Bu makalede sunulan yöntem BBSRC BB / tarafından finanse edilen çalışma ortaya çıktı I021507 / 1 (TB, RJTW) ve MRC doktora öğrencilik (MH).

Not: Bütün deneyler King College London, İngiltere ve İngiltere Home Office hayvan bakımı kurallarına uygun gerçekleştirilmiştir. E14 Serebellumunda 1. Diseksiyon <ol><li> Embriyonik Gün 14-38 ° C&#39;de kahverengi döllenmiş tavukların yumurtalarını kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> Kullanımı yumurta makas ovo civciv embriyo başını kesmek ve buz PBS (Şekil 1A) içeren bir Petri baş kaldırmak. </li><li> Standart forseps kullanarak, gözleri ve üst çene kaldırma, doku içinden her gözün arkasında tüm yol kesiler yapmak. Tüm yol alt çene (Şekil 1B) çıkarılması farenks yoluyla ikinci bir kesi yapmak. </li><li> Standart forseps kullanarak, (Şekil 1C) onu uzak soyulması ile kafatası yüzeyinden tüm cilt kaldırmak ve beyin açığa frontal ve parietal kemikler çıkarın. </li><li> Ventral açıdan, yutak kıkırdak ve yardımcı mezenşimi çıkarın. </li><li> Bir dorsal itibaren dikkatlily pia ve ayrı tüm beyin (Şekil 1D) zarar vermemeye Beyin alarak bakım mezenşimin dorsal çıkarın. </li><li> Tüm yol orta beyin ve arka beyin ve beyincik (Şekil 1E) da dahil olmak üzere ayrı Beyin arasındaki doku içinden kesi yapmak. </li><li> Tüm yol beyincik ve Beyin alar levhanın her iki yanal kavşaklarında doku içinden kesiler yaparak, diseksiyon boyunca pia bütünlüğünü (Şekil 1F) korumak için özen tüm beyincik çıkarın. Oluşturan koroid pleksusu (Şekil 1G) sökün. </li><li> Buz gibi soğuk HBSS içine disseke beyincik taşıyın. </li></ol> E14 Serebellumunda 2. Dilim Kültür <ol><li> Bir spatula ya da ucu ile 3 ml&#39;lik Pasteur pipeti kullanarak Doku Chopper steril platforma bütün beyincik transfer diyafram genişletmek için kesilmiş. Bir pipet kullanarak fazla sıvıyı çıkarın. </li><li> T tüm tüm beyincik CutO maksimum% 50 bir kesim hızı ayarlamak doku kıyıcı kullanarak 300 mikron kalınlığında yönünü gerekli. Doku bütünlüğü en kolay sagital bölümde korunur; Bununla birlikte, yönlendirme hücre analizi için önemli bir husustur (granül hücre aksonları enine çalıştırırken, Purkinje hücresi dendritler sagital Purkinje hücresi dendritler düzlemine dik olan, hizalanmaktadır). </li><li> 3 ml Pasteur pipet kullanarak, buz dilimlenmiş serebellum soğuk HBSS kapsamaktadır. </li><li> Kesme ucu ile 3 mi bir Pasteur pipeti kullanılarak buz gibi soğuk taze HBSS içeren bir 60 mm Petri kabı, HBSS içinde dilimleri aktarın. </li><li> Bir fiber optik ışık kaynağı ile aydınlatılan bir mikroskop altında, saatçilik forseps kullanılarak her dilim ayrılmasını sağlamak. Dilimleri belirleyin onların doku bütünlüğü ve medio-lateral pozisyonda dayalı, electroporated edilecek. Not: kültür ortamında inkübasyon dilim yoluyla embriyo Her diseksiyon yaklaşık 10-20 dk bağlı UPO alırn deneyim. Bu cerebella Dekapitasyon ve ex vivo kültür arasındaki minimum zaman miktarda harcama sağlamak için bir seferde diseksiyonlara birini gerçekleştirin. </li></ol> Dilimleri 3. elektroporasyonu <ol><li> Yalıtım bandı ile 60 mm Petri kabı tabanına bir Elektroporatör anot sabitleme tarafından bir elektroporasyon odasını oluşturun. Elektrot karşılamak için HBSS yaklaşık 1 ml ilave edilir. </li><li> HBSS kaplı elektrodun üstünde 0,4 um kültürü eki yerleştirin. Kültür insert elektrot her zaman uç ile elektrot arasında orada temasa olduğundan emin yapma dinlenmek için izin verin. Not: Bu ayarda, dilim kültür eklemek devresini korumak ama katot mekansal hedefleme sağlayan, çözüm yüzey üzerine duracaktır. </li><li> Aktarım tespit dilimleri (kültür insert başına beş adede kadar) kesme ucu ile 3 ml Pasteur pipeti kullanarak kültür eklemek üzerine. Ayrı bir sagitt kültür insert üzerine yerleşmek için izinal yönelim. </li><li> Dilimler, artık çözelti içinde kalmış, böylece, bir pipet kullanarak, fazla HBSS çıkarın. </li><li> Bir dilim hedeflenen bölgenin yüzeyi üzerinde 20% hızlı yeşil ile seyreltildi (1 ug / ul bir konsantrasyonda) P10 pipet, pipet DNA kullanılarak. % 20 hızlı yeşil viskoz DNA çözümü sağlar ve prohibitively DNA&#39;nın geniş dağılma önler. Her bir dilim (Şekil 2B), yaklaşık 5 ul DNA / hızlı yeşil bir çözelti ekleyin. </li><li> İstediğiniz hedeflenen doku üzerinde katot yerleştirin ve 3 x 10 V, 10 msn süreli darbeleri ile electroporate. Doku ile katot doğrudan temastan kaçının. Bunun yerine, iletkenlik korumak (aslında doku dokunmadan mümkün olduğunca dokuya yakın katot yerleştirin) sıvının yüzey gerilimi yararlanın. </li><li> Istediğiniz gibi her serebellar dilim EGL birden bölgelerine DNA teslimat ve elektroporasyon tekrarlayın. </li><li> Elektroporasyon tamamlanması, devir kültür INSE üzerine30 mm Petri kabı rt. </li><li> Glikoz,% 1 B27 takviyesi, 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penisilin - (+) - her bir kültür için, önceden ısıtılmış bir kültür ortamı (Basal Medium Eagle 1 ml% 0.5 (w / v) D ekleme Kültür uç ortamı ile temas halindedir, ancak dilimleri içinde banyo değildir, öyle ki kültür eklemek altında 100 ug / ml streptomisin). </li><li> Kadar 3 gün boyunca 37 ° C /% 6 CO2 kültürlerin inkübe edin. Kültür ortamı, taze, önceden ısıtılmış ortam ile, her 24 saat tüm değiştirin. </li><li> Kültür no kültür ortamı taze bir 30 mm çanak (4 ° C de veya O / N)% 4 paraformaldehid içinde 1 saat süre ile ekler kültürün ardından, dilimleri düzeltin. </li></ol> Serebellar Dilimleri 4. Görüntüleme <ol><li> Tespit sonra, PBS içinde 5 dakika boyunca dilimleri 3 kez yıkayın. </li><li> Bir jilet kullanarak, dilim etrafında kesme ve dilim ve yapıştırılan parçanın bölgesini kaldırarak kültür insert her Electroporated ve kültürlü serebellar dilim teşrih. Yapmakkültür insert yüzeyinden dilim çıkarmayı denemeyin. </li><li> Bir lamel alarak bakım altında (istenirse) DAPI içeren montaj orta yaklaşık 1 ml Mount dilimleri kabarcıkları tanıtmak için değil, ve görüntü lazer tarama konfokal mikroskopi kullanılarak. Not: Görüntüleme parametreler elektropore yapılara göre farklılık ve bireysel kullanıcı takdirine edilebilir. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Burada rapor edilen protokol kesme electroporating ve piliç embriyonik gün 14 beyincik dilimleri kültürlenmesi için bir yöntemi anlatmaktadır. Bu protokol, bireysel serebellar lob izole hedefleme dahil EGL küçük odak bölgelerinde, elektroporasyon hedefleme sağlar. Bu yüksek çözünürlük ve kolaylık genetik analiz ve görüntüleme sağlar ve düşük maliyetle kemirgenler 43-47 kurulan tekniklere göre. Böyle bir analiz sonucu değişiklikler EGL etkileyebilir demektir uzatılmış gelişim ...

