La méthode présentée dans cet article est née de travaux financés par le BBSRC BB / I021507 / 1 (TB, RJTW) et une bourse d&#39;études de doctorat MRC (MH).

Remarque: Toutes les expériences ont été réalisées avec conformément au King College de Londres, Royaume-Uni et les lignes directrices de soins aux animaux UK Home Office. 1. Dissection de e14 Cerebellum <ol><li> Incuber les oeufs bruns de poule fertilisés à 38 ° C à jour embryonnaire 14. </li><li> L&#39;aide de ciseaux d&#39;œufs décapitent embryon de poulet in ovo et retirer la tête d&#39;une boîte de Pétri contenant de la glace froide PBS (figure 1A). </li><li> En utilisant des pinces standard, faire des incisions derrière chaque oeil tout le chemin à travers le tissu, la suppression des yeux et de la mâchoire supérieure. Ajouter un deuxième incision tout le chemin à travers le pharynx enlever la mâchoire inférieure (figure 1B). </li><li> En utilisant des pinces standard, retirer toute la peau de la surface du crâne par éplucher loin (figure 1C) et retirer frontales et pariétales os, révélant cerveau. </li><li> Du point de vue ventrale, retirez pharyngée cartilage et mésenchyme auxiliaire. </li><li> Du point de vue dorsale, attentionLy supprimer mésenchyme dorsale du cerveau postérieur en prenant soin de ne pas endommager Pia, et tout le cerveau séparé (figure 1D). </li><li> Assurez incision tout le chemin à travers le tissu entre mésencéphale et du cerveau postérieur et cerveau postérieur séparé comprenant cervelet (figure 1E). </li><li> En faisant des incisions tout le chemin à travers le tissu à deux jonctions latérales du cervelet et de la plaque alaire du cerveau postérieur, retirez toute cervelet, en prenant soin de maintenir l&#39;intégrité de la pie au long de la dissection (figure 1F). Retirez le plexus choroïde de formation (figure 1G). </li><li> Déplacez le cervelet disséqué dans glacée HBSS. </li></ol> 2. Tranche Culture de e14 Cerebellum <ol><li> Transférer toute cervelet à la plate-forme stérile d&#39;un tissu Chopper aide d&#39;une spatule ou d&#39;un 3 ml pipette Pasteur avec le bout coupé pour élargir l&#39;ouverture. Retirer l&#39;excès de liquide à l&#39;aide d&#39;une pipette. </li><li> Couper toute entière cervelet en til nécessaire orientation à 300 um d&#39;épaisseur en utilisant le broyeur de tissu ensemble avec une vitesse de coupe à 50% du maximum. L&#39;intégrité des tissus est plus facilement conservé dans la section sagittale; Toutefois, l&#39;orientation est également un facteur important pour l&#39;analyse de cellule (dendrites des cellules de Purkinje sont sagittale alignés, tandis que les axones des cellules granulaires courent transversalement, perpendiculairement au plan de dendrites des cellules de Purkinje). </li><li> Utilisation d&#39;un 3 ml pipette Pasteur, couvrir le cervelet en tranches dans la glace HBSS froid. </li><li> Transférer les tranches dans un plat HBSS à 60 mm Petri contenant de la glace froide HBSS frais en utilisant un 3 ml pipette Pasteur avec la pointe de coupe. </li><li> Sous un microscope de dissection éclairé par une source de lumière de fibre optique, assurer la séparation des tranches individuelles aide de pinces horloger. Identifier les tranches à électroporation, en fonction de leur intégrité des tissus et la position médio-latérale. Remarque: Chaque dissection de l&#39;embryon grâce à trancher incubation dans un milieu de culture prend environ 10-20 min selon upon expérience. Effectuer dissections un à la fois pour assurer que cerebella passer un minimum de temps entre la décapitation et la culture ex vivo. </li></ol> 3. L&#39;électroporation de tranches <ol><li> Construction d&#39;une chambre d&#39;électroporation en fixant l&#39;anode d&#39;un électroporateur à la base d&#39;une boîte de Petri de 60 mm avec du ruban isolant. Ajouter environ 1 ml de HBSS pour couvrir l&#39;électrode. </li><li> Placer un insert de 0,4 um