Name: generating a "humanized" drosophila s2 cell line sensitive to pharmacological inhibition of kinesin-5
Uploaded: 2016-01-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generating a "Humanized" Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5 at JoVE.com

ونود أن نشكر باتريشيا ادز ورث عن هدية من كينيسين-5 بناء. وأيد هذا العمل من منحة المعاهد الوطنية للصحة (5 R01 GM107026) لTJM والبحوث منحة رقم 5 FY13-205 من مارس من مؤسسة مليم لTJM، وكذلك بدعم من مؤسسة تشارلز H. هود، وشركة، بوسطن، MA. لTJM

1. خلايا Transfecting S2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من مثقف سابقا 25 سم 2 قارورة، إضافة α معربا عن تويولين-GFP الخلايا S2 10 إلى الحجم النهائي من 2 مل ب 100٪ confluency، والسماح لهم شبه التمسك الجزء السفلي من 35 ملم صحن زراعة الأنسجة ل حوالي 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وسائل الإعلام من الطبق. Transfect 2 ميكروغرام من Eg5-mCherry بناء 11 مع 1 مل من وسائل الإعلام شنايدر تستكمل مع 10٪ FBS (المشار إليها فيما يلي باسم سائل الإعلام شنايدر) وترنسفكأيشن الكاشف، بعد بروتوكول الشركة المصنعة. ختم الطبق مع parafilm واحتضان الخلايا عند 25 درجة مئوية لمدة 16-18 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من وسائل الإعلام شنايدر. عودة الخلايا إلى 25 درجة مئوية الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم 3 بعد ترنسفكأيشن، ونقل 500 ميكرولتر من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل إلى الجديد 35 مم طبق زراعة الأنسجة التي تحتوي على 1.5 مل من وسائل الإعلام شنايدر لتحريض الاختبار. حمل تعبيرا عن Eg5-mCherry بإضافة كبريتات النحاس 4 </sub&gt; إلى تركيز النهائي من 500 ميكرومتر. ختم طبق في Parafilm واحتضان عند 25 درجة CO / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لجعل كونكانافالين coverslips المغلفة A، ماصة حجم ما يكفي من كونكانافالين حلا (0.5 ملغ / مل المنحل في H 2 O) إلى معطف حمض غسلها ساترة، وإزالة الزائدة، والسماح للساترة للهواء الجاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 22 ملم × 22 ملم كونكانافالين المغلفة ساترة في نظيفة 35 مم طبق زراعة الأنسجة، ثم البذور 500 ميكرولتر في 100٪ confluency من الخلايا التي يسببها على ساترة والسماح للخلايا الالتزام لمدة 1 ساعة على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتحقق من Eg5-mCherry التعبير والتجمع ساترة إلى غرفة تعالى (أو وعاء التصوير المناسبة) مع وسائل الإعلام للتصوير في RT على المجهر مضان. استخدام مصادر الضوء المناسبة ومجموعات مرشح لتصور الخلايا. على سبيل المثال، والاداة المستخدمة في هذه الدراسة لديه مصدر الضوء الأبيض الصمام وEGFP (FITC / Cy2) وDSRed (TRITC / CY3) مكعبات التصفية. Eg5-mCherry يموضع إلى الأنابيب الدقيقة وغير المخصب وكالة الطاقة النوويةأقطاب ص المغزل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التأكد من أن الخلايا التعبير عن كل Eg5-mCherry وGFP-α تويولين، ونقل ما تبقى من transfected الخلايا uninduced إلى 25 سم 2 الأنسجة قارورة الثقافة التي تحتوي على 4 مل من وسائل الإعلام شنايدر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة Blasticidin S HCL في تركيز النهائي من 25 ميكروغرام / مل إلى قارورة من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل ومواصلة تقسيم في ظل وجود 25 ميكروغرام / مل Blasticidin S حمض الهيدروكلوريك حتى يتوقف موت الخلايا ويجري التأكد من تحقق للتعبير عن Eg5-mCherry بشكل دوري. احتضان خطوط الخلايا في 25 ° C الحاضنة. ملاحظة: نسبة الخلايا معربا عن زيادات Eg5-mCherry مع مرور الوقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة و transfected الخلايا مستقر، والاستمرار في تقسيم في غياب المخدرات وتجميد 12 الخلايا لاستخدامها في المستقبل. </li></ol> 2. RNA التدخل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PCR تضخيم المنطقة BP ~ 500 من Klp61F من كدنا] (LD15641) باستخدام التمهيدي مع إضافة تسلسل T7 المروج (التسلسل الموضح في قائمة المواد) أن يكونتستخدم كنموذج لالرنا المزدوج الجديلة التوليف. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشكيل أربع لردود الفعل PCR، 50 ميكرولتر لكل منهما، تحتوي على 100 نانوغرام من الحمض النووي القالب، 25 ميكرومتر لكل التمهيدي، العازلة المناسبة، والبلمرة. ضبط بروتوكول PCR على thermocycler وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة للالبلمرة في ل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجمع ونظيفة أربعة تفاعلات PCR باستخدام PCR تنظيف عدة وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. تخزين قالب نظيفة في -20 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مزدوج RNA (الرنا المزدوج الجديلة) الذين تقطعت بهم السبل من قالب باستخدام النسخ عدة T7 RNA، بعد تعليمات الشركة الصانعة. نتوقع ~ تركيز 5-15 ملغ / مل من الرنا المزدوج الجديلة. تخزين الرنا المزدوج الجديلة في -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لضربة قاضية Klp61F مع الرنا المزدوج الجديلة، تسمح للخلايا S2 معربا عن Eg5-mCherry بنسبة 25٪ confluency إلى شبه الانضمام إلى الجزء السفلي من 35 ملم الأنسجة صحن الثقافة لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وسائل الإعلام من الأطباق وإضافة 5 ميكروغرام من الرنا المزدوج الجديلة ضد Klp61F (ذبابة الفاكهة كينيسين-5) المخفف في 1 مل من مصل خالية شنايدر &quot;الصورة سائل الإعلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في احتضان RT لمدة 1 ساعة، ثم يضاف 1 مل من وسائل الإعلام شنايدر مع 10٪ FBS. احتضان الخلايا عند 25 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24 ساعة بعد العلاج الرنا المزدوج الجديلة، لحث على التعبير عن Eg5-mCherry بإضافة كبريتات النحاس 4 إلى تركيز النهائي من 500 ميكرومتر. احتضان الخلايا عند 25 درجة مئوية لمدة 24 ساعة أخرى. </li></ol> 3. يعيش التصوير خلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 22 ملم × 22 ملم كونكانافالين ساترة المغلفة في نظيفة 35 مم طبق زراعة الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور 