이 문서에 제시된 방법은 BBSRC BB / 재정 지원 사업에서 발생 I021507 / 1 (TB, RJTW)와 MRC 박사 재학 (MH).

참고 : 모든 실험은 킹스 칼리지 런던, 영국, 영국 홈 오피스 동물 보호 지침에 따라 수행되었다. E14 소뇌 1. 해부 <ol><li> 배아의 날 (14)에 38 ° C에서 갈색 수정 된 암탉 &#39;계란을 품어. </li><li> 사용 계란 가위 비켜에서 병아리 배아 목을 벨과 얼음 차가운 PBS (그림 1A)를 포함하는 페트리 접시에 머리를 제거합니다. </li><li> 표준 집게를 사용하여 눈과 위턱을 제거, 조직을 통해 각각의 눈 뒤에있는 모든 방법을 절개합니다. 모든 방법 아래턱 (그림 1B)를 제거 인두를 통해 두 번째 절개를합니다. </li><li> 표준 집게를 사용하여 (그림 1C을)를 벗겨하여 두개골의 표면에서 모든 피부를 제거하고 뇌를 공개, 정면 및 정수리 뼈를 제거합니다. </li><li> 복부 측면에서, 인두 연골 및 보조 중간 엽을 제거합니다. </li><li> 등의 측면에서,주의LY는 PIA, 별도의 전체 뇌 (그림 1D)를 손상하지 후뇌 돌보는에 간엽 지느러미를 제거합니다. </li><li> 모든 방법 중뇌와 후뇌와 소뇌 (그림 1E)를 포함하여 별도의 후뇌 사이의 조직을 통해 절개를합니다. </li><li> 모든 방법 소뇌와 후뇌의 ALAR 판의 양측 접합부의 조직을 통해 절개를함으로써, 절개에 걸쳐 PIA의 무결성 (그림 1 층)을 유지하기 위해주의하면서 전체 소뇌를 제거합니다. 성형 맥락총 (그림 1G)를 제거합니다. </li><li> 얼음 차가운 HBSS로 해부 소뇌를 이동합니다. </li></ol> E14 소뇌 2. 슬라이스 문화 <ol><li> 주걱이나 팁 3 ㎖ 파스퇴르 피펫을 사용하여 조직 헬기의 멸균 플랫폼 전체 소뇌로 이동시켜 조리개를 확대하기 위해 절단. 피펫을 사용하여 물기를 제거합니다. </li><li> T의 전체 전체 소뇌를 잘라그는 최대 50 % 절삭 속도 설정 한 조직 헬기를 이용하여 300 μm의 두께로 방향을 요구했다. 조직의 무결성이 가장 쉽게 시상 절에 보존된다 그러나, 배향은 또한 세포 분석을위한 중요한 고려 사항이다 (과립 세포 축삭 횡 실행 동안 조롱박 세포 수지상 sagittally 조롱박 수지상 세포의 평면에 수직 정렬된다). </li><li> 3 ㎖ 파스퇴르 피펫을 사용하여, 얼음의 슬라이스 소뇌 차가운 HBSS를 다룹니다. </li><li> 컷 팁 3 ㎖ 파스퇴르 피펫을 사용하여 얼음 차가운 신선한 HBSS를 포함하는 60mm 페트리 접시에 HBSS에 조각을 전송합니다. </li><li> 광섬유 광원으로 조명 해부 현미경, 시계공 겸자를 사용하여 개별 조각의 분리를 보장한다. 슬라이스를 식별하는 것은 자신의 조직 무결성 및 메디 오 - 측면 위치에 따라, 전기 천공한다. 참고 : 배지에서 배양 슬라이스를 통해 배아에서 각각의 해부는 약 10 ~ 20 분 따라 우포늪 소요N 경험. 그 소뇌가 잘린 및 생체 문화 사이의 최소 시간을 보낼 수 있도록 한 번에 해부 하나를 수행합니다. </li></ol> 조각의 3 Electroporation에 <ol><li> 절연 테이프로 60mm 페트리 접시의 바닥에 electroporator의 양극을 고정하여 전기 챔버를 구축합니다. 