de la culture au-dessus de l&#39;électrode couvert dans du HBSS. Permettre à l&#39;insert de culture de se reposer sur l&#39;électrode en vous assurant qu&#39;il est toujours un contact entre l&#39;insert et l&#39;électrode. Remarque: Dans cette configuration, l&#39;insert de culture avec les tranches reposera sur la surface de la solution, le maintien du circuit, mais permettant un ciblage spatial de la cathode. </li><li> Tranches de transfert identifiés (jusqu&#39;à cinq par insert de culture) sur insert de culture en utilisant 3 ml pipette Pasteur avec la pointe de coupe. Indépendante et laisser reposer sur insert de culture dans un sagittorientation al. </li><li> En utilisant une pipette, éliminer l&#39;excès de HBSS sorte que les tranches ne sont plus baignés dans une solution. </li><li> En utilisant une pointe de pipette P10, de l&#39;ADN de pipette (à une concentration de 1 ug / ul), dilué avec 20% de vert rapide sur la surface de la région cible d&#39;une tranche. 20% de vert rapide assure solution d&#39;ADN visqueux et empêche prohibitif grande dispersion de l&#39;ADN. Ajouter la solution verte d&#39;environ 5 ul d&#39;ADN / rapide à chaque tranche (figure 2B). </li><li> Placez la cathode sur tissu ciblé souhaité et l&#39;électroporation avec 3 x 10 V, 10 impulsions de msec. Eviter le contact direct de la cathode avec le tissu. Au lieu de cela, profiter de la tension de surface du liquide pour maintenir la conductance (placer la cathode au plus près du tissu que possible sans le toucher du tissu). </li><li> Répétez la livraison de l&#39;ADN et l&#39;électroporation à plusieurs régions de EGL sur chaque tranche cérébelleuse individu comme souhaité. </li><li> À la fin de l&#39;électroporation, la culture de transfert Insert à 30 mm boîte de Petri. </li><li> Pour chaque culture, ajouter 1 ml de milieu de culture préchauffé (Basal Medium aigle, 0,5% (p / v) D - (+) - glucose, supplément de B27 1%, 2 mM de L-glutamine, 100 U / ml de pénicilline, 100 ug / ml de streptomycine) en dessous de l&#39;insert de culture de telle sorte que l&#39;insert de culture est en contact avec le milieu, mais des tranches ne sont pas baigné en elle. </li><li> Incuber les cultures à 37 ° C / 6% de CO2 pendant jusqu&#39;à 3 jours. Remplacez tout le milieu de culture tous les 24 heures avec un milieu préchauffé frais. </li><li> Après la culture, de fixer des tranches sur la culture insère pendant 1 h à 4% de paraformaldéhyde (ou O / N à 4 ° C) dans un plat frais de 30 mm sans les milieux de culture. </li></ol> 4. Imagerie de cervelet tranches <ol><li> Après la fixation, laver tranches 3 fois pendant 5 min dans du PBS. </li><li> En utilisant une lame de rasoir, disséquer chaque tranche cérébelleuse électroporation et cultivée de l&#39;insert de culture en coupant autour de la tranche et en supprimant la tranche et la région de l&#39;insert, il est respecté. Fairepas tenter de retirer une tranche de la surface de l&#39;insert de la culture. </li><li> Tranches de montage dans environ 1 ml de milieu de montage contenant DAPI (si désiré) sous une lamelle en prenant soin de ne pas introduire de bulles, et de l&#39;image en utilisant le laser-microscopie confocale à balayage. Remarque: des paramètres d&#39;images peuvent être modifiées selon les constructions électroporation, et à la discrétion de l&#39;utilisateur individuel. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Le protocole présenté ici décrit une méthode pour disséquer, électroporation et la culture tranches de jour embryonnaire 14 cervelet du poussin. Ce protocole permet le ciblage de l&#39;électroporation aux petites régions focales de l&#39;EGL, y compris le ciblage isolé de lobes cérébelleux individuels. Il permet l&#39;analyse génétique et de l&#39;imagerie à haute résolution et de commodité, et à un faible coût par rapport à des techniques établies chez les rongeurs 43-47. Cette analyse es...

