱2-プロパノール溶液。 </li><li>ヒートブロック中で85℃で15分間、各試料管と熱に12 mlの熱い2-プロパノール溶媒を加えます。このステップは、破壊された細胞から放出され得るリパーゼを不活性化します。 </li><li>チューブを室温まで冷却し、均一な懸濁液が得られるまでホモジナイザーで十分に組織を粉砕してみましょう。 </li><li>オービタルシェーカーでサンプルを置き、100rpmで、室温で1〜2時間振とうします。 </li><li> 800×gで10分間遠心し、上清を捨てます。 </li><li> 2-プロパノールの等量を加え、室温で12時間振とうします。 </li><li> 800×gで10分間遠心し、上清を捨てます。 </li><li> CH 12ミリリットルを追加します。CL 3：CH 3 OH（2：1、V / V）（試料のグラムあたり25 ml）を残渣に100rpmで、室温で一晩振とうします。 </li><li> 800×gで10分間遠心し、上清を捨てます。 </li><li> 12ミリリットルの CHCl 3 を追加 ：CH 3 OH（1：2、v / v）の残基および100 rpmで、室温で一晩振盪し。 </li><li> 800×gで10分間遠心分離し、溶媒を除去します。 </li><li>サンプルは室温で一晩換気フードの下で乾燥させます。 </li><li>残留物を空気は、乾燥した後、無水塩化カルシウムまたは重量が一定に（3~5日）に達するまでのCaSO 4上真空デシケーター中に置きます。 </li></ol> 2.解重合：ナトリウムメトキシドメタノリシス（図2） 注意： - 2.4、2.7から2.8、2.10 - 手順2.3実行2.15と2.17 - - 2.11、2.13ヒュームフードの下で2.18;常に実験室のコート、手袋、スプラッシュ安全ゴーグルを着用してください。 <ol><li> 60℃に予熱ヒートブロック。 </li><li> （さらなる計算のための重要な）乾燥残留物を含む試験管を計量。 </li><li>各チューブに内部標準を追加します：25ωLメチルheptadecanoate（1 mg / mlのストック）と25μlのω-ペンタデカラクトン（1 mg / mlのストック）。 </li><li>各チューブに0.9 mlの酢酸メチル、1.5 mlのナトリウムメトキシド、および3.6 mlのメタノールを追加し、それらをキャップ。あるいは、これら3試薬と反応ミックスを調製し、各サンプルに6 mlのアリコートを追加します。 </li><li> 15分間隔で定期的に60°Cとボルテックスで2時間加熱サンプル。 </li><li>サンプルは室温まで冷却してみましょう。 </li><li>脂肪酸メチルエステルを抽出するために、塩化メチレン（CH 2 Cl 2）と氷酢酸1.5mlを10mlのを追加します。 </li><li>各チューブキャップを充填するために生理食塩水（0.5 MのNaCl）を加えます。 </li><li> 800×gで10分間、1分間遠心のための渦のサンプル。 </li><li>ポリ16×125ミリメートルガラス試験管（中サイズのチューブをきれいにするために、有機相（下）を転送テトラフルオロエチレン（PTFE）-facedスクリューキャップ）。 </li><li>各チューブキャップを充填するために生理食塩水（0.5 MのNaCl）を加えます。 </li><li> 800×gで10分間、1分間遠心のための渦のサンプル。 </li><li>水（上）相を除去し、繰り返しは2.11から2.12までを繰り返します。 </li><li>全ての水性（上）相を削除します。 </li><li>溶媒を無水硫酸ナトリウム（Na 2 SO 4）を加えるチューブにキャップをし、1分間ボルテックス。サンプルは、以下の日まで放置することができる。 この時点で、サンプルは、ヒュームフード下で一晩放置することができます。 </li><li>底の中のNa 2 SO 4塩を圧縮するために800×gで2分間遠心。 </li><li>小さなガラス使い捨て管に有機相を転送（ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）と13×100mmのガラス試験管スクリューキャップを-​​faced）。 </li><li>窒素下で乾燥するまで溶剤を蒸発させ、誘導体化のステップに進みます。すぐに処理されない場合は、ストアは-20℃でサンプルを蒸発させる（サンプルをすることができますLSO）蒸発工程の前に格納されています。 </li></ol>ガスクロマトグラフィーのためのデリバティブの調製注意：ステップ3.1.2と3.1.5を実行 - ヒュームフードの下で3.1.8。常に実験室のコート、手袋、スプラッシュ安全ゴーグルを着用してください。 <ol><li> トリメチルシリル誘導体 <ol><li> 100℃に予熱ヒートブロック。 </li><li>各チューブにピリジンを100μlとBSTFA（N、Oビス - トリメチルシリルトリフルオロ）の100μlを添加して、それらをキャップ。 </li><li> 10分間100℃で熱サンプル。 </li><li>サンプルは室温まで冷却してみましょう。 </li><li>窒素下、室温でサンプルを蒸発させます。試料に熱を加えることを避ける、モノマーは、この段階では非常に揮発性です。 </li><li> 1（v / v）のヘプタン：トルエン1の500μLを追加します。 </li><li> 800×gで2分間の1分と遠心のための渦のサンプル。 </li><li> GCバイアルにサンプルを追加し、GC / MS分析に進みます。 </li></ol></li><li> アセチルデリバティブ 注：アセチル化については、手順を変更する3.1.1-3.1.3上記（ビデオには示されていない）は次の通りです。同じです3.1.4-3.1.8の手順を実行します。 <ol><li> 60℃に予熱ヒートブロック。 </li><li>チューブにピリジン100μlの無水酢酸（C 2 O）の100μLを加えます。 </li><li> 60℃での熱サンプル1時間。 </li></ol></li></ol> 4. GC / MS分析<ol><li> HP-5キャピラリーカラム（30 MX 0.25ミリメートル×0.25μmの膜厚）または同等（すなわち、5％のジフェニル、95％のジメチルポリシロキサン）を使用します。プログラム3℃/分で300℃まで150からプログラムされたヘリウムキャリアガスを1.5ml /分に設定流量とオーブン温度を有するGC。 </li><li>スプリット注入（スプリット比1:10）を使用し、40から600 AMU（電子衝撃イオン化）を介してモードをスキャンする質量分析計を設定します。 </li><li>示さクチン分析法を用いて、それぞれ、WTおよび変異体の複製、（空白）は、溶媒を含むシーケンステーブルを作成します。 </li><li>ロード溶剤そして、カルーセル上のサンプルバイアルは、必要に応じてオートサンプラシリンジすすぎバイアルにヘキサンを追加して、シーケンスを開始します。シーケンスが完了した後、全イオンクロマトグラムのトレースは、すべてのサンプルのために利用可能です。 </li></ol> 5.データ解析<ol><li>公開された質量スペクトルの各ピークのマススペクトルを比較することによって、または使用可能な場合は、市販のライブラリーを検索することにより、脂質ポリエステルモノマーを特定します。 </li><li>総イオン電流クロマトグラムの各識別されたピークについて、GC / MSソフトウェア（ 補足図1）からの積分結果テーブル上の領域を見つけるために、それぞれの保持時間を使用しています。 </li><li>各単量体（カラムA-B）については、あるモノマーのExcelのテーブル（ 補足ファイル2、カラムCF）、サンプルを複製するすべてのための対応する列に統合テーブル（ 補足図1、列D）で見つかった面積値を追加シロイヌナズナを定量化するために、スプレッドシートクチンTMSI誘導体。アセチル化誘導体が代わりに用意されている場合は、補足ファイル3を使用してください 。 </li><li> ISカラム（HK）への内部標準（IS）の領域を追加します。それらの誘導体化されていない単量体、すなわち、脂肪酸メチルエステル（FAME）、およびジカルボン酸ジメチルエステル（DCAのDME）については、17を使用します。モノマーテーブル内の紫色の網掛けセルは（定量化のためにISとして0 FAME（IS1）を、 補足ファイル2/3）。第一級アルコール、フェルラ酸、ωヒドロキシ酸を含むヒドロキシルモノマーについては、15を使用します化合物の定量化のための選択であるとして、0〜15ヒドロキシFAME（IS2）を（モノマーテーブル内の緑shadded細胞; 補足ファイル2/3） 。 </li><li>それぞれが列AX-BA（ 補足ファイル2）またはAQ-AT（ 補足ファイル3）に複製するための乾燥葉の重量を追加します。代替的に、単位当たりのモノマーの負荷を表現するために表面積を計算し、モノマーのテーブルに面積値を追加するために、葉をスキャン表面積。 </li></ol>

