O método apresentado neste artigo surgiu de trabalho financiado pelo BBSRC BB / I021507 / 1 (TB, RJTW) e uma bolsa de estudo de doutorado MRC (MH).

Nota: Todas as experiências foram realizadas com acordo de Kings College London, Reino Unido e as orientações de cuidados de animais UK Home Office. 1. Dissecção da e14 Cerebelo <ol><li> Incubar ovos de galinha fertilizados marrom a 38 ° C para o dia 14 embrionário. </li><li> Usando uma tesoura de ovos decapitam embrião de galinha in ovo e remover a cabeça para uma placa de Petri contendo PBS gelado (Figura 1A). </li><li> Utilizando uma pinça standard, fazer incisões atrás de cada olho todo o caminho através do tecido, remover os olhos e maxilar superior. Adicione uma segunda incisão todo o caminho através da faringe remoção do maxilar inferior (Figura 1B). </li><li> Utilizando uma pinça padrão, retire toda a pele da superfície do crânio por descascar-lo fora (Figura 1C) e remover os ossos frontal e parietal, revelando cérebro. </li><li> De um aspecto ventral, remover cartilagem faríngea e mesenchyme auxiliar. </li><li> De um aspecto dorsal, cuidadosaly remover mesênquima dorsal para o hindbrain tomando cuidado para não danificar pia, eo cérebro inteiro em separado (Figura 1D). </li><li> Faça incisão todo o caminho através do tecido entre mesencéfalo e rombencéfalo e hindbrain separada, incluindo cerebelo (Figura 1E). </li><li> Ao fazer incisões todo o caminho através do tecido em ambas as junções laterais do cerebelo e placa alar do cérebro posterior, retire cerebelo inteiro, tendo o cuidado de manter a integridade da pia em todo dissecção (Figura 1F). Remover o plexo coróide de conformação (Figura 1G). </li><li> Mova o cerebelo dissecados em gelo frio HBSS. </li></ol> 2. Fatia Cultura da e14 Cerebelo <ol><li> Transferir todo o cerebelo para a plataforma de um tecido estéril Chopper utilizando uma espátula ou uma pipeta de Pasteur de 3 ml com a ponta cortada para alargar a abertura. Remover o excesso de líquido, utilizando uma pipeta. </li><li> Cortar em todo o cerebelo inteiro tele necessária orientação em 300 uM de espessura usando o cortador de tecido fixado com uma velocidade de corte de 50% do máximo. Integridade do tecido é mais facilmente preservados em corte sagital; No entanto, a orientação é também uma consideração importante para a análise de células (células de Purkinje são dendritos sagital alinhados, enquanto axónios de células granulares correr de forma transversal, perpendicular ao plano de dendrites de Purkinje). </li><li> Usando um 3 ml Pasteur pipeta, cobrir o cerebelo cortado no gelo frio HBSS. </li><li> Transfira as fatias em HBSS para um prato de 60 milímetros Petri contendo gelo fresco frio HBSS com uma pipeta Pasteur 3 ml com ponta de corte. </li><li> Sob um microscópio de dissecação iluminado com uma fonte de luz de fibra óptica, garantir a separação de fatias individuais usando uma pinça relojoeiro. Identificar fatias para ser electroporado, com base na sua integridade do tecido ea posição medio-lateral. Nota: Cada dissecação de embriões através de cortar incubação em meio de cultura leva cerca de 10-20 minutos, dependendo upon experiência. Realizar dissecções um de cada vez para assegurar que cerebelos passar quantidade mínima de tempo entre a decapitação e cultura ex vivo. </li></ol> 3. Eletroporação de Slices <ol><li> Construir uma câmara de electroporação, pela fixação do ânodo de um electroporador à base de uma placa de Petri 60 mm, com fita de isolamento. Adicionar cerca de 1 ml de HBSS a cobrir o eléctrodo. </li><li> Coloque uma inserção de cultura de 0,4 um no topo do eléctrodo coberto em HBSS. Permitir a inserção de cultura para descansar no eletrodo ter certeza que não é sempre contato entre a pastilha eo eletrodo. Nota: Nesta configuração, a inserção de cultura com as fatias repousará sobre a superfície da solução, mantendo-se o circuito, mas permitindo a selecção especial do cátodo. </li><li> Transferência de fatias identificadas (até cinco por inserção de cultura) na inserção de cultura utilizando 3 ml pipeta Pasteur com a ponta cortada. Separado e deixa-se repousar para inserção da cultura em um sagittorientação ai. </li><li> Usando uma pipeta, remover o excesso de HBSS a fim de que as fatias não são banhadas em solução. </li><li> Utilizando uma ponta de pipeta P10, ADN pipeta (a uma concentração de 1 ug / uL), diluída com 20% de verde rápido através da superfície da região alvo de uma fatia. 20% verde rápido garante solução de ADN viscoso e evita proibitivamente grande dispersão de DNA. Adicionar cerca de 5 ul de ADN / rápido solução verde para cada fatia (Figura 2B). </li><li> Coloque o cátodo sobre o tecido alvo desejado e electroporate com 3 x 10 V, 10 pulsos mseg de duração. Evitar o contacto directo do cátodo com o tecido. Em vez disso, tomar vantagem da tensão superficial do líquido para manter a condutância (o cátodo colocar o mais próximo possível do tecido quanto possível, sem realmente tocar no tecido). </li><li> Repetir a entrega de ADN e electroporação que regiões múltiplas da EGL em cada fatia cerebelar indivíduo como desejado. </li><li> Após a conclusão da eletroporação, cultura transferência inseRT a 30 mm numa caixa de Petri. </li><li> Para cada cultura, adicionar 1 ml de meio de cultura pré-aquecido (Meio Basal de Eagle, 0,5% (w / v) de D - (+) - glucose, 1% de suplemento B27, 2 mM de L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina) por baixo da inserção de cultura de tal modo que a inserção de cultura está em contacto com o meio, mas não fatias são banhadas nele. </li><li> Incubar as culturas a 37 ° C / 6% de CO 2 durante 3 dias. Substituir todo o meio de cultura a cada 24 horas com meio fresco pré-aquecido. </li><li> Após a cultura, em cultura de fatias de fixar insere durante 1 hora em 4% de paraformaldeído (ou O / N a 4 ° C) em 30 de um novo prato mm sem meios de cultura. </li></ol> 4. Criação de Imagens de Cerebelar Slices <ol><li> Após a fixação, as fatias lavar 3 vezes durante 5 min em PBS. </li><li> Usando uma lâmina de barbear, dissecar cada fatia cerebelar electroporado e cultivados a partir da inserção de cultura, cortando ao redor da fatia e de retirar a fatia e região de inserção é respeitado. Faznão tente remover fatia a partir da superfície da lâmina de cultura. </li><li> Fatias de montagem em cerca de 1 ml de meio de montagem contendo DAPI (se desejado) sob uma lamela tomando cuidado para não introduzir bolhas e imagem usando microscopia confocal de varredura a laser. Nota: Os parâmetros de imagem podem variar de acordo com as construções eletroporados, e ao critério do utilizador individual. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