Beyincik Beyin ön ucunda oturur ve olgun beyindeki duyu ve motor işleme entegrasyonu sorumlu yanı sıra yüksek bilişsel süreçleri 1 düzenleyen olduğunu. Memeliler ve kuşlar, bu yetişkin beyindeki nöronların yarıdan fazlası ürettiği gelişimi sırasında, atalarıdır geniş geçiş amplifikasyon ürünü ayrıntılı bir morfoloji sahip ve ağır foliated edilir. Beyincik yüzyıllardır Nörobiyologlar ve moleküler çağda çalışmanın konusu olmuştur aynı şekilde önemli dikkat çekmiştir. Bu, özünde ilginç biyoloji, ama aynı zamanda ağır gibi en yaygın pediatrik beyin otizm spektrum bozuklukları 2 ve en belirgin serebellar kanser, medulloblastoma 3 gibi gelişimsel genetik bozukluklar da dahil olmak üzere insanlara hastalık bulaştıran gerçeği değil sadece ilgilidir tümör. Önemlisi, bu wh içinde mükemmel bir model sistemich beyin gelişimi 4 sırasında kaderi tahsisi ve nörogenezi incelemek için. Son yıllarda, aynı zamanda omurgalı phylogeny 5-10 arasında görülen serebellar formların büyük çeşitlilik nedeniyle, beyin gelişiminin karşılaştırmalı çalışma için bir model sistem olarak kurulmuştur. Beyincik Beyin 11&#39;de rhombomere 1 dorsal yarısından itibaren gelişir ve gelişimsel iki ana progenitör popülasyonları, eşkenar dudak ve ventriküler zon oluşur. Eşkenar dudak çatı plakası sınırındaki Beyin ve neuroepithelium dorsal bölgenin çevresinde uzanır. Bu beyincik 12-14 glutamaterjik eksitatör nöronların doğduğu yerdir. Ventriküler bölge en belirgin inhibitör GABAerjik serebellar nöronların, büyük Purkinje nöronları 14,15 yol açar. Daha sonra geliştirme (fare embriyonik gün 13.5 ila yaklaşık, civciv 16 e6), glutamaterjik ProGenitors eşkenar dudaktan teğet göç ve atalarıdır bir pial bir tabaka oluşturur: ikincil progenitör bölgesi dış granül tabakası (EGL) çağırdı. Olgun beyinde bulunan granül nöronların büyük sayılara neden kapsamlı geçiş amplifikasyon uğrar bu tabakadır. EGL çoğalma uzun hücre döngüsü çıkışı ve ortasına dış EGL katmandan kendi çıkış ile bağlantılıdır progenitörlerin nöronal farklılaşma anahtarıyla, eşkenar dörtgen şeklinde dudak 17 Tanjansiyal göç kaynaklanan alt Pial konumu ile bağlantılı olmuştur EGL 18. Medial-lateral ekseninde post-mitotik granül hücrelerinin Geniş teğet göç olgun serebellar korteksin iç granül tabakası içine son radyal göç öncesi, orta ve iç EGL 19 oluşur. Serebellar yüzey üzerinde eşkenar dudak hücrelerin göç pia 20-22 den CXCL12 sinyalizasyon bağlıdır </sup&gt; Ve granül hücrelerinin CXCL12 reseptörü CXCR4 ifade eder. Onların teğet migrasyon inhibitör interneuron popülasyonları 23-25 ​​göç neokortikal teğet o böylece anımsatıyor. Şaşırtıcı, elektron mikroskobik çalışmalar 17 proliferatif morfolojiye sahip EGL hücreleri memeli korteks 26 bazal atalarıdır anımsatan tarzda çoğalma yeteneği ile hücre davranışını bağlayan, pial temas halinde olduğunu ileri sürmüşlerdir. Bu 18 imzaların granül ön farklı gen ekspresyonunu sahip farklı hücre dışı durumlar tarafından tanımlanan üç alt katmanlar halinde EGL yukarıda belirtilen tabakalaşma yansıtılır. OEGL progenitörlerin Çoğalma atalarıdır bireysel genetik fare embriyonik gelişim sonunda etiketli, onlar 250-500 postmitotic g medyan ortalama doğuran şekilde klon boyutları normal dağılım oluşurranule nöronlar 27,28. Çoğalma Purkinje nöronları 29-32, altta yatan mitojenik SHH sinyallemesinin bağlıdır. SHH&#39;nin cevap verme transkripsiyon faktörünün Atoh1 hücre bağımsız ekspresyonu üzerine tamamen bağlı olduğu gösterilmiştir, in vitro ve in vivo 33 34,35 hem de. Benzer şekilde, hücre döngüsü çıkışı ve farklılaşması olasılıkla Atoh1 37 doğrudan bir bastırıcısıdır alt transkripsiyon faktörü NeuroD1 36, ifadesine bağımlı olduğu gösterilmiştir. Hücre döngüsü çıkışına 38-42 hücre biyolojik temelini çözmekte bu ilerleme ve önemli ilerleme olmasına rağmen, karar altında yatan temel moleküler mekanizma (lar) hücre döngüsünü çıkmak için bir ayırt nöron bir progenitör geçiş için, ve İç EGL de ilişkili postmitotic teğet göç yanı sıra, daha sonra anahtarradyal göç, anlaşılan eksik kalır. Bu, EGL deneysel inatçılığı büyük ölçüde: geç gelişen ve aynı nörojenik moleküllerin pek çoğu önemli önceki granül öncülerinin hayatta eşkenar paralel dudak altındadır beri genetik hedef zordur. Bu sorunu aşmak için, sayısız yazar kemirgenler 43-48 doğum sonrası beyincik hedeflemek için bir yöntem olarak in vivo ve ex vivo elektroporasyon gelişmiştir. Burada, maliyet ve kolaylık açısından önemli avantajlar temsil EGL, incelemek için civciv ex vivo elektroporasyon kullanımını öncülük. Elektroporasyon ve civciv serebellar doku ex vivo dilim kültürü Bizim yöntemi 14 civciv EGL çoğalması zirvesinde embriyonik Gün doku disseke kullanır. Bu yöntem, eşkenar dudak bağımsız EGL genetik hedefleme izin verir ve granül geçişin genetik diseksiyon için sahne koyacaktırbeyincik postmitotic granül nöron progenitör.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">McIlwain tissue chopper</td>
			<td style="width:71px;">Mickle Laboratory Engineering Ltd</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Cut at 300&#956;m for best results.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Basal Medium Eagle (Gibco)</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">41010-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.4&#956;m culture insert</td>
			<td style="width:71px;">Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TSS20 Ovodyne electroporator&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Intracel</td>
			<td style="width:119px;">01-916-02</td>
			<td>Use 3x10v, 10ms pulses for electroporation.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo culture of chick cerebellar slices and spatially targeted electroporation of granule cell precursors