전극을 커버하는 HBSS의 약 1 ML을 추가합니다. </li><li> HBSS에 덮여 전극의 상단에 0.4 μm의 문화 삽입을 놓습니다. 문화 삽입 전극이 항상 삽입과 전극 사이가 접촉되어 있는지 확인하기에 휴식을 허용합니다. 주 :이 설정에서는 슬라이스 배양 인서트 서킷을 유지하지만, 음극의 표적화를 허용 공간, 용액의 표면에 나머지 것이다. </li><li> 전송 확인 조각 (문화 삽입 당 최대 5) 절단 팁 3 ㎖ 파스퇴르 피펫을 사용하여 문화 삽입 상. 분리 및 sagitt 문화 삽입에 정착 할 수 있도록알 방향입니다. </li><li> 슬라이스가 더 이상 용액에 목욕을하지 않도록 피펫을 사용하여, 초과 HBSS 제거합니다. </li><li> 조각의 대상 영역의 표면에 20 % 빠른 그린으로 희석 (1 μg의 / μL의 농도) P10 피펫 팁, 피펫 DNA를 사용. 20 % 빠른 그린은 점성 DNA 용액을 보장하고 엄청나게 DNA의 넓은 분산을 방지 할 수 있습니다. 각각의 조각 (그림 2B)에 약 5 μL DNA / 빠른 그린 솔루션을 추가합니다. </li><li> 원하는 대상 조직을 통해 음극를 놓고 3 × 10 V, 10 밀리 초 지속 펄스 electroporate. 조직과 음극의 직접적인 접촉을 피하십시오. 대신 컨덕턴스를 유지 (실제로 조직에 닿지 않으면 서 가능한 한 조직에 가까운 음극 배치)하는 액체의 표면 장력을 이용한다. </li><li> 원하는대로 각각의 소뇌 조각에 EGL의 여러 지역에 DNA 전달 및 전기를 반복합니다. </li><li> 일렉트로 완료, 전송 배양시 INSE30mm 페트리 접시에 체류. </li><li> 글루코오스 1 % B27 보충제, 2 mM의 글루타민, 100 U가 / ㎖ 페니실린 - (+) - 각각의 배양, 미리 예열 배지 (기초 배지 이글 1 ㎖, 0.5 % (w / v)의 D를 추가 배양 인서트 매체와 접촉하지만, 슬라이스가 목욕하지되도록 배양 인서트 아래 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신). </li><li> 최대 3 일 동안 37 ° C / 6 % CO 2의 문화를 품어. 배지 신선한 사전 예열 매체 매 24 시간을 모두 교체합니다. </li><li> 문화가없는 문화 미디어와 신선한 30mm 접시에 (4 ° C에서 또는 O / N) 4 % 파라 포름 알데히드에서 1 시간 동안 삽입에 문화에 따라, 슬라이스를 수정합니다. </li></ol> 소뇌 조각 4. 영상 <ol><li> 고정 후, PBS에서 5 분 동안 조각을 3 회 반복한다. </li><li> 면도날을 사용하여, 주위 슬라이스 절단하고 조각에 부착되는 인서트의 영역을 제거하여 배양 인서트에서 각 일렉트로 배양 소뇌 슬라이스 해부. 해야 할 것문화 삽입 표면에서 슬라이스를 제거하려고하지. </li><li> 커버 슬립 돌보는에서 원하는 경우 DAPI를 포함하는 설치 매체의 약 1 ml의 마운트 슬라이스 거품을 소개하지, 이미지는 레이저 스캐닝 공 초점 현미경을 사용하여. 주 : 이미징 파라미터들이 전기 천공 구조에 따라 다양하고, 개별 사용자의 재량에 따라 할 수있다. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