500 ميكرولتر من الخلايا التي تم التعامل مع الرنا المزدوج الجديلة والتي يسببها O / N على كونكانافالين ساترة المغلفة، وتمكينهم من الانضمام لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع ساترة إلى غرفة تعالى (أو وعاء المناسبة) للتصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البحث عن الخلايا الإنقسامية التعبير عن كل Eg5-mCherry وGFP-α تويولين. ملاحظة: خلايا الميتوزى يعبر فقط GFP-α تويولين ينبغي أن يكون محور دوران أحادي منذ Klp61F، وهو مطلوب للقطبين المغزل، وترسيتها 10،13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الوقت الفاصل بين الصور من مغزل القطبين (على سبيل المثال، 1 الإطار في الدقيقة الواحدة) في الخلايا التعبير عن كل Eg5-mCherry وGFP-α تويولين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بينما التصوير، وإزالة وسائل الإعلام من غرفة ردة، واستبدالها مع وسائل الإعلام شنايدر تحتوي على 1 ميكرومتر STLC أكثر من 3 التبادلات الاعلامية متتالية (~ 5 مل الكل) في غرفة لتصور انهيار المغزل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتبييض المخدرات وعكس انهيار المغزل، وإزالة بعناية وسائل الإعلام التي تحتوي على STLC من غرفة ردة، ويغسل في وسائل الإعلام شنايدر 4X (المجموع 6-8 مل) قبل إعادة تعبئة غرفة ردة للمرة الأخيرة مع وسائل الإعلام الجديدة. مواصلة التصوير. </li></ol> 4. تصحيح الخطأ الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 22 ملم × 22 ملم كونكانافالين A coverslips المغلفة إلى 35 ملم أطباق زراعة الأنسجة نظيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور 500 ميكرولتر من الخلايا التي تم التعامل مع Klp61F الرنا المزدوج الجديلة على كونكانافالين ساترة المغلفة، والسماح لهم التمسك بها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الخلايا هي adherالطبعه، إضافة 1.5 مل من وسائل الإعلام شنايدر إلى كل طبق لجلب الحجم النهائي لتصل إلى 2 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلقاء القبض على الخلايا في الانقسام، إضافة MG132 إلى تركيز النهائي من 10 ميكرومتر إلى كل من الأطباق، واحتضان لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 ميكرومتر STLC واحتضان لمدة 1 ساعة للسماح لتشكيل القطب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل STLC قبل الشطف coverslips 3X مع 2 مل من وسائل الإعلام شنايدر جديدة في كل مرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان coverslips مع وسائل الإعلام شنايدر بالإضافة إلى أية عقاقير الدوائية (على سبيل المثال، أورورا كيناز مثبطات) أو DMSO كعنصر تحكم. ملاحظة: تركيزات مثبط تختلف ويجب تحديد تركيزات النهائي المناسبة من قبل المجرب. مصنوعة حلول الأسهم عادة مثل هذا أن المانع هو تمييع 1: 1000 في وسائل الإعلام. في هذه الحالة 1: 1000 تخفيف من DMSO (أو مذيب مناسب) بمثابة السيطرة على السيارة. نستخدم أورورا B المانع Binucleine 2 بتركيز نهائي 40 ميكرومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الخلايا في مختلف نقاط زمنية رس مراقبة تطور تكوين المغزل بين القطبين وتقييم الدول مرفق الحيز الحركي. لإصلاح: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف بسرعة لل coverslips مع 2 مل من 1X BRB-80. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الخلايا بإضافة 2 مل من 10٪ امتصاص العرق مخففة في 1X BRB-80 لمدة 10 دقيقة. الماصة لامتصاص العرق بعناية في غطاء الكيميائية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilize الخلايا مع 2 مل من برنامج تلفزيوني 1X + 1٪ تريتون-X لمدة 8 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الشرائح 3X مع 2 مل من 1X PBS + 0.1٪ تريتون-X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل coverslips جانب خلية تواجه حتى على ورقة من parafilm (استخدام علامة لتسمية Parafilm مناسب لتتبع الشرائح) في 150 مم طبق بتري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية لل coverslips مع 150 ميكرولتر المغلي المصل حمار (BDS)، واحتضان في RT لمدة 1 ساعة لمنع الأجسام المضادة غير محددة ملزمة. ملاحظة: وهنا، يمكن إيقاف بروتوكول تثبيت أن يستمر في مرحلة لاحقة. ويمكن تخزين Coverslips في غرفة الرطوبة عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 24 ساعة. لجعل الغرفة الرطوبة، خط حافة طبق 150 ملممع مختبر الرطب يمسح، وتغطي مع غطاء صحن بيتري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة كتلة، ولاحتضان coverslips لمدة 1 ساعة على RT مع 150 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية مخففة بشكل مناسب في BDS إلى وصمة عار لkinetochores والأنابيب الدقيقة لتركيزات النهائي من 2 ميكروغرام / مل (أو وفقا لتوصيات الشركة الصانعة) و1 ميكروغرام / مل على التوالي . ملاحظة: وهنا، يمكن إيقاف بروتوكول تثبيت أن يستمر في مرحلة لاحقة. ويمكن تخزين Coverslips في غرفة الرطوبة عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 24 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل coverslips بقوة 3x مع 500 ميكرولتر من 1X PBS + 0.1٪ تريتون-X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان coverslips لمدة 30-60 دقيقة في RT مع الأجسام المضادة الثانوية fluorophore مترافق المناسبة المخفف في BDS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل coverslips بقوة 3x مع 500 ميكرولتر من 1X PBS + 0.1٪ تريتون-X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان coverslips مع 150 ميكرولتر من BDS التي تحتوي على 1 ميكروغرام / مل دابي التركيز النهائي لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل coverslips 2X مع برنامج تلفزيوني 1X + 0.1٪ تريتون-X، وجبل جoverslips الجانب الخلية أسفل على &quot;الشريحة 3X1 مع 8 ميكرولتر من تصاعد وسائل الإعلام. طلاء زوايا بطلاء الأظافر لشل لل coverslips على الشرائح. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا صورة مع مغزل القطبين التي يتم التعبير عن Eg5-mCherry. اتخاذ سلسلة Z يتألف من 30 طائرة في 0.2 ميكرون فترات في جميع القنوات باستخدام الهدف 100X. تحليل دقيق للkinetochores والأنابيب الدقيقة لتحديد الدول المرفق (bioriented أو المرفقات syntelic). </li></ol>