O protocolo aqui relatado descreve um método para a dissecação, electroporating e cultura de fatias de embrionário do dia 14 a partir do cerebelo de pinto. Este protocolo permite a segmentação de eletroporação para pequenas regiões focais do EGL, incluindo isolado direcionamento dos lóbulos do cerebelo individuais. Ele permite a análise genética e de imagem com uma resolução elevada e conveniência, e de baixo custo em comparação com técnicas estabelecidas em roedores 43-47. Essa análise nã...

O cerebelo fica no final anterior da parte posterior do cérebro e é responsável pela integração do processamento sensorial e motor no cérebro maduro, bem como regulando processos cognitivos superiores 1. Nos mamíferos e aves, que possui uma morfologia elaborada e é fortemente foliados, um produto de grande amplificação trânsito de progenitores durante o desenvolvimento, que produz mais de metade dos neurónios no cérebro adulto. O cerebelo tem sido um tema de estudo para os neurobiólogos durante séculos e na era molecular recebeu igualmente uma atenção significativa. Isto diz respeito não só à sua biologia inerentemente interessante, mas também ao fato de que ele é fortemente implicado na doença humana, incluindo doenças genéticas de desenvolvimento, como transtornos do espectro do autismo 2 e mais proeminente o câncer cerebelar, meduloblastoma 3, que é o cérebro pediátrico mais prevalente tumor. Importante, é um excelente sistema de modelo dentro which para estudar alocação destino e neurogênese durante o desenvolvimento cerebral 4. Nos últimos anos, foi também estabelecida como um sistema modelo para o estudo comparativo de desenvolvimento do cérebro, devido à grande diversidade de formas de cerebelo visto do outro lado da filogenia vertebrado 5-10. O cerebelo desenvolve a partir da metade dorsal da rhombomere 1 no cérebro posterior 11 e desenvolvente é composta de duas populações progenitoras primárias, o lábio rômbica e da zona ventricular. O lábio rhombic se estende em torno da região dorsal do neuroepitélio da hindbrain na fronteira com a placa de telhado. É o berço dos neurônios excitatórios glutamatérgicos do cerebelo 12-14. A zona ventricular dá origem a neurônios do cerebelo GABAérgicos inibitórios, o mais proeminente os neurônios de Purkinje grandes 14,15. Mais tarde, em desenvolvimento (de cerca dia embrionário 13,5 em rato; e6 em pinto 16), Progen glutamatergicitors migrar tangencialmente a partir do lábio rômbica e formar uma camada de células progenitoras pial: uma zona secundária chamada de progenitor a camada externa de grânulo (EGL). É esta camada que sofre a grande amplificação de trânsito que leva para o grande número de neurônios granulares encontrados no cérebro maduro. Proliferação na EGL tem sido ligada à localização sub-pial que resulta da migração tangencial do lábio rômbico 17, com o interruptor para sair do ciclo celular e diferenciação neuronal de células progenitoras estarem associados com a sua saída a partir da camada exterior EGL para o meio EGL 18. Migração tangencial extensivo de células granulares pós-mitóticas no eixo lateral-medial ocorre no médio e interno EGL 19, antes da migração radial final para a camada de grânulos interior do córtex cerebelar maduro. A migração de células a partir do lábio rômbico sobre a superfície do cerebelo é dependente da sinalização da CXCL12 Pia 20-22 </sup&gt; E células de grânulos de expressar o receptor CXCR4 CXCL12. Sua migração tangencial é, portanto, lembra a dos tangencialmente neocortical migrando populações interneurônio inibitórios 23-25. Curiosamente, elétrons estudos microscópicos 17 sugeriram que as células EGL com uma morfologia proliferativa manter contato pial, ligando o comportamento das células com capacidade proliferativa de uma forma que lembra os progenitores basais do córtex dos mamíferos 26. Isso se reflete na estratificação acima mencionado da EGL em três subcamadas que são definidas por ambientes extracelulares distintas e onde os precursores granulares têm expressão genética distinta assinaturas 18. A proliferação de células progenitoras no oEGL ocorre com uma distribuição normal de tamanhos de clones de tal modo que quando são individualmente progenitores geneticamente marcado no final do desenvolvimento embrionário no ratinho, o que dá origem a uma média de 250-500 g mediana pós-mitóticoneurônios ranule 27,28. Proliferação é dependente de sinalização mitogénica de SHH subjacente Purkinje neurônios 29-32. A capacidade de responder a Shh foi demonstrado ser totalmente dependente de célula expressão autónoma do factor de transcrição Atoh1, tanto in vitro e in vivo 33 34,35. Da mesma forma, sair do ciclo celular e diferenciação tem sido mostrado para ser dependentes da expressão do factor de transcrição a jusante NeuroD1 36, o qual é provável que um repressor directo da Atoh1 37. Apesar deste progresso, e avanço considerável em decifrar a base biológica do ciclo celular de células de saída 38-42, o mecanismo molecular fundamental (s) que estão subjacentes à decisão de sair do ciclo celular e para a transição de um progenitor para um neurónio de diferenciação, e a migração tangencial pós-mitótico associado na EGL interior, bem como o interruptor mais tardea migração radial, permanecem completamente compreendida. Isto é, em grande medida devido ao intractability experimental da EGL: é manifestação tardia, e difícil de atingir uma vez que geneticamente muitas das mesmas moléculas neurogénicos também são cruciais no início da vida de precursores de grânulos no lábio rômbico. Para superar este problema, vários autores desenvolveram in vivo e ex vivo, electroporação, como um método para direccionar o cerebelo pós-natal em roedores 43-48. Aqui, nós caminho o uso de electroporação em ex vivo para estudar o pintainho EGL, o que representa consideráveis ​​vantagens em termos de custo e comodidade. Nosso método de eletroporação e ex vivo cultura fatia de tecido cerebelar pintainho utiliza tecido dissecado a partir do dia embrionário 14 pintos no pico da proliferação EGL. Este método permite a segmentação genética da EGL independentemente do lábio rhombic e irá definir o cenário para a análise genética da transição do grânuloprogenitoras para neurónios de grânulos pós-mitótico no cerebelo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">McIlwain tissue chopper</td>
			<td style="width:71px;">Mickle Laboratory Engineering Ltd</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Cut at 300&#956;m for best results.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Basal Medium Eagle (Gibco)</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">41010-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.4&#956;m culture insert</td>
			<td style="width:71px;">Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TSS20 Ovodyne electroporator&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Intracel</td>
			<td style="width:119px;">01-916-02</td>
			<td>Use 3x10v, 10ms pulses for electroporation.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo culture of chick cerebellar slices and spatially targeted electroporation of granule cell precursors