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No conflicts of interest declared.

DNAやタンパク質などの生体高分子、他のとは異なり、植物脂質のポリエステルは、テンプレートから作られていません。代わりに、その組成物は、これらの細胞外ポリマーを製造するための組織に存在する酵素の特異性に依存します。このように、構成成分の化学分析は、脂質のポリエステル組成物を理解することが重要です。 エステル結合を切断するための化学的方法は、ケン化、水素化分解、酸触媒トランスメチレーション、および塩基触媒トランスメチレーション2を含みます 。それらの各々は、長所と短所を有しています。鹸化は、二次反応を受けることができる遊離脂肪酸ヒドロキシ酸を生成します。水素化アルミニウムリチウム（LiAlH 4を）と水素化分解16は、クチン解析7に使用されています。水素化分解は、アルコールに官能基化炭素を減少させ、元の構造は、重水素化リチウムアルミニウム（LiAlD 4）でdeuteriolysisによって推論される必要があります。ザ・このアプローチの欠点は、それらの構造の割り当てを行うために得られる脂肪ポリオールのdeuteriationの程度を比較するための高分解能GC / MSの要件です。メタノール三フッ化ホウ素（BF 3）との酸触媒エステル交換を頻繁にクチンおよびスベリン8,17,18解重合に使用されてきたが、試薬は、限定された貯蔵寿命を有し、そして反応を15側に起因するアーチファクトを導入することができます。メタノール硫酸また、モノマーのメチルエステルが得られるが、おそらく、他の方法10に比べ、真の脂質ポリエステル成分でない2-ヒドロキシ脂肪酸のより大きな割合を有します。 このプロトコールに記載のNaOMe触媒によるエステル交換法は、識別のための特徴的な質量スペクトルを提供し、ヒドロキシル基のシリル化によって誘導体化された脂肪酸メチルエステルを生成し、またはアセチル化によってfoのヒドロキシル基のより安定な誘導体を提供することR定量。この技術の一つの欠点は、水が反応中に存在する場合、加水分解は、エステル交換反応と競合することです。水は、のNaOMe（触媒）と反応し、次いで、遊離酸（ 図2D）を得た脂肪酸メチルエステルを加水分解水酸化ナトリウムを生成します。したがって、分析を複雑に、メチルエステルおよびTMSIエステル誘導体：2つのピークが、各脂肪酸のために存在するので、これは望ましくない副反応です。無水の試薬 ​​を使用し、ケン化に対抗するために共溶媒として酢酸メチルを添加することは、加水分解（ 図2D）を防止することが重要なステップです。 クチンおよびスベリンは1と26％グリセロール4との間に含まれています。しかしながら、このモノマーは、このプロトコルに記載された実験条件では検出されないであろう。グリセロールは、脂肪酸メチルエステルモノマーとは異なり、水性溶媒洗浄工程中に除去される、高度に親水性であり、。この制限は、クチン他の解重合方法にpplies、グリセロール、酵素法を用いてエステル交換した後、得られた水層に決定することができます。あるいは、グリセロール定量化の目的のために有用な.Althoughグリセロール19,20を含む全てのモノマーを検出するためにさらに水抽出することなく、より穏やかな条件（ 例えば 、0.05 MのNaOMe）を用いて定量することができ、穏やかな条件は、通常、クチンの不完全な解重合を与えますスベリン。 炎イオン化検出器（FID）に結合されたGCが利用可能である場合の代表的な試料のピークは、GC / MSによって同定された後、すべての複製は、定量的な目的のために、この機器で分析することができます。それらの保持指標が知られている場合は別の方法として、GC / FIDトレース中のモノマーを特定することができます。水素炎イオン化検出器は、特に高感度、メジャーとマイナーの試料成分の定量化のために重要である比例の広い範囲を持っていますシングルランインチまた、堅牢で維持し、15を操作しやすいです。 記載されたプロトコルは、一つ以上の脂質ポリエステルモノマーの組成が異なる変異体の化学的な特徴付けを可能にする、植物脂質のポリエステルモノマーの信頼性と再現性の分離、同定、および定量を可能にします。手続きは、それが容易に根、種子、葉、茎、花などの種々の植物材料の小さなバルクの両方の量を処理するように適合させることができる、拡張可能です。多くの種からの脂質ポリエステルモノマーの質量スペクトルデータは、 例えば公開されている。、21-26と他の組織および/ ​​または種にこのプロトコルを適応させる際に、未知の単量体を識別するために貴重なリソースを構成しています。この方法は、高等植物における脂質ポリエステルの生合成、調節、及び分布の調査に適用可能です。