<ol>
	<li>Cheeseman, I. M., Desai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+kinetochore-microtubule+interface.">Molecular architecture of the kinetochore-microtubule interface.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 33-46 (2008).</li><li>Maresca, T. J., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Welcome+to+a+new+kind+of+tension:+translating+kinetochore+mechanics+into+a+wait-anaphase+signal.">Welcome to a new kind of tension: translating kinetochore mechanics into a wait-anaphase signal.</a> J Cell Sci. 123, 825-835 (2010).</li><li>Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+kinetochore+tracking+reveals+error-prone+homologous+chromosome+biorientation+in+mammalian+oocytes.">Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes.</a> Cell. 146, 568-581 (2011).</li><li>Cimini, D., Wan, X., Hirel, C. B., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aurora+kinase+promotes+turnover+of+kinetochore+microtubules+to+reduce+chromosome+segregation+errors.">Aurora kinase promotes turnover of kinetochore microtubules to reduce chromosome segregation errors.</a> Curr Biol. 16, 1711-1718 (2006).</li><li>Lampson, M. A., Renduchitala, K., Khodjakov, A., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correcting+improper+chromosome-spindle+attachments+during+cell+division.">Correcting improper chromosome-spindle attachments during cell division.</a> Nat Cell Biol. 6, 232-237 (2004).</li><li>Schneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+derived+from+late+embryonic+stages+of+Drosophila+melanogaster.">Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster.</a> J Embryol Exp Morphol. 27, 353-365 (1972).</li><li>Learman, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NSC+622124+inhibits+human+Eg5+and+other+kinesins+via+interaction+with+the+conserved+microtubule-binding+site.">NSC 622124 inhibits human Eg5 and other kinesins via interaction with the conserved microtubule-binding site.</a> Biochemistry. 48, 1754-1762 (2009).</li><li>Liu, L., Parameswaran, S., Liu, J., Kim, S., Wojcik, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop+5-directed+compounds+inhibit+chimeric+kinesin-5+motors:+implications+for+conserved+allosteric+mechanisms.">Loop 5-directed compounds inhibit chimeric kinesin-5 motors: implications for conserved allosteric mechanisms.</a> J Biol Chem. 286, 6201-6210 (2011).</li><li>Maliga, Z., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+and+mutational+analysis+of+allosteric+Eg5+inhibition+by+monastrol.">Small-molecule and mutational analysis of allosteric Eg5 inhibition by monastrol.</a> BMC Chem Biol. 6, 2 (2006).</li><li>Goshima, G., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+microtubule-based+motor+proteins+in+mitosis:+comprehensive+RNAi+analysis+in+the+Drosophila+S2+cell+line.">The roles of microtubule-based motor proteins in mitosis: comprehensive RNAi analysis in the Drosophila S2 cell line.</a> J Cell Biol. 162, 1003-1016 (2003).</li><li>Salemi, J. D., McGilvray, P. T., Maresca, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Drosophila+cell-based+error+correction+assay.">Development of a Drosophila cell-based error correction assay.</a> Front Oncol. 3, 187 (2013).</li><li>Rogers, S. L., Rogers, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+Drosophila+S2+cells+and+their+use+for+RNAi-mediated+loss-of-function+studies+and+immunofluorescence+microscopy.">Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy.</a> Nat Protoc. 3, 606-611 (2008).</li><li>Sharp, D. J., Yu, K. R., Sisson, J. C., Sullivan, W., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+microtubule-sliding+motors+position+mitotic+centrosomes+in+Drosophila+early+embryos.">Antagonistic microtubule-sliding motors position mitotic centrosomes in Drosophila early embryos.</a> Nat Cell Biol. 1, 51-54 (1999).</li><li>Kollu, S., Bakhoum, S. F., Compton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+of+microtubule+dynamics+and+sliding+during+bipolar+spindle+formation+in+mammalian+cells.">Interplay of microtubule dynamics and sliding during bipolar spindle formation in mammalian cells.</a> Curr Biol. 19, 2108-2113 (2009).</li><li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9.">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346, 1258096 (2014).</li><li>Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+applications+of+CRISPR-Cas9+for+genome+engineering.">Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.</a> Cell. 157, 1262-1278 (2014).</li><li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology.">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nat Methods. 10, 957-963 (2013).</li></ol>

تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

تصور تصحيح الخطأ هو أسلوب قيمة لدراسة الخطوات المتبعة في هذه العملية الخلوية الهامة والمعقدة. للقيام بذلك، يتم إنشاء المرفقات الخاطئة باستخدام مثبطات عكسها، ورصدت تصحيح الخطأ على فشل الدواء. وقد تم تطوير هذا الفحص أصلا باستخدام خلايا الثقافة أنسجة الثدييات 5. ومع وجود عدد كبير من kinetochores في العديد من نموذج أنواع خلايا الثدييات يشكل تحديا في مراقبة الأحداث الفردية تصحيح الخطأ. خلايا ذبابة الفاكهة S2 تمتلك عدد قليل من 4 أزواج من kinetochores، مما يجعلها خط الخلية أكثر الأفضل لمراقبة تصحيح الخطأ. ومع ذلك، فإن العيب الرئيسي هو أن العديد من مثبطات غير فعالة في خلايا ذبابة الفاكهة S2. وهكذا، والقدرة على توليد خط خلية ذبابة الفاكهة S2 أنسنة الإنسان معربا عن كينيسين-5 يوفر أداة قيمة لدراسة تصحيح الخطأ. على الرغم من أن خلايا ذبابة الفاكهة S2 يمكن أن يكونخط الخلية أفضل لدراسة تصحيح الخطأ، والخطوات المتعددة التي ينطوي عليها الحصول على خط الخلية وهدمت الجينات الأساسية تطرح بعض التحديات التي تواجه هذه التقنية. على سبيل المثال، يمكن أن يكون كفاءة ترنسفكأيشن منخفضة جدا. إذا كانت أقل من 20٪ من الخلايا تعبر عن Eg5-mCherry، وينبغي تكرار ترنسفكأيشن كما عملية الاختيار سوف يستغرق وقتا أطول. أيضا، فإن النسبة المئوية للخلايا التعبير عن كل البروتينات الفلورية قد ينخفض ​​مع مرور الوقت. يمكن التغلب على ذلك عن طريق تقسيم الخلايا في وجود Blasticidin S حمض الهيدروكلوريك وهيغروميسين B لتحديد الخلايا معربا عن Eg5-mCherry وGFP-α تويولين، على التوالي. ومن المهم أيضا أن نلاحظ أن الخلايا ذبابة الفاكهة S2 لها orthologues إلى العديد من البروتينات البشرية و. لذا، فمن الأهمية بمكان لتحسين ظروف ضربة قاضية للبروتينات الذاتية. قد تختلف الظروف المثلى ضربة قاضية في كمية الرنا المزدوج الجديلة وطول فترة العلاج. وبالنظر إلى ظهور والتحسن السريع للكريسبر-Cas9 تكنولوجىوفاق 15-17، وتوليد خط خلية ذبابة الفاكهة مع الجين Klp61F استبداله Eg5 البشري يقدم بديلا قويا من شأنه التغلب على القيود المفروضة على ترنسفكأيشن ونهج ضربة قاضية. يوضح عملنا أن ذبابة لالبشري استبدال الجينات يجب أن يكون خيارا قابلا للتطبيق في هذه الحالة على الرغم من الكواشف اللازمة للقيام بذلك في خلايا ذبابة الفاكهة S2 يجري حاليا تطويرها. ولا يقتصر هذا الإجراء لEg5، ولكن يمكن تطبيقها على دراسة وظيفة البروتينات الأخرى ذات الاهتمام. في حالة استخدام مثبطات التي سبق لها أن أنشئت لتكون فعالة في خلايا ذبابة الفاكهة S2، هذا البروتوكول يمكن تعديلها لدراسة التأثير المباشر لمثبطات في الخلايا الحية دون القلق بشأن آثار الهدف خارج. ويمكن أيضا أن خط الخلية المنتجة باستخدام هذا البروتوكول أن تستخدم في فحص عالية الإنتاجية تحليل لتحديد الأدوية التي تستهدف البروتينات المحتملة التي ينطوي عليها تصحيح الخطأ.