A camada externa de grânulo cerebelar (EGL) é o local de maior amplificação de trânsito no cérebro em desenvolvimento, e um excelente modelo para estudar a proliferação e diferenciação neuronal. Além disso, as modificações evolutivas da sua capacidade proliferativa ter sido responsável pela dramática expansão do tamanho do cerebelo nas amniotes, tornando o cerebelo um excelente modelo para estudos evo-devo do cérebro dos vertebrados. As células constituintes da EGL, progenitores de grânulos de cerebelo, também representam um celular significativa de origem para meduloblastoma, o tumor neuronal pediátrica mais prevalente. A seguir à amplificação de trânsito, os precursores de grânulos migrar radialmente para dentro da camada granular interna do cerebelo, onde eles representam a maior população de neurónios no cérebro de mamíferos madura. Em pintainho, o pico de proliferação EGL ocorre no final da segunda semana de gestação. A fim de direccionar a modificação genética para esta camada emo pico de proliferação, temos desenvolvido um método para a manipulação genética ex vivo através de electroporação de fatias do cerebelo a partir do Dia 14 embriões de pintos embrionários. Este método recapitula vários aspectos importantes da in vivo de grânulos desenvolvimento neuronal e será útil para gerar uma compreensão completa da proliferação de células granulares do cerebelo e diferenciação, e, portanto, do desenvolvimento do cerebelo, e a evolução da doença.

Esta seção ilustra exemplos de resultados que podem ser obtidos utilizando eletroporação fatia e cultura de cerebelo de embrionário Dia 14 do pintinho. A dissecção do cerebelo é ilustrada na Figura 1 e a câmara de electroporação configuração é mostrado na Figura 2. Nós mostramos que é possível electroporate e com sucesso fatias de cerebelo de cultura, que retêm a sua estrutura e morfologias celulares <e...

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Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

A camada externa de grânulo cerebelar é o local da maior amplificação de trânsito no cérebro em desenvolvimento. Aqui, apresentamos um protocolo para direcionar modificação genética a esta camada no pico de proliferação utilizando ex eletroporação vivo e cultura de fatias de cerebelo a partir do dia 14 embriões de galinha embrionárias.

Ex Cultura Vivo de Pintainho Cerebelar Slices e voltadas para o espaço Eletroporação do grânulo precursores de células

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying ...

ex-vivo-culture-chick-cerebellar-slices-spatially-targeted

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

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