維管束植物は、植物組織と外部環境との間の防水障壁として機能する細胞外の層に依存しています。これらの親油性の細胞壁に関連する構造は、病原体感染を制限し、および植物組織1からのガス、水および溶解した物質の受動輸送を調節します。このような障壁は、植物のクチクラ、植物2、および異なるスベリン含有拡散バリアに固有synapomorphic構造です。キューティクルは、細胞壁3-5の細胞外側にペクチンの層を介して上皮細胞により合成され、それらに結合した親油性層です。これは、植物組織と環境との間の重要なインターフェースとして機能し、高等植物の主要な空中臓器を包みます。 クチン、キューティクルの構造マトリックス、およびスベリンは、溶媒抽出ワックス2,4に関連する2つの不溶性グリセロポリエステルです。これらの高分子リットルipidsは、飽和および不飽和脂肪酸誘導体で構成され、両方の構造的および機能的に類似しているされています。しかし、彼らは化学組成と堆積サイトでの特性差によって区別されています。 スベリンは、二次壁を形成する特定の外部と内部組織の細胞壁の内側に位置する脂肪族ポリエステルです。 Suberized組織が ​​根、塊茎および樹皮のperiderms、根の内皮、種 ​​皮層、および癒さ傷2を含みます 。クチンとは異なり、スベリンポリエステルは、一般的に、アルコール、飽和およびモノ不飽和ジカルボン酸、および超長鎖モノマー（C≥20）の大部分が含まれています。 クチンは、維管束植物6で最も豊富な脂質ポリエステルであり、グリセロールおよび、ヒドロキシおよびヒドロキシ置換されたエポキシ脂肪酸4としてC16-C18 interesterified脂肪酸誘導体、から構成されています。クチンポリマーの組成をしながら0、18 - ヒドロキシ-9,10-エポキシ18：0、および9,10,18トリヒドロキシ18：0脂肪酸維管束植物種間で異なり、最も優勢な主要なモノマーは、10、16ジヒドロキシ16です。 2ジカルボン酸7,8：興味深いことに、シロイヌナズナの葉とクチン茎は主に18から構成されています。 植物のキューティクルも数ナノメートルから数マイクロメートル9までの範囲、厚さにかなりのばらつきを示します。キューティクル分離は特に、 シロイヌナズナ 8のものと非常に薄い葉のクチクラのための労力と時間のかかるステップであるため、キューティクルの分離を回避する方法が開発され、7,8を検証されています。ここでは、ナトリウムメトキシド（NaOMeの）触媒解重合とそれに続くガスクロマトグラフィー/質量分析（GC / MS）分析によりシロイヌナズナの葉におけるクチンのモノマー組成物を研究するための詳細なプロトコルを記述する。このプロトコルは、共同をアッセイするための堅牢な方法を提供しています全体脱脂組織における植物脂質ポリエステルのmposition、とは、以前に報告されたプロトコル7,10,11から適応されています。全組織サンプルは、クチクラとエピクチクラワックス、膜脂質、およびトリアシルグリセロールを含む溶剤抽出脂質を除去し、均質化された第一及び徹底的に脱脂されています。細胞壁に富む残渣を、次いでナトリウムメトキシドで触​​媒メタノリシスによってそれらの構成メチルエステルモノマーに解重合されます。脂肪酸メチルエステルは、酸性化時に抽出され、それらの対応するトリメチルシリルまたはアセチル誘導体​​を得るために誘導体化されます。誘導体化された残基は、高度に揮発性であり、およびGC / MS分析の間にその構造コンフォメーションを変更することなく、妥当な温度でのガスクロマトグラフィーカラムから溶出することができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1105">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Chemicals</td>
			<td style="width:228px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">2-propanol</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">BPA451-4</td>
			<td style="width:301px;">Solvent for delipidation</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Anhydrous sodium sulfate</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">S421500</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Acetic anhydride</td>
			<td style="width:228px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">320102</td>
			<td style="width:301px;">Derivatization agent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">BSTFA (N,O-bis(trimethylsilyl)-trifluoroacetamide)</td>
			<td style="width:228px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">15222</td>
			<td style="width:301px;">Derivatization agent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Butylated hydroxytoluene (BHT)</td>
			<td style="width:228px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">101162</td>
			<td style="width:301px;">Antioxidant</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Calcium chloride, anhydrous</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">C614-3</td>
			<td style="width:301px;">Desiccation agent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Calcium suflate, anhydrous (DRIERITE- 8 MESH with indicator)</td>
			<td style="width:228px;">Acros Organics</td>
			<td>219090020</td>
			<td style="width:301px;">Desiccation agent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Chloroform (Trichloromethane)</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">C6074</td>
			<td style="width:301px;">Organic solvent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Glacial acetic acid</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">BP2401212</td>
			<td style="width:301px;">Acidification agent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Helium carrier gas, compressed</td>
			<td style="width:228px;">Air Liquide</td>
			<td style="width:153px;">ALPHAGAZ1-UN1046</td>
			<td style="width:301px;">Carrier gas, GC/MS</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Heptane</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">H3501</td>
			<td style="width:301px;">Organic solvent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Hexanes</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">H3024</td>
			<td style="width:301px;">Organic solvent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Methanol</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">A4124</td>
			<td style="width:301px;">Organic solvent, transmethylation reactive</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Methyl acetate</td>
			<td style="width:228px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">296996</td>
			<td style="width:301px;">Organic solvent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Methyl heptadecanoate</td>
			<td style="width:228px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">H4515</td>
			<td style="width:301px;">Internal standard (1mg/mL stock)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Methylene dichloride (Dichloromethane)</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">D374</td>
			<td style="width:301px;">Organic solvent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Nitrogen, compressed</td>
			<td style="width:228px;">Air Liquide</td>
			<td style="width:153px;">ALPHAGAZ1-UN1044</td>
			<td style="width:301px;">Carrier gas, GC-FID</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Pentadecanolactone</td>
			<td style="width:228px;">Fluka</td>
			<td style="width:153px;">76530</td>