Serebellar dış granül tabakası (EGL) gelişmekte olan beyinde büyük Transit büyütme site ve nöronal çoğalmasını ve farklılaşmasını çalışmak için mükemmel bir model. Buna ek olarak, çoğalma yeteneği evrimsel değişiklikler beyinciği omurgalı beynin evo-devo çalışmaları için mükemmel bir model haline amniotları serebellar büyüklükte dramatik genişleme sorumlu olmuştur. EGL kurucu hücreleri, serebellar granül ataları da, Medulloblastoma için en yaygın pediatrik nöronal tümör kökenli önemli bir hücreyi temsil etmektedir. Transit amplifikasyon ardından, granül öncüleri olgun memeli beyninde büyük nöronal nüfusu temsil beyincik iç granüler tabaka içine radyal göç. Civciv, EGL çoğalması pik gebelik ikinci hafta sonuna doğru ortaya çıkar. Bu tabakaya genetik değişimine hedeflemek içinproliferasyonunun en yüksek, embriyonik gün 14 civciv embriyolarından serebellum dilimleri ex vivo elektroporasyon yoluyla genetik manipülasyonu için bir yöntem geliştirdik. Bu yöntem, in vivo granül nöron geliştirme birkaç önemli yönlerini özetlediği ve beyincik granül hücre çoğalması ve farklılaşması tam bir anlayış oluşturmada yararlı olacaktır ve böylece beyincik geliştirme, evrim ve hastalığın.

