Biz kinesin-5 yapının hediye için Patricia Wadsworth teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, Charles H. Hood Vakfı, ınc TJM ve Araştırma Bursu sayılı TJM için Dimes Vakfı Mart ayından itibaren 5 FY13-205 yanı sıra desteğiyle bir NIH hibe (5 R01 GM107026) tarafından desteklenmiştir Boston, MA. TJM için

1. transfekte S2 hücreleri <ol><li> Önceden kültürlenmiş 25 cm2 şişeye kaynaktan, onları% 100 konfluansa 2 ml&#39;lik bir nihai hacme GFP-α-tübülin-ifade eden S2 hücreleri 10 ekleyin ve izin 35 mm doku kültürü çanağı içinde alt için yarı bağlı Yaklaşık 1 saat. </li><li> Çanak ortamı çıkarın. Eg5-mCherry Transfect 2 ug,% 10 FBS ile takviye edilmiş Schneider ortamı 11 1 ml yapı üreticinin protokolü takip edilerek, (Schneider ortamı diye değinilmektedir) ve Transfeksiyon ReaktifMaddesi. Parafilm ile çanak Seal ve 16-18 saat boyunca 25 ° C&#39;de inkübe hücreleri. </li><li> Schneider medya 1 ml ekleyin. 25 ° C inkübatör hücreleri dönün. </li><li> 3. gün post-transfeksiyon üzerine bir test indüksiyonu için Schneider ortamı 1,5 ml içeren, yeni bir 35 mm doku kültürü çanağı içinde transfekte edilmiş hücrelerin 500 ul transfer. CuSO 4 ekleyerek Eg5-mCherry ekspresyonunu indüklemek </sub&gt; 500 uM&#39;lik bir son konsantrasyon elde etmek. Parafilm çanak mühür ve 25 ° CO / N inkübe. </li><li> Konkanavalin A ile kaplı lamelleri, kaplamak için bir çözeltisi (0.5 mg / mL kadar H2O içinde çözülmüş) Concanavalin pipet yeterli hacmi oluşturmak için bir asit yıkandı lamel aşırı kaldırmak ve hava ile kurumaya lamel sağlar. </li><li> Daha sonra lamel üzerine uyarılan hücrelerin% 100 konfluansa 500 ul, tohum temiz bir 35 mm doku kültürü çanağı içinde 22 mm x 22 mm konkanavalin A ile kaplı lamel yerleştirin ve hücreler oda sıcaklığında 1 saat yapışmaya izin verir. </li><li> , Eg5 mCherry ifade edin bir floresan mikroskop oda sıcaklığında görüntüleme medya ile bir gül haznesine lamel (ya da uygun görüntüleme gemi) bir araya getirmek için. Hücreleri görselleştirmek için uygun ışık kaynakları ve filtre setleri kullanın. Örneğin, bu çalışmada kullanılan mikroskop bir LED beyaz ışık kaynağı ve EGFP (FITC / Cy2) ve DsRed (TRITC / Cy3) filtre küpler vardır. Eg5-MCherry mikrotübüllere lokalize ve nea zenginleştirilmiştirr mili direkleri. </li><li> Olduktan sonra hücreler, Eg5-mCherry ve GFP-α-tubulin hem de ifade edilen, Schneider ortamı 4 ml ihtiva eden bir 25 cm&#39;lik 2 doku kültürü şişesine transfekte indüklenmemiş hücrelerin geri kalanı aktarın. </li><li> Transfekte edilmiş hücrelerin şişeye 25 ug / ml&#39;lik bir son konsantrasyonda Blastisidin S HCL eklenir ve hücre ölümü periyodik Eg5-mCherry ekspresyonu kontrol etmek için emin olarak sona erene kadar 25 ug / ml Blasticidin S, HCI varlığında, bölme devam etmektedir. 25 ° C inkübatör hücre hatları inkübe edin. NOT: Zamanla Eg5 mCherry artışları ifade hücrelerin yüzdesi. </li><li> Hücreler stabil olarak transfekte edildikten sonra, ilacın yokluğunda bölünmüş ve gelecekte kullanılmak üzere 12 hücreleri dondurma devam etmektedir. </li></ol> 2. RNA Girişim <ol><li> PCR olduğu (Malzeme Listesi verilen sekans) ilave T7 promotör sekansı ile primer kullanılarak cDNA&#39;nın (LD15641) için Klp61F bir ~ 500 bp&#39;lik bir bölge amplifiyedsRNA sentezi için bir şablon olarak kullanıldı. <ol><li> Şablon DNA 100 ng, her bir primer, uygun bir tampon ve polimeraz 25 uM içeren dört PCR reaksiyonları, 50 ul, her biri ayarlayın. Polimerazın üreticinin protokolüne göre PCR PCR protokolünü ayarlayın. </li><li> Havuz ve PCR üreticinin protokolüne göre kiti temizlemek kullanarak temiz dört PCR reaksiyonları. -20 ° C de, temiz bir şablon saklayın. </li></ol></li><li> Bir T7 RNA transkripsiyon kiti kullanılarak üreticinin talimatlarına şablon çift sarmallı RNA (dsRNA) hazırlayın. DsRNA&#39;nın ~ 5-15 mg / ml konsantrasyon bekliyoruz. -20 ° C&#39;de dsRNA saklayın. </li><li> DsRNA ile Klp61F demonte etmek için,% 25 birbirine karıştığında Eg5-mCherry ifade eden S2 hücreleri 1 saat boyunca 35 mm doku kültürü çanağı alt yarı uygun sağlar. </li><li> Yemekler ortamı çıkarın ve Klp61F karşı dsRNA&#39;nın 5 ug ekleyin (Drosophila kinesin-5) serum serbest Schneider 1 ml seyreltilmiş &#39;s medya. </li><li> Daha sonra% 10 FBS ile Schneider ortamı 1 ml ilave 1 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. 