			<td style="width:301px;">Internal standard (1 mg/mL stock)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Pyridine</td>
			<td style="width:228px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">270970</td>
			<td style="width:301px;">Co-solvent for derivatization</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">BP358212</td>
			<td style="width:301px;">Saline solution</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Sodium methoxide (25wt.%)</td>
			<td style="width:228px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">156256</td>
			<td style="width:301px;">Nucleophile</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Toluene</td>
			<td style="width:228px;">FIsher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">T2904</td>
			<td style="width:301px;">Organic solvent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Plant Growth Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:423px;">Pro-Mix PGX</td>
			<td>Premier Tech Horticulture Ltd</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;">Pro-Mix PGX is recommended to grow Arabidopsis plants (Eddy, R. and Hahn, D.T., 2012,http://docs.lib.purdue.edu/pmag/2) 
			Purdue Methods for Arabidopsis Growth.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">PermaNest Humidity Dome&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Grower&#39;s Solution, LLC, Cookeville, TN&#160;</td>
			<td style="width:153px;">GD2211-24</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">Perma-Nest Plant Trays (22x11in)</td>
			<td style="width:228px;">Grower&#39;s Solution, LLC, Cookeville, TN&#160;</td>
			<td style="width:153px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">Square greenhouse pots, 3.5 inch&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Grower&#39;s Solution, LLC, Cookeville, TN&#160;</td>
			<td style="width:153px;">P86</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:423px;">General Purpose Plant Fertilizer, Plant-Prod 20-20-20</td>
			<td style="width:228px;">Premier Tech Home and Garden In., Brantford, ON</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glassware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:423px;">13 x 100 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap</td>
			<td style="width:228px;">Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td>
			<td style="width:153px;">45066A-13100</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:423px;">16 x 125 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap</td>
			<td style="width:228px;">Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td>
			<td style="width:153px;">45066A-16125</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:423px;">20 x 125 mm glass test tubes with Teflon-faced screw cap</td>
			<td style="width:228px;">Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td>
			<td style="width:153px;">45066A-20125</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">GC vial caps</td>
			<td style="width:228px;">National Scientific</td>
			<td style="width:153px;">C400051A</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">GC vial microinserts</td>
			<td style="width:228px;">National Scientific</td>
			<td style="width:153px;">C4011631</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">GC vials</td>
			<td style="width:228px;">National Scientific</td>
			<td style="width:153px;">C40001</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Disposable pasteur pipets</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;">1367820B</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Flasks</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Allegra X15R centrifuge</td>
			<td style="width:228px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Analytic balance</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:423px;">Belly dancer</td>
			<td style="width:228px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;">A shaker can be used for this purpose if Belly Dancer not available</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">DB-5 Capillary GC column</td>
			<td style="width:228px;">J&#38;W Scientific, CA, USA;&#160;</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;">30 m x 0.25 mm x 0.25 &#956;m film thickness</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Desiccator</td>
			<td style="width:228px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Isotemp 202 water bath</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">ISQ LT single quadupole mass spectrometer</td>
			<td style="width:228px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Heat block</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Nitrogen evaporator</td>
			<td style="width:228px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Polytron homogenizer</td>
			<td style="width:228px;">Birkmann</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Trace 1300 gas chromatograph</td>
			<td style="width:228px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Two-stage regulator</td>
			<td style="width:228px;">Air Liquide</td>
			<td style="width:153px;">Q1-318B-580</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Vacuum desiccator</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:423px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:228px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and compositional analysis of plant cuticle lipid polyester monomers