الفصل المتساوي للجينوم خلال انقسام الخلايا يتطلب التفاعل الصحيح بين الحمض النووي والمغزل الأنابيب الدقيقة منسوخة. الأنابيب الدقيقة التفاعل بأنفسهم مع الكروموسومات من خلال مجموعة متكاملة من البروتينات التي تجمع في القسيم المعروفة باسم الحيز الحركي 1. التوزيع الصحيح للكروموزومات يتطلب أن kinetochores الشقيقة وbioriented، التي يرتبط كل أخت مع الأنابيب الدقيقة النابعة من أقطاب المغزل المعاكس. الحيز الحركي أنيبيب (MT كيلوطن) المرفقات التي ليست في التشكل bioriented يتم بسرعة وكفاءة زعزعة استقرار لإتاحة الفرصة لإقامة biorientation في عملية تعرف باسم تصحيح الخطأ. مقايسة تصحيح الخطأ الذي أنشئ في السابق خلايا الثدييات 5 يتطلب تجميع مغزل أحادي باستخدام مثبطات جزيء صغير عكسها ضد Eg5 (كينيسين-5). العلاج من تعاطي المخدرات يولد العديد من المرفقات syntelic الخاطئة التي بوتkinetochores ح شقيقة نعلق على نفس القطب المغزل. وفشل لاحق من هذا الدواء يسمح لرؤية عملية تصحيح الخطأ. ويمكن أن يتم فحص تصحيح الخطأ في وجود مثبطات جزيء صغير أو knockdowns لدراسة مساهمة البروتينات مرشح لتصحيح الخاطئة إرفاق ملفات KT-MT. القدرة على تصور تصحيح الخطأ في الخلايا الحية هي أداة قوية لمزيد من فهم الآلية الجزيئية تشارك في هذه العملية المعقدة. ومع ذلك، فإن عددا كبيرا من الكروموسومات الموجودة في معظم خطوط الخلايا يشكل تحديا في مراقبة الفردية إرفاق ملفات KT-MT. فإن خلايا ذبابة الفاكهة S2 يكون مثاليا لتطبيق فحص تصحيح الخطأ لأنها تحتوي على عدد قليل من 4 الكروموزومات 6، ولكن مثبطات جزيء صغير من كينيسين 5 مثل S-trityl-L-السيستين (STLC) وmonastrol 7-9 لا تؤثر التجمع المغزل أو كينيسين-5 وظيفة الحركة في خلايا ذبابة الفاكهة. وبالتالي فإننا أجناستيد خط خلية ذبابة الفاكهة S2 معربا عن كينيسين-5 البشري تحت المروج محرض التي تعتبر حساسة لكينيسين-5 مثبطات. يصف هذا البروتوكول كيفية ضربة قاضية للالذاتية ذبابة الفاكهة كينيسين-5 نديد، Klp61F، واستخدام هذا الخط خلية في خلية القاعدة تصحيح الخطأ الفحص.

<table><tbody><tr><td>Effectine Transfection Reagent</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td></td></tr><tr><td>Klp61F cDNA</td><td>Drosophila Genomic Resource Center</td><td>13690</td><td>Gene Name LD15641</td></tr><tr><td>Schneider&amp;rsquo;s Media</td><td>Invitrogen</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, certified</td><td>Invitrogen</td><td>10082-147</td><td>Heat Inactivated, US origin</td></tr><tr><td>Copper(II) Sulfate (CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma</td><td>C8027-500G</td><td>500&amp;nbsp;mM stock</td></tr><tr><td>S-trityl-L-cysteine</td><td>Sigma</td><td>164739-5G</td><td>1&amp;nbsp;mM stock in DMSO</td></tr><tr><td>Blasticidin HCl</td><td>Invitrogen</td><td>R21001</td><td>5&amp;nbsp;mg/ml stock in 1x PBS</td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>Invitrogen</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>T7 Large scale RNA Production System</td><td>Promega</td><td>P1320</td><td>The approximate dsRNA concentration from each reaction is about 5-15&amp;nbsp;&amp;micro;g/&amp;micro;l</td></tr><tr><td>Klp61F RNAi F primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>TAATACGACTCACTATAGGGTA-TTTGCGCATTATTTTAAAA</td></tr><tr><td>Klp61F RNAi R primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>TAATACGACTCACTATAGGGAT-ATTGATCAATTGAAAC</td></tr><tr><td>PCR clean-up kit</td><td>Mo Bio Laboratories, Inc</td><td>1250</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>Sigma</td><td>C5275</td><td>0.5&amp;nbsp;mg/ml solution made by dissolving in 1x PBS.</td></tr><tr><td>Boiled Donkey Serum</td><td>Jackson ImmunoResearch Labs</td><td>017-000-121</td><td>5% stock solution in 1x PHEM buffer, bring solution up to boil. Stored in 4&amp;nbsp;&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Mounting Media</td><td></td><td></td><td>20&amp;nbsp;mM Tris pH 8.0,&amp;nbsp; 0.5% &lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-propyl gallate, 90% Glycerol. Stored in 4&amp;nbsp;&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>1x BRB-80</td><td></td><td></td><td>80 mM PIPES pH 6.9; 1&amp;nbsp;mM EGTA; 1 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>White Light Source</td><td>Lumencor Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ET EGFP Filter Cube</td><td>Chroma</td><td>49002</td><td></td></tr><tr><td>DSRed Filter Cube</td><td>Chroma</td><td>49005</td><td></td></tr><tr><td>anti-NDC80 antibody&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>Custom made by the Maresca Lab</td></tr><tr><td>DM1&amp;alpha; (anti-&amp;alpha;-tubulin)</td><td>Sigma</td><td>T6199</td><td></td></tr><tr><td>anti-CID antibody</td><td>AbCam</td><td>ab10887</td><td></td></tr></tbody></table>

generating a &#34;humanized&#34; drosophila s2 cell line sensitive to pharmacological inhibition of kinesin-5

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper distribution of the genetic material requires that sister kinetochores on every chromosome become bioriented by attaching to microtubules from opposite spindle poles before progressing into anaphase. However, erroneous, non-bioriented attachment states are common and cellular pathways exist to both detect and correct such attachments during cell division. The process by which improper kinetochore-microtubule interactions are destabilized is referred to as error correction. To study error correction in living cells, incorrect attachments are purposely generated via chemical inhibition of kinesin-5 motor, which leads to monopolar spindle assembly, and the transition from mal-orientation to biorientation is observed following drug washout. The large number of chromosomes in many model tissue culture cell types poses a challenge in observing individual error correction events. Drosophila S2 cells are better subjects for such studies as they possess as few as 4 pairs of chromosomes. However, small molecule kinesin-5 inhibitors are ineffective against Drosophila kinesin-5 (Klp61F). Here we describe how to build a Drosophila cell line that effectively replaces Klp61F with human kinesin-5, which renders the cells sensitive to pharmacological inhibition of the motor and suitable for use in the cell-based error correction assay.