Le cervelet se trouve à l&#39;extrémité antérieure du cerveau postérieur et est responsable de l&#39;intégration du traitement sensoriel et moteur dans le cerveau mature ainsi que la régulation des processus cognitifs supérieurs 1. Chez les mammifères et les oiseaux, il possède une morphologie complexe et est fortement feuilleté, un produit de grande amplification des progéniteurs de transit au cours du développement, qui produit plus de la moitié des neurones dans le cerveau adulte. Le cervelet a été un sujet d&#39;étude pour les neurobiologistes pour des siècles et dans l&#39;ère moléculaire a également reçu beaucoup d&#39;attention. Cela concerne non seulement à sa biologie intrinsèquement intéressante, mais aussi au fait qu&#39;il est fortement impliqué dans les maladies humaines, y compris les troubles génétiques de développement tels que les troubles du spectre autistique 2 et plus en évidence le cancer du cervelet, médulloblastome 3, qui est le cerveau pédiatrique la plus répandue tumeur. Surtout, il est un excellent système de modèle au sein de which pour étudier la répartition de sort et la neurogenèse au cours du développement du cerveau 4. Au cours des dernières années, il a également été établi comme un système modèle pour l&#39;étude comparative du développement du cerveau, en raison de la grande diversité des formes cérébelleux vu à travers la phylogénie des vertébrés 5-10. Le cervelet se développe à partir de la moitié dorsale de rhombomère 1 dans le cerveau postérieur et de développement 11 est constitué de deux populations de cellules progénitrices primaires, la lèvre rhombique et la zone ventriculaire. La lèvre rhombique étend autour de la région dorsale de la neuroépithélium du cerveau postérieur à la frontière avec la plaque de toit. Il est le lieu de naissance des neurones excitateurs glutamatergiques du cervelet 12-14. La zone ventriculaire donne lieu à des neurones inhibiteurs GABAergiques cérébelleux, le plus en évidence les grands neurones de Purkinje 14,15. Plus tard dans le développement (d&#39;environ jour embryonnaire 13,5 chez la souris; e6 en poussin 16), glutamatergique Progenvisi- migrer tangentiellement à partir de la lèvre rhombique et forment une couche piale progéniteurs: une zone de progéniteur secondaire appelée la couche de granulés externe (EGL). Il est de cette couche qui subit l&#39;amplification très étendue de transit qui conduit à le grand nombre de neurones granulaires présents dans le cerveau mature. Prolifération dans le EGL a longtemps été associé à l&#39;emplacement du sous-pial qui résulte de la migration tangentielle à partir de la lèvre rhombique 17, avec le commutateur de sortie du cycle cellulaire et la différenciation neuronale de progéniteurs étant associée à leur sortie de la couche EGL extérieur dans le milieu EGL 18. La migration tangentielle étendue de cellules granulaires post-mitotiques dans l&#39;axe médio-latérale se produit dans la moyenne et interne EGL 19, avant la migration radiale finale dans la couche intérieure de granules du cortex cérébelleux mature. Migration de cellules de la lèvre rhombique sur la surface du cervelet dépend signalisation CXCL12 de la pie-20-22 </sup&gt; Cellules granulaires et expriment le récepteur CXCR4 CXCL12. Leur migration tangentielle est donc sans rappeler celui de la migration des populations tangentiellement néocortex des interneurones inhibiteurs 23-25. Curieusement, études au microscope électronique 17 ont suggéré que les cellules EGL avec une morphologie proliférative maintenir le contact pial, reliant le comportement des cellules avec une capacité de prolifération d&#39;une manière qui rappelle les progéniteurs basales du cortex des mammifères 26. Ceci se reflète dans la stratification précitée de la EGL en trois sous-couches qui sont définies par des environnements extracellulaires distinctes et où granulés précurseurs ont l&#39;expression du gène 18 signatures distinctes. Prolifération des progéniteurs dans la oEGL se produit avec une distribution normale des tailles de clones de sorte que lorsque les progéniteurs sont génétiquement marquées individuellement à la fin du développement embryonnaire chez la souris, ils donnent lieu à une moyenne médiane de 250 à 500 g postmitotiqueneurones ranule 27,28. Prolifération dépend de signalisation SHH mitogénique sous-jacents neurones de Purkinje 29-32. La capacité à répondre à SHH a été montré pour être entièrement dépendant de cellule autonome expression du facteur de transcription Atoh1, à la fois in vitro et in vivo 33 34,35. De même, la sortie du cycle cellulaire et de la différenciation a été démontré que l&#39;expression dépendant du facteur de transcription en aval NeuroD1 36, ce qui est probablement un répresseur directe de Atoh1 37. Malgré ces progrès, et le progrès considérable à déchiffrer la base biologique de la cellule de sortie du cycle cellulaire 38-42, le mécanisme moléculaire fondamentale (s) qui sous-tendent la décision de quitter le cycle cellulaire et la transition d&#39;un ancêtre à un neurone de différenciation, et la la migration tangentielle postmitotique associé dans le EGL intérieure ainsi que l&#39;interrupteur tardà la migration radiale, restent mal compris. Ceci est dans une large mesure en raison de l&#39;intransigeance de l&#39;EGL expérimentale: il est tard en développement et difficiles à cibler génétiquement puisque bon nombre des mêmes molécules neurogènes sont également cruciales tôt dans la vie des précurseurs de granulés à la lèvre rhombique. Pour surmonter ce problème, de nombreux auteurs ont développé in vivo et ex vivo électroporation comme une méthode pour cibler le cervelet postnatale chez les rongeurs 43-48. Ici, nous Pioneer l&#39;utilisation des ex vivo électroporation dans poussin pour étudier le EGL, ce qui représente des avantages considérables en termes de coût et de commodité. Notre méthode d&#39;électroporation et ex vivo tranche culture de tissu cérébelleux poussin utilise le tissu disséqué jour embryonnaire 14 poussins au sommet de EGL prolifération. Cette méthode permet le ciblage génétique de l&#39;EGL indépendamment de la lèvre rhombique et préparera le terrain pour la dissection génétique de la transition de granuleprogéniteur de neurone post-mitotiques granule dans le cervelet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">McIlwain tissue chopper</td>
			<td style="width:71px;">Mickle Laboratory Engineering Ltd</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Cut at 300&#956;m for best results.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Basal Medium Eagle (Gibco)</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">41010-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.4&#956;m culture insert</td>
			<td style="width:71px;">Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TSS20 Ovodyne electroporator&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Intracel</td>
			<td style="width:119px;">01-916-02</td>
			<td>Use 3x10v, 10ms pulses for electroporation.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo culture of chick cerebellar slices and spatially targeted electroporation of granule cell precursors