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester of glycerol and modified fatty acids that constitutes the framework of the cuticle that covers aerial plant surfaces. Suberin is a related lipid polyester that is deposited on the cell walls of certain tissues, including the root endodermis and the periderm of tubers, tree bark and roots. These lipid polymers are highly variable in composition among plant species, and often differ among tissues within a single species. Here, we describe a detailed protocol to study the monomer composition of cutin in Arabidopsis thaliana leaves by sodium methoxide (NaOMe)-catalyzed depolymerisation, derivatization, and subsequent gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS) analysis. This method can be used to investigate the monomers of insoluble polyesters isolated from whole delipidated plant tissues bearing either cutin or suberin. The method can by applied not only to characterize the composition of lipid polymers in species not previously analyzed, but also as an analytical tool in forward and reverse genetic approaches to assess candidate gene function.

。10日-この原稿に記載されているプロトコル脂質ポリエステルモノマーを決定するように設定されている（ すなわち 、クチンまたはスベリン）、非クチン脂質10の貢献を最小化図1は、完全に8の間にかかるアッセイの概要を説明します（最初の組織の収穫からのGCデータを得るために）、乾燥させているどのくらいのサンプルに応じて。 選択された塩基触媒メタノリシス（ 図2）のポリエステルを解重合する方法は、以前クチンおよびスベリンの両方が含まれているシロイヌナズナの種子のために検証されました。組織は、最初に均質化し、徹底的に溶剤抽出脂質を除去するために脱脂されています。抽出後の残渣の収率は、最初の新鮮重量の割合として、通常Aの 6％ですシロイヌナズナ COL-0の葉。細胞壁に富む残渣を真空デシケーター中で乾燥した後、それらの構成によってメチルエステルモノマーに解重合されています塩基触媒トランスメチレーション。 2時間のインキュベーションは、適切な解重合および脂質ポリエステル成分の回収のために必要な重要な時期として選ばれました。より長いインキュベーション時間は、2-ヒドロキシ酸の増加をもたらしました。これらは、潜在的に、膜スフィンゴ脂質10から派生。 シロイヌナズナ野生型の葉クチンはO -TMSiエーテル誘導体（ 図3A）及びO -アセチル誘導体（ 図3B）は、 図3に示されている場合の典型的なクロマトグラム。各ピークは、文献7,8および12。当社のビデオプロトコルは、TMSIの誘導体を製造する方法を示して公共データベースからの質量スペクトルとの比較により同定したが、サンプルが代わりにヒドロキシル基を誘導体化するアセチル化することができます。彼らは診断マススペクトルを与えるため、シリル化誘導体は、識別の目的のために良いです。しかし、アセチル化誘導体は、より安定したシリル化に良い代替されています一度モノマーは、10を同定されています。唯一のGCは、水素炎イオン化検出器（FID）に結合されている実験室でこのプロトコルの実装を支援するために、GC / FIDをWT葉クチンモノマーの脂肪酸メチルエステルの標準同族系列のアセチル化誘導体に対応するも示されているトレース（ 補足図4）。 この方法は、定性的であり、変異体解析のためにその値したがって、サンプル間の定量的な差を検出します。個々のモノマーの量は、サンプル間のモノマーの存在量の比較を可能にする、定量化の内部標準法を用いて決定されます。これは、ピークの大きさ（総イオンカウント数）は、ポリエステル中のモノマーのモル比を反映していない可能性があること、しかし、明確にする必要があります。我々は、脂肪酸メチルエステルおよびTMSI誘導体（ 補足ファイル1）、またはエースとしてシロイヌナズナ葉クチン中のモノマー量を計算するために、モノマーの編集可能なテーブルを含むされています<html>アルコールのティル誘導体（ 補足ファイル2）。これらの表は、サンプルが異なる器官または植物種から抽出された場合に適応する必要があるかもしれません。 例として、我々はシロイヌナズナタリアナコロンビア（COL-0）は、野生型の葉とCYP86A2 / ATT1遺伝子の2つの以前に特徴付けヌル変異対立遺伝子、att1-1（M-1）とatt1-2（M-2を分析しました ）13,14。 CYP86AサブファミリーのシトクロムP450モノオキシゲナーゼは、推定ω-oxydasesをエンコードし、スベリンおよびクチンモノマー生合成に参加しています。我々の結果（ 図4）は 、WTの葉に比べて、変異体の葉における三大脂質モノマーの負荷の大幅な削減を実証します。 、酵素の予測機能と一致して16：0、18：2、および18：1ジカルボキシレートは、特にATT1変異体において影響を受けました。 「SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 53386 / 53386fig1.jpg&quot; /&gt; 脂質ポリエステルの分析1.概要図。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig2.jpg" /> NaOMeを触媒によるメチル基転移反応の図2機構求核メトキシアニオンを容易に脂肪酸メチルエステルおよびアルコキシドアニオン（B）に解離する不安定な四面体中間体（A）を形成する脂質ポリエステルのcabonyl炭素を攻撃します。これらのアルコキシドは共役塩基であり、それによって追加の解重合反応（C）の維持、触媒的に活性なメトキシアニオンを再生する、メタノールと反応します。水が中に存在する場合システムには、水酸化ナトリウム、不可逆的に望ましくない遊離脂肪酸を生成するためにエステルを加水分解強塩基を形成するために、ナトリウムメトキシドと反応します。酢酸メチルは、システム（D）の中に、水酸化ナトリウムの少量を削除するには、15共溶媒として追加されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig3.jpg" /> 図3。野生型シロイヌナズナの葉クチンモノマーの代表的なトータルイオンクロマトグラム。（A）O -trimethylsilyl（TMSI）エーテルと、（B）、酢酸ヒドロキシル誘導体。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> </A&gt; <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig4.jpg" /> 図シロイヌナズナ WTの4クチンモノマー組成及びCYP86A2遺伝子の2つのヌル変異体対立遺伝子（ 変異1 = att1-1;変異2 = att1-2）。エラーバーは平均の標準偏差を示す（N = 4） 。 ©ブラックウェルパブリッシング（2007）の許可を得て、13から適応。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig1.jpg" /> GC / MSソフトウェアから補足図1のピーク積分結果テーブル。同定された単量体と内部標準に対応するピークは、彼らのretentiによって識別されます<html>時間に（列C）及び面積値が列Dに表にし<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_Figure_1.tif" target="_blank">、このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig2.jpg" /> シロイヌナズナクチンモノマー（ヒドロキシ脂肪酸メチルエステルのトリメチルシリルエーテル誘導体）の補足ファイル2.表。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_File_2_Cutin_template_TMSi.xls" target="_blank">このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig3.jpg" /> シロイヌナズナクチンモノマー（ヒドロキシ脂肪酸メチルエステルのOアセチル誘導体）の補足ファイル3表。COM /ファイル/ ftp_upload / 53386 / Supplemental_File_3_Cutin_template_Acetylated_derivati​​ves.xlsx「ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig4.jpg" /> （AB）脂肪酸メチルエステル（FAME）リテンションインデックススタンダード（ピークは各飽和FAME鎖長で標識される）の補足図4 GC / FIDトレース。及び（C）は、A をアセチル化WT シロイヌナズナ葉クチンモノマー。 16：0 FAME（1）、フェルラ酸（2）、18：3 FAME（3）、18：1/18：2のFAME（4）、18（5）、sinapate 0 FAME（6ピーク上の数字は、対応します）、16：0 DCA（7）、16-OH 16：0 FAME（8）、18：2 DCA（9）、18：1 DCA（10）18：0 DCA（11）、18-OH 18：2 FAME（12）、18-OH 18：1 FAME（13）、20：0 FAME（14）、10,16-DIOH 16：0 FAME（15）、24：0 FAME（16）。 DCA：ジカルボン酸ジメチルエステル。 FAME：脂肪酸メチルエステル。 IS1：内部標準1、17：0 FAME。 IS2：内部STandard 2、15-OH 15：0 FAME。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_Figure_4.tif" target="_blank">このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a>