여기에보고 된 프로토콜은 해부 electroporating 및 병아리 배아로부터 14 일째 소뇌의 슬라이스를 배양하기위한 방법을 설명한다. 이 프로토콜은 개별 소뇌 로브의 고립 된 타겟팅을 포함하여 EGL의 작은 초점 지역에 전기의 대상으로 할 수 있습니다. 그것은 높은 해상도와 편의에 따라 유전자 분석 및 이미징을 가능하게하고, 저렴한 비용으로 설치류 43-47 년에 설립 된 기술에 비해. 이러한 분...

소뇌는 후뇌의 앞쪽 끝 부분에 앉아 성숙한 뇌의 감각 및 모터 처리의 통합에 대한 책임뿐만 아니라 더 높은인지 과정 (1)을 조절하는 것입니다. 포유류와 조류, 그것은 성인의 뇌에서 신경 세포의 절반 이상을 생산하고 개발하는 동안, 조상의 광범위한 대중 교통 증폭의 제품을 정교한 형태를 보유하고 무겁게 잎 모양입니다. 소뇌는 수세기 동안 신경 생물 학자과 분자 시대 연구의 대상이되어왔다 마찬가지로 상당한 관심을 받고있다. 이는 본질적으로 흥미로운 생물학뿐만 아니라이 많이와 같은 가장 일반적인 소아 두뇌 자폐증 스펙트럼 장애 (2) 가장 눈에 띄게 소뇌 암, 수 모세포종 3, 등의 발달 유전 질환을 포함하여 인간의 질병에 연루되어 있다는 사실뿐만 아니라 관련 종양. 중요한 것은 WH 내의 우수한 모델 시스템이며무형 문화 유산은 두뇌 발달 4시에 운명 할당 및 신경을 연구한다. 최근에는 또한, 척추 동물 계통 5-10 걸쳐 본 소뇌 형태의 다양성으로 인하여 큰, 뇌 발달의 비교 연구를위한 모델 시스템으로 구축되었다. 소뇌는 후뇌 11 rhombomere 1의 등 반에서 개발하고 발달 두 가지 기본 전구 인구, 마름모꼴 입술과 심실 영역으로 구성되어 있습니다. 마름모꼴의 입술은 지붕 판과의 국경에있는 후뇌의 neuroepithelium의 등 주변 지역 확장합니다. 그것은 소뇌 12-14의 글루타메이트 흥분성 신경 세포의 발상지입니다. 심실 영역은 가장 눈에 띄게 억제 GABA 성 소뇌 신경 세포, 큰 조롱박 신경 세포 (14, 15)을 발생시킨다. 나중에 개발 (마우스의 배아 일 13.5 약에서, 병아리 16 E6), 글루타메이트의 progen마름모꼴적인 억제제는 립으로부터 접선 마이그레이션의 선조 PIAL 층을 형성 : 보조 선조 존 외부 과립 층 (EGL)라고. 이는 성숙한 뇌에서 발견되는 과립 뉴런의 거대한 수 리드 광범위한 중계 증폭을 겪는다이 층이다. EGL의 확산은 긴 세포주기 종료하고 중앙으로 외부 EGL 층에서 자신의 종료와 관련되는 전구 세포의 신경 세포 분화에 스위치, 마름모꼴 립 (17)에서 접선 마이그레이션의 결과 하위 PIAL 위치에 연결되었습니다 EGL (18). 중간 - 가로축에 후 유사 분열 과립 세포의 광범위한 접선 마이그레이션 성숙한 소뇌 피질의 내부 과립 층에 최종 반경 마이그레이션하기 전에, 중간 및 내부 EGL (19)에서 발생합니다. 소뇌 표면 마름모꼴 입술에서 세포의 마이그레이션 피아 20-22에서 CXCL12 신호에 따라 달라집니다 </sup&gt; 및 과립 세포 CXCL12 수용체 CXCR4를 발현. 그들의 접선 마이그레이션 억제 interneuron 인구 23-25 ​​마이그레이션 신피질 접선 방향으로의 그 때문에 연상시킨다. 흥미롭게도, 전자 현미경 연구 (17)는 증식 형태와 EGL 세포는 포유류의 피질 (26)의 기초 선조를 연상시키는 방식으로 증식 능력과 세포의 동작을 연결, PIAL 접촉을 유지한다고 제안했다. 이것은 18 시그니처 과립 전구체 별개의 유전자 발현이 뚜렷한 세포 외 환경에 의해 정의되는 세 개의 부 계층으로 EGL의 전술 한 층화에 반영된다. oEGL에서 증식 전구 세포의 전구 세포가 개별적 유전자 생쥐 배아 발달의 마지막에 표시 될 때, 그들은 postmitotic 250-500 g의 중앙값의 평균을 야기하도록 클론 크기의 정규 분포로 발생ranule 뉴런 (27, 28). 확산은 조롱박 뉴런 29-32의 기초에서 분열 쉬이 잇 신호에 따라 달라집니다. SHH에 응답하는 능력이 전사 인자 Atoh1의 세포 발현에 따라 자율적 전적으로 의존하는 것으로 밝혀졌다, 시험 관내 및 생체 내 (33) (34, 35)의 양쪽 모두. 이와 마찬가지로 세포주기 출구와 분화 가능성 Atoh1 37의 직접 리프레이다 하류 전사 인자 NeuroD1 36의 발현에 의존하는 것으로 밝혀졌다. 세포주기 출구 38-42의 세포 생물학적 근거를 해독이 진행하고, 상당한 발전에도 불구하고, 결정을 기초 근본적인 분자 메커니즘 (들)은 세포주기를 종료 및 분화 신경 세포에 선조에서 전환하고, 내부 EGL에서 관련 postmitotic 접선 마이그레이션뿐만 아니라 나중에 스위치방사형 마이그레이션 이해 불완전하게 남아있다. 이는 EGL의 실험 다루기 힘듦의 큰 정도이다 늦은 개발과 같은 신경성 분자의 많은 중요한 앞서 과립 전구체의 삶에서 마름모꼴 립에서 또한 때문에 유전자 타겟팅하기 어렵다. 이 문제를 극복하기 위해, 다수의 저자는 설치류 43-48에서 출생 후 소뇌를 대상으로하는 방법으로 생체와 생체 전기에서 개발했습니다. 여기에, 우리는 비용과 편의성면에서 상당한 이점을 나타내는 EGL을 공부 병아리에 생체 전기의 사용을 개척. 전기와 병아리 소뇌 조직의 생체 슬라이스 문화의 우리의 방법은 14 병아리 EGL 증식의 절정에 배아 날로부터 조직 해부 사용합니다. 이 방법은 마름모꼴 립의 독립적 EGL 유전자의 표적화를 허용하고 과립으로부터의 전이 유전자 해부 스테이지를 설정한다소뇌에 postmitotic 과립 신경 세포에 전구.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">McIlwain tissue chopper</td>
			<td style="width:71px;">Mickle Laboratory Engineering Ltd</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Cut at 300&#956;m for best results.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Basal Medium Eagle (Gibco)</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">41010-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.4&#956;m culture insert</td>
			<td style="width:71px;">Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TSS20 Ovodyne electroporator&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Intracel</td>
			<td style="width:119px;">01-916-02</td>
			<td>Use 3x10v, 10ms pulses for electroporation.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo culture of chick cerebellar slices and spatially targeted electroporation of granule cell precursors