25 ° C&#39;de inkübe hücreleri. </li><li> 24 saat dsRNA tedaviden sonra 500 uM nihai konsantrasyona kadar CuSO 4 ekleyerek Eg5-mCherry ifadesini teşvik eder. Başka bir 24 saat daha 25 ° C&#39;de inkübe hücreleri. </li></ol> 3. Canlı Hücre Görüntüleme <ol><li> Temiz bir 35 mm doku kültürü çanağı içinde bir kaplanmış lamel konkanavalin 22 mm x 22 mm yerleştirin. </li><li> Tohum dsRNA ile muamele edilmiş ve uyarılan O / N konkanavalin kaplanmış bir lamel üzerine ve bunları, yaklaşık 1 saat yapışmaya izin olan hücrelerin 500 ul. </li><li> Görüntüleme için bir gül odasına lamel (veya uygun damarı) birleştirin. </li><li> Eg5-mCherry ve GFP-α-tubulin hem de ifade mitotik hücrelerin bulun. NOT: mili iki kutupluluğun için gerekli olan Klp61F beri monopolar iğ olmalıdır sadece GFP-α-tubulin ifade Mitotik hücreleri, 10,13 düşürülürse. </li><li> Eg5-mCherry ve GFP-α-tubulin hem ifade eden hücrelerde bipolar miller (dakika başına, örneğin, 1 kare) zaman atlamalı görüntüleri toplayın. </li><li> Görüntüleme sırasında, gül odasından ortamı çıkarın ve Schneider medya mili çöküşü görselleştirmek için odasına 3 ardışık medya alışverişi (~ 5 ml toplam) üzerinde 1 mcM STLC içeren değiştirin. </li><li> Dikkatlice gül odasından STLC içeren ortamı çıkartın ve taze medya ile gül bölmesini son bir kez yeniden doldurmadan önce Schneider medya 4x (6-8 ml toplam) yıkayın, ilaç yıkanmaya ve mil çöküşü tersine çevirmek için. Görüntüleme devam edin. </li></ol> 4. Hata Düzeltme Testi <ol><li> Temiz 35 mm doku kültürü kaplarına bir kaplanmış lamelleri konkanavalin 22 mm x 22 mm yerleştirin. </li><li> Tohum konkanavalin kaplanmış bir lamel üzerine Klp61F dsRNA ile işlemden geçirildi ve bunları uygun izin olan hücrelerin 500 ul. </li><li> Sonra hücreler adher olaned, 2 ml kadar son hacim getirmek için her yemeğin Schneider medya 1,5 ml ekleyin. </li><li> Mitoz hücreleri yakalama tabağın her birine 10 uM&#39;lik bir son konsantrasyona değin MG132 ekleyin ve 1 saat kuluçkada bırakın için. </li><li> 1 uM STLC ekleyin ve tek kutup oluşturulması için izin vermek için 1 saat süre ile inkübe edilir. </li><li> Lamelleri taze Schneider medya 2 ml her seferinde 3x durulama STLC yıkayın. </li><li> Bir kontrol olarak herhangi bir farmakolojik ajanlar (örneğin Aurora kinaz inhibitörleri) veya DMSO ilave olarak Schneider ortamı ile lamelleri inkübe edin. Not: İnhibitör konsantrasyonları, değişebilir ve uygun son konsantrasyonları deneyi ile tespit edilmelidir. Ortama: 1,000 stok çözeltileri, tipik olarak inhibitör 1 seyreltilmiştir şekilde yapılır. Bu durumda, bir 1: DMSO (veya uygun bir çözücü) içinde 1000 seyreltme araç kontrolü olarak görev yapar. Bu 40 uM&#39;lik bir son konsantrasyonda Aurora B inhibitörü Binucleine 2 kullanır. </li><li> Farklı zaman noktaları t hücreleri saptamako Bipolar iğ oluşumunun ilerlemesini gözlemek ve kinetochore eki durumlarını değerlendirmek için. Düzeltmek: <ol><li> Çabuk 1x BRB-80 2 ml lamelleri yıkayın. </li><li> 10 dakika boyunca 1 x BRB-80 içinde seyreltilmiş,% 10 paraformaldehit 2 ml ekleyerek hücreleri saptamak. Bir kimyasal kaputu dikkatle Pipet paraformaldehit. </li><li> 8 dakika boyunca 1 x PBS +% 1 Triton-X 2 ml hücreleri geçirgenliği. </li><li> Yıkama 1x PBS +% 0.1 Triton-X 2 ml ile 3 kez kayar. </li><li> Aktarım hücre tarafı 150 mm Petri kabındaki (Parafilm etiketlemek için bir işaretleyici kullanmak uygun slaytlar izlemek için) Parafilm bir levha üzerine yukarı bakacak şekilde lamelleri. </li><li> 150 ul kaynatıldı eşek serumu (BDS) ile lamelleri kaplayın ve spesifik olmayan bağlanma antikorun bloke etmek 1 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. Not: Burada tespit protokolü daha ileri bir noktada devam etmesi durdurulabilir. Lameller kadar 24 saat boyunca 4 ° C&#39;de bir nem odasında saklanır. Nem odasına yapmak için, 150 mm çanak kenarını hattııslak laboratuvar ile siliniz ve Petri kabı kapağı ile kaplayın. </li><li> Sırasıyla ug / ml, 1 (üreticinin tavsiyelerine göre ya da) bloğunu ve birincil antikor 150 ul 2 ug / ml nihai konsantrasyonları kinetokorlar ile mikro için leke BDS uygun şekilde seyreltilmiş olan, oda sıcaklığında 1 saat boyunca lamelleri inkübe . Not: Burada tespit protokolü daha ileri bir noktada devam etmesi durdurulabilir. Lameller kadar 24 saat boyunca 4 ° C&#39;de bir nem odasında saklanır. </li><li> Yıkama 1x PBS +% 0.1 Triton-X 500 ul 3x lamelleri. </li><li> BDS içinde seyreltilmiş uygun bir florofor konjuge sekonder antikor ile oda sıcaklığında 30-60 dakika boyunca lamelleri inkübe edin. </li><li> Yıkama 1x PBS +% 0.1 Triton-X 500 ul 3x lamelleri. </li><li> 5 dakika boyunca 1 ug / ml DAPI nihai konsantrasyon içeren BDS 150 ul lamelleri inkübe edin. </li><li> Lameller 2x 1x PBS +% 0.1 Triton-X yıkayın ve c monteoverslips aşağı medyayı montaj 8 ul bir 3x1 &quot;slayt hücre tarafı. Slaytlarınıza lamelleri hareketsiz için oje ile köşeleri boyayın. </li></ol></li><li> Eg5-mCherry ifade bipolar iğ Görüntü hücreleri. Bir 100X objektif kullanan tüm kanallarda 0,2 mikron aralıklarla 30 uçaklarının oluşan Z serisi atın. Dikkatle eki (iki-yönlenmeli veya syntelic ekleri) durumlarını belirlemek için kinetokorlar ve mikrotübülleri analiz. </li></ol>