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Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers

Lipid polyesters constitute the structural components of two cell wall modifications, the plant cuticle and suberin-containing diffusion barriers. In this video, we describe a method to depolymerize cutin from whole delipidated leaves. The method can be applied to investigating mutants compromised in either cutin or suberin biosynthesis.

植物キューティクル脂質ポリエステルモノマーの単離と組成分析

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester ...

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Research

JoVE Journal

Biology

16.6K ビュー.  Algoma University. Lipid polyesters constitute the structural components of two cell wall modifications, the plant cuticle and suberin-containing diffusion barriers. In this video, we describe a method to depolymerize cutin from whole delipidated leaves. The method can be applied to investigating mutants compromised in either cutin or suberin biosynthesis.

ビデオ: Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers

Use of Arabidopsis eceriferum Mutants to Explore Plant Cuticle Biosynthesis

The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation, but is also an important barrier against the entry of pathogenic microorganisms.  The cuticle is made up of a tough crosslinked polymer called "cutin" and a protective wax layer that seals the plant surface.  The waxy layer of the cuticle is obvious on many plants, appearing as a shiny film on the ivy leaf or as a dusty outer covering on the surface of a grape or a cabbage leaf thanks to light scattering crystals present in the wax.  Because the cuticle is an essential adaptation of plants to a terrestrial environment, understanding the genes involved in plant cuticle formation has applications in both agriculture and forestry. Today, we'll show the analysis of plant cuticle mutants identified by forward and reverse genetics approaches.


The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation but is also an important barrier against the entry of pathogenic microorganisms. In this video, we demonstrate the analysis of plant cuticle mutants identified by forward and reverse genetics approaches.

植物のキューティクルの生合成を探検するシロイヌナズナeceriferum変異体の使用

The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation, but is also an important barrier against the entry of ...