La couche externe de granules cérébelleux (EGL) est le site de la plus grande amplification de transit dans le cerveau en développement, et un excellent modèle pour l&#39;étude de la prolifération et de la différenciation neuronale. En outre, les modifications évolutives de sa capacité proliférative ont été responsables de l&#39;expansion spectaculaire de la taille du cervelet dans les amniotes, rendant le cervelet un excellent modèle pour les études évo-dévo du cerveau des vertébrés. Les cellules constitutives de l&#39;EGL, progéniteurs granulaires du cervelet, représentent également une cellule d&#39;origine significatif pour le médulloblastome, la tumeur pédiatrique neuronale la plus répandue. Après un transit amplification, précurseurs granules migrent radialement dans la couche granulaire interne du cervelet où ils représentent la plus grande population de neurones dans le cerveau des mammifères mature. En poussin, le pic d&#39;EGL prolifération se produit vers la fin de la deuxième semaine de gestation. Afin de cibler la modification génétique de cette couche aule pic de la prolifération, nous avons développé une méthode de manipulation génétique par électroporation ex vivo de tranches de cervelet de jour embryonnaire 14 embryons de poulet. Ce procédé reprend plusieurs aspects importants de granule développement in vivo de neurones et sera utile pour générer une compréhension approfondie de la prolifération des cellules du cervelet de granulés et de la différenciation, et donc du développement de cervelet, l&#39;évolution et la maladie.

Cette section présente des exemples de résultats qui peuvent être obtenus en utilisant tranche électroporation et la culture du cervelet jour embryonnaire 14 poussin. La dissection du cervelet est illustré sur la Figure 1 et la chambre d&#39;électroporation mis en place est représenté sur la Figure 2. On montre qu&#39;il est possible pour l&#39;électroporation et avec succès la culture des tranches de cervelet, qui conservent leur structure et ...

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Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

La couche de granules cérébelleux externe est le site de la plus grande amplification de transit dans le cerveau en développement. Ici, nous présentons un protocole de cibler la modification génétique de cette couche au sommet de la prolifération utilisant ex électroporation et la culture de tranches de cervelet vivo à partir embryonnaires Jour 14 embryons de poulet.

Culture ex vivo de Chick cervelet tranches et spatialement ciblées électroporation de granules précurseurs de cellules

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

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