مطلوب Klp61F لتشكيل مغزل القطبين. كينيسين-5 البشري، Eg5، يمكن إنقاذ وظيفة Klp61F في خلايا ذبابة الفاكهة S2 (الشكل 1A و D). على إضافة المانع كينيسين-5 (STLC)، ومستويات المرتبط أنيبيب من الانخفاض محرك (1B الشكل وE)، وانهيارات المغزل، مما أدى إلى احتكار (الشكل 1C وF) في الخلايا التي تفتقر الذاتية Klp61F على رني الناجح (فيلم التكميلي 1). ومن الجدير بالذكر أن مغزل القطبين تنهار على إضافة STLC في الخلايا S2 أنسنة لكينيسين-5 النشاط غير مطلوب للحفاظ على الثنائية القطبية المغزل في الخلايا البشرية. قد يكون هذا التناقض المثير للاهتمام نتيجة للاختلافات في تداخل بين القطبين أنيبيب و / أو الاستقرار في النظم نموذج اثنين 14. كينيسين-5 تثبيط (الشكل 2A وE) يمكن ريف<html> rsed عن طريق الغسيل من المخدرات والتعافي من المغزل القطبين يمكن اتباعها مع مرور الوقت. على إزالة المانع (الشكل 2B وF)، وإعادة الزميلة-Eg5-mCherry مع ميكروتثبول بمثابة تجميع المغزل القطبين (الشكل 2C وG)، وخلايا يمكن أن تتطور إلى طور الصعود ثنائي القطب (الشكل 2D و H، فيلم التكميلي 2 ). <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/53594/53594fig1.jpg" /> الشكل 1. إضافة 1 ميكرومتر STLC يؤدي إلى مغزل أحادي في خلايا ذبابة الفاكهة S2. صور الممثل من الوقت الفاصل بين التصوير من خلية ذبابة الفاكهة S2 معربا عن Eg5-mCherry (AC) وGFP-α تويولين (DF) خلال إضافة 1 ميكرومتر STLC. وأضاف Eg5 المانع في 3 دقائق. مقياس شريط = 5 ميكرون. الطابع الزمني = دقيقة: ثانية.<html> w.jove.com/files/ftp_upload/53594/53594fig1large.jpg &quot;الهدف =&quot; _ فارغة &quot;&gt; الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/53594/53594fig2.jpg" /> الشكل 2. الإصلاحات المغزل بين القطبين على إزالة STLC. صور الممثل من الوقت الفاصل بين التصوير من خلية ذبابة الفاكهة 2 معربا عن Eg5-mCherry (AD) وGFP-α تويولين (EH) خلال تجربة STLC فشل. وجرفت STLC بها في 5 دقائق. A الإصلاحات المغزل القطبين في حدود 1 ساعة من إزالة STLC. مقياس شريط = 5 ميكرون. الطابع الزمني: الحد الأدنى: ثانية <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53594/53594fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="فيلم 1" src="/files/ftp_upload/53594/53594mov1.jpg" /> ww.jove.com/files/ftp_upload/53594/addin.mov &quot;الهدف =&quot; _ فارغة &quot;&gt; الفيلم التكميلي 1. (انقر بزر الماوس للتحميل). Widefield التصوير مضان من مثال ممثل خلية ذبابة الفاكهة S2 معربا عن Eg5-mCherry ( اليسار) وGFP-α تويولين (يمين). وأضيف 1 ميكرومتر STLC في 2 دقيقة، وأشكال المغزل احتكار في غضون 10 دقيقة بعد إضافة المانع. تم الحصول على الصور كل 1 دقيقة ولعب بمعدل 10 لقطة في الثانية مقياس بار = 5 ميكرون. <img alt="فيلم 2" src="/files/ftp_upload/53594/53594mov2.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53594/washout.mov" target="_blank">الفيلم التكميلي 2. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).</a> التصوير Widefield مضان مثالا نموذجيا للخلية ذبابة الفاكهة S2 معربا عن Eg5-mCherry (يسار) وGFP-α تويولين (يمين). تمت إزالة وسائل الإعلام التي تحتوي على 1 ميكرومتر STLC وتشطف في 5 دقائق. A الإصلاحات المغزل القطبين في حدود 1 ساعة لإزالة المانع. تم الحصول على الصور كل 1 دقيقة ولعب بمعدل 10 لقطة في الثانية. مقياس شريط = 5 ميكرون.

Watch this Scientific Journal Video about Generating a "Humanized" Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5 at JoVE.com

Generating a "Humanized" Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

توليد &quot;أنسنة&quot;<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; S2 خط خلية حساسة للالدوائية تثبيط كينيسين-5

This protocol describes how to generate a Drosophila S2 cell line that is sensitive to small molecule inhibitors of kinesin-5. The use of these cells in a cell-based error correction assay is also outlined.

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper ...

generating-humanized-drosophila-s2-cell-line-sensitive-to

Research

JoVE Journal

Biology

Generating a &#34;Humanized&#34; Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

7.2K Views.  University of Massachusetts, Amherst. This protocol describes how to generate a Drosophila S2 cell line that is sensitive to small molecule inhibitors of kinesin-5. The use of these cells in a cell-based error correction assay is also outlined. 

Video: Generating a "Humanized" Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

تعيش خلية التصوير الحسي للخلايا السليمة في الجهاز السلائف ذبابة الفاكهة شرانق

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Neuroscience

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic screening using chemical mutagens is a useful strategy for mapping mutant phenotypes to genes among Drosophila and other model organisms that share conserved cellular pathways with humans. If the mutated gene of interest is not lethal in early developmental stages of flies, a climbing assay can be conducted to screen for phenotypic indicators of decreased brain functioning, such as low climbing rates. Subsequently, secondary histological analysis of brain tissue can be performed in order to verify the neuroprotective function of the gene by scoring neurodegeneration phenotypes. Gene mapping strategies include meiotic and deficiency mapping that rely on these same assays can be followed by DNA sequencing to identify possible nucleotide changes in the gene of interest.