<ol>
	<li>Cheeseman, I. M., Desai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+kinetochore-microtubule+interface.">Molecular architecture of the kinetochore-microtubule interface.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 33-46 (2008).</li><li>Maresca, T. J., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Welcome+to+a+new+kind+of+tension:+translating+kinetochore+mechanics+into+a+wait-anaphase+signal.">Welcome to a new kind of tension: translating kinetochore mechanics into a wait-anaphase signal.</a> J Cell Sci. 123, 825-835 (2010).</li><li>Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+kinetochore+tracking+reveals+error-prone+homologous+chromosome+biorientation+in+mammalian+oocytes.">Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes.</a> Cell. 146, 568-581 (2011).</li><li>Cimini, D., Wan, X., Hirel, C. B., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aurora+kinase+promotes+turnover+of+kinetochore+microtubules+to+reduce+chromosome+segregation+errors.">Aurora kinase promotes turnover of kinetochore microtubules to reduce chromosome segregation errors.</a> Curr Biol. 16, 1711-1718 (2006).</li><li>Lampson, M. A., Renduchitala, K., Khodjakov, A., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correcting+improper+chromosome-spindle+attachments+during+cell+division.">Correcting improper chromosome-spindle attachments during cell division.</a> Nat Cell Biol. 6, 232-237 (2004).</li><li>Schneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+derived+from+late+embryonic+stages+of+Drosophila+melanogaster.">Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster.</a> J Embryol Exp Morphol. 27, 353-365 (1972).</li><li>Learman, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NSC+622124+inhibits+human+Eg5+and+other+kinesins+via+interaction+with+the+conserved+microtubule-binding+site.">NSC 622124 inhibits human Eg5 and other kinesins via interaction with the conserved microtubule-binding site.</a> Biochemistry. 48, 1754-1762 (2009).</li><li>Liu, L., Parameswaran, S., Liu, J., Kim, S., Wojcik, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop+5-directed+compounds+inhibit+chimeric+kinesin-5+motors:+implications+for+conserved+allosteric+mechanisms.">Loop 5-directed compounds inhibit chimeric kinesin-5 motors: implications for conserved allosteric mechanisms.</a> J Biol Chem. 286, 6201-6210 (2011).</li><li>Maliga, Z., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+and+mutational+analysis+of+allosteric+Eg5+inhibition+by+monastrol.">Small-molecule and mutational analysis of allosteric Eg5 inhibition by monastrol.</a> BMC Chem Biol. 6, 2 (2006).</li><li>Goshima, G., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+microtubule-based+motor+proteins+in+mitosis:+comprehensive+RNAi+analysis+in+the+Drosophila+S2+cell+line.">The roles of microtubule-based motor proteins in mitosis: comprehensive RNAi analysis in the Drosophila S2 cell line.</a> J Cell Biol. 162, 1003-1016 (2003).</li><li>Salemi, J. D., McGilvray, P. T., Maresca, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Drosophila+cell-based+error+correction+assay.">Development of a Drosophila cell-based error correction assay.</a> Front Oncol. 3, 187 (2013).</li><li>Rogers, S. L., Rogers, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+Drosophila+S2+cells+and+their+use+for+RNAi-mediated+loss-of-function+studies+and+immunofluorescence+microscopy.">Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy.</a> Nat Protoc. 3, 606-611 (2008).</li><li>Sharp, D. J., Yu, K. R., Sisson, J. C., Sullivan, W., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+microtubule-sliding+motors+position+mitotic+centrosomes+in+Drosophila+early+embryos.">Antagonistic microtubule-sliding motors position mitotic centrosomes in Drosophila early embryos.</a> Nat Cell Biol. 1, 51-54 (1999).</li><li>Kollu, S., Bakhoum, S. F., Compton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+of+microtubule+dynamics+and+sliding+during+bipolar+spindle+formation+in+mammalian+cells.">Interplay of microtubule dynamics and sliding during bipolar spindle formation in mammalian cells.</a> Curr Biol. 19, 2108-2113 (2009).</li><li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9.">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346, 1258096 (2014).</li><li>Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+applications+of+CRISPR-Cas9+for+genome+engineering.">Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.</a> Cell. 157, 1262-1278 (2014).</li><li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology.">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nat Methods. 10, 957-963 (2013).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını var olduğunu beyan ederiz.