소뇌 외부 과립 층 (EGL)이 개발 뇌에서 가장 큰 교통 증폭의 사이트 및 신경 세포의 증식 및 분화 연구를위한 훌륭한 모델입니다. 또한, 자사의 증식 능력의 진화 적 수정은 소뇌 척추 동물의 뇌의 EVO-DEVO 연구를위한 훌륭한 모델을 만들고, 양막 류 (amniotes)에서 소뇌 크기의 극적인 확장을위한 책임이있다. EGL의 구성 세포, 소뇌 과립 전구 세포는 또한, 수 모세포종에 대한 가장 일반적인 소아 종​​양 신경 기원의 상당한 셀을 나타낸다. 교통 증폭 다음, 과립 전구체은 성숙한 포유류의 뇌에서 가장 큰 신경 인구를 대표하는 소뇌의 내부 세분화 된 계층에 반경 방향으로 이동한다. 병아리, EGL 증식의 피크는 임신의 두 번째 주 끝으로 발생합니다. 이 층에서 유전 적 변형을 타겟팅하기 위해서확산의 피크, 우리는 배아의 날 (14) 병아리 배아에서 소뇌 조각의 생체 전기를 통해 유전자 조작하는 방법을 개발했다. 이 방법은 생체 내 과립 신경 발달의 여러 중요한 양상을 되풀이되었습니다 소뇌 과립 세포 증식 및 분화에 대한 철저한 이해를 생성하기에 유용 할 것이며, 따라서 소뇌 개발, 질병의 진화.

이 섹션에서는 배아의 날 (14) 병아리에서 슬라이스 전기 및 소뇌의 문화를 사용하여 얻을 수있다 결과의 예를 보여줍니다. 소뇌의 박리는도 1에 도시되어 설정 일렉트로 포 레이션 챔버는도 2에 도시되어있다. 우리가 성공적으로 시험 관내에서 (도 3a)을 그 구조 및 셀룰러 모폴로지를 유지 배양 소뇌 슬라이스, electroporate 및하?...

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Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

소뇌 외부 과립 층은 개발 뇌에서 가장 큰 교통 증폭의 사이트입니다. 여기, 우리는 배아의 날 (14) 병아리 배아에서 생체 전기와 소뇌 조각의 문화를 사용하여 확산의 절정에이 계층에 유전자 변형을 대상으로하는 프로토콜을 제시한다.

예 생체 병아리 소뇌 조각의 문화가 공간적으로 Electroporation에 과립 세포 전구체의 표적

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

9.2K 조회수.  King's College London.  소뇌 외부 과립 층은 개발 뇌에서 가장 큰 교통 증폭의 사이트입니다. 여기, 우리는 배아의 날 (14) 병아리 배아에서 생체 전기와 소뇌 조각의 문화를 사용하여 확산의 절정에이 계층에 유전자 변형을 대상으로하는 프로토콜을 제시한다. 