Bu bölüm, embriyonik gün 14 hatundan kesit elektroporasyon ve beyincik kültürü kullanılarak elde edilebilir sonuçlarının örneklerini göstermektedir. Beyincik diseksiyon Şekil 1 içinde tasvir edilmektedir ve ayarlamak elektroporasyon haznesi, Şekil 2 &#39;de gösterilmiştir. Bu başarılı in vitro (Şekil 3A), yapı ve hücresel morfolojik korumak kültür serebellar dilimleri, elektroporasyona ve mümkün olduğ...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors at JoVE.com

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

Serebellar dış granül tabakası gelişmekte olan beyinde büyük Transit amplifikasyon sitedir. Burada, embriyonik Gün 14 civciv embriyolardan ex vivo elektroporasyon ve serebellar dilim kültürü kullanarak çoğalması zirvesinde bu tabakaya genetik modifikasyon hedeflemek için bir protokol mevcut.

Ex Vivo Chick Serebellar Dilimleri Kültür ve Mekansal Elektroporasyon granül hücre öncülerinin Hedefli

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying ...

ex-vivo-culture-chick-cerebellar-slices-spatially-targeted

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

9.2K Görüntüleme.  King's College London.  Serebellar dış granül tabakası gelişmekte olan beyinde büyük Transit amplifikasyon sitedir. Burada, embriyonik Gün 14 civciv embriyolardan ex vivo elektroporasyon ve serebellar dilim kültürü kullanarak çoğalması zirvesinde bu tabakaya genetik modifikasyon hedeflemek için bir protokol mevcut. 