Hata düzeltme görselleştirme bu önemli ve kompleks hücresel süreçte yer alan adımları incelemek için değerli bir tekniktir. Bunu yapmak için, hatalı ek parça döner inhibitörleri kullanılarak oluşturulur ve hata düzeltme ilacın yıkanması sırasında gözlenir. Bu deney, ilk olarak, memeli doku kültürü hücreleri 5 kullanılarak geliştirilmiştir. Ancak birçok model, memeli hücre tiplerinde kinetokorlar çok sayıda varlığı, bireysel hata düzeltme olayları gözlemleyerek bir sorun teşkil etmektedir. Drosophila S2 hücrelerinin hata düzeltme gözlemlemek için onlara daha fazla tercih hücre hattı yapım kinetokorlar olarak az 4 olarak çift sahiptirler. Bununla birlikte, önemli bir dezavantajı, birçok inhibitörleri, Drosophila S2 hücrelerinde etkili olmasıdır. Bu nedenle, insan kinesin-5 eksprese eden bir insanlaştırılmış Drosophila S2 hücre çizgisi oluşturma yeteneği hata düzeltme incelemek için değerli bir araç sağlar. Drosophila S2 hücreleri olabilir, ancak, birhata düzeltme incelemek için daha iyi hücre hattı, hücre hattını elde etmek ve gerekli genleri aşağı vurma katılan çok sayıda adım bu tekniğin bazı zorluklar yaratıyor. Örneğin, transfeksiyon verimi oldukça düşük olabilir. Hücrelerin% 20&#39;den az Eg5-mCherry ifade ediyorsanız seçim süreci uzun sürer olarak, transfeksiyon tekrarlanmalıdır. Ayrıca, her iki floresan proteinleri eksprese eden hücrelerin yüzdesi zamanla azalabilir. Bu, sırasıyla, Eg5-mCherry eksprese eden hücreler ve GFP-α-tubulin seçilmesi için Blastisidin S HCI ve Higromisin B varlığında hücrelerin bölünmesi ile aşılabilir. Bu Drosophila S2 hücrelerinin birçok insan proteinleri ve ortologlara sahip olduğunu not etmek de önemlidir; bu nedenle, endojen proteinler için demonte koşulları optimize etmek için kritiktir. Optimal demonte koşulları dsRNA&#39;nın miktarı ve tedavinin uzunluğu değişebilir. Ortaya çıkışı ve hızla iyileşme dikkate alındığında CRISPR-Cas9 TECHNOLOGI15-17 es, insan Eg5 yerini Klp61F geni ile bir Drosophila hücre hattı nesil transfeksiyonu ve demonte yaklaşımın sınırlamaları aşmak olacağını güçlü bir alternatif sunuyor. Çalışmalarımız gerekli reaktifler halen geliştirilmekte olan Drosophila S2 hücrelerinde bunu her ne kadar sinek-insana gen değişimi bu durumda geçerli bir seçenek olması gerektiğini göstermektedir. Bu prosedür, Eg5 ile sınırlı değildir, ancak ilgi duyulan diğer proteinlerin fonksiyonu çalışma uygulanabilir. Daha önce Drosophila S2 hücrelerinde etkisiz olduğu kurulmuştur inhibitörleri kullanıyorsanız, bu protokol dışı hedef etkileri hakkında endişeler olmadan canlı hücrelerde inhibitörlerinin direkt etkisini araştırmak için modifiye edilebilir. Bu protokol kullanılarak üretilen hücre çizgisi, aynı zamanda, yüksek verimli tarama kullanılabilecek hata düzeltme katılan proteinleri hedef potansiyel ilaçlar tespit etmek analiz eder.

Hücre bölünmesi sırasında genomun Eşit ayrımı çoğaltılmış DNA ve iğ mikrotübüller arasında doğru etkileşimi gerektirir. Mikrotübüller fiziksel kinetokor oluşumunu uyarır 1 olarak bilinen sentromer çeviren proteinlerin bir topluluk sayesinde kromozomlar ile etkileşim. Kromozomların doğru dağıtım kardeş kinetokorlar burada her kardeş zıt kutuplarda iğ kaynaklanan mikrotübül ile ilişkili, iki-yönlenmeli gerektirir. Kinetochore mikrotübül (kt-MT) iki-yönde yönlendirilmiş konformasyonunda olmayan ekler hızlı ve verimli hata düzeltme olarak bilinen bir süreç içinde iki yönde yönlendirilmesi kurmak için fırsat sunmak amacıyla istikrarsızlaştırdı edilir. Daha önce, memeli hücrelerinde kurulmuş bir hata düzeltme deney 5 (kinesin-5) Eg5 karşı döner küçük molekül inhibitörleri kullanılarak tek kutuplu iğ monte gerektirir. Ilaç tedavisi hatalı syntelic ekleri çok sayıda üretir both kardeş kinetokorlar aynı iğ kutbuna bağlayın. Uygulanacak ilacın daha sonraki yıkama hata düzeltme işleminin olarak gösterebilir. Hata düzeltme tahlil hatalı kt-MT ekleri düzelterek aday proteinlerin katkısını incelemek için küçük molekül inhibitörleri veya knockdowns varlığında yapılabilir. Canlı hücreler hata düzeltme görselleştirmek için yeteneği daha bu karmaşık süreçte yer alan moleküler mekanizmayı anlamak için güçlü bir araçtır. Ancak, çoğu hücre hatlarında bulunan kromozomların çok sayıda bireysel kt-MT ekleri gözlemleyerek bir sorun teşkil etmektedir. Onlar kadar az 4 olarak kromozom 6, fakat küçük molekül inhibitörleri içerdiğinden Drosophila S2 hücrelerinin hata düzeltme deneyi uygulamak için ideal olacaktır S-tritil-L-sistein (STLC) halinde kinesin 5 ve 7-9 monastrol Drosophila hücrelerinde mili grubunu ya da kinesin-5 motor fonksiyonu etkilemez. Bu nedenle, cinslerted kinesin-5 inhibitörlerine duyarlıdır bir uyarılabilir promoterin altında insan kinesin-5 eksprese eden bir Drosophila S2 hücre çizgisi. Bu protokol, endojen Drosophila kinesin-5 homologunda, Klp61F demonte ve hücre tabanlı hata düzeltme deneyde bu hücre hattını kullanmayı açıklamaktadır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="826">
	<tbody>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:221px;">Effectine Transfection Reagent</td>
			<td style="width:184px;">Qiagen</td>
			<td style="width:167px;">301425</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:221px;">Klp61F cDNA</td>
			<td style="width:184px;">Drosophila Genomic Resource Center</td>
			<td style="width:167px;">13690</td>
			<td style="width:255px;">Gene Name LD15641</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Schneider&#8217;s Media</td>
			<td style="width:184px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:167px;">21720-024</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:221px;">Fetal Bovine Serum, certified</td>
			<td style="width:184px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:167px;">10082-147</td>
			<td style="width:255px;">Heat Inactivated, US origin</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:221px;">Copper (II) Sulfate (CuSO4)</td>
			<td style="width:184px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">C8027-500G</td>
			<td style="width:255px;">500mM stock&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">S-trityl-l-cysteine</td>
			<td style="width:184px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">164739-5G</td>
			<td style="width:255px;">1mM stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Blasticidin HCl</td>
			<td style="width:184px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:167px;">R21001</td>
			<td style="width:255px;">5mg/ml stock in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:221px;">Hygromycin B</td>
			<td style="width:184px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:167px;">10687010</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:221px;">T7 Large scale RNA Production System</td>
			<td style="width:184px;">Promega</td>
			<td style="width:167px;">P1320</td>
			<td style="width:255px;">The approximate dsRNA concentration from each reaction is about 5-15&#181;g/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:221px;">Klp61F RNAi F primer</td>
			<td style="width:184px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:255px;">TAATACGACTCACTATAGGGTA-TTTGCGCATTATTTTAAAA</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:221px;">Klp61F RNAi R primer</td>
			<td style="width:184px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:255px;">TAATACGACTCACTATAGGGAT-ATTGATCAATTGAAAC</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:221px;">PCR clean-up kit</td>
			<td style="width:184px;">Mo Bio Laboratories, Inc</td>
			<td style="width:167px;">1250</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:221px;">Concanavalin A</td>
			<td style="width:184px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">C5275</td>
			<td style="width:255px;">0.5mg/ml solution made by dissolving in 1xPBS.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:221px;">Boiled Donkey Serum</td>
			<td style="width:184px;">Jackson ImmunoResearch Labs</td>
			<td style="width:167px;">017-000-121</td>
			<td style="width:255px;">5% stock solution in 1X PHEM buffer, bring solution up to boil. Stored in 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:221px;">Mounting Media</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:255px;">20mM Tris pH 8.0,&#160; 0.5% N-propyl gallate, 90% Glycerol. Stored in 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">1x BRB-80</td>
			<td dir="LTR" style="width:184px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:255px;">80 mM PIPES pH 6.9; 1 mM EGTA; 1 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:221px;">White Light Source</td>
			<td>Lumencor Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:221px;">ET EGFP Filter Cube</td>
			<td>Chroma</td>
			<td align="right">49002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:221px;">DSRed Filter Cube</td>
			<td>Chroma</td>
			<td align="right">49005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:221px;">anti-NDC80 antibody&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Custom made by the Maresca Lab</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:221px;">DM1&#945; (anti-&#945;-tubulin)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:221px;">anti-CID antibody</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab10887</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating a &#34;humanized&#34; drosophila s2 cell line sensitive to pharmacological inhibition of kinesin-5