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

We present a protocol using a forward genetic approach to screen for mutants exhibiting neurodegeneration in Drosophila melanogaster. It incorporates a climbing assay, histology analysis, gene mapping and DNA sequencing to ultimately identify novel genes related to the process of neuroprotection.

في فيفو إلى الأمام الشاشة الوراثية لتحديد الجينات العصبية الجديدة في دروسوفيلا melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

Genetics

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Drosophila S2 cells are an important tool in studying mitosis in tissue culture, providing molecular insights into this fundamental cellular process in a rapid and high-throughput manner. S2 cells have proven amenable to both fixed- and live-cell imaging applications. Notably, live-cell imaging can yield valuable information about how loss or knockdown of a gene can affect the kinetics and dynamics of key events during cell division, including mitotic spindle assembly, chromosome congression, and segregation, as well as overall cell cycle timing. Here we utilize S2 cells stably transfected with fluorescently tagged mCherry:&#945;-tubulin to mark the mitotic spindle and GFP:CENP-A (referred to as &#8216;CID&#8217; gene in Drosophila) to mark the centromere to analyze the effects of key mitotic genes on the timing of cell divisions, from prophase (specifically at Nuclear Envelope Breakdown; NEBD) to the onset of anaphase. This imaging protocol also allows for the visualization of the spindle microtubule and chromosome dynamics throughout mitosis. Herein, we aim to provide a simple yet comprehensive protocol that will allow readers to easily adapt S2 cells for live imaging experiments. Results obtained from such experiments should expand our understanding of genes involved in the cell division by defining their role in several simultaneous and dynamic events. Observations made in this cell culture system can be validated and further investigated in vivo using the impressive toolkit of genetic approaches in flies.

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Cell divisions can be visualized in real time using fluorescently tagged proteins and time-lapse microscopy. Using the protocol presented here, users can analyze cell division timing dynamics, mitotic spindle assembly, and chromosome congression and segregation. Defects in these events following RNA interference (RNAi)-mediated gene knockdown can be assessed and quantified.

استخدام خلايا Drosophila S2 للتصوير الحي لقسم الخلايا

Drosophila S2 cells are an important tool in studying mitosis in tissue culture, providing molecular insights into this fundamental cellular process in a ...

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

Drosophila is an excellent model organism that can be used to screen compounds that might be useful for cancer therapy. The method described here is a cost-effective in vivo method to identify heterochromatin-promoting compounds by using Drosophila. The Drosophila&#39;s DX1 strain, having a variegated eye color phenotype that reflects the extents of heterochromatin formation, thereby providing a tool for a heterochromatin-promoting drug screen. In this screening method, eye variegation is quantified based on the surface area of red pigmentation occupying parts of the eye and is scored on a scale from 1 to 5. The screening method is straightforward and sensitive and allows for testing compounds in vivo. Drug screening using this method provides a fast and inexpensive way for identifying heterochromatin-promoting drugs that could have beneficial effects in cancer therapeutics. Identifying compounds that promote the formation of heterochromatin could also lead to the discovery of epigenetic mechanisms of cancer development.

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

Drosophila is a widely used experimental model suitable for screening drugs with potential applications for cancer therapy. Here, we describe the use of Drosophila variegated eye color phenotypes as a method for screening small-molecule compounds that promote heterochromatin formation.

طريقة فحص لتحديد العقاقير المعززة للهيتروكروماتين باستخدام دروسوفيلا

Drosophila is an excellent model organism that can be used to screen compounds that might be useful for cancer therapy. The method described here is a ...

A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells

We have developed a cell-based assay using Drosophila cells that recapitulates apical constriction initiated by folded gastrulation (Fog), a secreted epithelial morphogen. In this assay, Fog is used as an agonist to activate Rho through a signaling cascade that includes a G-protein-coupled receptor (Mist), a G&#945;12/13 protein (Concertina/Cta), and a PDZ-domain-containing guanine nucleotide exchange factor (RhoGEF2). Fog signaling results in the rapid and dramatic reorganization of the actin cytoskeleton to form a contractile purse string. Soluble Fog is collected from a stable cell line and applied ectopically to S2R+ cells, leading to morphological changes like apical constriction, a process observed during developmental processes such as gastrulation. This assay is amenable to high-throughput screening and, using RNAi, can facilitate the identification of additional genes involved in this pathway.

A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells

Here we describe a contractility assay using Drosophila S2R+ cells. The application of an exogenous ligand, folded gastrulation (Fog), leads to the activation of the Fog signaling pathway and cellular contractility. This assay can be used to investigate the regulation of cellular contractility proteins in the Fog signaling pathway.

تحليل يستند إلى الخلية للتحقيق غير العضلات الميوسين الثاني Contractility عبر gastrulation مطوية إشارات الطريق في المورفولوجية S2R + الخلايا

We have developed a cell-based assay using Drosophila cells that recapitulates apical constriction initiated by folded gastrulation (Fog), a secreted ...