生物学

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and genetics because of its simple life cycle, ease of growth and manipulation for genetic analysis, genomic resources, and transformability of the nucleus and both organelles. Mating strains is a common practice when genetic approaches are used in Chlamydomonass, to create vegetative diploids for analysis of dominance, or following tetrad dissection to ascertain nuclear vs. organellar inheritance, to test allelism, to analyze epistasy, or to generate populations for the purpose of map-based cloning. Additionally, genetic crosses are routinely used to combine organellar genotypes with particular nuclear genotypes. Here we demonstrate standard methods for gametogenesis, mating, zygote germination and tetrad separation. This protocol consists of an easy-to-follow series of steps that will make genetic approaches amenable to scientists who are less familiar with Chlamydomonas. Key parameters and trouble spots are explained. Finally, resources for further information and alternative methods are provided.

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Mating and tetrad separation are required for genetic analysis in Chlamydomonas reinhardtii. Here we demonstrate standard methods for gametogenesis, mating, zygote germination and tetrad dissection. This protocol consists of an easy-to-follow series of steps that will make genetic approaches amenable to scientists who are less familiar with Chlamydomonas.

交配との四分子の分離クラミドモナス遺伝子解析用

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part I: Lignin

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st century. This has rekindled interest in the use of plant products as industrial raw materials for the production of liquid fuels for transportation1 and other products such as biocomposite materials7. Plant biomass remains one of the greatest untapped reserves on the planet4. It is mostly comprised of cell walls that are composed of energy rich polymers including cellulose, various hemicelluloses (matrix polysaccharides, and the polyphenol lignin6 and thus sometimes termed lignocellulosics. However, plant cell walls have evolved to be recalcitrant to degradation as walls provide tensile strength to cells and the entire plants, ward off pathogens, and allow water to be transported throughout the plant; in the case of trees up to more the 100 m above ground level. Due to the various functions of walls, there is an immense structural diversity within the walls of different plant species and cell types within a single plant4. Hence, depending of what crop species, crop variety, or plant tissue is used for a biorefinery, the processing steps for depolymerization by chemical/enzymatic processes and subsequent fermentation of the various sugars to liquid biofuels need to be adjusted and optimized. This fact underpins the need for a thorough characterization of plant biomass feedstocks. Here we describe a comprehensive analytical methodology that enables the determination of the composition of lignocellulosics and is amenable to a medium to high-throughput analysis. In this first part we focus on the analysis of the polyphenol lignin (Figure 1). The method starts of with preparing destarched cell wall material. The resulting lignocellulosics are then split up to determine its lignin content by acetylbromide solubilization3, and its lignin composition in terms of its syringyl, guaiacyl- and p-hydroxyphenyl units5. The protocol for analyzing the carbohydrates in lignocellulosic biomass including cellulose content and matrix polysaccharide composition is discussed in Part II2.

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part I: Lignin

Plant biomass is a major carbon-neutral renewable resource that could be used for the production of biofuels. Plant biomass consists mainly of cell walls, a structurally complex composite material termed lignocellulosics. Here we describe a protocol for a comprehensive analysis of the content and composition of the polyphenolic lignin.

植物細胞壁の包括的な組成分析（リグノセルロース系バイオマス）パートI：リグニン

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st century. This has rekindled interest in the use of plant products as industrial raw materials for the production of liquid fuels for transportation2 and other products such as biocomposite materials6. Plant biomass remains one of the greatest untapped reserves on the planet4. It is mostly comprised of cell walls that are composed of energy rich polymers including cellulose, various hemicelluloses, and the polyphenol lignin5 and thus sometimes termed lignocellulosics. However, plant cell walls have evolved to be recalcitrant to degradation as walls contribute extensively to the strength and structural integrity of the entire plant. Despite its necessary rigidity, the cell wall is a highly dynamic entity that is metabolically active and plays crucial roles in numerous cell activities such as plant growth and differentiation5. Due to the various functions of walls, there is an immense structural diversity within the walls of different plant species and cell types within a single plant4. Hence, depending of what crop species, crop variety, or plant tissue is used for a biorefinery, the processing steps for depolymerisation by chemical/enzymatic processes and subsequent fermentation of the various sugars to liquid biofuels need to be adjusted and optimized. This fact underpins the need for a thorough characterization of plant biomass feedstocks. Here we describe a comprehensive analytical methodology that enables the determination of the composition of lignocellulosics and is amenable to a medium to high-throughput analysis (Figure 1). The method starts of with preparing destarched cell wall material. The resulting lignocellulosics are then split up to determine its monosaccharide composition of the hemicelluloses and other matrix polysaccharides1, and its content of crystalline cellulose7. The protocol for analyzing the lignin components in lignocellulosic biomass is discussed in Part I3.

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part II: Carbohydrates

Plant biomass is a major carbon-neutral renewable resource that could be used for the production of biofuels. Plant biomass consists mainly of cell walls, a structurally complex composite material termed lignocellulosics. Here we describe a protocol for a comprehensive analysis of the content and composition of wall derived carbohydrates.