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper distribution of the genetic material requires that sister kinetochores on every chromosome become bioriented by attaching to microtubules from opposite spindle poles before progressing into anaphase. However, erroneous, non-bioriented attachment states are common and cellular pathways exist to both detect and correct such attachments during cell division. The process by which improper kinetochore-microtubule interactions are destabilized is referred to as error correction. To study error correction in living cells, incorrect attachments are purposely generated via chemical inhibition of kinesin-5 motor, which leads to monopolar spindle assembly, and the transition from mal-orientation to biorientation is observed following drug washout. The large number of chromosomes in many model tissue culture cell types poses a challenge in observing individual error correction events. Drosophila S2 cells are better subjects for such studies as they possess as few as 4 pairs of chromosomes. However, small molecule kinesin-5 inhibitors are ineffective against Drosophila kinesin-5 (Klp61F). Here we describe how to build a Drosophila cell line that effectively replaces Klp61F with human kinesin-5, which renders the cells sensitive to pharmacological inhibition of the motor and suitable for use in the cell-based error correction assay.

Klp61F bipolar iğ oluşturmak için gereklidir. İnsan kinesin-5, Eg5, Drosophila S2 hücrelerinde (Şekil 1 A ve D) Klp61F işlevini kurtarmak. Kinesin-5 inhibitörünün (STLC) eklenmesi üzerine, başarılı bir RNAi üzerine endogen Klp61F olmayan hücrelere bir monopol (Şekil 1C ve F) &#39;de elde edilen, motor damla (Şekil 1B ve E) ve iğ kaymalarının mikrotübüle bağlı seviyeleri (Ek film 1). Bu kinesin-5 etkisi insana ait hücrelerde mili çift kutuplu korumak için gerekli değildir, çünkü, bipolar iğ insanlaştırılmış S2 hücrelerinde STLC ilave edilmesi üzerine çökmeye olması dikkat çekicidir. Bu ilginç bir farklılık, iki model sistemlerinde 14 interpolar mikrotübül üst üste ve / veya stabilite farklılıkların bir sonucu olabilir. Kinesin-5 inhibisyonu (Şekil 2A ve E) Reve edilebilir<html> iki kutuplu bir milin ilaç ve geri kazanım yıkanarak rsed zaman içerisinde takip edilebilir. Inhibitörünün (Şekil 2B ve F) çıkarılması üzerine, Eg5-MCherry iki kutuplu bir mili kurullarının (Şekil 2C ve G) olarak mikrotubul-ortakları tekrar ve hücreler, iki kutuplu anafaz (Şekil 2D ve H, Ek film 2 içine ilerleyebilir ). <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53594/53594fig1.jpg" /> 1. Toplama 1 mcM STLC Şekil Drosophila S2 hücrelerinde monopolar miller yol açar. Temsili görüntüleri Eg5-mCherry (AC) ve GFP-α-tubulin (DF) ifade eden bir Drosophila S2 hücresi time-lapse görüntüleme 1 mcM eklenmesi sırasında STLC. Eg5 önleyicisi 3 dakika ilave edildi. Ölçek çubuğu = 5 um. Zaman Damgası = dk: sn.<html> w.jove.com/files/ftp_upload/53594/53594fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53594/53594fig2.jpg" /> Şekil 2. STLC uzaklaştırılması üzerine bir bipolar mili reformları. Bir STLC yıkama deney sırasında Eg5-mCherry (AD) ve GFP-α-tubulin (EH) ifade eden bir Drosophila 2 hücre time-lapse görüntüleme Temsilcisi görüntüler. STLC 5 dakikada yıkandı. STLC kaldırma 1 saat içinde bir bipolar mili reformları. Ölçek çubuğu = 5 um. Timestamp: dk:. Sn <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53594/53594fig2large.jpg" target="_blank">bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Film 1" src="/files/ftp_upload/53594/53594mov1.jpg" /> ww.jove.com/files/ftp_upload/53594/addin.mov &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Ek Film 1. (sağ indirmek için tıklayın). Widefield floresan görüntüleme Eg5-mCherry ifade eden Drosophila S2 hücresinin bir temsilcisi örnek ( sol) ve GFP-α-tubulin (sağ) 1 uM STLC 2 dakikada ilave edildi ve mili formları inhibitörün ilave edildikten sonra 10 dakika içinde, bir tek kutuplu. Görüntüler her 1 dakika satın almış ve 10 kare bir oranda oynamıştır. saniyede. Ölçek çubuğu = 5 mikron. <img alt="Film 2" src="/files/ftp_upload/53594/53594mov2.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53594/washout.mov" target="_blank">Ek Film 2. (Sağ indirmek için tıklayın).</a> Eg5-mCherry (solda) ve GFP-α-tubulin (sağda) ifade eden bir Drosophila S2 hücre temsili örnek Widefield floresan görüntüleme. 1 uM STLC ihtiva Ortam çıkarıldı ve5 dk çalkalandı. Inhibitörü kaldırma 1 saat içinde bir bipolar mili reformları. Görüntüler her 1 dk edinilen ve saniyede 10 kare hızında çalındı. Ölçek çubuğu = 5 um.

Watch this Scientific Journal Video about Generating a "Humanized" Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5 at JoVE.com

Generating a "Humanized" Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

Bir &quot;humanize&quot; oluşturuluyor<em&gt; Drosophila</emKinesin-5 Farmakolojik inhibisyonu için&gt; S2 Hücre Hattı Duyarlı

This protocol describes how to generate a Drosophila S2 cell line that is sensitive to small molecule inhibitors of kinesin-5. The use of these cells in a cell-based error correction assay is also outlined.

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper ...

generating-humanized-drosophila-s2-cell-line-sensitive-to

Research

JoVE Journal

Biology

Generating a &#34;Humanized&#34; Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

7.2K Görüntüleme.  University of Massachusetts, Amherst. This protocol describes how to generate a Drosophila S2 cell line that is sensitive to small molecule inhibitors of kinesin-5. The use of these cells in a cell-based error correction assay is also outlined. 

Video: Generating a "Humanized" Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an enabling experimental tool, because it can precisely manipulate fluid flows, enable high-throughput experiments, and generate stable soluble concentration gradients.  Compared to conventional gradient generators, poly(dimethylsiloxane) (PDMS)-based  microfluidic devices can generate stable concentration gradients of growth factors with well-defined profiles.  Here, we developed simple gradient-generating microfluidic devices with three separate inlets.  Three microchannels combined into one microchannel to generate concentration gradients.  The stability and shape of growth factor gradients were confirmed by fluorescein isothyiocyanate (FITC)-dextran with a molecular weight similar to epidermal growth factor (EGF).  Using this microfluidic device, we demonstrated that fibroblasts exposed to concentration gradients of EGF migrated toward higher concentrations.  The directional orientation of cell migration and motility of migrating cells were quantitatively assessed by cell tracking analysis.  Thus, this gradient-generating microfluidic device might be useful for studying and analyzing the behavior of migrating cells.

We describe a protocol for the microfabrication of the gradient-generating microfluidic device that can generate spatial and temporal gradients in well-defined microenvironment. In this approach, the gradient-generating microfluidic device can be used to study directed cell migration, embryogenesis, wound healing, and cancer metastasis.

Hücre Biyolojisi Degrade üreten mikroakışkan Aygıt

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an ...

Biyoloji

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical shock or electrical stimulation is available for study of various aspects of seizure activity and behavior. All flies, including wild-type, will undergo seizure-like activity if stimulated at a high enough voltage. Seizure like activity is an all-or-nothing response and each genotype has a specific seizure threshold. The seizure threshold of a specific genotype of fly can be altered either by treatment with a drug or by genetic suppression or enhancement. The threshold is easily measured by electrophysiology. Seizure-like activity can be induced via high frequency electrical stimulation delivered directly to the brain and recorded through the dorsal longitudinal muscles (DLMs) in the thorax. The DLMs are innervated by part of the giant fiber system. Starting with low voltage, high frequency stimulation, and subsequently raising the voltage in small increments, the seizure threshold for a single fly can be measured.

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Using high frequency electrical stimulation, seizure-like activity can be induced in Drosophila. This activity is easily recorded from the giant fiber system.

, Epilepsi Mutants Nöbetler Neurocircuit Tahliller Drosophila</em

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical ...

Cellular Toxicity of Nanogenomedicine in MCF-7 Cell Line: MTT assay

Cytotoxicity of the futuristic nanogenomedicine (e.g., short interfering RNA and antisense) may hamper its clinical development. Of these, the gene-based medicine and/or its carrier may elicit cellular toxicity. For assessment of such cytotoxicity, a common methodology is largely dependent upon utilization of the 3-(4, 5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay which has been widely used as a colorimetric approach based on the activity of mitochondrial dehydrogenase enzymes in cells. In this current investigation, MCF-7 cells were inoculated in 96-well plate and at 50% confluency they were treated with different nanopolyplexes and subjected to MTT assay after 24 hours. Water soluble yellow MTT is metabolized by the metabolically active cells to the water insoluble purple formazan, which is further dissolved in dimethylsulfoxide and Sornson s buffer pH 10.5. The resultant product can be quantified by spectrophotometry using a plate reader at 570 nm.

The MTT assay is an easy and reproducible colorimetric assay for evaluation of cell viability based on reduction of yellow MTT and production of water insoluble purple formazan. Here, the viability of MCF-7 cells upon treatment of nanogenomedicine has been evaluated.

MCF-7 Hücre Line Nanogenomedicine Hücresel Toksisite: MTT assay

Cytotoxicity of the futuristic nanogenomedicine (e.g., short interfering RNA and antisense) may hamper its clinical development. Of these, the gene-based ...

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature and genome sequence database. Cultured Drosophila S2 cells, the product of disassociated 20-24 hour old embryos1, possess all these properties. Consequently, S2 cells are extremely well-suited for the analysis of cellular processes, including the discovery of the genes encoding the molecular components of the process or mechanism of interest. The features of S2 cells that are most responsible for their utility are the ease with which they are maintained, their exquisite sensitivity to double-stranded (ds)RNA-mediated interference (RNAi), and their tractability to fluorescence microscopy as either live or fixed cells.
S2 cells can be grown in a variety of media, including a number of inexpensive, commercially-available, fully-defined, serum-free media2. In addition, they grow optimally and quickly at 21-24&deg;C and can be cultured in a variety of containers. Unlike mammalian cells, S2 cells do not require a regulated atmosphere, but instead do well with normal air and can even be maintained in sealed flasks.
Complementing the ease of RNAi in S2 cells is the ability to readily analyze experimentally-induced phenotypes by phase or fluorescence microscopy of fixed or live cells. S2 cells grow in culture as a single monolayer but do not display contact inhibition. Instead, cells tend to grow in colonies in dense cultures. At low density, S2 cultures grown on glass or tissue culture-treated plastic are round and loosely-attached. However, the cytology of S2 cells can be greatly improved by inducing them to flatten extensively by briefly culturing them on a surface coated with the lectin, concanavalin A (ConA)3. S2 cells can also be stably transfected with fluorescently-tagged markers to label structures or organelles of interest in live or fixed cells. Therefore, the usual scenario for the microscopic analysis of cells is this: first, S2 cells (which can possess transgenes to express tagged markers) are treated by RNAi to eliminate a target protein(s). RNAi treatment time can be adjusted to allow for differences in protein turn-over kinetics and to minimize cell trauma/death if the target protein is important for viability. Next, the treated cells are transferred to a dish containing a coverslip pre-coated with conA to induce cells to spread and tightly adhere to the glass. Finally, cells are imaged with the researcher's choice of microscopy modes. S2 cells are particularly good for studies requiring extended visualization of live cells since these cells stay healthy at room temperature and normal atmosphere.

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Drosophila Schneider (S2) cells are an increasingly popular system for the discovery and functional analysis of genes. Our goal is to describe some of the microscopic techniques that make S2 cells such an increasingly important experimental system.

Hazırlanması Drosophila Işık Mikroskopi S2 hücreleri

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from these animals reform the original body plan following regeneration of missing body structures. For example if a 'trunk' fragment is cut from an intact worm, a new 'head' will regenerate anteriorly and a 'tail' will regenerate posteriorly restoring the original 'head-to-tail' polarity of body structures prior to amputation (Figure 1A).
Regeneration is driven by planarian stem cells, known as 'neoblasts' which differentiate into ~30 different cell types during normal body homeostasis and enforced tissue regeneration. This regenerative process is robust and easy to demonstrate. Owing to the dedication of several pioneering labs, many tools and functional genetic methods have now been optimized for this model system. Consequently, considerable recent progress has been made in understanding and manipulating the molecular events underpinning planarian developmental plasticity2-9.
The planarian model system will be of interest to a broad range of scientists. For neuroscientists, the model affords the opportunity to study the regeneration of an entire nervous system, rather than simply the regrowth/repair of single nerve cell process that typically are the focus of study in many established models. Planarians express a plethora of neurotransmitters10, represent an important system for studying evolution of the central nervous system11, 12 and have behavioral screening potential13, 14. 
Regenerative outcomes are amenable to manipulation by pharmacological and genetic apparoaches. For example, drugs can be screened for effects on regeneration simply by placing body fragments in drug-containing solutions at different time points after amputation. The role of individual genes can be studied using knockdown methods (in vivo RNAi), which can be achieved either through cycles of microinjection or by feeding bacterially-expressed dsRNA constructs8, 9, 15. Both approaches can produce visually striking phenotypes at high penetrance- for example, regeneration of bipolar animals16-21. To facilitate adoption of this model and implementation of such methods, we showcase in this video article protocols for pharmacological and genetic assays (in vivo RNAi by feeding) using the planarian Dugesia japonica.

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

An attractive model for studying stem cell differentiation within a live animal is the planarian flatworm. Regeneration is studied by simple amputation experiments that are easily performed in a basic laboratory and are amenable to pharmacological and genetic (in vivo RNAi) manipulation as detailed by protocols in this article.

Farmakolojik ve Fonksiyonel Genetik Tahliller Planarian Rejenerasyon işleyin<emJaponica> Dugesia</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

Drosophila oogenesis or follicle development has been widely used to advance the understanding of complex developmental and cell biologic processes. This methods paper describes how to isolate mid-to-late stage follicles (Stage 10B-14) and utilize them to provide new insights into the molecular and morphologic events occurring during tight windows of developmental time. Isolated follicles can be used for a variety of experimental techniques, including in vitro development assays, live imaging, mRNA expression analysis and western blot analysis of proteins. Follicles at Stage 10B (S10B) or later will complete development in culture; this allows one to combine genetic or pharmacologic perturbations with in vitro development to define the effects of such manipulations on the processes occurring during specific periods of development. Additionally, because these follicles develop in culture, they are ideally suited for live imaging studies, which often reveal new mechanisms that mediate morphological events. Isolated follicles can also be used for molecular analyses. For example, changes in gene expression that result from genetic perturbations can be defined for specific developmental windows. Additionally, protein level, stability, and/or posttranslational modification state during a particular stage of follicle development can be examined through western blot analyses. Thus, stage-specific isolation of Drosophila follicles provides a rich source of information into widely conserved processes of development and morphogenesis.

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

Stage-specific isolation of mid-to-late Drosophila follicles is useful for a variety of purposes. Such follicles develop in culture, which allows for genetic and/or pharmacologic manipulations to be coupled with in vitro development assays and live imaging. Additionally, follicles can be used for molecular studies, such as isolating mRNA and protein.

Of Utility Sahne özgü Orta-geç<em&gt; Drosophila</em&gt; Folikül İzolasyon

Drosophila oogenesis or follicle development has been widely used to advance the understanding of complex developmental and cell biologic processes. This ...

A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

Biomarkers are becoming increasingly more important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing myocardial infarction (MI) is largely driven by detecting cardiac-specific proteins in patients' serum or plasma as an indicator of myocardial injury. Having recently shown that cardiac myosin binding protein-C (cMyBP-C) is detectable in the serum after MI, we have proposed it as a potential biomarker for MI. Biomarkers are typically detected by traditional sandwich enzyme-linked immunosorbent assays. However, this technique requires a large sample volume, has a small dynamic range, and can measure only one protein at a time.	
Here we show a multiplex immunoassay in which three cardiac proteins can be measured simultaneously with high sensitivity. Measuring cMyBP-C in uniplex or together with creatine kinase MB and cardiac troponin I showed comparable sensitivity. This technique uses the Meso Scale Discovery (MSD) method of multiplexing in a 96-well plate combined with electrochemiluminescence for detection. While only small sample volumes are required, high sensitivity and a large dynamic range are achieved. Using this technique, we measured cMyBP-C, creatine kinase MB, and cardiac troponin I levels in serum samples from 16 subjects with MI and compared the results with 16 control subjects. We were able to detect all three markers in these samples and found all three biomarkers to be increased after MI. This technique is, therefore, suitable for the sensitive detection of cardiac biomarkers in serum samples.

Measuring biomarkers in complex biological samples is increasingly guiding clinical decision-making. We describe a highly sensitive method to simultaneously measure cardiac myosin binding protein-C, creatine kinase MB, and cardiac troponin I in serum samples from subjects with myocardial infarction and healthy control subjects.

Elektrokemiluminesan immunoassay Serum Kardiyak Miyozin Bağlayıcı Protein-C belirlenmesi için hassas ve özel miktar tayini yöntemi

Biomarkers are becoming increasingly more  important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing  myocardial infarction (MI) is ...

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized microtubules. Organelles move along these processes by microtubule motors. Easy maintenance, high sensitivity to RNAi-mediated protein knock-down and efficient procedure for creating stable cell lines make Drosophila S2 cells an ideal model system to study cargo transport by live imaging. The results obtained with S2 cells can be further applied to a more physiologically relevant system: axonal transport in primary neurons cultured from dissociated Drosophila embryos. Cultured neurons grow long neurites filled with bundled microtubules, very similar to S2 processes. Like in S2 cells, organelles in cultured neurons can be visualized by either organelle-specific fluorescent dyes or by using fluorescent organelle markers encoded by DNA injected into early embryos or expressed in transgenic flies. Therefore, organelle transport can be easily recorded in neurons cultured on glass coverslips using living imaging. Here we describe procedures for culturing and visualizing cargo transport in Drosophila S2 cells and primary neurons. We believe that these protocols make both systems accessible for labs studying cargo transport.

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Drosophila S2 cells and cultured neurons are great systems for imaging of motor-driven organelle transport in vivo. Here we describe detailed protocols for culturing both cell types, their imaging and analysis of transport.

Kültürlü organel Ulaşım<em&gt; Drosophila</em&gt; Hücreler: S2 Hücre Hattı ve İlköğretim Nöronlar.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting factors, such as labor intensive sample preparations, low detection limits, slow scan speeds, intensive method optimization for each metabolite, and the inability to measure both positively and negatively charged ions in single experiments. Therefore, a novel metabolomics protocol could advance metabolomics studies. Amide-based hydrophilic chromatography enables polar metabolite analysis without any chemical derivatization. High resolution MS using the Q-Exactive (QE-MS) has improved ion optics, increased scan speeds (256 msec at resolution 70,000), and has the capability of carrying out positive/negative switching. Using a cold methanol extraction strategy, and coupling an amide column with QE-MS enables robust detection of 168 targeted polar metabolites and thousands of additional features simultaneously.&#160; Data processing is carried out with commercially available software in a highly efficient way, and unknown features extracted from the mass spectra can be queried in databases.

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. Utilizing normal-phased liquid chromatography coupled to high-resolution mass spectrometry with polarity switching and a rapid duty cycle, we describe a protocol to analyze the polar metabolic composition of biological material with high sensitivity, accuracy, and resolution.

Hassas, Büyük Ölçekli Kantitatif metabolomik için bir strateji

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes differentiation from a stem cell population, mitotic amplification, and meiosis. In addition, post-meiotic germ cells undergo a dramatic morphological reshaping process as well as a global epigenetic reconfiguration of the germ line chromatin&#8212;the histone-to-protamine switch.
Studying the role of a protein in post-meiotic spermatogenesis using mutagenesis or other genetic tools is often impeded by essential embryonic, pre-meiotic, or meiotic functions of the protein under investigation. The post-meiotic phenotype of a mutant of such a protein could be obscured through an earlier developmental block, or the interpretation of the phenotype could be complicated. The model organism Drosophila melanogaster offers a bypass to this problem: intact testes and even cysts of germ cells dissected from early pupae are able to develop ex vivo in culture medium. Making use of such cultures allows microscopic imaging of living germ cells in testes and of germ-line cysts. Importantly, the cultivated testes and germ cells also become accessible to pharmacological inhibitors, thereby permitting manipulation of enzymatic functions during spermatogenesis, including post-meiotic stages.
The protocol presented describes how to dissect and cultivate pupal testes and germ-line cysts. Information on the development of pupal testes and culture conditions are provided alongside microscope imaging data of live testes and germ-line cysts in culture. We also describe a pharmacological assay to study post-meiotic spermatogenesis, exemplified by an assay targeting the histone-to-protamine switch using the histone acetyltransferase inhibitor anacardic acid. In principle, this cultivation method could be adapted to address many other research questions in pre- and post-meiotic spermatogenesis.

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

Diseksiyon, Görüntüleme ve Farmakolojik Tedavi: Drosophila Pupa Testis ve Bekar Erkek germ-line Kistler ex vivo Kültür

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes ...

Bir "humanize" oluşturuluyor

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Hücre Biyolojisi Degrade üreten mikroakışkan Aygıt

, Epilepsi Mutants Nöbetler Neurocircuit Tahliller Drosophila

MCF-7 Hücre Line Nanogenomedicine Hücresel Toksisite: MTT assay

Hazırlanması Drosophila Işık Mikroskopi S2 hücreleri

Farmakolojik ve Fonksiyonel Genetik Tahliller Planarian Rejenerasyon işleyin Dugesia

Of Utility Sahne özgü Orta-geç

Elektrokemiluminesan immunoassay Serum Kardiyak Miyozin Bağlayıcı Protein-C belirlenmesi için hassas ve özel miktar tayini yöntemi

Kültürlü organel Ulaşım

Hassas, Büyük Ölçekli Kantitatif metabolomik için bir strateji

Diseksiyon, Görüntüleme ve Farmakolojik Tedavi: Drosophila Pupa Testis ve Bekar Erkek germ-line Kistler ex vivo Kültür