Developmental Biology

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

ذوبان الجليد واستزراع كريوبريسيرفينج خطوط الخلايا المورفولوجية

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature and genome sequence database. Cultured Drosophila S2 cells, the product of disassociated 20-24 hour old embryos1, possess all these properties. Consequently, S2 cells are extremely well-suited for the analysis of cellular processes, including the discovery of the genes encoding the molecular components of the process or mechanism of interest. The features of S2 cells that are most responsible for their utility are the ease with which they are maintained, their exquisite sensitivity to double-stranded (ds)RNA-mediated interference (RNAi), and their tractability to fluorescence microscopy as either live or fixed cells.
S2 cells can be grown in a variety of media, including a number of inexpensive, commercially-available, fully-defined, serum-free media2. In addition, they grow optimally and quickly at 21-24&deg;C and can be cultured in a variety of containers. Unlike mammalian cells, S2 cells do not require a regulated atmosphere, but instead do well with normal air and can even be maintained in sealed flasks.
Complementing the ease of RNAi in S2 cells is the ability to readily analyze experimentally-induced phenotypes by phase or fluorescence microscopy of fixed or live cells. S2 cells grow in culture as a single monolayer but do not display contact inhibition. Instead, cells tend to grow in colonies in dense cultures. At low density, S2 cultures grown on glass or tissue culture-treated plastic are round and loosely-attached. However, the cytology of S2 cells can be greatly improved by inducing them to flatten extensively by briefly culturing them on a surface coated with the lectin, concanavalin A (ConA)3. S2 cells can also be stably transfected with fluorescently-tagged markers to label structures or organelles of interest in live or fixed cells. Therefore, the usual scenario for the microscopic analysis of cells is this: first, S2 cells (which can possess transgenes to express tagged markers) are treated by RNAi to eliminate a target protein(s). RNAi treatment time can be adjusted to allow for differences in protein turn-over kinetics and to minimize cell trauma/death if the target protein is important for viability. Next, the treated cells are transferred to a dish containing a coverslip pre-coated with conA to induce cells to spread and tightly adhere to the glass. Finally, cells are imaged with the researcher's choice of microscopy modes. S2 cells are particularly good for studies requiring extended visualization of live cells since these cells stay healthy at room temperature and normal atmosphere.

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Drosophila Schneider (S2) cells are an increasingly popular system for the discovery and functional analysis of genes. Our goal is to describe some of the microscopic techniques that make S2 cells such an increasingly important experimental system.

إعداد ذبابة الفاكهة خلايا S2 الميكروسكوب لايت

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

تثبيط البصريات الوراثية لانقباض أكتوميوسين بوساطة Rho1 في ذبابة الفاكهة

Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos

Contractile forces generated by actin and non-muscle myosin II ("actomyosin contractility") are critical for morphological changes of cells and tissues at multiple length scales, such as cell division, cell migration, epithelial folding, and branching morphogenesis. An in-depth understanding of the role of actomyosin contractility in morphogenesis requires approaches that allow the rapid inactivation of actomyosin, which is difficult to achieve using conventional genetic or pharmacological approaches. The presented protocol demonstrates the use of a CRY2-CIBN based optogenetic dimerization system, Opto-Rho1DN, to inhibit actomyosin contractility in Drosophila embryos with precise temporal and spatial controls. In this system, CRY2 is fused to the dominant negative form of Rho1 (Rho1DN), whereas CIBN is anchored to the plasma membrane. Blue light-mediated dimerization of CRY2 and CIBN results in rapid translocation of Rho1DN from the cytoplasm to the plasma membrane, where it inactivates actomyosin by inhibiting endogenous Rho1. In addition, this article presents a detailed protocol for coupling Opto-Rho1DN-mediated inactivation of actomyosin with laser ablation to investigate the role of actomyosin in generating epithelial tension during Drosophila ventral furrow formation. This protocol can be applied to many other morphological processes that involve actomyosin contractility in Drosophila embryos with minimal modifications. Overall, this optogenetic tool is a powerful approach to dissect the function of actomyosin contractility in controlling tissue mechanics during dynamic tissue remodeling.

تسليط الضوء على المؤلف: تثبيط البصريات الوراثية لانقباض الأكتوميوسين بوساطة Rho1 إلى جانب قياس التوتر الظهاري في أجنة ذبابة الفاكهة  

Actomyosin contractility plays an important role in cell and tissue morphogenesis. However, it is challenging to manipulate actomyosin contractility in vivo acutely. This protocol describes an optogenetic system that rapidly inhibits Rho1-mediated actomyosin contractility in Drosophila embryos, revealing the immediate loss of epithelial tension after the inactivation of actomyosin in vivo.

تثبيط البصريات الوراثية لانقباض أكتوميوسين بوساطة Rho1 إلى جانب قياس التوتر الظهاري في أجنة ذبابة الفاكهة

Contractile forces generated by actin and non-muscle myosin II ("actomyosin contractility") are critical for morphological changes of cells and tissues at ...

توليد "أنسنة"

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

تعيش خلية التصوير الحسي للخلايا السليمة في الجهاز السلائف ذبابة الفاكهة شرانق

في فيفو إلى الأمام الشاشة الوراثية لتحديد الجينات العصبية الجديدة في دروسوفيلا melanogaster

استخدام خلايا Drosophila S2 للتصوير الحي لقسم الخلايا

طريقة فحص لتحديد العقاقير المعززة للهيتروكروماتين باستخدام دروسوفيلا

تحليل يستند إلى الخلية للتحقيق غير العضلات الميوسين الثاني Contractility عبر gastrulation مطوية إشارات الطريق في المورفولوجية S2R + الخلايا

ذوبان الجليد واستزراع كريوبريسيرفينج خطوط الخلايا المورفولوجية

إعداد ذبابة الفاكهة خلايا S2 الميكروسكوب لايت

تثبيط البصريات الوراثية لانقباض أكتوميوسين بوساطة Rho1 إلى جانب قياس التوتر الظهاري في أجنة ذبابة الفاكهة

تثبيط البصريات الوراثية لانقباض أكتوميوسين بوساطة Rho1 إلى جانب قياس التوتر الظهاري في أجنة ذبابة الفاكهة

تثبيط البصريات الوراثية لانقباض أكتوميوسين بوساطة Rho1 إلى جانب قياس التوتر الظهاري في أجنة ذبابة الفاكهة