植物細胞壁の包括的な組成分析（リグノセルロース系バイオマス）パートII：炭水化物

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

から初期段階の胚の効率的かつ迅速な単離<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;種子

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

比較プロテオーム解析のための代謝標識および膜分画<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;サスペンション細胞培養

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex composition under different conditions. In this protocol the approach is demonstrated by comparing the composition of the protein complex responsible for cyclic electron flow (CEF) in Chlamydomonas reinhardtii, isolated from genetically different strains. The procedure comprises the isolation of thylakoid membranes, followed by their separation into multiprotein complexes by sucrose density gradient centrifugation, SDS-PAGE, immunodetection and comparative, quantitative mass spectrometry (MS) based on differential metabolic labeling (14N/15N) of the analyzed strains. Detergent solubilized thylakoid membranes are loaded on sucrose density gradients at equal chlorophyll concentration. After ultracentrifugation, the gradients are separated into fractions, which are analyzed by mass-spectrometry based on equal volume. This approach allows the investigation of the composition within the gradient fractions and moreover to analyze the migration behavior of different proteins, especially focusing on ANR1, CAS, and PGRL1. Furthermore, this method is demonstrated by confirming the results with immunoblotting and additionally by supporting the findings from previous studies (the identification and PSI-dependent migration of proteins that were previously described to be part of the CEF-supercomplex such as PGRL1, FNR, and cyt f). Notably, this approach is applicable to address a broad range of questions for which this protocol can be adopted and e.g. used for comparative analyses of multiprotein complex composition isolated from distinct environmental conditions.

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The described comparative, quantitative proteomic approach aims at obtaining insights into the composition of multiprotein complexes&#160;under different conditions and is demonstrated by comparing genetically different strains. For quantitative analysis equal volumes of different fractions from a sucrose density gradient are mixed and analyzed by mass spectrometry.

に基づいた多タンパク質複合体の比較分析のための新たなアプローチ<sup&gt; 15</sup&gt; N代謝標識および定量的質量分析

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force used to pump blood. Individual cardiomyocytes were first isolated over 40 years ago in order to better study the physiology and structure of heart muscle. Techniques have rapidly improved to include enzymatic digestion via coronary perfusion. More recently, analyzing the contractility and calcium flux of isolated myocytes has provided a vital tool in the cellular and sub-cellular analysis of heart failure. Echocardiography and EKGs provide information about the heart at an organ level only. Cardiomyocyte cell culture systems exist, but cells lack physiologically essential structures such as organized sarcomeres and t-tubules required for myocyte function within the heart. In the protocol presented here, cardiomyocytes are isolated via Langendorff perfusion. The heart is removed from the mouse, mounted via the aorta to a cannula, perfused with digestion enzymes, and cells are introduced to increasing calcium concentrations. Edge and sarcomere detection software is used to analyze contractility, and a calcium binding fluorescent dye is used to visualize calcium transients of electrically paced cardiomyocytes; increasing understanding of the role cellular changes play in heart dysfunction. Traditionally used to test drug effects on cardiomyocytes, we employ this system to compare myocytes from WT mice and mice with a mutation that causes dilated cardiomyopathy. This protocol is unique in its comparison of live cells from mice with known heart function and known genetics. Many experimental conditions are reliably compared, including genetic or environmental manipulation, infection, drug treatment, and more. Beyond physiologic data, isolated cardiomyocytes are easily fixed and stained for cytoskeletal elements. Isolating cardiomyocytes via perfusion is an extremely versatile method, useful in studying cellular changes that accompany or lead to heart failure in a variety of experimental conditions.

Individual cardiomyocytes from wild type and mutant mice can be isolated from the heart in order to study their contractility and calcium transients. This allows characterization of the contribution of cellular dysfunction to heart dysfunction from any cause.

マウス心筋細胞の単離と生理解析

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while maintaining transparency of the visual axis. Perturbations to this delicate balance cause blinding illnesses, such as diabetic retinopathy. Therefore, the understanding of energy metabolism changes in the retina during disease is imperative to the development of rational therapies for various causes of vison loss. The recent advent of commercially-available extracellular flux analyzers has made the study of retinal energy metabolism more accessible. This protocol describes the use of such an analyzer to measure contributions to retinal energy supply through its two principle arms - oxidative phosphorylation and glycolysis - by quantifying changes in oxygen consumption rates (OCR) and extracellular acidification rates (ECAR) as proxies for these pathways. This technique is readily performed in explanted retinal tissue, facilitating assessment of responses to multiple pharmacologic agents in a single experiment. Metabolic signatures in retinas from animals lacking rod photoreceptor signaling are compared to wild-type controls using this method. A major limitation in this technique is the lack of ability to discriminate between light-adapted and dark-adapted energy utilization, an important physiologic consideration in retinal tissue.

This technique describes real time recording of oxygen consumption and extracellular acidification rates in explanted mouse retinal tissues using an extracellular flux analyzer.

細胞外のフラックスを用いた Explanted 網膜組織のエネルギー代謝の測定

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral lipids encased by a monolayer of phospholipids and proteins. Hepatic LD lipids, such as ceramides, and proteins are implicated in several diseases that cause hepatic steatosis. Although previous methods have been established for LD isolation, they require a time-consuming preparation of reagents and are not designed for the isolation of multiple subcellular compartments. We sought to establish a new protocol to enable the isolation of LDs, endoplasmic reticulum (ER), and lysosomes from a single mouse liver.
Further, all reagents used in the protocol presented here are commercially available and require minimal reagent preparation without sacrificing LD purity. Here we present data comparing this new protocol to a standard sucrose gradient protocol, demonstrating comparable purity, morphology, and yield. Additionally, we can isolate ER and lysosomes using the same sample, providing detailed insight into the formation and intracellular flux of lipids and their associated proteins.

This protocol establishes a novel method of lipid droplet isolation and purification from mouse livers, using a well-established endoplasmic reticulum isolation kit.

老舗のオルガネラの分離キットを使用して急速な脂質液滴の隔離のプロトコル

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral ...